JP5829030B2 - 顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡に関するものである。

従来、厚みのある標本をスライス化することなく、そのまま３Ｄイメージング（ＸＹＺスキャン）をすることができるレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。

特開２００５−２０２０８７号公報

ところで、レーザ顕微鏡で観察できるのは、図１２に示すように、表面から限られた深さまでである。したがって、Ｚスタック（Ｚ方向の断層像）を取る場合、図１３に示すように、理想的には表面から一定距離に対してＺスタックを取ればよい。しかしながら、実際の標本は凹凸のある表面形状を有しているため、各ＸＹエリアでＺスタックの開始位置を変更する必要があり、その変更作業には多大な時間を要するという不都合があった。したがって、従来のレーザ顕微鏡では、図１４に示すように、全てのＸＹＺ範囲の画像を取得せざるを得ず、これが撮像時間の増大につながっていた。

特許文献１に開示されているレーザ顕微鏡では、Ｚ方向の移動距離が短くなるように各ＸＹエリアにおけるＺスキャン開始位置を決定することで、撮像時間の短縮を図っている。しかしながら、特許文献１に開示されているレーザ顕微鏡では、凹凸のある表面形状を有する標本や、傾いている標本に対しては、撮像時間の短縮には有効ではないという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本の形状等に関わらず、効率的に３Ｄイメージングを行うことができる顕微鏡を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本を載置するステージと、蛍光物質を含む前記標本に照明光を集光する一方、該照明光の照射により前記標本内の前記蛍光物質が励起されて発生する蛍光を集める対物レンズと、前記ステージと前記対物レンズとを前記対物レンズの光軸に直交する方向に相対移動させる第１の駆動部と、前記ステージと前記対物レンズとを前記対物レンズの光軸方向に相対移動させる第２の駆動部と、前記対物レンズの光軸に直交する方向における前記標本の観察範囲を複数の領域に分割する領域分割部と、複数の前記領域について前記ステージの位置と前記標本の表面位置とを対応付けて記憶する表面位置記憶部と、該表面位置記憶部に記憶された複数の前記領域についての前記ステージの位置および前記標本の表面位置から前記標本の表面形状を推定する表面形状推定部と、前記対物レンズの光軸方向において、前記表面形状推定部により推定された前記標本の表面位置を基準とする所定範囲にわたって前記標本からの前記蛍光を検出する光検出部と、各前記領域における、前記光検出部により検出された前記標本からの前記蛍光および前記対物レンズの集光位置から前記標本の３次元画像を生成する画像生成部とを備える顕微鏡を採用する。

本発明によれば、対物レンズにより、ステージ上の標本に照明光が集光されるとともに、標本からの光が集められる。この際、ステージと対物レンズとが、第１の駆動部により対物レンズの光軸に直交する方向に相対移動させられるとともに、第２の駆動部により対物レンズの光軸方向に相対移動させられる。これにより、標本における照明光の集光位置が３次元的に移動させられ、この際の標本からの光を光検出部により検出し、画像生成部により対物レンズの集光位置と対応付けることで、標本の３次元画像が生成される。

この場合において、領域分割部により標本の観察範囲が対物レンズの光軸に直交する方向に複数の領域に分割され、このうち複数の領域についてのステージの位置と標本の表面位置とが表面位置記憶部に対応付けて記憶されている。この記憶された情報から表面形状推定部により標本の表面形状が推定される。そして、光検出部により、全ての領域について、標本からの光が、対物レンズの光軸方向において、推定された標本の表面位置を基準とする所定範囲にわたって検出され、画像生成部により標本の３次元画像が生成される。

このようにすることで、標本の全ての領域について、標本の表面近傍に照明光を集光させて、標本の対物レンズの光軸方向の断層像（Ｚスタック）を取得することができ、効率的に標本の３次元画像を生成することができる。

上記発明において、複数の前記領域について前記ステージの位置と前記標本の前記対物レンズの光軸方向の撮像条件とを対応付けて記憶する撮像条件記憶部と、該撮像条件記憶部に記憶された撮像条件を用いて、前記表面形状推定部により推定された前記標本の表面位置における前記対物レンズの光軸方向の撮像条件を決定する撮像条件決定部とを備えることとしてもよい。

