JP5793428B2

JP5793428B2 - プロドラッグ形態のキナーゼインヒビターおよび治療におけるそれらの使用

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Publication number: JP5793428B2
Application number: JP2011553972A
Authority: JP
Inventors: ジェフリーブルーススマイル; アダムフォルンパターソン; マイケルパトリックヘイ; ウィリアムアレキサンダーデニー; ウィリアムロバートウィルソン; グオ−リャンルー; ロバートフォーブスアンダーソン; ホーフアットリー; アミルアショールザデー
Original assignee: オークランドユニサーヴィスィズリミテッド
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2010-03-11
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2030-03-11
Also published as: US20160002222A1; EP2406262A1; EP2406262A4; KR20110130468A; EP2406262B1; NZ595206A; BRPI1011505A2; CN105541836A; JP2012520295A; WO2010104406A1; WO2010104406A8; US9073916B2; CA2754808A1; CN102348708A; MX2011009034A; CA2754808C; EP3031807A1; US20120077811A1; NZ620000A; RU2011141121A

Description

本発明は、キナーゼインヒビター、特に、プロドラッグ形態のキナーゼインヒビター、それらを含有する組成物および医薬、並びにこのようなインヒビター、組成物および医薬の調製方法および使用に関する。

キナーゼは、タンパク質、脂質および代謝産物のリン酸化を触媒し、さまざまな細胞プロセスの調節において中心的な役割を果たす酵素の大きなファミリーに相当する。異常なキナーゼ活性は、癌を含むさまざまな障害と関連している。このことが、抗癌剤をはじめ、治療薬としてのキナーゼインヒビターの開発につながった。

本発明は、概して、キナーゼインヒビターとしての活性を有する化合物（それらのプロドラッグ形態を含む）並びに治療におけるこのような化合物の適用に関する。

（発明の要約）
第１の態様では、本発明は、キナーゼインヒビターと、還元的に活性化されるフラグメント化芳香族ニトロヘテロ環または芳香族ニトロ炭素環のトリガーとを含む化合物を提供し、前記化合物は、正電荷を保持する。

好ましい実施形態では、トリガーは、一電子還元レベルでフラグメント化する。

好ましい実施形態では、キナーゼインヒビターは、四級化可能な窒素を有し、トリガーは、直接または間接的にその窒素と連結して、四価窒素を形成する。直接連結される還元的トリガーが、現在、最も望ましいと考えられている。

別の態様では、本発明は、キナーゼインヒビターと、一電子還元レベルでフラグメント化する芳香族ニトロヘテロ環化合物または芳香族ニトロ炭素環のフラグメント化トリガーとを含む化合物を提供し、前記キナーゼインヒビターは、四価窒素を提供するように前記トリガーが直接的または間接的に連結する、四級化可能な窒素を含む。

好ましい実施形態では、化合物は、トリガーのフラグメント化の際、四級化可能な窒素を含有するキナーゼインヒビターが無傷で放出されるようなものである。

好ましい実施形態では、放出の際に、キナーゼインヒビターは、第三アミン部分を含有し、第三アミン部分の窒素は、トリガーが連結される窒素である。

特定の実施形態では、化合物は、ＮＨＥ（Normal Hydrogen Electrode：標準水素電極）に対して、−０．６〜−０．２Ｖ、例えば−０．５〜−０．３Ｖ、例えば−０．３５〜−０．４５Ｖ、例えば−０．４〜−０．４５ＶのＥ（１）を有する。

特定の実施形態では、化合物は、一電子還元について、１〜４０００ｓ^−１、例えば１〜３０００ｓ^−１、例えば１〜１５００ｓ^−１、例えば２〜５００ｓ^−１、例えば２〜３００ｓ^−１、例えば２〜６０ｓ^−１、例えば２０〜６０ｓ^−１のフラグメント化速度定数を有する。

好ましい化合物は、−０．２〜−０．６ＶのＥ（１）および一電子還元について１〜４０００ｓ^−１のフラグメント化速度定数、−０．３〜−０．５ＶのＥ（１）および一電子還元について１〜３０００ｓ^−１（より好ましくは、１〜１５００ｓ^−１）のフラグメント化速度定数、−０．３５〜−０．４５ＶのＥ（１）および一電子還元について２〜５００ｓ^−１、より好ましくは１０〜３００ｓ^−１、さらにより好ましくは２０〜６０ｓ^−１のフラグメント化速度定数、および−０．４〜−０．４５ＶのＥ（１）および一電子還元について２０〜６０ｓ^−１（好ましくは４０〜５５ｓ^−１）のフラグメント化速度定数を有する。

好ましい実施形態では、本発明の化合物は、キナーゼインヒビターと、還元的に活性化されるフラグメント化トリガーとを含み、キナーゼインヒビターは、前記トリガーが直接または間接的に連結される四級化可能な窒素を有し、トリガーは、式IIId：

［式中、^＊は結合点であり；
Ｒ_８は、ＨおよびＣ１−Ｃ３アルキルから選択され；および
Ｒ_９は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択される］
の構造を有する。

好ましい実施形態では、Ｒ_８はＨである。さらに好ましい実施形態では、Ｒ_９はＣ１−Ｃ３アルキル、好ましくはメチルである。特に好ましい実施形態では、Ｒ_８はＨであり、Ｒ_９はメチルである。

キナーゼインヒビターは、可逆性キナーゼインヒビターまたは不可逆性キナーゼインヒビター、例えば不可逆性erbB1、2、4チロシンキナーゼインヒビターのいずれかであり得る。不可逆性が好ましい。

特定の実施形態では、キナーゼインヒビターは、システイン捕捉官能基と連結している塩基性第三アミン部分を有する不可逆性erbB1、2、4チロシンキナーゼインヒビターである。

特定の実施形態では、システイン捕捉官能基は、リンカー部分（ＣＨ_２）_ｎ（式中、ｎは０〜６の整数である）によって前記第三アミンと連結している。

特定の実施形態では、システイン捕捉官能基は、マイケル受容基（Michael acceptor）、例えば二重または三重結合含有アミドマイケル受容基である。

不可逆性erbB1、2、4チロシンキナーゼインヒビター、例えば、キナゾリン、７−アルコキシキナゾリン、７−アルコキシキノリンカルボニトリル、４−アニリノ−［１，７］ナフチリジン−３−カルボニトリル、４−アニリノ−５，７−ジヒドロ−６Ｈ−ピロロ［３’，４’：４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジンおよび４−アニリノピリド［３，４−ｄ］ピリミジンキナーゼインヒビターであって、システイン捕捉官能基が、６位の二重または三重結合含有アミドマイケル受容基であるものが特に適している。

さらに別の態様では、本発明は、式I：

［式中、
Ｘは、任意の負荷電対イオンであり；
Ｒ_１は、式−（ＣＨ_２）_ｎＴｒの基であり、式中、Ｔｒは、芳香族ニトロヘテロ環または芳香族ニトロ炭素環であり、−（ＣＨ_２）_ｎＴｒは、還元的に活性化されるフラグメント化トリガーとして作用し；ｎは、０〜６の整数であり；
Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は各々独立に、第三アミンキナーゼインヒビター（Ｒ_２）（Ｒ_３）（Ｒ_４）Ｎの脂肪族または芳香族の基から選択され得るか、またはＲ_２、Ｒ_３およびＲ_４のうちの２つが、キナーゼインヒビターの脂肪族もしくは芳香族ヘテロ環式アミンリングを形成してもよく、またはＲ_２、Ｒ_３およびＲ_４のうちの１つが存在せず、かつＲ_２、Ｒ_３およびＲ_４のうちの２つが、キナーゼインヒビターの芳香族ヘテロ環式アミンリングを形成してもよい］
の四価窒素塩を提供する。

別の態様では、本発明は、式II：

［式中、
Ｘは、任意の負荷電対イオンであり；
Ｙは、ＮまたはＣ−Ｒ_７であり、ここで、Ｒ_７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシおよび式VI

｛式中、^＊は結合点であり、
Ｔは、Ｏ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）および直接結合から選択され；
ｍは、０〜６の整数から選択され；
Ｕは、ＯＲ_４４、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＣＮ、ＮＲ_４５Ｒ_４６、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、Ｎ１−メチルピペラジニル、モルホリニル、ＣＯＮ（Ｒ_４７）（Ｒ_４８）、ＳＯ_２Ｎ（Ｒ_４９）（Ｒ_５０）、Ｎ（Ｒ_５１）ＣＯＲ_５２、Ｎ（Ｒ_５３）ＳＯ_２Ｒ_５４、ＣＯＲ_５５、ＳＯＲ_５６、ＳＯ_２Ｒ_５７およびＣＯＯＲ_５８から選択され；
Ｒ_４２、Ｒ_４３、Ｒ_４４、Ｒ_４５、Ｒ_４６、Ｒ_４７、Ｒ_４８、Ｒ_４９、Ｒ_５０、Ｒ_５１、Ｒ_５２、Ｒ_５３、Ｒ_５４、Ｒ_５５、Ｒ_５６、Ｒ_５７、Ｒ_５８は独立に、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択される］
の基からなる群から選択され；
Ｚは、ＮまたはＣ−ＣＮであり；
ｎは、０〜６の整数であり；
Ｒ_１は、式（ＣＨ_２）_ｎＴｒの基であり、式中、Ｔｒは、芳香族ニトロヘテロ環または芳香族ニトロ炭素環であり、−（ＣＨ_２）_ｎＴｒは、還元的に活性化されるフラグメント化トリガーとして作用し；ｎは、０〜６の整数であり；
Ｒ_２およびＲ_３は独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択されるか、またはＲ_２およびＲ_３は、一緒になって、非芳香族炭素環式リングまたは少なくとも１個のヘテロ原子を含有する非芳香族ヘテロ環式リングを形成してもよく；
Ｒ_５は、アニリン、インドール、インドリン、アミン、アミノインドールおよびアミノインダゾールから選択され、それらの各々は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２、ＣＯＮＨ_２、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＳＯ_２ＮＨ_２およびＳＯ_２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよく；および
Ｒ_６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２および式V：

［式中、
^＊は、結合点であり；
Ｖは、（ＣＨ_２）_ｋ（ｋは、０〜６の整数である）、Ｏ、ＮＨおよびＮ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択され；および
Ｒ_４１は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択される］
の基から選択される］
の四級アンモニウム塩を提供する。

好ましい実施形態では、Ｘは、ハリド（フルオリド、クロリド、ブロミド、ヨージド）、メタンスルホナート、トリフルオロメタンスルホナート、アセタート、トリフルオロアセタート、トシラート、ラクタート、シトラートおよびホルマートから選択される。

特定の好ましい実施形態では、Ｘは、ハリド、好ましくは、ブロミドまたはクロリドである。

その他の好ましい実施形態では、Ｘは、ホルマートまたはトリフルオロアセタートである。

好ましい実施形態では、Ｒ_１は、式III：

［式中、
^＊は、式IIの化合物の四価窒素との結合点であり；
Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＳＯ_２ＮＨ_２、ＳＯ_２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＳＯ_２Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２、ＳＯ_２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）および式VIaの基（上記定義の通りであるが、^＊は式IIIの基への結合点である）から選択され；
Ｒ_９は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよび式VIaの基（上記で定義されるとおりであるが、^＊は、式IIIの基との結合点である）からなる群から選択され；および
Ｒ_１０は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択される］
の群から選択される。

特定の好ましい実施形態では、Ｒ_１は、式IIIcの基から選択され、ここで、Ｒ_８はＨであり、Ｒ_９はＣＨ_３である。

その他の好ましい実施形態では、Ｒ_１は、式IIIdの基から選択され、ここで、Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル（メチルなど）、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ（ＯＣＨ_３など）、Ｃ２−Ｃ６アルキニル（エチニルなど）、ＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｂｒ、ＮＯ_２およびＣＮから選択され、Ｒ_９は、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２およびＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮから選択される。

その他の好ましい実施形態では、Ｒ_１は、式IIId：

［式中、^＊は、結合点であり、Ｒ_８は、ＨおよびＣ１−Ｃ３アルキルから選択され、Ｒ_９は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択される］
の基から選択される。

好ましい実施形態では、Ｒ_８はＨである。Ｒ_９は、好ましくはＣ１−Ｃ３アルキルであり、最も好ましくは、メチルである。特に好ましい実施形態では、Ｒ_８はＨであり、Ｒ_９はメチルである。

その他の好ましい実施形態では、Ｒ_１は、式IIIdの基（式中、Ｒ_８は１−プロピニルであり、Ｒ_９はＣＨ_３である）から選択される。

その他の好ましい実施形態では、Ｒ_１は、式IIIqの基（式中、Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル（メチルまたはエチルなど）およびＣ１−Ｃ６アルコキシ（ＯＣＨ_３など）から選択され、Ｒ_９がＣＨ_３である）から選択される。

特定の実施形態では、Ｒ_２およびＲ_３は、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、Ｎ１−メチルピペラジニウムおよびモルホリニウムから選択されるリングを形成する。

好ましい実施形態では、Ｒ_５は、式IV：

［式中、
^＊は、結合点であり；
Ｒ_１１、Ｒ_１８、Ｒ_１９、Ｒ_２１、Ｒ_２６、Ｒ_３１およびＲ_３６は独立に、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４、Ｒ_１５、Ｒ_１６、Ｒ_１７、Ｒ_２０、Ｒ_２２、Ｒ_２３、Ｒ_２４、Ｒ_２５、Ｒ_２７、Ｒ_２８、Ｒ_２９、Ｒ_３０、Ｒ_３２、Ｒ_３３、Ｒ_３４、Ｒ_３５、Ｒ_３７、Ｒ_３８、Ｒ_３９およびＲ_４０は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２、ＣＯＮＨ_２、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＳＯ_２ＮＨ_２およびＳＯ_２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択され；および
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｈである］
の基から選択される。

特定の好ましい実施形態では、ＹはＮであり、Ｚは、ＮまたはＣ−ＣＮであり、
Ｒ_１は、以下から選択され：
（ａ）式IIIcの基（式中、Ｒ_８はＨであり、Ｒ_９はＣＨ_３である）；
（ｂ）式IIIdの基（式中、（i）Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル（メチルなど）、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ（ＯＣＨ_３など）、Ｃ２−Ｃ６アルキニル（エチニルなど）、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｂｒ、ＮＯ_２およびＣＮから選択され、Ｒ_９は、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２およびＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮから選択される；または（ii）Ｒ_８は１−プロピニルであり、Ｒ_９はＣＨ_３である）；
（ｃ）式IIIfの基（式中、Ｒ_８はＨであり、Ｒ_９はＣＨ_３である）；および
（ｄ）式IIIqの基（式中、Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル（メチルまたはエチルなど）およびＣ１−Ｃ６アルコキシ（ＯＣＨ_３など）から選択され、Ｒ_９はＣＨ_３である）；
Ｒ_２およびＲ_３は独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択されるか、または一緒になって、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、Ｎ１−メチルピペラジニウムおよびモルホリニウムから選択されるリングを形成し；
Ｒ_５は、以下から選択され：
（ａ）式IVaの基、［式中、
^＊は結合点であり；および
Ｒ_１１はＨであり；
Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択される］；
（ｂ）式IVdの基、［式中、
^＊は結合点であり；
Ｒ_２１はＨであり；
Ｒ_２２およびＲ_２３は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択され；
Ｒ_２４およびＲ_２５は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択され；
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｈである］；および
（ｃ）式IVfの基、［式中、
^＊は結合点であり；
Ｒ_３１はＨであり；および
Ｒ_３２およびＲ_３３は独立に、ＨまたはＦから選択され；
Ｒ_３４およびＲ_３５は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３から選択され；
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｈである］；
Ｒ_６はＨであり；
Ｘは、任意の負荷電対イオンであり；および
ｎ＝１または２である。

その他の好ましい実施形態では、Ｙは、Ｃ−ＨまたはＣ−（Ｃ１−Ｃ６アルコキシ）であり、Ｚは、ＮまたはＣ−ＣＮであり；
Ｒ_１は、以下から選択され：
（ａ）式IIIcの基（式中、Ｒ_８はＨであり、Ｒ_９はＣＨ_３である）；
（ｂ）式IIIdの基（式中、Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｂｒ、ＮＯ_２およびＣＮから選択され、Ｒ_９は、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２およびＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮから選択されるか；またはＲ_８は１−プロピニルでありかつＲ_９はＣＨ_３である）；
（ｃ）式IIIfの基（式中、Ｒ_８はＨであり、Ｒ_９はＣＨ_３である）；
（ｄ）式IIIqの基（式中、Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル（メチルまたはエチルなど）およびＣ１−Ｃ６アルコキシ（ＯＣＨ_３など）から選択され、Ｒ_９はＣＨ_３である）；
Ｒ_２およびＲ_３は独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択されるか、または一緒になって、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、Ｎ１−メチルピペラジニウムおよびモルホリニウムから選択されるリングを形成し；
Ｒ_５は、以下から選択され：
（ａ）式IVaの基（式中、
^＊は結合点であり；
Ｒ_１１はＨであり；および
Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択される）；
（ｂ）式IVdの基（式中、
^＊は、結合点であり；
Ｒ_２１はＨであり；
Ｒ_２２およびＲ_２３は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択され；
Ｒ_２４およびＲ_２５は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択され；および
ＷはＮまたはＣ−Ｈである）；および
（ｃ）式IVfの基（式中、
^＊は結合点であり；
Ｒ_３１はＨであり；
Ｒ_３２およびＲ_３３は独立に、ＨまたはＦから選択され；
Ｒ_３４およびＲ_３５は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３から選択される；および
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｈである）；
Ｒ_６はＨであり；
Ｘは、任意の負荷電対イオンであり；
ｎ＝１または２である。

その他の好ましい実施形態では、Ｙは、Ｃ−Ｒ_７であり、ここで、Ｒ_７は、式VIbの基であり；
Ｚは、ＮまたはＣ−ＣＮであり；
Ｒ_１は、以下から選択され：
（ａ）式IIIcの基（式中、Ｒ_８はＨであり、Ｒ_９はＣＨ_３である）；
（ｂ）式IIIdの基（式中、Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｂｒ、ＮＯ_２およびＣＮから選択され、Ｒ_９は、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２およびＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮから選択されるか；または、Ｒ_８は、１−プロピニルであり、かつＲ_９はＣＨ_３である）；
（ｃ）式IIIfの基（式中、Ｒ_８はＨであり、Ｒ_９はＣＨ_３である）；および
（ｄ）式IIIqの基（式中、Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル（メチルまたはエチルなど）およびＣ１−Ｃ６アルコキシ（ＯＣＨ_３など）から選択され；Ｒ_９はＣＨ_３である）；
Ｒ_２およびＲ_３は独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択されるか、または一緒になって、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、Ｎ１−メチルピペラジニウムおよびモルホリニウムから選択されるリングを形成し；
Ｒ_５は、以下から選択され：
（ａ）式IVaの基（式中、
^＊は、式IIの化合物への結合点であり；
Ｒ_１１はＨであり；
Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択される）；
（ｂ）式IVdの基（式中、
^＊は、式IIの化合物への結合点であり；
Ｒ_２１はＨであり；および
Ｒ_２２およびＲ_２３は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択され；
Ｒ_２４およびＲ_２５は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択され；および
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｈである）；
（ｃ）式IVfの基（式中、
^＊は、式IIの化合物への結合点であり；
Ｒ_３１はＨであり；および
Ｒ_３２およびＲ_３３は独立に、ＨまたはＦから選択され；
Ｒ_３４およびＲ_３５は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３から選択され；および
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｈである）；
Ｒ_６はＨであり；
Ｘは、任意の負荷電対イオンであり；
ｎ＝１または２である。