このようにすることで、撮像条件記憶部に記憶された撮像条件（例えば、Ｚスキャンを開始するＺ座標、Ｚスキャンを終了するＺ座標、Ｚスキャンを行う間隔）を用いて、表面形状推定部により推定された標本の表面位置における対物レンズの光軸方向の撮像条件を決定することができる。これにより、各領域について、撮像条件を決定する必要性を省くことができ、効率的に標本の３次元画像を生成することができる。

上記発明において、前記表面形状推定部が、３点の前記ステージの位置および前記標本の表面位置の座標から前記３点を通る平面の方程式を決定することで、前記標本の表面形状を推定することとしてもよい。

このようにすることで、３点のステージの位置および標本の表面位置の座標を表面位置記憶部を記憶しておき、これらの座標から平面の方程式を決定することで、標本の表面形状を容易に推定することができる。これにより、標本の全ての領域について、標本の断層像（Ｚスタック）を取得することができ、効率的に標本の３次元画像を生成することができる。

上記発明において、前記表面位置記憶部に記憶する前記標本の表面位置を検出する表面位置検出部を備えることとしてもよい。
このようにすることで、表面位置検出部により自動的に標本の表面位置を検出し、検出した標本の表面位置をステージの位置と対応付けて表面位置記憶部に記憶させることができる。これにより、複数の領域について手動で標本の表面位置を探す手間を省くことができ、標本の３次元画像を生成する際の効率性を向上することができる。

上記発明において、前記表面位置検出部が、前記光検出部により検出された前記標本からの光の輝度情報に基づいて前記標本の表面位置を検出することとしてもよい。
このようにすることで、標本の表面位置を容易に且つ精度よく検出することができ、標本の３次元画像を生成する際の効率性を向上することができる。

本発明によれば、標本の形状等に関わらず、効率的に３Ｄイメージングを行うことができるという効果を奏する。

本発明の各実施形態に係るレーザ顕微鏡の概略構成図である。 本発明の第１の実施形態に係る制御部の機能ブロック図である。 図２の制御部により各ＸＹ領域についてＺスキャンが行われる状態を説明する図である。 図２の制御部により実行される処理を示すフローチャートである。 図２のステップＳ６の詳細な処理を示すフローチャートである。 図２のステップＳ７の詳細な処理を示すフローチャートである。 標本の３次元画像の一部を示すイメージ図である。 図７の撮像データのＺ方向の領域を示すグラフである。 図８の撮像データに輝度値０のデータを補ったグラフである。 本発明の第２の実施形態に係る制御部の機能ブロック図である。 図１０の制御部による図２のステップＳ６の詳細な処理を示すフローチャートである。 レーザ顕微鏡における実際に観察可能な範囲を示す図である。 レーザ顕微鏡における理想的な観察可能な範囲を示す図である。 従来のレーザ顕微鏡における観察可能な範囲を示す図である。

［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡について、図面を参照して説明する。
図１は、本実施形態のレーザ顕微鏡１の概略構成図である。図１に示すように、本実施形態のレーザ顕微鏡１は、レーザ光源１１と、ダイクロイックミラー１２と、スキャナ１３と、レボルバ１４と、対物レンズ１５と、電動ステージ１６と、レンズ１７と、ピンホール板１８と、バリアフィルタ１９と、光検出器２０と、顕微鏡本体２１と、制御部３０とを備えている。

レーザ光源１１は、標本Ａの表面を走査するスポット光（集束光）としてのレーザ光を射出するようになっている。このレーザ光は、標本Ａ内の蛍光指示薬を励起させ、蛍光を発生させる。レーザ光源１１は、制御部３０により制御される。

スキャナ１３は、例えばアルミコートされた一対のガルバノミラー（図示略）を有しており、これら一対のガルバノミラーの揺動角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。このような構成を有することで、スキャナ１３は、レーザ光源１１からのレーザ光を、標本Ａ上において２次元走査するようになっている。このスキャナ１３は、制御部３０により制御される。

レボルバ１４は、倍率の異なる対物レンズ１５を複数保持しており、複数の対物レンズ１５のうち、所望の倍率を有する対物レンズ１５をレーザ顕微鏡１の観察光路に配置することができるようなっている。
対物レンズ１５は、スキャナ１３により走査されたレーザ光を電動ステージ１６上に載置された標本Ａ上に照射する一方、標本Ａから発生した蛍光を集光するようになっている。

ダイクロイックミラー１２は、レーザ光源１１とスキャナ１３との間におけるレーザ光の光路上に設けられており、スキャナ１３を介して得られる標本Ａからの蛍光を選択して光検出器２０に導く波長選択ミラーである。具体的には、ダイクロイックミラー１２は、レーザ光源１１からのレーザ光を透過させる一方、標本Ａにおいて発生して対物レンズ１５により集められ、スキャナ１３を通過してきた蛍光を、光検出器２０に向けて反射するようになっている。このような構成を有することで、ダイクロイックミラー１２は、レーザ光の光路と標本Ａからの蛍光の光路とを分岐するようになっている。

電動ステージ１６は、対物レンズ１５に対向して配置されており、標本Ａを載置するようになっている。
顕微鏡本体２１には、電動ステージ１６を対物レンズ１５の光軸に直交する方向（ＸＹ方向）に移動させる第１の駆動部（図示略）と、電動ステージ１６を対物レンズ１５の光軸方向（Ｚ方向）に移動させる第２の駆動部（図示略）とが設けられている。これら第１の駆動部および第２の駆動部を動作させることで、対物レンズ１５に対して３次元方向（ＸＹＺ方向）に電動ステージ１６および電動ステージ１６上の標本Ａを相対移動させるようになっている。これら第１の駆動部および第２の駆動部は、制御部３０により制御される。

ピンホール板１８は、標本Ａ上におけるレーザ光の焦点位置から発生した蛍光のみを通過させるピンホールを有している。すなわち、対物レンズ１５により集められてダイクロイックミラー１２により反射された蛍光は、ピンホール板１８を通過することによりレーザ光の焦点位置から光軸方向にずれた位置からの光がカットされる。これにより、光軸方向に焦点位置と同一な面からの蛍光だけがバリアフィルタ１９に入射する。また、ダイクロイックミラー１２とピンホール板１８との間には、標本Ａからの蛍光をピンホールに集光させるレンズ１７が設けられている。

バリアフィルタ１９は、標本Ａからの蛍光を透過させる一方、レーザ光を遮断するフィルタ特性を有しており、ピンホール板１８を通過してきた蛍光からレーザ光の成分を除去するようになっている。

光検出器２０は、バリアフィルタ１９を透過してきた蛍光を検出し、検出した蛍光をその光量に応じた電気信号に変換する光電変換素子である。
後述するように、制御部３０により、光検出器２０からの電気信号と、スキャナ１３による標本Ａの走査位置および電動ステージ１６のＸＹＺ位置とを対応付けることで、標本Ａの蛍光画像が生成されるようになっている。

以下に、制御部３０により実行される処理について図２を参照して説明する。図２は、制御部３０が有する機能を展開して示した機能ブロック図である。
図２に示すように、制御部３０は、領域分割部３１と、表面位置記憶部３２と、Ｚスキャン条件記憶部（撮像条件記憶部）３３と、表面形状推定部３４と、Ｚスキャン条件決定部（撮像条件決定部）３５と、画像生成部３６とを機能として備えている。

領域分割部３１は、対物レンズ１５の光軸に直交する方向（ＸＹ方向）における標本Ａの観察範囲を複数の領域に分割するようになっている。具体的には、領域分割部３１は、図３（ａ）に示すように、電動ステージ１６のＸＹ方向の可動範囲から、標本ＡのＸＹ方向の観察範囲Ｂを設定する。そして、領域分割部３１は、図３（ｂ）に示すように、観察条件（例えば対物レンズ１５の倍率やスキャナ１３の走査範囲）から定まる視野（領域）の大きさを算出し、観察範囲Ｂを複数の領域に分割する。図３（ｂ）に示す例では、観察範囲Ｂを１４個の領域に分割している。