式IIの好ましい化合物として以下が挙げられる：
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（４−ニトロベンジル）−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ニトロベンジル）−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１８）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−５−ニトロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１９）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２０）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２１）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２２）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（３−ニトロイミダゾ［１，２−ａ］ピリシン−２−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２２Ａ）
１−（（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−４−オキソ−２−ブテニル）−１−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］ピペリジニウムブロミド（２３）
４−（（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−４−オキソ−２−ブテニル）−４−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］モルホリン−４−イウムホルマート（２４）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２５）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２７Ａ）
（２Ｅ）−４−｛［４−（４−フルオロ−３−メトキシアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２７Ｂ）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４２）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４３）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−メトキシ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４４）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−エチニル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４５）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−｛［１−メチル−４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４６）
（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（３−アミノ−３−オキソプロピル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４７）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−シアノ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４８）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−シアノ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムトリフルオロアセタート（４８ＴＦ）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−｛［１−（２−シアノエチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４９）
（２Ｅ）−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５０）
（２Ｅ）−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５１）
（２Ｅ）−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ−［（２−メトキシ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５２）
（２Ｅ）−Ｎ−［（２−エチニル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５３）
（２Ｅ）−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−｛［１−メチル−４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５４）
（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（３−アミノ−３−オキソプロピル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５５）
（２Ｅ）−Ｎ−［（２−シアノ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５６）
（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（２−シアノエチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５７）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５８）
（２Ｅ）−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５９）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−メトキシ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６０）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−エチニル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６１）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−｛［１−メチル−４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６２）
（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（３−アミノ−３−オキソプロピル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６３）
（２Ｅ）−Ｎ−［（２−シアノ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６４）
（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（２−シアノエチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６５）
（２Ｅ）−４−（｛４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フラニルオキシ］−６−キナゾリニル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムトリフルオロアセタート（８２）
（２Ｅ）−４−（｛４−［３−クロロ−４−（２−ピリジニルメトキシ）アニリノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムトリフルオロアセタート（８３）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（８４）
２−（４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］エタンアンモニウムブロミド（１４０）
２−（４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェノキシ）−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアンモニウムブロミド（１４１）
４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝−１−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］ピリジニウムブロミド（１４２）
１−［２−（４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェノキシ）エチル］−１−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］ピペリジニウムブロミド（１４３）
Ｎ，Ｎ−ジエチル−２−［（｛５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル｝カルボニル）アミノ］−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］エタンアンモニウムトリフルオロアセタート（１４４）
Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジエチル−２−［（｛５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル｝カルボニル）アミノ］エタンアンモニウムブロミド（１４５）
４−（｛［４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−キナゾリニル］オキシ｝メチル）−１−メチル−１−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］ピペリジニウムトリフルオロアセタート（１４６）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−エチル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７２）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−｛［１−メチル−４−ニトロ−２−（１−プロピニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７３）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７４）
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（４−エチル−１−メチル−２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７５）および
（２Ｅ）−Ｎ−［（２−エチル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７６）。

上記の化合物の構造は、図４〜９、図１７および図１８に示されている。

本発明の特定の好ましい実施形態では、還元的に活性化されるフラグメント化部分（式IおよびIIの化合物中のＲ_１）は、以下の部分からなる群から選択される：

［式中、^＊は、四価窒素への結合点である］。

本発明の特定の好ましい実施形態では、キナーゼインヒビターは、以下の化合物に由来する基（radical）から選択される：

さらなる態様では、本発明は、治療における使用のための、式IおよびIIの化合物を含む上記で定義される本発明の化合物を提供する。

さらなる態様では、本発明は、式Iまたは式IIの化合物などの上記で定義される本発明の化合物を、１種以上の医薬上許容される賦形剤または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。

本発明はまた、ヒトを含めた哺乳類において、癌を含めた増殖性疾患を治療する際の使用のための、式Iまたは式IIの化合物などの上記で定義される本発明の化合物を、１種以上の医薬上許容される賦形剤または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。

一層さらなる態様では、本発明は、ヒトを含めた哺乳類において、癌などの増殖性疾患を治療する方法であって、哺乳類に、式Iまたは式IIの化合物などの、上記で定義される本発明の化合物の治療上有効な量を投与することを含む、方法を提供する。

一層さらなる態様では、本発明は、癌などの増殖性疾患を治療するための医薬の調製における、式Iまたは式IIの化合物などの、上記で定義される本発明の化合物の使用を提供する。

一層さらなる態様では、本発明は、癌などの増殖性疾患を治療するための、式Iまたは式IIの化合物などの、上記で定義される本発明の化合物の調製におけるキナーゼインヒビターの使用を提供する。

一実施形態では、キナーゼインヒビターは、上記で列挙されるキナーゼインヒビターから選択される。

特定の実施形態では、キナーゼインヒビターは、以下から選択される：
（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド（１１）
（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド（１６１）
（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝−２−ブテンアミド（１７０）および
（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］−２−ブテンアミド（１７１）。

さらに別の態様では、本発明は、以下から選択される、上記定義の本発明の化合物の調製における使用のためを含めて、キナーゼインヒビターを提供する。

（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド（１６１）
（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝−２−ブテンアミド（１７０）および
（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］−２−ブテンアミド（１７１）。

さらに別の態様では、本発明は、癌などの増殖性疾患を治療するための、式Iまたは式IIの化合物などの上記で定義される本発明の化合物の調製における、還元的に活性化されるフラグメント化芳香族ニトロヘテロ環または芳香族ニトロ炭素環の使用を提供する。

一実施形態では、ニトロヘテロ環またはニトロ炭素環は、上記で定義される式IIIdの部分である。

図１は、化合物１１、１６（キナーゼインヒビター）および２０（本発明のプロドラッグ化合物）についてのA431細胞自己リン酸化阻害を示す。図２は、A431異種移植片に対する化合物１９、２０および２１（本発明のプロドラッグ化合物）の有効性を示す。図３Ａは、A431異種移植片に対する化合物１１および２０の有効性を示す。図３Ｂは、化合物１１および２０で処理されたA431保有マウスの平均体重変化を示す。図４は、本発明の特定の化合物の構造を示す。図５は、本発明の特定の化合物の構造を示す。図６は、本発明の特定の化合物の構造を示す。図７は、本発明の特定の化合物の構造を示す。図８は、本発明の特定の化合物の構造を示す。図９は、本発明の特定の化合物の構造を示す。図１０は、化合物１１および１６〜２２（化合物１１および１６は、キナーゼインヒビターであり；化合物１７〜２２は、本発明のプロドラッグ化合物である）についてのA431細胞自己リン酸化阻害を示す。図１１は、A431、BT474、SKBR3、SKOV3およびSW620細胞における有酸素および低酸素条件下での化合物１１および２０の細胞増殖の阻害（ＩＣ_５０）を示す。図１２は、無細胞コントロールと比較した、A431およびSKOV3細胞が有酸素および低酸素条件下で１０μＭのプロドラッグ２０で処理される場合の、ＬＣＭＳによって検出されるインヒビター１１の時間依存性放出を示す。図１３は、雌A431腫瘍保有NIHIIIマウスが、q4dx3 MTDにおける各試験化合物の単回用量（ip）を投与される（それぞれ１３３および７５μｍｏｌ／ｋｇ）場合の、血漿およびA431腫瘍中の、化合物２０および化合物１１（投薬化合物２０に由来し、および、直接的に投薬された場合）の、時間の関数としての濃度である。図１４は、SKOV3異種移植片に対する化合物１１および２０の有効性を示す。図１５は、化合物１１および２０で処理されたSKOV3保有マウスの平均体重変化を示す。図１６は、インビトロでのA431細胞におけるプロドラッグ２０およびエフェクタ１１による細胞HER1（erbB1，EGFR）およびErk1/2リン酸化の用量依存性阻害を示す。図１７は、本発明の特定の化合物の構造を示す。図１８は、本発明の特定の化合物の構造を示す。図１９は、既知可逆性および不可逆性のerbB1インヒビター、エルロチニブおよびBIBW-2992それぞれに対する、本発明の化合物１６１および４２についてのA431細胞erbB1自己リン酸化阻害を示す。図２０は、q3dx4スケジュールでのそのそれぞれのＭＴＤでテストされた場合の、H1975異種移植片に対する、本発明の化合物４２、５０および５８の有効性を示す。図２１は、SKOV3異種移植片に対する、本発明の化合物１６１および４２の有効性を示す。図２２は、NIHIIIヌードマウスにおいて増殖したH1975腫瘍異種移植片に対する、化合物４２および１６１の有効性を示す。図２３は、NIHIIIヌードマウスにおいて増殖した大きなH1975腫瘍異種移植片に対する、プロドラッグ４２の有効性を示す。図２４は、NIHIIIヌードマウスにおいて増殖した大きなA431腫瘍異種移植片に対する、プロドラッグ４２の有効性を示す。図２５は、雌A431腫瘍保有NIHIIIマウスが、q3dx4 MTDの約７５％（それぞれ、１００および３１．６μｍｏｌ／ｋｇ）で各試験化合物の単回用量（ip）を投与された場合の、血漿およびA431腫瘍中の化合物４２および化合物１６１（投薬化合物４２に由来し、かつ、直接投薬された場合）の、時間の関数としての濃度を示す。

（定義）
本明細書において用いられる場合、用語「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」および「アルコキシ」は、特に断りのない限り、直鎖および分枝鎖基並びに無置換および置換基の両方を含む。任意選択の置換基は、制限するものではないが、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２、ＣＯＮＨ_２、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＳＯ_２ＮＨ_２およびＳＯ_２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）を含み得る。

本明細書において用いられる場合、用語「四級化可能な窒素」は、特に断りのない限り、求電子性基（例えば、α−メチルハリド／メシラート／トシラートまたはトリフラート）と反応して窒素の四級アンモニウム塩を提供する十分な塩基性（または求核性）の完全に置換された窒素を意味する。

本明細書において用いられる場合、用語「芳香族ニトロヘテロ環」は、任意のリング位置で１個以上のニトロ（ＮＯ_２）基によって置換された芳香族ヘテロ環部分を意味する。芳香族ヘテロ環部分は、４〜１２個の原子を含有し、そのうち少なくとも１個の原子が、窒素、硫黄または酸素から選択される単環式または二環式のリングであり得る。芳香族ヘテロ環部分は、連結された炭素または窒素であり得る。芳香族ヘテロ環部分は、さらに、１個以上のさらなる置換基によって任意の空いているリング炭素またはヘテロ原子において置換され得る。置換基は、式IIIにおいてＲ_８について定義される基を含み得るが、それらに限定されない。

本明細書において用いられる場合、用語「芳香族ニトロ炭素環」は、任意の位置で１個以上のニトロ（ＮＯ_２）基によって置換されたベンゼン部分を意味する。さらに、２個の隣接するリング炭素原子は、場合により連結して、縮合炭素環式リングまたはヘテロ環式リングを形成してもよい。ベンゼン部分（および場合による縮合環）は、１個以上のさらなる置換基によって任意の空いている炭素またはヘテロ原子においてさらに置換されてもよい。置換基は、式IIIにおいてＲ_８について定義される基を含み得るが、それらに限定されない。

本明細書において用いられる場合、用語「システイン捕捉官能基（cysteine trapping functionality）」は、タンパク質の対を形成していないシステイン残基と共有結合的に反応するのに十分な反応性の求電子性基を意味する。

（詳細な説明）
上記で定義されるように、大まかには、本発明は、キナーゼ活性のインヒビターである化合物、特に、このような阻害が治療目的のためである化合物に関する。キナーゼ阻害は、例えば、増殖性疾患または障害の治療において有用であり得る。これによって、本発明の化合物は、抗癌剤として、特に、ターゲッティングされる抗癌剤として有用となる。

一形態では、本発明の化合物は、キナーゼインヒビターと、正電荷を有する化合物により還元されるとフラグメント化する（還元的トリガー）、芳香族ニトロヘテロ環またはニトロ炭素環とを含む。化合物の正電荷は、重要な利点を、特に、癌の治療において有し、このことは、以下に記載されることになる。

トリガーを還元するのに必要な還元性等価物は、酵素、放射線誘導性ラジカルまたは化学的還元剤によって提供され得る。放射線は、例えば、トリガーを還元する際およびキナーゼインヒビターの放出を単数または複数の腫瘍が存在する領域へターゲッティングする際の両方において特に有効であり得る。しかしながら、現在、還元が酸素の存在下で抑制されるよう、トリガーが腫瘍内に存在する内因性酵素（特に、内因性一電子還元酵素）によって還元されることが好ましい。一電子還元酵素によるこの好ましい還元は、キナーゼインヒビターの、腫瘍内の低酸素症の領域への放出を効果的にターゲッティングする。したがって、この形態では、化合物は、プロドラッグであり、このものは、腫瘍関連環境（「還元的活性化」とも呼ばれる）内での還元の際に、キナーゼインヒビターを放出して、抗癌作用を生じさせる。

キナーゼインヒビターは、ひとたび、還元的トリガーから放出されるとキナーゼインヒビターとしての活性を有するあらゆる分子または構造であり得る。通常、インヒビターは、無傷または実質的に無傷のキナーゼインヒビターであり、これに、トリガーが結合されるか機能的に連結され、無傷のキナーゼインヒビターは、還元の際に放出される。

キナーゼインヒビターは、可逆性であっても、不可逆性であってもよい。しかしながら、本明細書における化合物における還元的トリガーとの組合せには、不可逆性インヒビターが好ましい。最も好ましいのは、不可逆性erB1, 2, 4キナーゼインヒビター、特に、ＡＴＰ競争性の不可逆性erb1, 2, 4キナーゼのインヒビターであり、このものは、腫瘍細胞の生存、増殖、転移および治療抵抗性に関与しているシグナル伝達経路を阻害する。これらのインヒビターは、塩基性第三アミン部分を必要とする。第三アミン部分は、システイン捕捉官能基と極めて接近することになる。これは、例えばerbB−インヒビターＢを有するエポキシドであり得る（Carmi,C et al., J. Med. Chem. 2010, ASAP Online, DOI:10:1021/jm901558p）。より好ましくは、システイン捕捉官能基は、マイケル受容基である。このような実施形態では、マイケル受容基は、二重または三重結合のいずれかを含有し得る。アミンは、erbB1、2および4のＡＴＰ−結合ドメインの口部のシステイン残基とマイケル受容基との間の反応の塩基触媒作用を提供し、キナーゼターゲットの不可逆性阻害をもたらす。キナーゼ−不活性のerbB3を通じた細胞シグナリングの阻害は、そのヘテロ二量体化パートナーの阻害を介してこのような化合物によって達成され、その結果、事実上、全erbBファミリー（erbB1-4）を通じた細胞シグナリングは、これらの化合物によって阻害される。

上記のように、プロドラッグの還元的トリガーは、還元時にフラグメント化を受ける芳香族ニトロヘテロ環またはニトロ炭素環である。このニトロヘテロ環またはニトロ炭素環ユニットは、好ましくは、四級化可能な窒素を介して、例えば、環外メチレンリンカーを通じてキナーゼインヒビターと連結して、四価窒素を形成し、それにより、正電荷を作り出す。還元的条件下でのトリガーのフラグメント化は、活性なキナーゼインヒビターを放出し、トリガーが連結する窒素は、放出されるキナーゼインヒビターの一部のままである。

内因性還元酵素による活性化のために、還元的トリガーのフラグメント化が、酸素によって効果的に抑制されるという必要条件が重要である。トリガーのフラグメント化は、内因性一電子還元酵素によって一電子還元レベルで生じる。酸素による効果的なフラグメント化の抑制は、酸素による一電子ラジカルの再酸化を通じて、またはプロドラッグ還元に必要な中間体を還元することによる酸化を通じて生じ得る。後者は、例えば、水和電子などの放射線誘導還元性ラジカルの酸素によるスカベンジング、またはレダクターゼ酵素の触媒サイクルにおける還元性中間体の酸化を含むだろう。しかし、メカニズムが何であれ、酸素抑制効果が結果である。

このような抑制は、プロドラッグの選択的ターゲッティングにとって重要である。腫瘍関連環境は、通常、低酸素性となる。理論に拘束されることを望まないが、低酸素性組織へのインヒビターの放出および腫瘍の酸素化領域へのインヒビターのその後の逆拡散（back-diffusion）の制限が、内因性酵素を介した腫瘍選択性の主な根拠であると信じられる。キナーゼインヒビターの腫瘍への放出のこのターゲッティングはまた、このようなインヒビター、特に、広範囲のキナーゼ−受容体結合ターゲットを有する不可逆性erbB1、2、4インヒビターの治療機会を広げることにおいて有益である。

好ましいトリガーとして、式III：

［式中、
^＊は、結合点であり；
Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＳＯ_２ＮＨ_２、ＳＯ_２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＳＯ_２Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２、ＳＯ_２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）および式VIaの基（上記で定義される通りであるが、^＊が式IIIの基への結合点である）から選択され；
Ｒ_９は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよび式VIaの基（上記で定義される通りであるが、^＊が式IIIの基への結合点である）からなる群から選択され；
Ｒ_１０は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択される］
のものが挙げられる。

現在最も好ましいトリガーは、以下の式：

［式中、^＊は、結合点であり、Ｒ_８は、ＨおよびＣ１−Ｃ３アルキルから選択され、Ｒ_９は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは、Ｃ１−Ｃ３アルキルから選択される］
のものである。

複数のこれらのトリガーは、以下の部分：

からなる群に含まれる。

正電荷および上記のように選択されたトリガーを有することに加え、プロドラッグは、ＮＨＥに対して−０．２〜−０．６Ｖの一電子還元電位（Ｅ（１））を有することがさらに好ましい。Ｅ（１）値は、低酸素性条件下での還元のために本発明の化合物を最適化することにおいて役に立つ。より好ましくは、Ｅ（１）値は、ＮＨＥに対して、−０．３〜−０．５Ｖ、さらにより好ましくは−０．３５〜−０．４５Ｖ、最も好ましくは−０．４〜−０．４５Ｖである。化合物のＥ（１）は、MeiselおよびCzapskiによって記載されたように決定され得る（J. Phys. Chem., 1975, 79, 1503〜1509）。

プロドラッグが一電子還元下でフラグメント化して、キナーゼインヒビターを放出する速度に関して特定の判定基準を本発明のプロドラッグが満たすことも好ましい。これらの速度（フラグメント化速度定数として表される）は、１〜４０００ｓ^−１であり得、１〜３０００ｓ^−１、１〜１５００ｓ^−１、２〜５００ｓ^−１、２〜３００ｓ^−１、２〜６０ｓ^−１および２０〜６０ｓ^−１の間の範囲が代表的であるが、より速いまたは遅い本発明のプロドラッグのフラグメント化が望ましいと見なされるかどうかに応じて変わる。

一電子還元されたプロドラッグのフラグメント化の速度定数ｋｆｒａｇは、パルス放射線分解を用いて測定され得、ベンジルタイプのラジカルの吸収スペクトルの形成が観察される［Anderson, R. F. et al,. J. Phys. Chem A, 101:9704〜9769,1997］。

特に好ましい実施形態では、プロドラッグを構成するトリガー／キナーゼインヒビターの組合せは、組合せにおける特定の判定基準に一致するよう選択され得る。例えば、トリガー／キナーゼインヒビターの組合せは、Ｅ（１）値：−０．２〜−０．６Ｖおよび一電子還元についてのフラグメント化速度定数：１〜４０００ｓ^−１、Ｅ（１）値：−０．３〜−０．５Ｖおよび一電子還元についてのフラグメント化速度定数：１〜３０００ｓ^−１（好ましくは１〜１５００ｓ^−１）、Ｅ（１）値：−０．３５〜−０．４５Ｖおよび一電子還元についてのフラグメント化速度定数：２〜５００ｓ^−１、１０〜３００ｓ^−１または２０〜６０ｓ^−１、およびＥ（１）値：−０．４〜−０．４５Ｖおよび一電子還元についてのフラグメント化速度定数：２０〜６０ｓ^−１（好ましくは４０〜５５ｓ^−１）を有するよう選択され得る。

全般的に、フラグメント化還元活性化トリガーおよびキナーゼインヒビターの組合せによって形成される本発明のプロドラッグは、本出願者によって、それらをターゲッティングされる抗癌剤として特に適しているものにする、多くの驚くべき特性を有するように決定されてきた。これらの特性のうち一番に挙げられるのは、それらのターゲッティングされる有効性である。本出願人は、当該技術において既に一般に知られている多数の還元的トリガー、例えば、カルバミン酸ニトロベンジル（Hay et al. J. Med. Chem, 2003, 46, 2456-2466； Sykes et al., J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1, 2000, 10, 1601-1608； Hay et al., J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1, 1999, 2759-2770）、カルバミン酸ニトロアリールメチル（Hay et al., Tetrahedron, 2000, 56, 645-657； Hay et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 2237-2242； Davis et al., ＰＣＴ国際出願WO 2006032921）、５−ニトロフラン−２−イルメチリデンエーテル（Mahmud et al., Anticancer Drug Des, 1998, 13, 655-662）、ニトロベンジルチオエーテル（Thomson et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2007, 17, 4320-4322）、ニトロチエニルプロパ−２−イルエーテル（Thomson et al., Mol. Cancer. Ther., 2006, 5(11), 2886-2894）および２−アリール−６−メチル−５−ニトロキノリンエーテル（Couch et al., Tetrahedron, 2008, 64, 2816-2823）を超越して、最初に、プロドラッグのターゲッティングされた腫瘍の隣接領域へ安全に送達し、次いで、治療的抗腫瘍作用を有するように支配的な腫瘍関連条件下にフラグメント化して細胞毒性エフェクタを放出することを可能にするのは、特に、上記定義のトリガーおよび好ましい四級塩であることを決定した。安定性を欠き、腫瘍領域に送達する前に活性化されるか、または、エフェクタを効果的に放出せず、腫瘍への細胞毒性の影響が大きく低減したかのいずれかの他の還元的トリガーとのよい対照をなす。これは、本発明に根拠を与える驚くべき有効性である。

還元的トリガーがキナーゼインヒビターと四級窒素塩としてカップリングされる場合（好ましい場合）に、本発明のプロドラッグのこの能力は、特に驚くべきものである。アルキル化剤メクロレタミンの還元的プロドラッグとしての一連のニトロアリールメチル四級塩の合成および評価は、Tercel,M.et al., J. Med. Chem. 2001, 44, 3511〜3522に報告された。著者は、一連のこのようなプロドラッグ化合物にわたる高度に可変性の毒性を報告した。腫瘍選択的細胞毒性活性の点で最も有望な化合物に関してでさえ、活性が、予測不可能な宿主毒性を伴うことが報告された。結論は、ニトロアリールメチル四級塩は、「生体還元性薬剤として役に立つメクロレタミンの非特異的放出に関してあまりにも不安定である」ということであった（３５１７頁参照のこと）。

定義されたＥ（１）および定義されたフラグメント化速度定数を有するプロドラッグの好ましい選択はまた、以下に記載されるように、低酸素下での効率的な一電子還元および一過性の移動する腫瘍内低酸素のターゲッティングの両方を補助するという点で、利点を提供する。

（本発明の四価窒素塩プロドラッグの調製）
本発明の式Iおよび式IIのプロドラッグ化合物は、ニトロヘテロ環還元的トリガーと連結しているエフェクタ部分を含む。

エフェクタ部分は、可逆性または不可逆性のキナーゼインヒビターであり得る。それは、ＡＴＰ−結合ドメイン中、キナーゼ基質結合ドメイン中、またはアロステリック結合部位中に結合することによってキナーゼを阻害し得る。不可逆性インヒビター、特に、不可逆性erbB1、2、4キナーゼインヒビターが好ましい。

その他のクラスのキナーゼインヒビターの例として、PDGFRα、PDGFRβ、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、ABL、KIT、AKT1、AKT2、AKT3、p70 S6K、MEK、c-MET、JAK2、JAK3、SRC、LCK、p38 MAPK、CHK1、CHK2、FGFR、DNA-PK、ATM、ATR、AuroraA、AuroraB、P13Kファミリーアイソフォームp110α、β、δ、γおよびmTORのインヒビターが挙げられる。

本発明において有用なキナーゼインヒビターの具体的な例として、AST-487、CHIR-258、イマチニブ、VX-680、LY-333531、MLN-518、SU-14813、スニチニブ、PI-103、ZD6474、ソラフェニブ、ダサチニブ、PD 166285、PD 166285類似物A、PD 166285類似物B、AEE788、Ｎ−メチルスタウロスポリン、BIBW2992、HKI272、EKB569、ゲフィチニブ、バルガテフ（Vargatef）、セジラニブ、ボスチニブ、AZD0530、BIRB796、PHA-665752、10-DEBC、GDC-0941、MK-2206類似物、マシチニブ（Masitinib）、SU11274、XL880、XL184、ZM39923、AZD1152、ダヌセルチブ（Danusertib）、ZM447439およびPKI-587が挙げられる。

最も好ましい不可逆性erbB1、2、4キナーゼインヒビターは、６位にアミドマイケル受容基を有し、システイン捕捉官能基を提供する。これらのインヒビターに関して、マイケル受容基は、二重または三重結合のいずれかを特徴とし得、以下に示される、第三アミンで終結する可変長のメチレン鎖によりβ炭素で置換され得る。

当然のことではあるが、式VII中に示されていないエフェクタ部分の残部は、式IIに定義される二環式芳香族リング構造を有する。

大まかに言えば、式Iおよび式IIの好ましいプロドラッグ化合物は、ニトロヘテロ環還元的トリガー部分を用いて脂肪族第三アミンまたは芳香族ヘテロ環式アミンエフェクタ部分を四級化することによって調製され得る。式Iおよび式IIの化合物を調製する方法は、以下に、より詳細に記載される。

（不可逆性erbB1、2、4キナーゼインヒビターの調製）
式VIIのエフェクタ化合物であって、上記に示され、ＹおよびＺが、同時に両方ともＮではなく、マイケル受容基が二重結合を含有するものは公知であり、当技術分野において記載される方法に従って調製され得る。例えば、このような化合物およびその調製方法は、Tsou et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 2719〜2734、Wissner et al., J. Med. Chem., 2003, 46, 49〜63、Wissner et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 14, 1411〜1416、Tsou et al., J. Med. Chem., 2005, 48, 1107〜1131、Klutchko et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 1475〜1485、米国特許第6,251,912号（Wissner et al）、米国特許出願2002/0173509（Himmelsbach et al）、米国特許第7,019,012号（Himmelsbach et al）、米国特許出願第2005/0250761号（Fakhoury et al）、米国特許第6,288,082号（Wissner et al）、米国特許第6,297,258号（Wissner et al）、米国特許第7,399,865号（Wissner et al）、米国特許第6,355,636号（Wissner et al）、米国特許第6,602,863号（Bridges et al）に記載されている。

また、例として、以下に示される化合物１１、１２および１３は、Tsou et al., J. Med. Chem. 2001; 44: 2719〜34に開示される方法によって調製され得る。

下記スキーム１は、Tsou et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 2719〜2734の方法に基づく、６−ニトロ−４（３Ｈ）−キナゾリノン（６６）（Morley et al.,J. Chem. Soc., 1948, 360〜366）からの、本発明における使用に適したキナゾリンエフェクタ化合物の調製を説明する。

下記スキーム２は、Tsou et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 2719〜2734およびSmaill et al., J. Med. Chem., 2000, 43, 1380〜1397の方法に基づく、７−フルオロ−６−ニトロ−４（３Ｈ）−キナゾリノン（７２）（Rewcastle et al., J Med Chem, 1996, 39, 918〜928）からの、本発明における使用に適した７−アルコキシキナゾリンエフェクタ化合物の調製を説明する。

下記スキーム３は、Wissner et al., J. Med. Chem., 2003, 46, 49〜63によって報告された方法に基づく、７−アルコキシ−４−クロロ−６−ニトロ−３−キノリンカルボニトリル（７８）からの、本発明における使用に適した７−アルコキシキノリンカルボニトリルエフェクタ化合物の調製を説明する。

下記スキーム４は、Wissner et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 14, 1411〜1416によって報告された方法に基づく、４−クロロ−６−フルオロ［１，７］ナフチリジン−３−カルボニトリル（８３）からの、本発明における使用に適した４−アニリノ−［１，７］ナフチリジン−３−カルボニトリルエフェクタ化合物の調製を説明する。

下記スキーム５は、Rewcastle et al., J. Chem. Soc., Perkins. Trans. 1, 1996, 2221〜2226;Smaill et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 1803〜1815;Klutchko et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 1475〜1485;Soyka et al., US 2005/0085495 A1およびTsou et al.,J. Med. Chem.,2001,44,2719〜2734の方法を用いる、市販の６−フルオロ−３−ピリジンアミン（８９）から、既知の中間体６−フルオロピリド［３，４−ｄ］ピリミジノン（９３）（Rewcastle et al., J. Chem. Soc., Perkins. Trans. 1, 1996, 2221〜2226）を通じて進行する、本発明における使用に適した４−アニリノピリド［３，４−ｄ］ピリミジンエフェクタ化合物の調製を説明する。

上記スキーム１〜５は、Ｒ_５が式IVaのものであるように選択される場合の合成ルートの例を表す。Tsou et al., J. Med. Chem., 2005, 48, 1107〜1131によってキノリンカルボニトリルエフェクタ化合物について証明されているように、上記ルートは、Ｒ_５が式IVb〜IVgから選択される場合に同様に適用され得ることが理解されるだろう。

下記スキーム６は、本発明における使用に適した２つの特定のエフェクタ化合物の調製を説明する。化合物１４および１６は、既知の６−アミノ誘導体８（Bridges et al.,J. Med. Chem., 1996, 39, 267〜276）および１０（Rewcastle et al., J. Med. Chem., 1995, 38, 3482〜3487）と、（２Ｅ）−４−ブロモ−２−ブテノイルクロリドまたは４−クロロブタノイルクロリドのいずれかとの反応、続く、得られたアルキルハリドとジメチルアミン水溶液との反応によって調製され得る。

化合物１６１、１７０および１７１は、下記スキーム７によって調製され得る：

（プロドラッグの調製）
式Iのプロドラッグ化合物は、一般的には、脂肪族第三級アミンまたは芳香族ヘテロ環式アミンを含むキナーゼインヒビターを適当なニトロヘテロ環式またはニトロ炭素環式のα−メチルハリド／メシラート／トシラートと、適切な溶媒中で適切な時間にわたって（例えば、テトラヒドロフラン中で約２４時間にわたって）反応させ、式Iの四価窒素塩を生じさせることによって調製され得る。

式IIのプロドラッグ化合物は、一般的には、上記定義の式VIIのエフェクタ化合物を適当なニトロヘテロ環式またはニトロ炭素環式のα−メチルハリド／メシラート／トシラートと、適切な溶媒中で適切な時間長にわたって（例えば、テトラヒドロフラン中で約２４時間にわたって）反応させ、式IIの四級アンモニウム塩を生じさせることによって調製され得る。

本発明のプロドラッグにおける使用に適した、好ましい還元的トリガー部分は、下記の式IIIのものである：

［式中、^＊、Ｒ_８、Ｒ_９およびＲ_１０は、前に定義したとおりである］。

特に好ましいトリガーは、以下の通りである：

上記のIIIc-1およびIIId-1のα−メチルハリドは公知である（ブロミド；Stribbling et al., ＰＣＴ国際特許公報WO2008/039087）；（クロリド；Tercel et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 3511〜3522；Jentzer et al., Eur. J. Med. Chem., 1991; 26, 687〜697）あるが、これは、上記IIIq-1およびIIIq-2のα−メチルブロミドも同様である（それぞれ、Everett et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 1267〜1272およびJiao et al., WO2008151253 A1）。

下記スキーム８は、市販の出発材料からの、既知のα−メチルブロミド（１０５）への３つの代替ルートを説明する。

下記スキーム９は、市販の出発材料からの、新規なα−メチルブロミド１１５および１１６への２つの代替ルートを説明する。

下記スキーム１０は、市販の出発材料からの、新規なα−メチルブロミド１２２へのルートを説明する。

下記スキーム１１は、市販の出発材料からの新規なα−メチルブロミド１２５へのルートおよび２−ブロモイミダゾール１５３（下記）からの新規なα−メチルブロミド１２７および１３０へのルートを説明する。

下記スキーム１２は、市販の出発材料または２−ブロモイミダゾール誘導体１２３または１５４（下記）からの、新規なα−メチルブロミド１３６へのルートを説明する。

下記スキーム１３は、２−ブロモイミダゾール中間体１２３および１４９（下記）それぞれからの、調製トリガー１７８、１８０、１８３、１８５および１８８へのルートを説明する。

下記スキーム１４は、脂肪族第三級アミンまたは芳香族ヘテロ環式アミンを含むキナーゼインヒビターを適当なニトロヘテロ環式α−メチルハリド／メシラート／トシラートと、適切な溶媒中で適切な時間長にわたって（例えば、テトラヒドロフラン中約２４時間にわたって）反応させることによる、式Iおよび式IIの四価窒素塩化合物へのルートを説明する。

下記スキーム１５は、本発明による式IIの多くのプロドラッグ化合物の調製を説明する。

本発明の四級アンモニウム塩プロドラッグの合成は、下記スキーム１５に示されるように行われた。（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（１１）（Tsouet al., J. Med. Chem., 2001; 44: 2719〜34）は、適当なニトロヘテロ環式α−メチルハリドと、典型的にはテトラヒドロフラン中２４時間にわたって反応させられて、四級アンモニウム塩（１７−２２）が、微細沈殿物として提供され、この沈殿物は、ろ過によって集められ、テトラヒドロフランおよびジエチルエーテルにより洗浄される。同様に、化合物１２〜１４および１６は、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（Stribbling et al., ＰＣＴ国際特許公報WO2008/039087）と反応させられて、それぞれ四級アンモニウム塩プロドラッグ２３〜２５および２７が与えられる。必要なニトロヘテロ環式α−メチルハリド、２−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾールおよび５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾールは、それぞれ、既知クロロメチルイミダゾール（Jentzer et al., Eur. J. Med. Chem. 1991; 26: 687〜697）およびクロロメチルピラゾール（Tercel et al., J. Med. Chem. 2001; 44: 3511〜22）前駆体のＬｉＢｒ媒介ブロミド交換によって調製された。立体障害型の、反応がより遅いピペリジンおよびモルホリン含有誘導体（１２および１３）の四級化は、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（N-methyl-2-pyrolidinone：ＮＭＰ）中で行われ、それぞれ、化合物２３および２４が与えられた。

下記スキーム１６〜１９は、本発明による複数のプロドラッグ化合物の調製を説明する。

本発明は、下記の限定されない実験セクションＡおよびＢを参照することによってよりよく理解されることになる。

（実験）
（セクションＡ）
（Ａ．１合成）
（Ａ．１．１化学合成）
燃焼分析は、Microchemical Laboratory, University of Otago, Dunedin, NZで行われた。融点は、いずれも、Electrothermal Model 9200を使用して測定され、読み取りのとおりである。^１ＨＮＭＲスペクトルは、いずれも、Bruker Avance-400分光計において測定され、Ｍｅ_４Ｓｉが基準とされた。高分解能マススペクトルは、公称５０００の分解能のVarian VG-70SE分光計で記録された。質量分析は、ThermoFinnigan MSQシングル四重極型質量分析計において行われた。質量検出は、ＡＰＣＩ源を用い、正負イオン同時捕捉を使用して行われた。特に断りのない限り、化合物は、指示された溶出剤を使用する、シリカゲル６０担体（support）（Scharlau, 230-400メッシュＡＳＴＭ）によるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製された。

（Ａ．１．１．１一般的手順Ａ：キナーゼインヒビターエフェクタの合成）
Ｎ^４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−４，６−キナゾリンジアミン（８）（４．０ｇ，１２．５ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）中の攪拌溶液に、窒素下で、トリエチルアミン（１９ｍｍｏｌ）、続いて、新たに調製した、無水テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の（２Ｅ）−４−ブロモ−２−ブテノイルクロリド（１５ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、得られた溶液を、室温で２時間にわたって攪拌し、減圧下に濃縮した。ジクロロメタンからの粉砕（trituration）によって、粗（２Ｅ）−４−ブロモ−Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−キナゾリニル］−２−ブテナミド（４．６ｇ）を得、これをそのまま使用した。

上の粗（２Ｅ）−４−ブロモ−Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−キナゾリニル］−２−ブテナミド（１．０ｇ，２．１５ｍｍｏｌ）のジメチルアセトアミド（３５ｍＬ）中の攪拌溶液に、０℃で、過剰のジメチルアミン水溶液（４０％，５ｍＬ）を加えた。３時間後、反応物を、食塩水で希釈し、酢酸エチルで抽出した（３回）。合わせた有機抽出物を食塩水で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下に濃縮した。次いで、ジクロロメタン／メタノール（５：９５から１５：８５）を用いて溶出するシリカゲルによるクロマトグラフィーによって、（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（１４）（０．７４ｇ，８０％）を、白色の固体として得た。

m.p.(MeOH)179〜181℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 9.78 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.13 (dd, J=2.6, 6.9Hz, 1H), 7.83-7.79(m, 1H), 7.42(dd, J=9.1Hz, J_H-F=9.1Hz, 1H), 7.29(s, 1H), 6.80(td, J=6.0, 15.4Hz, 1H), 6.58(d, J=15.4Hz, 1H), 4.01(s, 3H), 3.08(d, J=6.0Hz, 2H), 2.19(s, 6H).分析値：C, 56.32;H, 5.14;N, 15.73. C₂₁H₂₁ClFN₅O₂.H₂O理論値：C, 56.32;H, 5.18;N, 15.64.