表面位置記憶部３２は、複数の領域について、対物レンズ１５に対するＸＹ方向の電動ステージ１６の位置と、対物レンズ１５に対するＺ方向の標本Ａの表面位置とを、それぞれ対応付けて記憶するようになっている。具体的には、表面位置記憶部３２は、図３（ｃ）に示すように、例えば領域ｂに対応する標本Ａの表面部分について、その中心位置ＰｂのＸＹ方向の座標（Ｘｂ，Ｙｂ）と、その中心位置ＰｂのＺ方向の座標（Ｚｂ）とを対応付けて記憶するようになっている。なお、Ｚ方向の標本Ａの表面位置（Ｚｂ）の算出方法については後述する。

Ｚスキャン条件記憶部３３は、複数の領域について、対物レンズ１５に対するＸＹ方向の電動ステージ１６の位置と、電動ステージ１６の位置に対応するＺスキャン条件とを、それぞれ対応付けて記憶するようになっている。具体的には、Ｚスキャン条件記憶部３３は、図３（ｄ）に示すように、例えば領域ｂに対応する電動ステージ１６の位置と、この位置に対応するＺスキャン条件（すなわち、Ｚスキャンを開始するＺ座標、Ｚスキャンを終了するＺ座標、Ｚスキャンを行う間隔）とを対応付けて記憶するようになっている。

表面形状推定部３４は、表面位置記憶部３２に記憶された複数の領域についての、電動ステージ１６の位置（ＸＹ方向）および標本Ａの表面位置（Ｚ方向）から、標本Ａの表面形状を推定するようになっている。具体的には、表面形状推定部３４は、図３（ｅ）に示すように、例えば表面位置記憶部３２に記憶された標本Ａの表面位置Ｐ１〜Ｐ６のＸＹＺ座標から標本Ａの表面形状を推定するようになっている。

より具体的には、表面形状推定部３４は、例えば、標本Ａの表面位置Ｐ１〜Ｐ６のうち、近接する３点の座標（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を以下の平面の方程式に代入し、この平面の方程式における係数ａ，ｂ，ｃ，ｄを求める。
ａＸ＋ｂＹ＋ｃＺ＋ｄ＝０
これにより、近接する３点の座標を通る平面の方程式が算出される。この平面の方程式を近接する３点全てについて算出し、算出された複数の平面を組み合わせることで、標本Ａの表面形状が推定される。このようにすることで、標本Ａの表面形状を容易に推定することができる。

Ｚスキャン条件決定部３５は、任意の電動ステージ１６の位置におけるＺスキャン条件を決定するようになっている。具体的には、Ｚスキャン条件決定部３５は、図３（ｆ）に示すように、全ての領域（ＸＹ方向）について、表面形状推定部３４により推定された標本Ａの表面形状およびＺスキャン条件記憶部３３に記憶されたＺスキャン条件から、この標本Ａの表面位置を基準とする所定範囲を、光検出部２０により標本Ａからの光を検出する範囲として決定する。

画像生成部３６は、標本Ａの各領域における、光検出部２０により検出された標本Ａからの光と、対物レンズ１５のＸＹ方向およびＺ方向の集光位置（すなわちＸＹＺ座標）から標本Ａの３次元画像を生成するようになっている。

上記構成を有するレーザ顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡１を用いて標本Ａの観察を行う場合、レーザ光源１１から射出されたレーザ光は、ダイクロイックフィルタ１２を透過してスキャナ１３に入射する。スキャナ１３ではレーザ光が標本Ａ上で２次元走査され、対物レンズ１５により標本Ａ上に集光される。

標本Ａのレーザ光の焦点位置では、標本Ａ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ１５により集められ、スキャナ１３を通過して、ダイクロイックフィルタ１２により反射される。反射された蛍光は、レンズ１７によりピンホール板１８のピンホールに集光され、ピンホール板１８を通過することによりレーザ光の焦点位置から光軸方向にずれた位置からの蛍光がカットされる。これにより、光軸方向に焦点位置と同一な面からの蛍光だけがバリアフィルタ１９に入射し、バリアフィルタ１９では、ピンホール板１８を通過してきた蛍光からレーザ光の成分を除去される。