Ｎ^４−（３−ブロモフェニル）−４，６−キナゾリンジアミン（１０）（１．７６ｇ，５．５８ｍｍｏｌ）を、４−クロロブタノイルクロリド（０．７５ｍＬ，６．７０ｍｍｏｌ）、次いで、ジメチルアミン水溶液と、（第一工程をジオキサン中で行い、第二工程を５０℃で２４時間にわたって行うことを除き）一般手順Ａに従って反応させることにより、Ｎ−［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）ブタンアミド（１６）（３６％）を、白色の固体として得た。

m.p.(MeOH)180〜182℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 10.23 (s, 1H), 9.87(s, 1H), 8.72(d, J=2.0Hz, 1H), 8.57(s, 1H), 8.17(dd, J=1.9, 1.9Hz, 1H), 7.88-7.84(m, 2H), 7.77(d, J=8.9Hz, 1H), 7.37-7.27(m, 2H), 2.43(t, J=7.2Hz, 2H), 2.29(t, J=7.2Hz, 2H), 2.16(s, 6H), 1.78(quintet, J=7.2Hz, 2H).分析値:C, 55.46;H, 5.33;N, 15.96. C₂₀H₂₂BrN₅O.¹/₄H₂O理論値:C, 55.50;H, 5.24;N, 16.18.
（Ａ．１．１．２一般的手順Ｂ：ＬｉＢｒ媒介によるハリド交換（スキーム８、経路２について）
２−（クロロメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（４８５ｍｇ，２．７６ｍｍｏｌ）およびＬｉＢｒ（４．８０ｇ，５５．２ｍｍｏｌ）のアセトン中の混合物を５時間にわたって還流加熱した後、溶媒を全て減圧下で除去した。残渣を酢酸エチルと水とで分液した。水相を酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機相を食塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、真空で濃縮した。粗生成物をＤＣＭ／ヘキサンから再結晶化させ、２−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（５７６ｍｇ，９５％）を、灰白色の固体として得た。

m.p.130〜132℃。¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ 7.74 (s, 1H), 4.50(s, 2H), 3.83(s, 3H).分析値:C, 27.81;H, 3.27;N, 19.05. C₅H₆BrN₃O₂.0.04ヘキサン理論値:C, 28.16;H, 2.96;N, 18.80.HRMS (FAB+)実測値:219.97220, 221.97018 (M+1),C₅H₇ ^79/81BrN₃O₂の計算値: 219.97216, 221.97012.
５−（クロロメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール（８０ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）をＬｉＢｒと、一般手順Ｂに従って反応させることによって、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール（７０ｍｇ，７０％）を、白色の結晶固体として得た。

m.p.71〜73℃。¹H NMR (CDCl₃, 400MHz) δ 8.08(s, 1H), 4.82(s, 2H), 3.95(s, 3H).分析値:C, 27.76;H, 3.08;N, 18.99. C₅H₆BrN₃O₂.0.02ヘキサン理論値:C, 27.73;H, 2.86;N, 18.95.HRMS (FAB+)実測値: 219.97223, 221.97012(M+1), C₅H₇ ^79/81BrN₃O₂の計算値: 219.97216, 221.97012.
（Ａ．１．１．３一般的手順Ｃ：四級アンモニウム塩プロドラッグの調製）
（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（１１）（１５０ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）中の攪拌溶液に、窒素下で、４−ニトロベンジルブロミド（８４ｍｇ，１．１モル当量，０．３９ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、得られた溶液を、室温で２４時間にわたって攪拌し、白色の沈殿物を得、この沈殿物を、ろ過により集め、無水テトラヒドロフランおよびジエチルエーテルで洗浄し、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（４−ニトロベンジル）−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７）（１０１ｍｇ，４５％）を得た。

m.p.178〜181℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 10.75(s, 1H), 9.93 (s, 1H), 8.77(s, 1H), 8.61(s, 1H), 8.39(d, J=8.7Hz, 2H), 8.18(br s, 1H), 8.04(d, J=9.0Hz, 1H), 7.93-7.83(m, 4H), 7.38-7.29(m, 2H), 7.04(td, J=7.3, 15.2Hz, 1H), 6.68(d, J=15.2Hz, 1H), 4.78(s, 2H), 4.30(d, J=7.3Hz, 2H), 3.07(s, 6H).分析値:C, 50.02;H, 4.30;N, 12.75. C₂₇H₂₆Br₂N₆O₃.¹/₄H₂O理論値:C, 50.14;H, 4.13;N, 12.99.
１１（２００ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）を、２−ニトロベンジルブロミド（１１１ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ）と一般手順Ｃに従って反応させることにより、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ニトロベンジル）−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１８）（２２１ｍｇ，７３％）を得た。

m.p.166〜169℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 10.76(s, 1H), 9.94(s, 1H), 8.80(s, 1H), 8.61(s, 1H), 8.22-8.17(m, 2H), 8.04(d, J=9.0Hz, 1H), 7.95-7.82(m, 5H), 7.37-7.28(m, 2H), 7.01(td, J=7.3, 15.2Hz, 1H), 6.71(d, J=15.2Hz, 1H), 5.01(s, 2H), 4.38(d, J=7.3Hz, 2H), 3.04(s, 6H).分析値:C, 50.66;H, 4.29;N, 12.88. C₂₇H₂₆Br₂N₆O₃理論値:C, 50.49;H, 4.08;N, 13.08.
１１（２００ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）を、２−（ブロモメチル）−１−メチル−５−ニトロ−１Ｈ−ピロール（１２３ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）と一般手順Ｃに従って反応させることにより、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−５−ニトロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１９）（２０７ｍｇ，６８％）を得た。

m.p.164〜168℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 10.74(s, 1H), 9.93 (s, 1H), 8.77(s, 1H), 8.61(s, 1H), 8.18(br s, 1H), 8.03(d, J=8.9Hz, 1H), 7.88-7.82(m, 2H), 7.37-7.28(m, 3H), 6.99(td, J=7.3, 15.2Hz, 1H), 6.71-6.65(m, 2H), 4.84(s, 2H), 4.33(d, J=7.3Hz, 2H), 4.01(s, 3H), 3.08(s, 6H).分析値:C, 48.34;H, 4.68;N, 14.19. C₂₆H₂₇Br₂N₇O₃.¹/₄THF.¹/₂H₂O理論値:C, 48.23;H, 4.50;N, 14.58.
１１（１２９ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（７０ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）と一般手順Ｃに従って反応させることにより、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２０）（１３９ｍｇ，７２％）を得た。

m.p.163〜167℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 10.75(s, 1H), 9.96(s, 1H), 8.81(s, 1H), 8.61(s, 1H), 8.17(br s, 1H), 8.15(s, 1H), 7.99(d, J=9.0Hz, 1H), 7.88-7.83(m, 2H), 7.38-7.29(m, 2H), 7.02(td, J=7.3, 15.2Hz, 1H), 6.71(d, J=15.2Hz, 1H), 5.08(br s, 2H), 4.48(d, J=7.3Hz, 2H), 3.89(s, 3H), 3.13(s, 6H).分析値:C, 45.23;H, 4.36;N, 16.34. C₂₅H₂₆Br₂N₈O₃.¹/₁₀THF.1¹/₄H₂O理論値:C, 45.13;H, 4.37;N, 16.57.
（Ａ．１．１．４一般的手順Ｄ：Ｎ−メチル−２−ピロリジノン中での四級アンモニウム塩プロドラッグの調製）
（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（１１）（１５０ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）の無水Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）（１ｍＬ）中の攪拌溶液に、窒素下で、２−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（５２ｍｇ，０．６６モル当量，０．２３ｍｍｏｌ）を、少量ずつ５時間かけて加えた。次いで、得られた溶液を室温で２０時間にわたって攪拌した後、ジエチルエーテルを加えた。得られた沈殿物を、ろ過し、ジクロロメタンで十分に洗浄した。粗生成物を、ジオキサンの添加によるアセトニトリル（痕跡量のトリエチルアミンを含有する）からの分別沈殿によって精製した。沈殿物を、遠心機により母液から分離し、ＴＨＦおよびＤＣＭ（１：１）の混合物で３回洗浄し、真空下で乾燥させ、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２１）（１２７ｍｇ，８４％）を得た。

m.p.184〜187℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 10.69(s, 1H), 9.91(s, 1H), 8.76(s, 1H), 8.61(s, 2H), 8.17(t, J=1.9Hz, 1H), 7.99(d, J=9.0Hz, 1H), 7.88-7.83(m, 2H), 7.37-7.29(m, 2H), 7.00(td, J=7.3, 15.2Hz, 1H), 6.64(d, J=15.2Hz, 1H), 4.79(s, 2H), 4.36(d, J=7.2Hz, 2H), 3.88(s, 3H), 3.19(s, 6H).分析値:C, 46.11;H, 4.33;N, 16.78. C₂₅H₂₆Br₂N₈O₃.¹/₂H₂O理論値:C, 45.82;H, 4.15;N, 17.10.HRMS (FAB+)実測値:565.13144, 567.12820 (M-Br), C₂₅H₂₆ ^79/81BrN₈O₃ ⁺の計算値:565.13112, 567.12908.
１１（１５０ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）を、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール（５２ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）と２３時間にわたって一般手順Ｄに従って反応させることにより、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２２）（９４ｍｇ，６２％）を得た。

m.p.178〜182℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 10.71(s, 1H), 9.93(s, 1H), 8.79(s, 1H), 8.61(s, 1H), 8.56(s, 1H), 8.17(br s, 1H), 7.98(d, J=8.8Hz, 1H), 7.88-7.83(m, 2H), 7.37-7.29(m, 2H), 7.00(td, J=7.3, 15.2Hz, 1H), 6.69(d, J=15.2Hz, 1H), 5.11(s, 2H), 4.47(d, J=7.1Hz, 2H), 4.11(s, 3H), 3.15(s, 6H).分析値:C, 45.54;H, 4.50;N, 16.30. C₂₅H₂₆Br₂N₈O₃.H₂O.¹/₄ジオキサン理論値:C, 45.50;H, 4.41;N, 16.33.HRMS (FAB+)実測値:565.13015, 567.13016 (M-Br), C₂₅H₂₆ ^79/81BrN₈O₃ ⁺の計算値: 565.13112, 567.12908.
ＮＭＰ（４ｍＬ）中で（Ｅ）−Ｎ−（４−（３−ブロモフェニルアミノ）キナゾリン−６−イル）−４−（ピペリジン−１−イル）ブタ−２−エナミド（１２）（１．０ｇ，２．１４ｍｍｏｌ）を、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（３１５ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ）と３．５日間にわたって一般手順Ｄに従って反応させることによって、１−（（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−４−オキソ−２−ブテニル）−１−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］ピペリジニウムブロミド（２３）（６００ｍｇ，６１％）を得た。

m.p.188℃(分解)。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 10.73(s, 1H), 9.94(s, 1H), 8.82(s, 1H), 8.61(s, 1H), 8.17(t, J=1.8Hz, 1H), 8.14(s, 1H), 7.98(d, J=8.8Hz, 1H), 7.88-7.83(m, 2H), 7.37-7.29(m, 2H), 7.08(td, J=7.3, 15.1Hz, 1H), 6.80(d, J=15.1Hz, 1H), 5.02(br s, 2H), 4.62(br s, 2H), 3.87(s, 3H), 3.58-3.55(m, 2H), 2.04-1.99(m, 2H), 1.78-1.75(m, 2H), 1.64-1.61(m, 1H), 1.46-1.36(m, 1H).分析値:C, 48.24;H, 4.58;N, 15.89. C₂₈H₃₀Br₂N₈O₃.¹/₂H₂O 理論値:C, 48.36;H, 4.49;N, 16.11.HRMS (FAB+)実測値:605.16226, 607.15997 (M-Br), C₂₈H₃₀ ^79/81BrN₈O₃ ⁺の計算値: 605.16242, 607.16038.
ＮＭＰ（４ｍＬ）中で（Ｅ）−Ｎ−（４−（３−ブロモフェニルアミノ）キナゾリン−６−イル）−４−モルホリノブタ−２−エナミド（１３）（１．０ｇ，２．１４ｍｍｏｌ）を、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（３１３ｍｇ，１．４２ｍｍｏｌ）と３．５日間にわたって一般手順Ｄに従って反応させ、続いて、ＭｅＯＨ／ギ酸／水を移動相として用いる分取ＨＰＬＣを行うことによって、４−（（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−４−オキソ−２−ブテニル）−４−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］モルホリン−４−イウムホルマート（２４）（１１０ｍｇ，１２％）を得た。

m.p.125〜129℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 11.69(s, 1H), 10.17(s, 1H), 9.28(s, 1H), 8.65(br, 1H), 8.61(s, 1H), 8.44-8.40(m, 2H), 8.14(s, 1H), 8.07(d, J=8.1Hz, 1H), 7.34(t, J=8.1Hz, 1H), 7.27(d, J=8.5Hz, 1H), 7.17-7.10(m, 2H), 6.82(d, J=14.6Hz, 1H), 5.12(br s, 2H), 4.81(br s, 2H), 4.16(t, J=12.0Hz, 2H), 3.91(m, 2H), 3.88(s, 3H), 3.70-3.60(m, 2H), 3.46(t, J=12.0Hz, 2H).HRMS (FAB+)実測値:607.14189, 609.14034(M-HCOO), C₂₇H₂₈ ^79/81BrN₈O₄ ⁺の計算値:607.14169, 609.13964.
ＮＭＰ（６ｍＬ）中で（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（１４）（９９０ｍｇ，２．３０ｍｍｏｌ）を、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（４２２ｍｇ，１．９２ｍｍｏｌ）と２４時間にわたって一般手順Ｄに従って反応させることにより、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２５）（１０７６ｍｇ，８６％）を得た。

m.p.192℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 9.99(s, 1H), 9.82(s, 1H), 8.91(s, 1H), 8.56(s, 1H), 8.14-8.11(m, 2H), 7.83-7.78(m, 1H), 7.42(t, J=9.1Hz, 1H), 7.33(s, 1H), 7.00-6.95(m, 1H), 6.90-6.86(d, J=15.3Hz, 1H), 5.06(br s, 2H), 4.43(d, J=6.8Hz, 2H), 4.03(s, 3H), 3.88(s, 3H), 3.12(s, 6H).分析値:C, 47.04;H, 4.32;N, 16.18. C₂₆H₂₇BrClFN₈O₄.H₂O.¹/₄THF 理論値:C, 47.28;H, 4.56;N, 16.34.
HR-MS (FAB+, ^35/37Cl)実測値: m/z 569.18207/571.18086 (M-Br), C₂₆H₂₇ ^35/37ClFN₈O₄ ⁺の計算値:569.182782/571.17983.
ＮＭＰ（５ｍＬ）中でＮ−（４−（３−ブロモフェニルアミノ）キナゾリン−６−イル）−４−（ジメチルアミノ）ブタナミド（１６）（１．０ｇ，２．３４ｍｍｏｌ）を５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（３４２ｍｇ，１．５６ｍｍｏｌ）と１５時間にわたって一般手順Ｄに従って反応させることにより、４−｛［４−（３−ブロモアニリノ）−６−キナゾリニル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−１−ブタンアミニウムブロミド（２７）（７１０ｍｇ，７０％）を得た。

m.p.177℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 10.39(s, 1H), 9.99(s, 1H), 8.69(d, J=1.6Hz, 1H), 8.59(s, 1H), 8.17(t, J=1.9Hz, 1H), 8.12(s, 1H), 7.93-7.84(m, 2H), 7.80(d, J=9.0Hz, 1H), 7.35(t, J=8.0Hz, 1H), 7.29(td, J=1.4, 8.4Hz, 1H), 5.02(br s, 2H), 3.86(s, 3H), 3.62-3.58(m, 2H), 3.10(s, 6H), 2.55(t, J=7.0Hz, 2H), 2.20-2.12(m, 2H).分析値:C, 45.69;H, 4.95;N, 15.57. C₂₅H₂₈Br₂N₈O₃.H₂O.¹/₂ジオキサン理論値:C, 45.65;H, 4.82;N, 15.77.HRMS (FAB+)実測値:567.14724, 569.14564 (M-Br), C₂₅H₂₈ ^79/81BrN₈O₃ ⁺の計算値:567.14677, 569.14473.
（Ａ．１．１．５トリガーブロミド２００の調製）

ブロミド１４９（５００ｍｇ，１．８０ｍｍｏｌ）（スキーム２０）、トリブチル（１−プロピニル）スズ（１．６４ｍＬ，５．３９ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（４１６ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（５ｍＬ）中の混合物を、８０℃で終夜（１４時間）加熱した後、標準的な水−酢酸エチルのワークアップを行った。得られた粗生成物を、ＭｅＣＮ／ＤＣＭ（１：２０から１：５へ勾配）を用いて溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、化合物１５０（１４７ｍｇ，３４％）を、白色の固体として得：¹H NMR(CDCl₃, 400MHz) δ 5.47(s, 2H), 3.77(s, 3H), 2.14(s, 3H), 2.10(s, 3H).LR-MS (+):m/e 238.5(M+1)；続いて、化合物１５１（１０５ｍｇ，３０％）も白色の固体として得た：¹H NMR(CDCl₃, 400MHz) δ 4.96(d, J=7.0Hz, 2H), 3.79(s, 3H), 2.60(t, J=7.0Hz, 1H), 2.14(s, 3H). LR-MS (+):m/e 196.5 (M+1)。化合物１５１は、化合物１５０をＭｅＯＨ中Ｋ_２ＣＯ_３で処理することによって定量的に得られた。

ブロミド１４９は、中間化合物１２３（スキーム１１）から、アセトニトリル中でＮ−ブロモスクシンイミド（N-bromosuccinimide：ＮＢＳ）と反応させてブロモメチレン誘導体１５３を得、続いてジメチルホルムアミド（dimethylformamide：ＤＭＦ）中で酢酸ナトリウム媒介ブロミド置換を行うことによって得られ得る（スキーム２０）。

化合物１５１（１１０ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）中の溶液に、０℃で、トリエチルアミン（０．１１８ｍＬ，０．８４ｍｍｏｌ）、続いて、ＭｓＣｌ（０．０５２ｍＬ，０．６８ｍｍｏｌ）を滴下した。０℃での３０分および室温での３０分の後、混合物を、飽和塩化アンモニウム水溶液および食塩水で２回洗浄した後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、セライトを通してろ過した。減圧下での濃縮によって、化合物（複数種）１５２（１４５ｍｇ，約９４％）を、灰白色の固体として得、この固体は、^１ＨＮＭＲによって、メシラートおよびクロリド（３．６：１）の混合物であることが分かり、これを、さらなる精製を行わずに使用した。

¹H NMR(CDCl₃, 400MHz)メシラートについて:δ 5.62(s, 2H), 3.81(s, 3H), 3.13(s, 3H), 2.15(s, 3H); クロリドについて:δ 5.02(s, 2H), 3.79(s, 3H), 2.14(s, 3H).LR-MS(+): 274.5(メシラートのM+1);214.4/216.4(3:1, クロリドのM+1).
混合物１５２（１４５ｍｇ，約０．５３ｍｍｏｌ）を、還流ＴＨＦ（１０ｍＬ）中３０分間にわたってＬｉＢｒ（９２２ｍｇ，１０．６１ｍｍｏｌ）で処理した。次いで、ＴＨＦを真空で除去し、得られた残渣を水と酢酸エチルとの間に分配させた。有機相を水および食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにより乾燥させ、セライトを通してろ過した後、真空で濃縮した。そのようにして得られた粗生成物を、酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を用いて溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−２−（１−プロピニル）−１Ｈ−イミダゾール（２００）（９５ｍｇ，６９％）を、白色の固体として得た。

¹H NMR(CDCl₃, 400MHz) δ 4.86(s, 2H), 3.76(s, 3H), 2.14(s, 3H).LR-MS(+):m/e 258.5/260.5(1:1, M+1).
（Ａ．１．１．６ α−メチルブロミド１２７の調製（スキーム１１））
ブロミド１５３（スキーム１４）（１．４０ｇ，４．６８ｍｍｏｌ）の、数滴の水を含むＤＭＡ（１４ｍＬ）中の溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（６４７ｍｇ，４．６８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を終夜攪拌した後、標準的なＥｔＯＡｃワークアップを行い、続いて、ＭｅＣＮ／ＤＣＭ（５：９５から１５：８５）を用いて溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行うことによって、アルコール１５４（３３０ｍｇ，３０％）を、灰白色の固体として得た。

¹H NMR(⁶d-DMSO, 400MHz) δ 5.56(t, J=5.8Hz, 1H), 4.86(d, J=5.8Hz, 2H), 3.70(s, 3H).LR-MS (+):m/e 236.5/238.5(1:1, M+1).
アルコール１５４（３００ｍｇ，１．２７ｍｍｏｌ）、Ｚｎ（ＣＮ）_２（９０ｍｇ，０．７６ｍｍｏｌ）、亜鉛粉末（１０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（２３ｍｇ，０．０２５ｍｍｏｌ）およびｄｐｐｆ（２８ｍｇ，０．０５１ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（３ｍＬ）中の混合物を、窒素下に１２０℃で３．５時間にわたって攪拌した。次いで、標準的なＮＨ_４Ｃｌ水溶液／ＥｔＯＡｃのワークアップを行い、続いて、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１から２：１へ）を用いて溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行うことによって、シアノイミダゾール１２６（１８０ｍｇ）を、灰白色の固体として得、この固体は、^１ＨＮＭＲによって、少量の未反応の出発材料１５４を含むことが分かり、これを次の工程にそのまま使用した。

¹H NMR(CDCl₃, 400MHz) δ 5.09(d, J=6.7Hz, 2H), 4.00(s, 3H), 2.49(t, J=6.7Hz, 1H).
シアノイミダゾール１２６（１７３ｍｇ，約０．９３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中の溶液に、０℃で、ＭｓＣｌ（０．０８８ｍＬ，１．１４ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＩＰＥＡ（０．１８２ｍＬ，１．０４ｍｍｏｌ）を滴下した。１時間にわたって攪拌した後、反応混合物を、標準的なＮＨ_４Ｃｌ水溶液／ＥｔＯＡｃのワークアップに付し、黄色の油状物（２３７ｍｇ；^１ＨＮＭＲによればメシラートおよびα−メチルクロリドの混合物）を得、この油状物をそのまま使用した。この油状物（２３５ｍｇ，約０．９０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）中の溶液に、ＬｉＢｒ（１．５７ｇ，１８．０６ｍｍｏｌ）を加えた。０．５時間にわたって還流加熱した後、溶媒を真空で除去し、残渣を、標準的なＮＨ_４Ｃｌ水溶液／ＥｔＯＡｃのワークアップに付した。粗生成物を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：４から１：２へ）を用いて溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、α−メチルブロミド１２７（６５ｍｇ，３工程で２１％）を、桃色の油状物として得た。

¹H NMR(CDCl₃, 400MHz) δ 4.86(s, 2H), 3.95(s, 3H).LR-MS(+):m/e 277.6/279.6(1:1, M+1+MeOH).
（Ａ．１．１．７ α−メチルブロミドトリガー２０１の調製）

ブロモイミダゾール１４９（１．９０ｇ，６．８３ｍｍｏｌ）（スキーム１４）、テトラエチルスズ（５．４２ｍＬ，２７．３４ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（７９０ｍｇ，０．６８ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（２０ｍＬ）中の混合物を、１１０〜１２０℃で５時間にわたって加熱した後、標準的な水−酢酸エチルのワークアップを行った。得られた粗生成物を、ＭｅＣＮ／ＤＣＭ（１：５）を用いて溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した後、ヘキサンの添加によりＤＣＭから沈殿させ、エチルイミダゾール１５６（１．０４ｇ，６７％）を、白色の固体として得た。

m.p.71〜73℃。¹H NMR(CDCl₃, 400MHz) δ 5.48(s, 2H), 3.64(s, 3H), 2.76(q, J=7.43Hz, 2H), 2.10(s, 3H), 1.37(t, J=7.43Hz, 3H).分析値:C, 48.11;H, 5.90;N, 18.23%. C₉H₁₃N₃O₄・0.04ヘキサン理論値:C, 48.11;H, 5.92;N, 18.22%.LR-MS (+):m/e 228.5 (M+1).
エチルイミダゾール１５６（１．２５ｇ，５．５０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の溶液に、無水Ｋ_２ＣＯ_３（１．５２ｇ，１１．０ｍｍｏｌ）を加えた。２０分間にわたって攪拌した後、溶媒を減圧で除去し、残渣をＤＣＭに溶解させ、シリカゲルの層を通してろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を濃縮し、白色の結晶を得、この結晶を、ろ過により集め、酢酸エチル／ヘキサン（１：１）の混合物で洗浄し、アルコール１５７（９４９ｍｇ，９３％）を、白色の結晶固体として得た。

m.p.153〜155℃。¹H NMR(CDCl₃, 400MHz) δ 4.96(d, J=6.80Hz, 2H), 3.67(s, 3H), 2.79(t, J=6.80Hz, 1H), 2.74(q, J=7.50Hz, 2H), 1.36(t, J=7.50Hz, 3H).分析値:C, 45.71;H, 6.07;N, 22.87%. C₇H₁₁N₃O₃理論値:C, 45.40;H, 5.99;N, 22.68%.
LR-MS(+):m/e 186.5 (M+1).
アルコール１５７（６８５ｍｇ，３．７０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３０ｍＬ）中の溶液に、０℃で、トリエチルアミン（０．７７３ｍＬ，５．５５ｍｍｏｌ）、続いて、ＭｓＣｌ（０．３４４ｍＬ，４．４４ｍｍｏｌ）を滴下した。４５分間にわたって攪拌した後、混合物を、飽和塩化アンモニウム水溶液で２回、食塩水で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにより乾燥させ、セライトを通してろ過した。真空でのろ液の濃縮によって、白色の固体（９７１ｍｇ）を得、この固体は、^１ＨＮＭＲによって、メシラートおよびα−メチルクロリド（３：１）の混合物であることが分かり、次の工程にそのまま使用した。この固体（９６８ｍｇ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）中の溶液を、ＬｉＢｒ（６．３９ｇ，８６．８５ｍｍｏｌ）により還流下に０．５時間にわたって処理した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を水と酢酸エチルとの間で分配させた。有機相を、水で２回、食塩水で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにより乾燥させ、セライトを通してろ過した。溶媒を真空で除去し、α−メチルブロミドIIId-10（８５１ｍｇ，９３％）を、白色固体として得た。

m.p.91〜93℃。¹H NMR(CDCl₃, 400MHz) δ 4.88(s, 2H), 3.65(s, 3H), 2.76(q, J=7.60Hz, 2H), 1.37(t, J=7.60Hz, 3H).分析値:C, 34.41;H, 4.07;N, 16.96%. C₇H₁₀BrN₃O₂・0.04EtOAc理論値:C, 34.18;H, 4.13;N, 16.70%.LR-MS(+):m/e 248.4/250.4(1:1, M+1).
（Ａ．１．１．８他のキナーゼインヒビターのプロドラッグの調製）
（２Ｅ）−Ｎ−｛４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フラニルオキシ］−６−キナゾリニル｝−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（BIBW2992;Himmelsbach et al., US 07019012 B2）（１５００ｍｇ，３．０９ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（４ｍＬ）中の溶液に、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（７４７ｍｇ，３．４０ｍｍｏｌ）を、一般的手順Ｃに従って加え、（２Ｅ）−４−（｛４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フラニルオキシ］−６−キナゾリニル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１２１０ｍｇ，５６％）を得、これを、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ／ＴＦＡを用いて溶出する分取ＨＰＬＣによってさらに精製し、（２Ｅ）−４−（｛４−（３−クロロ−４−フルオロアニリノ）−７−［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フラニルオキシ］−６−キナゾリニル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムトリフルオロアセタート（８２）（７３０ｍｇ，３２％）を得た。

m.p.149〜152℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 10.80(s, 1H), 9.93(s, 1H), 9.07(s, 1H), 8.78(s, 1H), 8.14(s, 1H), 8.03-8.01(dd, J=6.8, 2.5Hz, 1H), 7.73-7.69(m, 1H), 7.50(t, J=9.1Hz, 1H), 7.38(s, 1H), 7.04-6.96(m, 1H), 6.88(d, J=15.2Hz, 1H), 5.32-5.31(m, 1H), 5.05(br, 2H), 4.42(d, J=6.9Hz, 2H), 4.02-3.91(m, 3H), 3.87(s, 3H), 3.82-3.77(m, 1H), 3.12(s, 6H), 2.43-2.34(m, 1H), 2.18-2.08(m, 1H).分析値:C, 44.42;H, 3.88;N, 12.21%. C₃₁H₃₁ClF₄N₈O₇・1.2CF₃COOH・1.5H₂O理論値:C, 44.43;H, 3.93;N, 12.41%.
（２Ｅ）−Ｎ−｛４−［３−クロロ−４−（２−ピリジニルメトキシ）アニリノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル｝−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（HKI272;Tsou et al., J. Med. Chem., 2005, 48, 1107〜1131）（７００ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（４ｍＬ）中の溶液に、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（３０４ｍｇ，１．３８ｍｍｏｌ）を、ＭｅＣＮの代わりにＭｅＣＮ／ＥｔＯＡｃ（１：３）が用いられたことを除き一般手順Ｃに従って加え、（２Ｅ）−４−（｛４−［３−クロロ−４−（２−ピリジニルメトキシ）アニリノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（７０３ｍｇ，７２％）を得、これを、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ／ＴＦＡを用いて溶出する分取ＨＰＬＣによってさらに精製し、（２Ｅ）−４−（｛４−［３−クロロ−４−（２−ピリジニルメトキシ）アニリノ］−３−シアノ−７−エトキシ−６−キノリニル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムトリフルオロアセタート（８３）（４１０ｍｇ，４０％）を得た。

m.p.147〜149℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 9.93(br, 1H), 9.84(s, 1H), 8.97(s, 1H), 8.62-8.59(m, 1H), 8.14(s, 1H), 7.90-7.86(dt, J=7.7, 1.8Hz, 1H), 7.59(d, J=7.8Hz, 1H) 7.44(s, 2H), 7.40-7.36(m, 1H), 7.29-7.22(m, 2H), 6.99-6.84(m, 2H), 5.30(s, 2H), 5.04(br, 2H), 4.40(d, J=6.7Hz, 2H), 4.36-4.31(q, J=7.0Hz, 2H), 3.86(s, 3H), 3.11(s, 6H), 1.47(t, J=7.0Hz, 3H).分析値:C, 49.42;H, 4.57;N, 13.90%. C₃₇H₃₅ClF₃N₉O₇・0.5CF₃COOH・3H₂O理論値:C, 49.54;H, 4.54;N, 13.68%.
Ｎ−（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［（１−メチル−４−ピペリジニル）メトキシ］−４−キナゾリンアミン（ZD6474;Hennequin et al., J. Med. Chem., 2002, 45, 1300〜1312）（２５０ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（１ｍＬ）中の溶液に、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（１３９ｍｇ，０．６３ｍｍｏｌ）を、反応物が４８時間にわたって攪拌されワークアップにおいてＭｅＣＮの代わりにＥｔＯＡｃが用いられたことを除き一般手順Ｃに従って加え、４−（｛［４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−キナゾリニル］オキシ｝メチル）−１−メチル−１−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］ピペリジニウムブロミド（３９２ｍｇ）を得、これを、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ／ＴＦＡを用いて溶出する分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、４−（｛［４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−キナゾリニル］オキシ｝メチル）−１−メチル−１−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］ピペリジニウムトリフルオロアセタート（１４６）（２４６ｍｇ，６４％）を、^１ＨＮＭＲにより約２：５の比のトランス／シスの異性体として得た（以降の記載において、マイナーな異性体についてＡとして名付けられ、メジャーな異性体についてＢとして名付けられる）。

m.p.185〜188℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 10.42(br, 1H), 8.60(s, 1H), 8.114 & 8.110(s×2, A&B異性体, 1H), 7.74-7.71(m, 1H), 7.56-7.53(m, 1H), 7.34 & 7.27(s×2, A&B異性体, 1H), 5.07(br, 2H), 4.29 & 4.14(d×2, A&B異性体, J=6.6Hz, 2H), 3.99 & 3.97(s×2, A&B異性体, 3H), 3.88(s, 3H), 3.75-3.60(m, 4H), 3.15 & 3.01(s×2, A&B異性体, 3H), 2.33-1.82(m, 5H).
６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−｛４−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］アニリノ｝−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（PD166285; Klutchko et al., J. Med. Chem., 1998, 41(17), 3276〜3292）（２００ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）の無水ＮＭＰ（２ｍＬ）中の攪拌溶液に、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（１０３ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、得られた溶液を室温で７２時間にわたって攪拌した後、Ｅｔ_２Ｏを加えた。得られた沈殿物を、ろ過し、Ｅｔ_２ＯおよびＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。粗生成物を、ＣＨ_３ＣＮ／Ｅｔ_２Ｏからの沈殿によって精製した。沈殿物を、ろ過し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄し、真空下で乾燥させ、２−（４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］エタンアンモニウムブロミド（１４０）（１７０ｍｇ，５９％）を、淡黄色の粉末として得た。

m.p.142〜145℃。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 10.12(s, 1H), 8.82(s, 1H), 8.13(s, 1H), 7.88(s, 1H), 7.78(d, J=8.9Hz, 2H), 7.59(dd, J=8.1, 0.7Hz, 2H), 7.46(dd, J=8.8, 7.4Hz, 1H), 7.05(d, J=9.1Hz, 2H), 5.15(s, 2H), 4.48(t, J=4.4Hz, 2H), 3.89(s, 3H), 3.86(t, J=4.5Hz, 2H), 3.65(s, 3H), 3.58(q, J=6.8Hz, 4H), 1.31(t, J=7.0Hz, 6H).分析値:C, 47.13;H, 4.26;N, 13.76. C₃₁H₃₃BrCl₂N₈O₄.CH₂Cl₂理論値:C, 47.02;H, 4.32;N, 13.71.
６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−｛４−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］アニリノ｝−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（PD166285; Klutchko et al., J. Med. Chem., 1998, 41(17), 3276〜3292）（２００ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）の無水ＮＭＰ（１．５ｍＬ）中の攪拌溶液に、５−（ブロモメチル）−１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１２２）（１１０ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、得られた溶液を室温で１２０時間にわたって攪拌した後、Ｅｔ_２Ｏを加えた。得られた沈殿物を、ろ過し、Ｅｔ_２ＯおよびＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄し、真空下で乾燥させ、２−（４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェノキシ）−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアンモニウムブロミド（１４１）（２１０ｍｇ，７２％）を、淡黄色の粉末として得た。

m.p.163〜166℃。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 10.13(s, 1H), 8.82(s, 1H), 7.89(s, 1H), 7.78(d, J=8.8Hz, 2H), 7.59(dd, J=8.0, 0.6Hz, 2H), 7.45(dd, J=8.8, 7.4Hz, 1H), 7.05(d, J=9.1Hz, 2H), 5.15(s, 2H), 4.47(t, J=4.4Hz, 2H), 3.85(t, J=4.2Hz, 2H), 3.75(s, 3H), 3.65(s, 3H), 3.58(q, J=7.2Hz, 4H), 2.44(s, 3H), 1.31(t, J=7.0Hz, 6H).分析値:C, 51.74;H, 4.79;N, 14.86. C₃₂H₃₅BrCl₂N₈O₄理論値:C, 51.49;H, 4.73;N, 15.01.
６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−２−（４−ピリジニルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（PD166285類似物A; Klutchko et al.,J. Med. Chem., 1998, 41(17), 3276〜3292）（２００ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）の無水ＮＭＰ（３ｍＬ）／ＴＨＦ（２００ｍＬ）中の攪拌溶液に、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（１３３ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、得られた溶液を室温で２５日間にわたって攪拌した後、ＴＨＦを除去した。得られた溶液をＥｔＯＡｃ／水で分液した。水性部分を凍結乾燥に付し、得られたゴム状物を、Ｅｔ_２Ｏ／ＥｔＯＡｃ／ＣＨ_２Ｃｌ_２を用いてすりつぶし、４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝−１−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］ピリジニウムブロミド（１４２）（２００ｍｇ，６５％）を、淡黄色の粉末として得た。

m.p.252℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.83(bs, 1H), 9.08(s, 1H), 8.68(d, J=7.0Hz, 2H), 8.21(bs, 2H), 8.09(s, 1H), 8.05(s, 1H), 7.61(dd, J=8.1, 0.6Hz, 2H), 7.5(dd, J=8.9, 7.4Hz, 1H), 6.00(s, 2H), 3.84(s, 3H), 3.73(s, 3H).分析値:C, 44.33 ;H, 3.42 ;N, 17.00. C₂₄H₁₉BrCl₂N₈O₃.2H₂O理論値:C, 44.06 ;H, 3.54 ;N, 17.13.
６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−２−｛４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］アニリノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（PD166285類似物B; Klutchko et al.,J. Med. Chem., 1998, 41(17), 3276〜3292）（２３０ｍｇ，０．４４ｍｍｏｌ）の無水ＮＭＰ（５ｍＬ）中の攪拌溶液に、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１２２）（１１６ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、得られた溶液を室温で１２日間にわたって攪拌した後、Ｅｔ_２Ｏを加えた。得られた沈殿物を、ろ過し、ＥｔＯＡｃおよびＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。粗生成物を、ＮＭＰ／ＥｔＯＡｃからの沈殿によって精製した（２回）。沈殿物を、ろ過し、真空下で乾燥させ、１−［２−（４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェノキシ）エチル］−１−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］ピペリジニウムブロミド（１４３）（１００ｍｇ，３１％）を、淡黄色の粉末として得た。

m.p.176〜178℃。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 10.14(s, 1H), 8.82(s, 1H), 8.14(s, 1H), 7.89(s, 1H), 7.80(d, J=8.9Hz, 2H), 7.59(dd, J=8.1, 0.7Hz, 2H), 7.46(dd, J=8.8, 7.4Hz, 1H), 7.10(d, J=9.1Hz, 2H), 5.22(bs, 2H), 4.61(t, J=4.4Hz, 2H), 4.17(bs, 2H), 3.86(s, 3H), 3.72-3.64(m, 2H), 3.65(s, 3H), 2.10-1.95(m, 4H), 1.74(bd, J=14.3Hz, 2H), 1.60(bd, J=14.3Hz, 1H), 1.46-1.31(m, 1H);2個のプロトンは観察されず。分析値:C, 48.33 ;H, 4.64 ;N, 13.32. C₃₂H₃₃BrCl₂N₈O₄.3H₂O.¹/₄EtOAc 理論値:C, 48.31 ;H, 5.04 ;N, 13.66.
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（スニチニブ； Sun et al.,J. Med. Chem., 2003, 46(7), 1116〜1119）（１９９ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（１ｍＬ）中の溶液に、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（１００ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）を一般手順Ｂに従って加え、Ｎ，Ｎ−ジエチル−２−［（｛５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル｝カルボニル）アミノ］−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］エタンアンモニウムブロミドを得、これを、分取ＨＰＬＣによってさらに精製して、Ｎ，Ｎ−ジエチル−２−［（｛５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル｝カルボニル）アミノ］−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］エタンアンモニウムトリフルオロアセタート（１４４）（１９０ｍｇ，６４％）を得た。

m.p.162〜165℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 13.74(s, 1H), 10.89(s, 1H), 8.13(s, 1H), 7.80-7.75(m, 2H), 7.73(s, 1H), 6.96-6.91(m, 1H), 6.87-6.84(m, 1H), 5.03(s, 2H), 3.90(s, 3H), 3.61-3.48(m, 8H), 2.45(s, 3H), 2.42(s, 3H), 1.34(t, J=7.1Hz, 6H). ¹⁹F NMR[(CD₃)₂SO, 376.5MHz] δ -73.97(s, 3.31F), -122.71(m, 1F).
分析値:C, 50.50 ;H, 4.89 ;N, 13.88. C₂₉H₃₃F₄N₇O₆・0.31(F₃CCOOH)・H₂O 理論値:C, 50.46 ;H, 5.05 ;N, 13.91.
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド（スニチニブ； Sun et al.,J. Med. Chem., 2003, 46(7), 1116〜1119）（１９９ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（１ｍＬ）中の溶液に、５−（ブロモメチル）−１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１２２）（１０６ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）を、ＭｅＣＮの代わりにＥｔＯＡｃが用いられたことを除き一般手順Ｃに従って加え、Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジエチル−２−［（｛５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−イル｝カルボニル）アミノ］エタンアンモニウムブロミド（１４５）（２６８ｍｇ，９３％）を得た。

m.p.244〜248℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 13.74(s, 1H), 10.89(s, 1H), 7.79-7.75(m, 2H), 7.73(s, 1H), 5.04(br, 2H), 3.77(s, 3H), 3.58-3.46(m, 8H), 2.46(s, 3H), 2.45(s, 3H), 2.42(s, 3H), 1.34(t, J=7.1Hz, 6H).分析値:C, 52.59 ;H, 5.64 ;N, 14.98. C₂₈H₃₅BrFN₇O₄・0.5H₂O 理論値:C, 52.42 ;H, 5.66 ;N, 15.28.
（Ａ．２．プロドラッグの有効性）
不可逆性erbB1、2、4インヒビター（１１〜１４）およびマイケル受容基二重結合が飽和している比較の可逆性インヒビター（１６）を、さまざまなフラグメント化還元的トリガーを有する一連のそれらの四級アンモニウム塩プロドラッグ（１７〜２３、２７）に対して比較した。プロドラッグの脱活性化度、低酸素下での細胞におけるそれらの活性化、一電子還元によるそれらのフラグメント化およびA431腫瘍異種移植片におけるそれらの有効性を評価するためのさまざまなアッセイが採用された。