バリアフィルタ１９を透過してきた蛍光は、光検出器２０により検出され、その光量に応じた電気信号に変換される。この電気信号は、制御部３０の画像生成部３６に出力され、スキャナ１３による標本Ａの走査位置と対応付けることで、標本Ａの蛍光画像が生成される。上記の処理を、電動ステージ１６を動作させて、各視野（領域）に対して行うことで、標本Ａの観察範囲における蛍光画像が生成される。

この場合において、標本Ａの３Ｄイメージングを行う場合の処理について、図４に示すフローチャートを用いて以下に説明する。
まず、対物レンズ１５の光軸に直交する方向（ＸＹ方向）における標本Ａの観察範囲を設定する（ステップＳ１）。具体的には、図３（ａ）に示すように、電動ステージ１６のＸＹ方向の可動範囲から、標本ＡのＸＹ方向の観察範囲Ｂが設定される。

次に、領域分割部３１により、観察条件から求まる視野数で、ステップＳ１において設定した観察範囲Ｂを分割する（ステップＳ２）。具体的には、図３（ｂ）に示すように、例えば対物レンズ１５の倍率やスキャナ１３の走査範囲等の観察条件から定まる視野（領域）を算出し、観察範囲Ｂを複数の領域に分割する。ここでは、分割した視野（領域）の数をＭとする。

次に、対物レンズ１５の視野をステップＳ２における任意のＸＹ位置に移動する（ステップＳ３）。具体的には、電動ステージ１６を動作させて、標本Ａを対物レンズ１５に対してＸＹ方向に移動させ、図３（ｃ）に示すように、対物レンズ１５の視野をステップＳ２において分割した領域のうち、任意の領域（図３（ｃ）に示す例では領域ｂ）に移動する。この際の領域のＸＹ方向の座標をＸｂ，Ｙｂとする。

次に、ステップＳ３において移動した位置で、Ｚスキャン条件を設定する（ステップＳ４）。具体的には、図３（ｄ）に示すように、電動ステージ１６を動作させて、標本Ａを対物レンズ１５に対してＺ方向に移動させ、その際に取得される標本Ａの３次元画像を観察する。そして、標本Ａの表面付近の所定範囲を、Ｚスキャンを行う範囲として設定する。ここでは、領域ｂに対応する標本Ａの表面部分について、Ｚスキャンを開始するＺ座標をＺｓｔａｒｔ＿ｂ，Ｚスキャンを終了するＺ座標をＺｅｎｄ＿ｂ，Ｚスキャンを行う間隔をＺｓｔｅｐ＿ｂとする。

次に、ステップＳ３，Ｓ４の設定条件を記憶する（ステップＳ５）。具体的には、表面位置記憶部３２に、複数の領域について、対物レンズ１５に対するＸＹ方向の電動ステージ１６の位置と、対物レンズ１５に対するＺ方向の標本Ａの表面位置とを対応付けて記憶する。また、Ｚスキャン条件記憶部３３に、複数の領域について、対物レンズ１５に対するＸＹ方向の電動ステージ１６の位置と、前述のＺスキャン条件とを対応付けて記憶する。

より具体的には、図３（ｄ）に示すように、例えば領域ｂに対応する標本Ａの表面部分について、その中心位置ＰｂのＸＹ方向の座標（Ｘｂ，Ｙｂ）と、その中心位置ＰｂのＺ方向の座標（Ｚｂ）およびＺスキャン条件（Ｚスキャンを開始するＺ座標、Ｚスキャンを終了するＺ座標、Ｚスキャンを行う間隔）とを対応付けて記憶する。

次に、標本の表面形状の推定処理を行う（ステップＳ６）。具体的には、表面形状推定部３４により、図３（ｅ）に示すように、例えば予め表面位置記憶部３２に記憶された標本Ａの表面位置Ｐ１〜Ｐ６の座標から標本Ａの表面形状を推定する。この際の詳細な処理については後述する。

次に、ステップＳ６における推定結果およびステップＳ５において記憶された設定条件を用いて、ステップＳ２の各ＸＹ位置におけるＺスキャン条件を生成する（ステップＳ７）。具体的には、Ｚスキャン条件決定部３５により、図３（ｆ）に示すように、全ての領域について、表面形状推定部３４により推定された標本Ａの表面位置を基準とする所定範囲を、光検出部２０により標本Ａからの光を検出する範囲として決定する。この際の詳細な処理については後述する。
上記の処理を、電動ステージ１６を動作させて、各視野（領域）に対して行うことで、標本Ａの３次元画像が生成される。