（実験：方法および材料）
（Ａ．２．１細胞性erbB1阻害：有酸素および低酸素条件実験）
ヒトA431類表皮癌腫細胞を、４００，０００細胞／ウェルで６ウェルプレート中の、１０％のウシ胎児血清、１０ｍＭのＤ−グルコースおよび０．２ｍＭの２’−デオキシシチジンを含有するα最小必須培地（alpha minimal essential media：αＭＥＭ）中に播種した。A431細胞を、有酸素または無酸素条件下に９０分間にわたって接着させ、次いで、有酸素または無酸素条件下で、１μＭの濃度の試験化合物にさらに４時間にわたって曝露した。次いで、細胞を、血清不含有培地を使用して３回洗浄して試験化合物を除去し、次いで、有酸素条件下で一晩、インキュベータに戻した。次いで、細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを用いて１５分間にわたって刺激し、その後、培地を吸引し、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を改変ＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４、１ｍＭのＮaFおよび１×プロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma）に溶解させ、氷上で５〜１０分間にわたってインキュベートした。ＢＣＡアッセイを採用して、サンプルのタンパク質濃度を決定した。アクチンローディングに対するＥＧＦＲのリン酸化を、適当な抗体を使用するウエスタンブロットによって決定した。ウェルあたり１μｇの総タンパク質を、１５ウェルのNuPAGE 4-12%ゲル（Invitrogen）中にロードした。電気泳動後、タンパク質を０．４５μｍのニトロセルロース膜（Biorad）に移し、TBS-Tween ０．１％中の２％ＢＳＡ（ICPBio）を用いて１時間にわたってブロックした。抗体を、TBS-Tween ０．１％に示されるように希釈した。

タンパク質は、Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate（Pierce/Thermo Scientific）を使用して検出される。リン酸化タンパク質の検出後、Restore Western Blot Stripping Buffer（Pierce/Thermo Scientific）を用いてブロットを３０分間にわたってストリッピングし、洗浄し、再ブロックし、アクチンに対する抗体とともにインキュベートする。

（Ａ．２．２細胞増殖阻害実験）
５％ウシ胎仔血清（fetal bovine serum：ＦＢＳ）を含有するα最小必須培地（αＭＥＭ）中の対数期指数増殖（log phase exponential growth）にあるヒトA431、BT474、SKBR3、SKOV3、SW620、H1975およびHT29癌腫細胞を、トリプシン処理（１×トリプシン／ＥＤＴＡ、Gibco Brl）によって回収し、カウントし、９６ウェルプレート（Nunc）中に８００〜１５００細胞／ウェルの範囲の細胞密度で播種した。細胞サンプルの半量をプレートに播種した。このプレートは、予備平衡化され、無酸素環境下（９０％Ｎ_２、５％Ｈ_２、５％ＣＯ_２、３７℃；無酸素チャンバ，Coy Laboratory Products）に保持されていた。有酸素（２１％Ｏ_２）または無酸素（＜１０ｐｐｍＯ_２）の条件のいずれかの下で３時間接着させた後、細胞を、適当な希釈範囲にわたるさまざまなプロドラッグまたはエフェクタ濃度に４時間にわたって曝露した。この期間の最後に、無酸素プレートを、有酸素チャンバから回収し、標準ＣＯ_２インキュベータ（３７℃）中、酸素正常状態下で２０時間にわたって保持した。すべてのプレートを洗浄して化合物を除去し、細胞を５％ＦＢＳ＋抗生物質を含有するαＭＥＭ中でさらに４日間にわたって増殖させた。細胞をトリクロロ酢酸中で固定し（３０分）、洗浄し、スルホローダミンＢで染色し（SRB、６０分）、その後、酸性化水で洗浄した。ＳＲＢを可溶化し、吸収を４５０ｎｍで読み取って、細胞密度を算出した。増殖の阻害は、未処理のコントロールウェルに対して算出された。

（Ａ．２．３有酸素および低酸素の細胞代謝実験）
A431およびSKOV3細胞を、T75フラスコ中で増殖させ、４０Ｋ、７日の増殖後に８０〜９０％のコンフルエント細胞層を与える密度で播種した。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、１０００ｒｐｍで、室温で５分間にわたって遠心分離し、１ｍＬの細胞培養培地（１０％のＦＣＳ、１０ｍＭのＤ−グルコースおよび０．２ｍＭの２’−デオキシシチジンを含有するα−ＭＥＭ）に再懸濁させた。Coulterカウンターを用いて細胞数を測定し、適当な数の細胞を新しいチューブに移した。ウェルあたり５×１０^５個の細胞を２４ウェルプレートのウェルに３５０μＬ／ウェルの総体積で入れた（すなわち、１４．３×１０^５細胞／ｍＬ）。細胞を３７℃で２時間にわたってインキュベートして、ウェルに接着させ、無酸素サンプルは平衡化した。８０μＭの化合物２０を含有する５０μＬの細胞培養培地（３５０μＬ／ウェル）を各ウェルに加えて、各ウェルにおいて２細胞系のそれぞれについて２通りに最終化合物２０濃度１０μＭを与えた。細胞を、１、２または３時間にわたって３７℃でインキュベートした。適当な時間で、２４ウェルプレートをインキュベータ／無酸素チャンバから取り出し、氷上に置いた。各ウェルの内容物を、氷上に維持されたマイクロ遠心チューブに移した。８００μＬのアセトニトリル（各０．５μＭの化合物１１および２０のＤ６内部標準によりスパイクされた）を、薬物処理したウェルの各々に加え、細胞単層からの効率的な抽出を可能にした。次いで、全内容物（１２００μＬ＝４００＋８００μＬ）をボルテックス混合し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムで実施されるまで保存のために−８０℃に移行させた。コントロールサンプルについて同様の手順が続けられた。コントロールサンプルを使用して、それぞれ、化合物２０および化合物１１をスパイクすることによって較正曲線が構築された。分析の当日、−８０℃フリーザからのサンプルを氷上で解凍し、ボルテックス混合し、５分間にわたって１３０００ｒｐｍで遠心分離し、細胞デブリを沈降させた。３５μＬの上清をＨＰＬＣインサートに注意深く移し、８５μＬのホルマートバッファ（４５ｍＭ、ｐＨ４．５）と混合した。２５μＬの再構成されたサンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。

（Ａ．２．４血漿および腫瘍薬物動態学実験）
化合物２０を、１３３μｍｏｌ／ｋｇの用量で、A431腫瘍異種移植片を有する２４匹の雌NIH-IIIマウスに、ｐＨ４．０乳酸バッファの溶液として腹腔内注射を介して投与した。血液サンプルを、Ｔ＝０．２５、１、３、５、２４、３６、４８および７２時間に、末梢出血（terminal bleed）（コホートあたりｎ＝３）によって、イソフルラン麻酔下に集めた。A431腫瘍サンプルを、Ｔ＝０．２５、１、３、５、２４、３６、４８および７２時間で集め（コホートあたりｎ＝３）、液体窒素中で直ちに凍結させ、−８０℃で保存し、その後に、薬物分析のためのサンプル調製がなされた。小片（約１００ｍｇ）の組織をバイオパルベライザーウェル（予め液体窒素中で予め冷却される）に入れ、ステンレススチール乳棒の２〜３回の強打で小さくして微細粉末にした。凍結粉末を、予め秤量されたマイクロ遠心チューブ（ドライアイス上で維持された）中に集めた。４容積の氷冷アセトニトリル（それぞれ化合物２０および化合物１１のＤ６内部標準０．５μＭを含有する）を加え、粉砕された組織から薬物を抽出した。マイクロ遠心チューブを、１０分間にわたって１３，０００ｒｐｍで回転させ、細胞デブリおよびタンパク質を沈殿させた。１０μＬの血漿（ＥＤＴＡ中に集められた）に、４０μＬの氷冷アセトニトリル（化合物２０および化合物１１のＤ６内部標準０．５μＭ）を加えた。得られた溶液を混合し、次いで、５分間にわたって１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清（４０μＬ）をＨＰＬＣインサートに移し、８０μＬの４５ｍＭホルマートバッファーｐＨ４．５と混合し、次いで、化合物２０、化合物１１、および化合物２０を投薬されたマウスからのサンプル中の化合物１１の濃度を、ダイオードアレイ吸光度検出器（diode array absorbance detector：ＤＡＤ）を質量検出器に合わせて備えたAgilent 6410 ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した。分析は、マルチモードイオン源検出器をエレクトロスプレーネガティブモードで構成し、乾燥ガス流５．５Ｌ／分、ネブライザー圧力５５ｐｓｉ、乾燥ガス温度３５０℃、気化器温度２２５℃、キャピラリー電圧２５００Ｖ、充電電圧２０００Ｖとすることにより実施され、ＤＡＤ検出は、３２２ｎｍであり、８ｎｍのバンド幅であった。定量化（quantitat
ion）は、５６４＞３１４のｍ／ｚ（プロドラッグ）、４２５＞３１４のｍ／ｚ（エフェクタ）および５７０＞３１４のｍ／ｚ（プロドラッグのＤ６内部標準）、４３１＞３１４のｍ／ｚ（エフェクタのＤ６内部標準）におけるＭＲＭ遷移をベースとしていた。分析物は、アセトニトリル（８０％）−水（２０％）混合液中０．０１％ギ酸および水（１００％）中０．０１％ギ酸の勾配を用いて、Zorbax SB C-18, Rapid resolution HT 3.0×50mm, 1.8ミクロン(Agilent) ＨＰＬＣカラム上、０．６ｍＬ／分の流量で溶出された。

（Ａ．２．５インビボの有効性実験）
A431異種移植片：特定病原体不含有のホモ接合型の雌のCD-1ヌードマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、A431細胞の単細胞懸濁液を皮下播種した（５×１０^６細胞／１００μＬ；右脇腹）。A431腫瘍異種移植片が確立された時点で（通常６〜１０日）、マウスを処理群に無作為化した。全ての化合物は、乳酸塩バッファ（ｐＨ４）中に調製された。マウスは、示されたスケジュールおよび用量レベルを使用して腹腔内注射（０．０１〜０．０３ｍＬ／ｇ）によって投薬された。腫瘍の大きさおよび体重を、一定の間隔で測定した。腫瘍の容積は、π（長さ×幅^２）／６として算出された。腫瘍が処理前の容積に対して４倍の容積に増大する時間（ＲＴＶ^４）を求め、腫瘍増殖阻害の％（% Tumour Growth Inhibition：％ＴＧＩ）を、コントロールに対する処理ＲＴＶ^４における中央値パーセンテージ増大として算出した。ＲＴＶ^４の相違は、マンホイットニーのＵ検定によってSigmaStat v3.5を使用して統計的差異について検定された。

SKOV3異種移植片：特定病原体不含有のホモ接合型の雌のNIH-IIIヌードマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、SKOV3細胞の単細胞懸濁液を皮下播種した（１×１０^７細胞／１００μＬ；右脇腹）。SKOV3腫瘍異種移植片が確立した時点で（通常５０〜６５日）、マウスを処理群に無作為化した。全ての化合物は、乳酸塩バッファ（ｐＨ４）中で調製された。マウスは、示されたスケジュールおよび用量レベルを使用して腹腔内注射（０．０１〜０．０３ｍＬ／ｇ）によって投薬された。腫瘍の大きさおよび体重を、一定の間隔で測定した。腫瘍の容積は、π（長さ×幅^２）／６として算出された。腫瘍が処理前の容積に対して４倍の容積に増大する時間（ＲＴＶ^４）を求め、腫瘍増殖阻害の％（％ＴＧＩ）を、コントロールに対する処理ＲＴＶ^４における中央値パーセンテージ増大として算出した。ＲＴＶ^４の相違は、マンホイットニーのＵ検定によってSigmaStat v3.5を使用して統計的差異について検定された。

（Ａ．２．６放射線分解還元実験）
還元性等価物の導入の際の、エフェクタを遊離させる、溶液中の実施例のプロドラッグの相対的な活性が、^６０Ｃｏγ線照射装置の使用によって測定された。プロドラッグを、Millpore水（５ｍＭのリン酸ナトリウムによりｐＨ７に緩衝された、添加された５０ｍＭのギ酸ナトリウムを含有する）に、５０μＭ以下の濃度で溶解させた。溶液は、３０分間にわたりＮ_２Ｏガスにより継続的に飽和された気密性ガラス容器中に含まれ、その後、Fricke線量測定法（Fricke and Hart,“Chemical Dosimetry” Radiation Dosimetry Vol.2, Attrix,F.H.;Roesch,W.C.; Tochilin,E.(Eds.), Academic Press, New York, 1966, pp167〜239）を用いて予め決められた７．５Ｇｙ・ｍｉｎ^−１の照射量で放射線分解が行われる。上記の採用される放射線条件下、１電子還元等価物（ＣＯ_２ ^・−ラジカル）中０．６６μＭの濃度が、Ｇｙにつき生じさせられ（Mulazzani et al., J. Phys. Chem., 90, 5347〜5352, 1980）、プロドラッグ（Ｐ）は、電子移動によって還元される。

各プロドラッグの喪失およびそのエフェクタの形成は、ＨＰＬＣ−質量分光光度法（ＭＳ）によって２連照射されたサンプルにおいてモニタリングされた。０．９５還元等価物レベルでのプロドラッグの濃度における喪失のパーセンテージおよびエフェクタの形成が測定された。さらに、各プロドラッグに由来するメチル−ニトロ芳香族化合物の検出を記録した。０．９５還元性等価物レベルでの濃度における＞５０％の喪失を示すプロドラッグは、１電子化学量論を示す。

パルス放射線分解を使用して、一電子還元および化合物の安定性をリアルタイムでモニタリングした。迅速分光光度計検出システムを備えた、高エネルギー電子の短パルス（４ＭｅＶの２００ｎｓにおいて２〜３Ｇｙ）を送達する線形加速器を用いた（Anderson et al., J. Phys. Chem. A, 101, 9704〜9709, 1997）。プロドラッグを、上記のホルマートイオンを含有するＮ_２Ｏ飽和溶液に溶解させ、これは、パルス放射線分解後に、数マイクロ秒内に化合物のラジカルアニオンの迅速な形成をもたらした。フラグメント化の速度は、トリガー部分のベンジルタイプのラジカルの形成に対応する波長での動力学的遷移を分析することによって決定された（Bays et al., J. Am. Chem. Soc., 105, 320〜324, 1983; Anderson et al., J. Phys. Chem. A, 101, 9704〜9709, 1997）。

（結果および考察）
（Ａ．２．７酵素阻害活性）
表１の化合物を、単離酵素アッセイにおいてerbB1、erbB1^T790M、erbB2およびerbB4を阻害するそれらの能力について試験した。このアッセイは、合成ＦＲＥＴ可能ペプチド基質を利用する。これらの基質のリン酸化は、それらを展開試薬（development reagent）による切断から保護し、それらのＦＲＥＴ−能力を無傷で残す。データは、ペプチド基質のリン酸化を５０％阻害するのに必要な薬物の濃度（ＩＣ_５０）として提示される。他者によって指摘されたように（Tsou et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 2719〜2734）、特定の単離酵素アッセイ間で化合物を比較すると、酵素、基質の性質およびアッセイ全体の条件の相違に起因して相当な変動が存在する。さらなる検討事項として、酵素の不可逆性阻害が可能である化合物について、ＩＣ_５０は、酵素への可逆性および不可逆性の結合の両方を反映する。酵素の迅速かつ完全なアルキル化が可能な化合物について、ＩＣ_５０値は、化学量論方法で酵素活性を滴定することに本質的に由来し（すなわち、無限阻害（infinite inhibition））、したがって、単に「見掛け」のＩＣ_５０として考えられる。この性質のアッセイは、ここに記載されるような１セットのアッセイ条件内で化合物を順位付けするために広く使用されている（Tsou et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 2719〜2734;Wissner et al., J. Med. Chem., 2003, 46, 49〜63;Wissner et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 14, 1411〜1416;Tsouet al., J. Med. Chem., 2005, 48, 1107〜1131;Klutchko et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 1475〜1485）。

これらのアッセイ条件下に、既知の不可逆性erbB1/2インヒビター１１は、erbB1、2および4の強力なインヒビターであり（それぞれ、ＩＣ_５００．２２ｎＭ、８ｎＭおよび２．７ｎＭ）、これらの酵素の各々のＡＴＰ−結合ドメインの口部におけるシステイン残基をアルキル化する能力と一致し、別のerbB1選択的４−アニリノキナゾリンスキャフォールドに、汎erbB効力を付与することが確認された。このアッセイでは、１１は、固相ＥＬＩＳＡベースアッセイにおいて、これまでに報告されたもの（Tsou et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 2719〜2734）より強力であるが（erbB1 ＩＣ_５０＝１１ｎＭ、erbB2 ＩＣ_５０＝３０１ｎＭ）、同一のＺ’−ＬＹＴＥアッセイを使用して実施された最近報告されたerbB1 ＩＣ_５０（０．２２ｎＭ）（Michalczyk et al., Bioorg. Med. Chem., 16, 2008, 3482〜3488）と直接的に比較可能である。化合物１１は、さらに、不可逆性erbBインヒビターに感受性であることが知られているerbB1のT790M突然変異型に対して良好な効力（ＩＣ_５０１０．３ｎＭ）を示す。この突然変異体は、臨床上の可逆性４−アニリノキナゾリンゲフィチニブおよびエルロチニブの結合を共にブロックし、ＡＴＰ結合親和性を回復させると考えられている、かさ高いゲートキーパー残基を有し、ゲフィチニブおよびエルロチニブ感受性非小細胞肺癌における約５０％の患者の再発につながる。対照として、化合物１６は、化合物１１の直接的な可逆性類似物であり、実際にerbB1選択的であり、erbB2、erbB4およびerbB1^T790Mに対して１０〜４２倍の効力の喪失を示し、これらの酵素をアルキル化しかつ阻害効力を改善する能力がないことと一致する。このアッセイ内で最も重要には、化合物１１の四級アンモニウム塩プロドラッグ（１７〜２２）は、単離されたerbB1の強力なインヒビターであることが示されたが（ＩＣ_５００．２０〜０．５６ｎＭ）、さらに、単離されたerbB2、erbB1^{Ｔ７９０Ｍ}を阻害する時には少なくとも１４〜４４倍より低い有効性である。４−アニリノキナゾリンスキャフォールドの公知のerbB1選択的性質および単離されたerbB1^T790Mに対する効力の喪失のような、erbBファミリーの可逆性インヒビターである化合物をもたらす化合物１１の第三アミンの四級化と一致する傾向（後の、細胞ベースの薬剤洗い流しデータも参照のこと）が、プロドラッグ（１７〜２２）について明らかである。

表２の化合物が、EGF刺激A431細胞においてerB1の自己リン酸化を阻害するそれらの能力について、ホスホ−erbB1状態のウエスタン免疫ブロッティング測定によって試験された。化合物１１〜１３は、細胞erbB1の強力なインヒビターであると示され（ＩＣ_５０それぞれ９、４５および１６ｎＭ）、化合物１６（化合物１１の直接的可逆性類似物）も同様であった（ＩＣ_５０１８ｎＭ）。対照的に、四級アンモニウム塩誘導体（１９〜２３、２７）は、無傷のA431細胞におけるerbB1自己リン酸化の阻害において、それらの各エフェクタ分子と比較して、２７〜２０１倍の範囲にわたってより低い有効性であった。プロドラッグについての細胞erbB1阻害効力のこの喪失は、上記の保持される単離酵素erbB1阻害効力と合わせて、正荷電四級アンモニウム塩プロドラッグの細胞排除（cellular exclusion）に主に起因すると考えられる。

（Ａ．２．８細胞erbB1阻害：不可逆性の洗い流し（wash-out）アッセイ）
四級アンモニウム塩プロドラッグ２０が、既知の不可逆性erbB11/2インヒビター１１（プロドラッグ２０に対するエフェクタ）および化合物１６と並行して、無傷のA431細胞においてerbB1自己リン酸化を不可逆的に阻害するそれらの能力について評価された。細胞は、薬物（１μＭ）に１時間にわたって継続的に曝露され、次いで、ＥＧＦで刺激され、全細胞溶解物がウエスタンブロットによってホスホ−erbB1レベルについて測定されるか、または薬物（１μＭ）に１時間にわたって曝露され、次いで、洗浄されて、未結合薬物が除去され、その後に、ＥＧＦ刺激およびホスホ−erbB1ウエスタンブロッティングがなされるかのいずれかであった（図１Ａ／Ｂ）。化合物１１についてこれまでに記載されたように（Tsou et al.,J. Med. Chem., 2001, 44, 2719〜2734）、erbB1自己リン酸化は、ＥＧＦ刺激に先行して細胞が洗浄により未結合薬物が除かれたかどうかに拘わらず、A431細胞において完全に阻害され、このことは、erbB1の不可逆性阻害が起こったという解釈を強力に支持する。対照的に、化合物１６は、細胞自己リン酸化の強力なインヒビターであるとわかっている（ＩＣ_５０＝１８ｎＭ、表２）が、６位にマイケル受容基により置換されないので、酵素アルキル化することができない。したがって、化合物１６は、洗浄により薬物が除去されなかった細胞においてerbB1自己リン酸化の完全な阻害を示す一方で、洗浄により薬物が除去された細胞は、erbB1を自己リン酸化するそれらの能力において回復させられ、このことは、化合物１６が、erbB1の強力な、可逆性インヒビターであることを示す。同様の傾向が、プロドラッグ２０について観察された一方で、自己リン酸化は、１μＭの薬物曝露を使用する未洗浄細胞では完全には阻害されず（この化合物のerbB1自己リン酸化の細胞ＩＣ_５０（５５５ｎＭ、表２）と一致する）、洗浄により薬物が除去された細胞は、完全に回復させられた、erbB1を自己リン酸化するそれらの能力を有しており、プロドラッグ２０がerbB1の可逆性インヒビターであることと一致した。

図１は、化合物１１、１６および２０についてのA431細胞自己リン酸化阻害を示す。細胞は、１μＭの試験化合物への１時間にわたる曝露を与えられ、ＥＧＦにより直接的に刺激され、溶解させられ、ＥＧＦＲ（erbB1）およびホスホ−ＥＧＦＲ（ホスホ−erbB1）についてウエスタンブロットがなされるか、試験化合物を除去するように薬物不含有培地により広範に洗浄され、その後に、ＥＤＦ刺激、細胞溶解およびウエスタンブロッティングが行われるかのいずれかであった。Ａ：ウエスタンブロット。Ｂ：総細胞ＥＧＦＲタンパク質を使用してタンパク質ローディングについて規格化されたウエスタン免疫ブロットの定量。

（Ａ．２．９細胞増殖阻害活性）
表３の化合物が、文献の前例との比較を提供するように選択された３種のヒト癌腫細胞株の増殖を阻害するそれらの能力について試験された（Tsou et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 2719〜2734）：A431（類表皮腫）；これは、erbB1を過剰発現する；SKBR3（乳癌）；これは、erbB2を過剰発現し、かつ、これより低い程度であるがerbB1を過剰発現する；およびSW620（結腸癌）；これは、任意の重要な程度にerbB1またはerbB2を発現しないコントロール株として機能する。細胞は、有酸素条件下に２４時間にわたって、または無酸素下に４時間、続いて有酸素条件下に２０時間にわたってかのいずれかで試験化合物に曝露された。次いで、それらは、洗浄により薬物が除去され、さらに４日間にわたってインキュベートされ、その後、スルホローダミンＢを用いて細胞生存について染色された。

不可逆性erbB1/2インヒビター１１は、A431およびSKBR3細胞の増殖を、SW620細胞に行ったよりも強力に阻害した（A431：ＩＣ_５０＝０．０４０μＭ；SKBR3：ＩＣ_５０＝０．０８１μＭ；SW620（ＩＣ_５０＝３．４３μＭ））。この化合物およびその他の報告された化合物（１２および１３）のこの傾向およびＩＣ_５０値は、これまでに報告された結果と一致する（薬物曝露およびインキュベーション時間における所与の相違）（Tsou et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 2719〜2734）。７−メトキシキナゾリンスキャフォールドを有するインヒビター１４は、erbBファミリーメンバーを発現する細胞の増殖を最も強力に阻害する化合物１１に匹敵する活性を示した。対照的に、可逆性のインヒビター１６は、erb1/2駆動細胞株において、その不可逆性の対応物１１よりも３２〜３９倍低い活性であった。細胞が４時間の無酸素を与えられた場合には、化合物１１〜１４および１６は、効力において何等の有意な変化を示さなかった。

それらのそれぞれのキナーゼインヒビター（１１、１２、１６）に対して、四級アンモニウム塩プロドラッグ（１７〜２３、２７）は、A431細胞の増殖の阻害において１２〜２７７倍より低い有効性であり；SKBR3細胞の増殖の阻害において１９〜３３２倍より低い有効性であり；SW620細胞の増殖の阻害において１８〜１２３より低い有効性であった。表４のいくつかのプロドラッグ（１９、２０、２２および２３）は、細胞が４時間の無酸素を受けた後に、A431およびSKBR3細胞の増殖を阻害する時に有意により強力であった（SW620細胞は強力ではない）。低酸素細胞毒性比（hypoxic cytotoxicity ratios：ＨＣＲ）は、A431細胞において１０．４〜２６．８の範囲およびSKBR3細胞において６．７〜１８．１の範囲にわたり、このことは、ニトロヘテロ環還元的トリガーの低酸素選択的還元と、それに続く、不可逆性のerbB1、2、4インヒビターを放出するトリガーフラグメント化と一致していた。

（Ａ．２．１０放射線分解還元）
電子親和性プロドラッグは、正常組織における正常酸素圧条件下と対照的に、固形腫瘍の低酸素領域において、一電子プロセスによって選択的に還元されて、細胞毒性エフェクタを形成または放出し得る（Brown and Wilson, Nature Rev. Cancer, 2004 , 4,437〜447）。プロドラッグは、ＮＨＥに対して−０．６〜−０．２Ｖ、好ましくは−０．５〜−０．３Ｖの一電子還元電位Ｅ（１）を有するトリガー部分を含有するべきである。多数の化合物のＥ（１）値は、文献（例えば、Wardman, P. J .Phys. Chem. Ref. Data, 1989, 18, 1637〜1755）から得られ得るか、または多数の方法によって測定され得る。例えば、パルス放射線分解法は、プロドラッグの、それらの一電子還元の際に形成されるラジカルアニオンと、それらから化合物のデータＥ（１）値を算出され得るビオロゲンおよびキノン化合物などの参照標準の間の平衡定数を測定する（Meisel and Czapski. J. Phys. Chem., 1975, 79, 1503〜1509）。プロドラッグ１７〜２２、１４０〜１４５のＥ（１）値は、パルス放射線分解法によって測定され、−０．４９３〜−０．３８８Ｖ範囲に決定された（表４）。全てが、生物学的背景で、それらのラジカルアニオンを酵素的に形成することができる適切なＥ（１）値を有すると考えられる。

適切なＥ（１）値を有するプロドラッグは、溶液中のプロドラッグの放射線分解の後に、多くの方法によってエフェクタ部分を放出するそれらの能力について試験され得る。例えば、放射線分解の前後の質量分析（mass spectrometry：ＭＳ）および／または高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography：ＨＰＬＣ）によって、出発化合物および放射線分解の結果として形成される生成物が確認される。いくつかの一電子還元体が、種々の溶質（soluter）を含有する溶液の放射線分解の際に生じ得る。例えば、ホルマートイオンを含有するγ線照射溶液中で形成されるＣＯ_２ ^・−ラジカルは、−１．９０Ｖの低いＥ（１）を有し（Schwarz et al., Inorg. Chem., 1985, 24, 433〜439）、より高いＥ（１）の化合物への容易な電子移動を経る。使用される放射線条件下に、吸収された放射線用量のＧｙ（Ｊｋｇ^−１）につき、一電子還元等価物（ＣＯ_２ ^・−ラジカル）中０．６６μＭの濃度が生じさせられる（Mulazzaniet al, J. Phys. Chem., 1980, 90, 5347〜5352）。プロドラッグ濃度の喪失を、溶液の放射線分解の際に生じた還元性等価物の濃度と比較することによって、各プロドラッグの完全な喪失に、一電子還元が必要であるか、複数電子還元が必要であるかを決定することが可能である。通常、同じプロドラッグ分子の多電子還元を最小にするために、０．９５還元当量がプロドラッグに移動させられた後のプロドラッグの１電子除去についての証拠が求められる。プロドラッグを１電子除去する場合、これは、しばしば、そのラジカルアニオンのフラグメント化を示す。この結論は、放出された細胞毒性エフェクタおよび一過性のベンジルタイプのラジカルから生じる生成物（例えば、Ｈ原子抽出（abstraction）によって形成されたメチルニトロ芳香族化合物（methyl nitroaromatic compound：ＭＮＡ））のＨＰＬＣ−ＭＳ組合せ同定によってさらに指示される。これは、所定の関連するアリールメチル四価窒素マスタードの場合に起こることを示した。（Anderson et al., J. Phys. Chem., 1997, 101,9 704〜9709;Wilson et al., Radiat. Res., 1998, 149, 237〜245）。プロドラッグ１９および２０について得られたデータは、一電子還元レベルでのそれらの消費と一致し（０．９５還元当量のレベルでプロドラッグの＞５０％喪失）、放出されたエフェクタ（化合物１１）がＨＰＬＣ−ＭＳによって検出された（表４）。同様に、定常状態の放射線分解と、それに続くＨＰＬＣ−ＭＳによって、プロドラッグ１４０、１４３および１４４は、一電子還元後にそれらのそれぞれのエフェクタ化合物を放出したことが確認された。対照的に、プロドラッグ２１について得られたデータは、二電子還元を必要とする消費と一致する。一電子還元後に、エフェクタ（化合物１１）の放出は、観察されなかった。プロドラッグ１７、１８、２２および１４２は、一電子還元後にそれらのそれぞれのエフェクタ化合物を放出せず、多電子還元後にのみ消費された。

還元的プロドラッグは、トリガー部分の一電子還元の際に制御されたフラグメント化速度定数を有するように選択されることが望ましい。腫瘍細胞の低酸素領域において高濃度の細胞毒性エフェクタを放出する迅速なフラグメント化が望ましいが、正常酸素状態下の正常組織細胞にとってはそうではない。エフェクタの放出を効果的に阻害する、酸素による一電子還元型ニトロアレンベースのプロドラッグの逆酸化の速度定数ｋＯ_２は、以下の式によって与えられる：

［式中、Ｅ（１）Ｃ／Ｃ^・−は、プロドラッグの一電子還元電位である］（Wardman et al., Biochem. Soc. Symp., 1995, 61, 171〜194;Anderson et al., Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 2167〜2174）。

一電子還元型プロドラッグのフラグメント化の速度定数ｋｆｒａｇは、パルス放射線分解を用いてラジカルアニオンのフラグメント化の際に生じたベンジルタイプのラジカルの吸収スペクトルの時間分解形成を観察することにより測定され得る（Anderson et al., J. Phys. Chem. A, 1997, 101, 9704〜9709）。プロドラッグ１９、２０、１４０、１４１および１４３〜１４５のｋｆｒａｇ値は、パルス放射線分解によって測定され、表４に示されている。表３に記載されたプロドラッグのうち、プロドラッグ１９および２０は、低酸素下での一電子還元の際にフラグメント化速度を最も望ましい範囲内で有し、それらが、A431およびSKBR3細胞ベースの抗増殖アッセイにおいて最も大きい低酸素細胞毒性比（hypoxic cytotoxicity ratio：ＨＣＲ）をインビトロで示すことと一致する（表３）。

（Ａ．２．１１ A431異種移植片における化合物１９、２０および２１のインビボスクリーニング）
プロドラッグ１９、２０および２１は、それらのそれぞれの最大耐用用量の際のA431異種移植片における有効性について、乳酸塩バッファ中のＩＰ投薬後のq4dx3スケジュールで比較された（図２）。

図２は、A431異種移植片に対する化合物１９、２０および２１の有効性を示す。

プロドラッグ２０（q4dx3 ＭＴＤ＝１３３μｍｏｌ／ｋｇ／用量）は、A431異種移植片において相当な有効性を実証した（算出された腫瘍増殖阻害（Tumour Growth Inhibition：ＴＧＩ）＞＞２１０％）が、プロドラッグ１９（q4dx3 ＭＴＤ＝７５μｍｏｌ／ｋｇ／用量）は、弱くしか活性でなく（ＴＧＩ＝１２０％）、プロドラッグ２１（q4dx3 ＭＴＤ＝７５μｍｏｌ／ｋｇ／用量）は、不活性であった（ＴＧＩ＝１０％）。各プロドラッグは、同一エフェクタ（化合物１１）をベースとし、使用される還元的トリガーの性質のみが異なる。プロドラッグについての活性のランク順序（２０＞１９＞２１）は、パルス放射線分解による一電子還元後のトリガーのフラグメント化の速度定数（２０＞１９＞２１）およびインビトロでA431細胞においてプロドラッグについて観察されたＨＣＲ（２０＞１９＞２１）と一致し、このことは、A431異種移植片の低酸素コンパートメントにおけるプロドラッグの低酸素選択的活性化およびエフェクタの放出、それに続く、腫瘍中の有酸素細胞へのエフェクタの逆拡散は、プロドラッグ１９および２０の作用機序であるという仮説を支持する。

（Ａ．２．１２化合物２０の溶解性および安定性）
四級アンモニウム塩プロドラッグ２０は、さまざまな溶質における溶解性および化学的安定性についてＨＰＬＣにより研究されている。αＭＥＭ細胞培養培地中１１１２μＭの溶解性を有しながらも、良好な安定性（半減期＝５８時間）も有することが測定されている。エフェクタ１１の放出は、α−ＭＥＭ中３７℃で２４時間後にＨＰＬＣによって観察されなかった。さらに、プロドラッグ２０は、ＤＭＳＯおよび乳酸塩バッファ（ｐＨ＝４）中で本質的に安定である（半減期＞９６時間）。

（Ａ．２．１３化合物１１および２０のマウスの毒性および薬物動態学）
表５には、不可逆性erbB1/2インヒビター１１およびプロドラッグ２０の最大耐量（maximum tolerated dose：ＭＴＤ）および血漿薬物動態学（乳酸塩バッファ（ｐＨ４）中の溶液としての各化合物の腹腔内注射後）が記載されている。両化合物は、下痢および体重減少を示し、このことは、用量制限としての胃腸毒性を示唆する。体重減少が出発重量の＞１５％であった場合には、人道的選別が実施された。ＭＴＤ値は、すべての薬物関連原因による７中１未満の死亡として定義された。プロドラッグ２０は、単回用量として、またはq4dx3スケジュールで送達される場合に化合物１１よりも１．８倍良好に耐容性であると決定された。両化合物は、それらのそれぞれの単回用量ＭＴＤの小部分での多数回用量スケジュールで十分に耐容性であり（次のセクション参照）、唯一の観察され得る毒性としての体重減少があった。各化合物の血漿薬物動態学は、単回投与ＭＴＤの４２％での単回腹腔内投与後に測定された。プロドラッグ２０は、化合物１１のものよりも２３倍高い曲線下面積（area under the curve：ＡＵＣ）を示したが、プロドラッグ２０による投薬後に血漿中に見られた化合物１１の量は最小であり（エフェクタＡＵＣは、プロドラッグＡＵＣの１パーセントである）、このことは、プロドラッグ２０が、インビボでの非特異的放出に安定であることを示した。