以下に、上述したステップＳ６の詳細な処理について図５を用いて説明する。
まず、ｉ＝１として（ステップＳ１１）、標本Ａの表面形状の推定に使用する測定点の個数を決定する（ステップＳ１２）。ここでは、この個数をＮとする。なお、この測定点の個数が多いほど、標本Ａの表面形状の推定精度を向上することができる。

次に、ｉ＝Ｎであるか否かを判断し（ステップＳ１３）、ｉ＝Ｎでない場合には電動ステージ１６を動作させ、測定対象の座標（Ｘｉ，Ｙｉ）に移動する（ステップＳ１４）。
この状態においてユーザが観察を開始し（ステップＳ１５）、座標（Ｘｉ，Ｙｉ）における標本Ａの表面を、対物レンズ１５の焦点位置をＺ方向に動かしながら見つける（ステップＳ１６）。このようにして見つかったＺ座標をＺｉとする（ステップＳ１７）。

次に、ｉ＝ｉ＋１として（ステップＳ１８）、ステップＳ１３に戻り、ｉ＝Ｎでない場合にはステップＳ１４からステップＳ１８までの処理を繰り返す。
ステップＳ１３においてｉ＝Ｎとなった場合には、（Ｘｉ，Ｙｉ，Ｚｉ）ｉ∈｛１，．．．，Ｎ｝から（Ｘｉ，Ｙｉ，Ｚｉ）を通る曲面または平面を算出する（ステップＳ１９）。具体的には、前述のように、近接する３点の座標を通る平面の方程式を算出する。

なお、これらの点を通る平面を算出する場合には、表面形状推定部３４は、例えば、標本Ａ上の複数の測定点のうち、近接する３点の座標（Ｘ，Ｙ，Ｚ）を以下の平面の方程式に代入し、以下の平面の方程式における係数ａ，ｂ，ｃ，ｄを求める。
ａＸ＋ｂＹ＋ｃＺ＋ｄ＝０
これにより、近接する３点の座標を通る平面の方程式が求められる。この平面の方程式を近接する３点全てについて求め、求められた複数の平面を組み合わせることで、標本Ａの表面形状が推定される。このようにすることで、標本Ａの表面形状を容易に推定することができる。

以下に、上述したステップＳ７の詳細な処理について図６を用いて説明する。
まず、座標（Ｘｉ，Ｙｉ）におけるＺスキャン条件を以下のように設定する（ステップＳ２１）。
Ｚｓｔａｒｔ＿ｉ
Ｚｅｎｄ＿ｉ
Ｚｓｔｅｐ＿ｉ

次に、ｉ＝１として（ステップＳ２２）、ｉ＝Ｍであるか否かを判断する（ステップＳ２３）。ここで、Ｍは前述のように、観察範囲Ｂを分割した視野（領域）の数である。
ステップＳ２３において、ｉ＝Ｍでない場合にはＺスキャン条件を以下のように設定する（ステップＳ２４）。
Ｚｓｔａｒｔ＿ｉ＝Ｚｓｔａｒｔ＿ｂ−（ｆ（Ｘｂ，Ｙｂ）＿ｉ−ｆ（Ｘｉ，Ｙｉ））
Ｚｅｎｄ＿ｉ＝Ｚｅｎｄ＿ｂ−（ｆ（Ｘｂ，Ｙｂ）＿ｉ−ｆ（Ｘｉ，Ｙｉ））
Ｚｓｔｅｐ＿ｉ＝Ｚｓｔｅｐ＿ｂ

次に、ｉ＝ｉ＋１として（ステップＳ２５）、ステップＳ２３に戻り、ｉ＝Ｍでない場合にはステップＳ２４からステップＳ２５までの処理を繰り返す。
そして、ステップＳ２３においてｉ＝Ｍとなった場合には処理を終了する。
上記の処理を行うことで、表面に曲率のある標本Ａや、傾いた標本Ａに対しても、全ての観察範囲でＺスキャン条件を設定することなく、必要な範囲のみを観察することができる。

以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１によれば、領域分割部３１により標本Ａの観察範囲が対物レンズ１５の光軸に直交する方向（ＸＹ方向）に複数の領域に分割される。また、分割された領域のうち、複数の領域についての電動ステージ１６の位置と標本Ａの表面位置およびＺスキャン条件とが、表面位置記憶部３２およびＺスキャン条件記憶部３３に対応付けて記憶されている。この記憶された情報から、表面形状推定部３４により標本Ａの表面形状が推定され、Ｚスキャン条件決定部３５により任意の電動ステージ１６の位置におけるＺスキャン条件が決定される。これにより、標本Ａの表面位置を基準とする所定範囲にわたって標本Ａからの光が光検出部２０により検出され、画像生成部３６により標本Ａの３次元画像が生成される。

このようにすることで、標本Ａの全ての領域について、標本Ａの表面近傍に照明光を集光させて、標本Ａの対物レンズ１５の光軸方向の断層像（Ｚスタック）を取得することができ、効率的に標本Ａの３次元画像を生成することができる。

また、Ｚスキャン条件記憶部３３に記憶されたＺスキャン条件（Ｚスキャンを開始するＺ座標、Ｚスキャンを終了するＺ座標、Ｚスキャンを行う間隔）を用いて、表面形状推定部３４により推定された標本Ａの表面位置における対物レンズ１５の光軸方向のＺスキャン条件を決定することができる。これにより、各領域について、Ｚスキャン条件を決定する必要性を省くことができ、効率的に標本Ａの３次元画像を生成することができる。

なお、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１において、標本Ａの各領域における３次元画像は、図７に示すように、Ｚスキャンの開始位置および終了位置が、各領域（エリア）によって異なる。したがって、図８に示すように、これらの３次元画像を並べた場合に、撮像データの存在する領域がエリアによって異なるため、そのままでは標本Ａの３次元画像が不連続な画像となってしまう。

そこで、本実施形態に係るレーザ顕微鏡１では、図９に示すように、各エリアにおいてデータのない領域については輝度値０の画像を補う。これにより、各エリアのＺ方向の画像領域を揃えることができ、連続的な標本Ａの３次元画像を生成することができる。

［第２の実施形態］
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡について説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡２が、前述の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と異なる点は、標本Ａの表面位置を自動的に検出する点である。以降では、本実施形態に係るレーザ顕微鏡２について、第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡１と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。

本実施形態に係るレーザ顕微鏡２において、制御部３０は、図１０に示すように、前述の実施形態（図２参照）に示す機能に加えて、標本Ａの表面位置を検出する表面位置検出部３７を機能として有している。

上記構成を有する本実施形態に係るレーザ顕微鏡２の作用について、図１１を用いて説明する。図１１は、本実施形態に係るレーザ顕微鏡２において実行される、前述したステップＳ６（図４参照）の詳細な処理を示すフローチャートである。

まず、ｉ＝１として（ステップＳ３１）、標本Ａの表面形状の推定に使用する測定点の位置、個数を決定する（ステップＳ３２）。
次に、ｉ＝Ｎであるか否かを判断し（ステップＳ３３）、ｉ＝Ｎでない場合には電動ステージ１６を動作させ、測定対象の座標（Ｘｉ，Ｙｉ）に移動する（ステップＳ３４）。

この状態において制御部３０により観察が開始され（ステップＳ３５）、表面位置検出部３７が、座標（Ｘｉ，Ｙｉ）における標本Ａの表面を検出する（ステップＳ３６）。この際、表面位置検出部３７は、光検出部２０により検出された標本Ａからの蛍光の輝度情報に基づいて標本Ａの表面位置を検出する。具体的には、制御部３０は、光検出部２０により検出された標本Ａからの蛍光強度が高いＺ位置を、標本Ａの表面付近として検出する。そして、このようにして見つかったＺ座標をＺｉとする（ステップＳ３７）。

次に、ｉ＝ｉ＋１として（ステップＳ３８）、ステップＳ３３に戻り、ｉ＝Ｎでない場合にはステップＳ３４からステップＳ３８までの処理を繰り返す。
ステップＳ３３においてｉ＝Ｎとなった場合には、（Ｘｉ，Ｙｉ，Ｚｉ）ｉ∈｛１，．．．，Ｎ｝から（Ｘｉ，Ｙｉ，Ｚｉ）を通る曲面または平面を算出する（ステップＳ３９）。具体的には、前述のように、近接する３点の座標を通る平面の方程式を算出する。

本実施形態に係るレーザ顕微鏡２によれば、表面位置検出部３７により自動的に標本Ａの表面位置を検出し、検出した標本Ａの表面位置を電動ステージ１６の位置と対応付けて表面位置記憶部３２に記憶させることができる。これにより、複数の領域について手動で標本Ａの表面位置を探す手間を省くことができ、標本Ａの３次元画像を生成する際の効率性を向上することができる。

また、表面位置検出部３７が、光検出部２０により検出された標本Ａからの光の輝度情報に基づいて標本Ａの表面位置を検出することで、標本Ａの表面位置を容易に且つ精度よく検出することができ、標本Ａの３次元画像を生成する際の効率性を向上することができる。

以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、各実施形態において、本発明を１光子励起顕微鏡に適用した例を説明したが、本発明を多光子励起顕微鏡に適用してもよい。

Ａ 標本
１，２ レーザ顕微鏡
１１ レーザ光源
１２ ダイクロイックミラー
１３ スキャナ
１４ レボルバ
１５ 対物レンズ
１６ 電動ステージ
１７ レンズ
１８ ピンホール板
１９ バリアフィルタ
２０ 光検出器
２１ 顕微鏡本体
３０ 制御部
３１ 領域分割部
３２ 表面位置記憶部
３３ Ｚスキャン条件記憶部（撮像条件記憶部）
３４ 表面形状推定部
３５ Ｚスキャン条件決定部（撮像条件決定部）
３６ 画像生成部
３７ 表面位置検出部

Claims (5)

1. 標本を載置するステージと、
   蛍光物質を含む前記標本に照明光を集光する一方、該照明光の照射により前記標本内の前記蛍光物質が励起されて発生する蛍光を集める対物レンズと、
   前記ステージと前記対物レンズとを前記対物レンズの光軸に直交する方向に相対移動させる第１の駆動部と、
   前記ステージと前記対物レンズとを前記対物レンズの光軸方向に相対移動させる第２の駆動部と、
   前記対物レンズの光軸に直交する方向における前記標本の観察範囲を複数の領域に分割する領域分割部と、
   複数の前記領域について前記ステージの位置と前記標本の表面位置とを対応付けて記憶する表面位置記憶部と、
   該表面位置記憶部に記憶された複数の前記領域についての前記ステージの位置および前記標本の表面位置から前記標本の表面形状を推定する表面形状推定部と、
   前記対物レンズの光軸方向において、前記表面形状推定部により推定された前記標本の表面位置を基準とする所定範囲にわたって前記標本からの前記蛍光を検出する光検出部と、
   各前記領域における、前記光検出部により検出された前記標本からの前記蛍光および前記対物レンズの集光位置から前記標本の３次元画像を生成する画像生成部とを備える顕微鏡。
2. 複数の前記領域について前記ステージの位置と前記標本の前記対物レンズの光軸方向の撮像条件とを対応付けて記憶する撮像条件記憶部と、
   該撮像条件記憶部に記憶された撮像条件を用いて、前記表面形状推定部により推定された前記標本の表面位置における前記対物レンズの光軸方向の撮像条件を決定する撮像条件決定部とを備える請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記表面形状推定部が、３点の前記ステージの位置および前記標本の表面位置の座標から前記３点を通る平面の方程式を決定することで、前記標本の表面形状を推定する請求項１に記載の顕微鏡。
4. 前記表面位置記憶部に記憶する前記標本の表面位置を検出する表面位置検出部を備える請求項１に記載の顕微鏡。
5. 前記表面位置検出部が、前記光検出部により検出された前記標本からの光の輝度情報に基づいて前記標本の表面位置を検出する請求項４に記載の顕微鏡。

Images