（Ａ．２．１４化合物１１および２０の有効性の比較）
プロドラッグ２０は、A431異種移植片における有効性について、等毒性（equitoxic）用量（単回投与ＭＴＤの６３％）において、乳酸塩バッファ中のＩＰ投与後のより長期化したq4dx6スケジュールでエフェクタ１１と直接的に比較された。プロドラッグ２０は、増殖遅延によってエフェクタ１１よりも優れた有効性を示し、これは、統計的に有意であると決定された（図３Ａ）。各剤について採用された用量およびスケジュールは、平均体重減少によって判断されるように等毒性であるとして決められ（図３Ｂ）、エフェクタ１１で処理されたマウスについて２／１２の死亡が観察され、プロドラッグ２０で処理されたマウスについて０／１２の死亡が観察された。

図３Ａは、A431異種移植片に対する化合物１１および２０の有効性を示す。

図３Ｂは、化合物１１および２０で処理されたA431保有マウスの平均体重変化を示す。

（Ａ．２．１５細胞erbB1阻害：有酸素および低酸素の条件）
図１０は、化合物１１および１６〜２２のA431細胞自己リン酸化阻害を示す。細胞は、有酸素または低酸素の条件下に１μＭの試験化合物への４時間の曝露を与えられ、その後、薬物不含有培地により広範囲に洗浄されて、試験化合物が除去され、終夜、血清欠乏とされ、次いで、ＥＧＦにより刺激され、溶解させられ、ホスホ−ＥＧＦＲ（ホスホ−erbB1）またはタンパク質ローディングコントロールとしてのアクチンについてウエスタンブロッティングが行われた。

化合物１９および２０は、p-erbB1の低酸素選択的阻害を実証した。化合物１７、１８、２１および２２は、p-erbB1の明らかな低酸素選択的阻害を示さなかった。

（Ａ．２．１６細胞株パネルにおける化合物１１および２０の細胞増殖阻害活性）
図１１は、有酸素および低酸素の条件下、A431、BT474、SKBR3、SKOV3およびSW620細胞における化合物１１および２０の細胞増殖の阻害（ＩＣ_５０）を示す。

化合物２０は、細胞株パネルの全域で低酸素選択的抗増殖性活性を示し、その選択性は、erbB−ファミリーのメンバー（A431、BT474、SKBR3、SKOV3）を過剰発現すると知られている細胞株において最大である。対照的に、不可逆性erbB1/2インヒビター１１は、細胞株パネルの全域で低酸素選択的抗増殖活性を示さない。

（Ａ．２．１７化合物２０の細胞代謝：有酸素および低酸素条件）
図１２は、有酸素および低酸素条件下にA431およびSKOV3細胞が１０μＭのプロドラッグ２０により処理される場合にＬＣＭＳによって検出されるインヒビター１１の、細胞不含有コントロールに対する時間依存放出を示す。

A431およびSKOV3細胞は、低酸素条件下でプロドラッグ２０を選択的に代謝して、それぞれ、２００および５００ｐｍｏｌ／時／１００万個細胞の速度で不可逆性erbB1/2インヒビター１１を生じさせることを実証した。プロドラッグ２０のある程度の低酸素選択的還元が５％ウシ胎仔血清を含有する細胞不含有培地において起こり、６２ｐｍｏｌ／時の速度でインヒビター１１を放出する。

（Ａ．２．１８化合物１１および２０の、それらのそれぞれのq4dx3 ＭＴＤでの血漿およびA431腫瘍の薬物動態学）
図１３は、雌のA431腫瘍保有NIHIIIマウスが単回用量（ｉｐ）の各試験化合物をq4dx3 ＭＴＤ（それぞれ１３３および７５μｍｏｌ／ｋｇ）で投与される場合の、血漿およびA431腫瘍中の、化合物２０および化合物１１（化合物２０の投与に由来し、直接的に投与される場合）の濃度を時間の関数として示す。

表６は、雌のA431腫瘍保有NIHIIIマウスが単回用量（ｉｐ）の化合物２０をq4dx3 ＭＴＤ（１３３μｍｏｌ／ｋｇ）で投与された場合の、化合物２０および１１（投与化合物２０に由来する）の、血漿およびA431腫瘍における、０〜７２時間の算出された曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。

プロドラッグ２０およびインヒビター１１の血漿およびA431腫瘍の薬物動態学が、雌のNIHIIIマウスにおいて、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ検出（Ｄ６内部標準による）によって、それらのそれぞれのＭＴＤ（１３３および７５μｍｏｌ／ｋｇ；ｉｐ）投与に従って測定された。プロドラッグ２０は、２０１６μｍｏｌ−ｈ／Ｌの血漿ＡＵＣ_{０−７２ｈ}を与え、インヒビター１１の投与について達成されたもの（１８μｍｏｌ−ｈ／Ｌ）よりも数倍〜１１０倍大きかった。後者は、１００μｍｏｌ−ｈ／ｋｇの腫瘍ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}を与え、半減期（ｔ_１／２）は９時間であった。対照的に、プロドラッグ２０は、２２４５μｍｏｌ−ｈ／ｋｇの腫瘍ＡＵＣ_{０−７２ｈ}を与え、７２時間まで約３０μｍｏｌ／ｋｇの安定な腫瘍組織濃度を有し、ｔ_１／２は、測定され得なかった。この長いプロドラッグ残留性と一致して、プロドラッグ２０から放出されたインヒビター１１は、腫瘍組織において、＞７２時間のｔ_１／２を有しており、４６４μｍｏｌ−ｈ／ｋｇのＡＵＣ_{０−７２ｈ}を提供した。したがって、A431腫瘍におけるインヒビター１１のＡＵＣは、プロドラッグ２０の投与後に、等価な毒性でのインヒビター１１自体の投与後よりも少なくとも４．６倍高かった。

図１４は、SKOV3異種移植片に対する化合物１１および２０の有効性を示す。

図１５は、化合物１１および２０で処理されたSKOV3保有マウスの平均体重変化を示す。

プロドラッグ２０は、SKOV3異種移植片における有効性について、等毒性（eqitoxic）用量（それぞれ１３３および５６μｍｏｌ／ｋｇ／用量）において、乳酸塩バッファ中のＩＰ投与後のq3dx6スケジュールでエフェクタ１１と直接的に比較された。プロドラッグ２０は、増殖遅延によってエフェクタ１１よりも優れた有効性を示し、この増殖遅延は統計的に有意であると決定された（図１４）。各薬剤について採用された用量およびスケジュールは、平均体重減少によって判断された時に等毒性であると決定され（図１５）、エフェクタ１１で処理されたマウスについて１／７の死亡が観察され、プロドラッグ２０で処理されたマウスについて０／７の死亡が観察された。

図１６は、インビトロでのA431細胞におけるプロドラッグ２０およびエフェクタ１１による細胞HER1（erbB1, EGFR）およびErk1/2リン酸化の用量依存性阻害を示す。

プロドラッグ２０およびエフェクタ１１は、ホスホ−HER1およびホスホ（phosphor）−Erk1/2状態のウエスタン免疫ブロッティング測定によるEGF刺激A431細胞におけるHER1（erbB1）およびErk1/2のリン酸化を阻害するそれらの能力について試験された。化合物１１は、細胞HER1およびErk1/2の強力なインヒビターであると示された。対照的に、四級アンモニウム塩誘導体２０は、HER1およびErk1/2の阻害において約６０倍より低い有効性であった。

（Ａ．２．１９細胞株パネルにおける化合物８２および１４０〜１４４の阻害活性）
表７は、A431、H1975およびHT29細胞における細胞増殖に対するプロドラッグ８２、１４０、１４１、１４２、１４３および１４４の阻害効果を示す。

表７のプロドラッグ（８２、１４０、１４１、１４３および１４４）は、細胞が４時間の無酸素を与えられた後に３種の細胞株すべての増殖の阻害において有意により強力であった。低酸素細胞毒性比（ＨＣＲ）は、A431細胞において７〜６２、H1975細胞において３〜２８およびHT29細胞において５〜３１の範囲であり、ニトロヘテロ環還元的トリガーの低酸素選択的還元と、それに続く、キナーゼインヒビターを放出するトリガーのフラグメント化と一致した。放出されるキナーゼインヒビターの性質は、細胞株感受性のスペクトルに影響を及ぼす。例えば、プロドラッグ８２は、A431細胞に対して最大の抗増殖活性および低酸素選択性を示し、プロドラッグ１４４は、HT29細胞に対して最大の抗増殖活性および低酸素選択性を示す。

（Ａ．２．２０要約）
集められたデータにより、マイケル受容基に隣接する第三アミンを有する不可逆性erbB1、2、4インヒビターの四級アンモニウム塩プロドラッグは、有酸素条件下で実施される細胞ベースのターゲット調節および抗増殖アッセイにおいてあまり活性でないことが示される。一電子還元の際に望ましい速度定数でフラグメンテト化して第三アミン含有不可逆性erbB1、2、4インヒビターを放出するよう適宜選択されるフラグメント化還元的トリガーを採用するプロドラッグは、無酸素条件下で実施される細胞ベースの抗増殖アッセイにおいて選択的により強力であり、量的に大きな薬物曝露レベルでマウスに送達され得、従って、腫瘍異種移殖片実験において、それらの親不可逆性erbB1、2、4インヒビターに対して改善された治療係数を有し得る。

（セクションＢ）
（Ｂ．１．合成）
（Ｂ．１．１化学合成）
燃焼分析は、Microchemical Laboratory, University of Otago, Dunedin, NZによって実施された。融点は、いずれも、Electrothermal Model 9200を使用して測定され、読み取りのとおりとした。^１ＨＮＭＲスペクトルは、Bruker Avance-400分光計で測定され、Ｍｅ_４Ｓｉを基準とした。高分解能質量スペクトルは、公称５０００の分解能のVarian VG-70SE分光計で記録された。質量分析は、ThermoFinnigan MSQシングル四重極型質量分析計で実施された。質量検出は、ＡＰＣＩ源により、正負イオン同時捕捉を用いて行われた。特に断りのない限り、化合物は、指示された溶出剤を使用する、Silica gel 60担体（Scharlau、２３０〜４００メッシュＡＳＴＭ）によるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製された。

（Ｂ．１．１．１４−アニリノピリド［３，４−ｄ］ピリミジンキナーゼインヒビターの合成（スキーム７））
（Ｂ．１．１．１．１（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（１６１））
６−フルオロピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（９３）（４．０ｇ，２４．２ｍｍｏｌ）、塩化チオニル（１００ｍＬ）および触媒量のＤＭＦ（３滴）の不均一混合物を還流下に１時間にわたって攪拌した。得られた溶液を減圧下、４５℃（浴温）で蒸発させ、明るい褐色の固体を得た。この固体に、３−ブロモ−４−フルオロアニリン（５．１ｇ，２６．８ｍｍｏｌ）および無水ＤＭＡ（２５ｍＬ）の混合物を加えた。反応混合物を、室温で４０分間にわたって攪拌し、次いで、５％炭酸水素ナトリウム溶液（２５０ｍＬ）を加え、混合物を室温で１５分間にわたって攪拌した。沈殿した固体を、ろ過により集め、水およびヘキサンで数回逐次洗浄した後、真空下でシリカゲル上で乾燥させ、Ｎ−（３−ブロモ−４−フルオロフェニル）−６−フルオロピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（１６２）（８．１３ｇ，９９％）を得た。

mp 275〜277℃（文献のmp 269〜270℃；Smaill et al., .J Med. Chem., 1999, 42, 1803〜1815）；¹H NMR δ [(CD₃)₂SO] 10.12(s, 1H), 8.97(s, 1H), 8.74(s, 1H), 8.32(dd, J=6.4, 2.6Hz, 1H), 8.23(d(不十分に分解), J=0.8Hz, 1H), 7.93-7.87(m, 1H), 7.46(t, J=8.8Hz, 1H).C₁₃H₇BrF₂N₄の分析計算値:C, 46.32 ;H, 2.09 ;N, 16.62%.実測値:C, 46.54 ;H, 3.33 ;N, 16.42%.
化合物１６２（１３．９ｇ，４１．３ｍｍｏｌ）および４−メトキシベンジルアミン（５４．３ｍＬ，４１３ｍｍｏｌの無水ＤＭＳＯ（１００ｍＬ）中の混合物を、窒素雰囲気下、７５℃（浴温）で９５時間にわたって攪拌した。次いで、溶液を冷却し、石油エーテル（５００ｍＬ）を加えた。室温で１５分間にわたって攪拌した後、層を分離させ、石油エーテル層をデカントした。この手順をさらに２回繰り返し、次いで、得られたＤＭＳＯ層に水（５００ｍＬ）を加え、混合物を室温で１時間にわたって攪拌し、黄色／橙色の固体を沈殿させ、この固体を、ろ過により集め、水で洗浄した（５×１００ｍＬ）後、真空下で乾燥させ、次いで、石油エーテルで洗浄した（２×１００ｍＬ）。次いで、黄橙色の固体を温アセトン（１Ｌ）とともに約３時間にわたって攪拌した後、水（１Ｌ）を加え、必要な生成物を沈殿させた。固体を、ろ過により集め、アセトン／水（１：１，５×８０ｍＬ）で洗浄し、真空でシリカゲルにより乾燥させ、純粋なＮ^４−（３−ブロモ−４−フルオロフェニル）−Ｎ^６−（４−メトキシベンジル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（１６５）（１４．８ｇ，７９％）を、黄色／橙色の固体として得た。

mp 181〜184℃;¹H NMR δ [(CD₃)₂SO] 9.69(s, 1H), 8.75(s, 1H), 8.37(s, 1H), 8.26(dd, J=6.4, 2.6Hz, 1H), 7.91-7.83(m, 1H), 7.42(t, J=8.8Hz, 1H), 7.33(br d, J=8.6Hz, 2H), 7.27(t, J=6.3Hz, 1H), 7.16(s, 1H), 6.91-6.85(m, 2H), 4.49(d, J=6.3Hz, 2H), 3.71(s, 3H).C₂₁H₁₇BrFN₅Oの分析計算値:C, 55.52 ;H, 3.77 ;N, 15.42%.実測値C: 55.75 ;H, 3.88 ;N, 15.44%.
化合物１６５（１５．９ｇ，３４．９ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（８０ｍＬ）中の攪拌均一溶液に、アニソール（７．５８ｍＬ，６９．８ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、混合物を室温で２０時間にわたって攪拌した。トリフルオロ酢酸の大部分を減圧下、３５℃（浴温）で蒸発させた。得られた赤褐色の油状物を石油エーテル（４００ｍＬ）とともに室温で約１０分間にわたって攪拌した。次いで、石油エーテル層をデカントし、さらに石油エーテルを用いてこの処理を繰り返した（２×３００ｍＬ）。次いで、残渣を５ＭＮＨ_３とともに、０℃で５分間にわたり、次いで、室温でさらに４５分間にわたって攪拌した。このようにして得られた固体を、ろ過により集め、水で洗浄した（３×６０ｍＬ）後、真空で乾燥させた。次いで、固体を温アセトン（５００ｍＬ）とともに３０分間にわたって攪拌した。水（８００ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１時間にわたって攪拌した。固体を、再度ろ過により集め、水（６×７０ｍＬ）、次いで、石油エーテル／酢酸エチル（３：１，４×１００ｍＬ）で逐次洗浄した後、減圧下で乾燥させ、Ｎ^４−（３−ブロモ−４−フルオロフェニル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（１５９）（１１．５ｇ，９９％）を得た。

mp 269〜271℃（文献のmp 268〜270℃）。^１ＨＮＭＲは報告されているものと同一であった（Smaill et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 1803〜1815）。

（Ｅ）−メチル４−ブロモブタ−２−エノアート（５３．７ｇ，３００ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）中の攪拌均一溶液に、０℃（浴温）、窒素雰囲気下で、水酸化リチウム一水和物（１６．４ｇ，３９０ｍｍｏｌ）の水溶液（８０ｍＬ）を滴下した（３５分かけて）。添加後、混合物を０℃で３時間にわたって攪拌した。冷水（３００ｍＬ）および石油エーテル（４００ｍＬ）を加え、混合物を０℃で１０分間にわたって攪拌した。有機層を分離し、廃棄した。次いで、酢酸エチル／石油エーテル（１：１０，３００ｍＬ）を加え、混合物を再度０℃で１０分間にわたって攪拌した後、有機層を分離し、廃棄した。水溶液を、濃硫酸を用いて０℃でｐＨ＜１に酸性化した。生成物をジクロロメタン（４００ｍＬ；２００ｍＬ）中に抽出し、合わせた有機抽出物を、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、減圧下、３５℃（浴温）で蒸発させ、黄色の油状物を得た。油状物を石油エーテル（２×５００ｍＬ）とともに５０℃（浴温）で攪拌した。合わせた石油エーテル抽出物を減圧下、２０〜２５℃（浴槽）で濃縮し、生成物の沈殿を促した。次いで、懸濁液を５℃で一晩静置した後、固体を、ろ過により集め、冷石油エーテルで洗浄し、乾燥させ、（Ｅ）−４−ブロモブタ−２−エン酸（９）（１９．９ｇ，４０％）を得た。

（方法Ａ：酸クロリドを用いたアミドカップリング）
塩化オキサリル（５０８ｍｇ，４．００ｍｍｏｌ）を、酸１５９（４９６ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（６ｍＬ）溶液に加え、混合物を室温で４０分間にわたって攪拌した。次いで、溶液を減圧下、室温で蒸発させ、油状物を得、この油状物を、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解させ、化合物８ａ（６６８ｍｇ，２．００ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．８４ｍＬ，６．００ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１５ｍＬ）の攪拌混合物に０℃で加えた。１時間後、塩化オキサリル（５０８ｍｇ，４．００ｍｍｏｌ）および酸９（４９６ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）から事前に作製された、別のバッチの酸クロリドを加え、０℃でもう３０分間にわたりさらに攪拌した。４０％ＮＨＭｅ_２（１５．２ｍＬ，１２．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡ（１０ｍＬ）の混合物を加え、反応混合物を０℃〜室温で１９時間にわたって攪拌した。揮発物を減圧下、２５℃で蒸発させ、褐色の油状物を得、この油状物を、１％炭酸ナトリウム溶液（１００ｍＬ）とともに０℃で３０分間にわたって攪拌した。このようにして形成された固体を、ろ過により集め、水で数回洗浄し、乾燥させた。ジクロロメタン〜ジクロロメタン／ＭｅＯＨ（１５：１）を用いて溶出する、この材料のシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーによって、（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（１６１）（４００ｍｇ，４５％）を、黄色／橙色の固体として得た。

mp 163〜166℃;¹H NMR δ [(CD₃)₂SO] 10.96(s, 1H), 10.33(s, 1H), 9.02(br s, 1H), 8.99(br s, 1H), 8.63(s, 1H), 8.24(dd, J=6.4, 2.6Hz, 1H), 7.92-7.84(m, 1H), 7.44(t, J=8.8Hz, 1H), 6.87(dt, J=15.5, 6.0Hz, 1H), 6.52(br d, J=15.5Hz, 1H), 3.09(dd, J=6.0, 1.2Hz, 2H), 2.19(s, 6H).C₁₉H₁₈BrFN₆O.MeOHの分析計算値:C, 50.33 ;H, 4.65 ;N, 17.61%.実測値:C, 50.38 ;H, 4.31 ;N, 17.86%.
（方法Ｂ：ＤＣＣを用いたアミドカップリング）
ＤＣＣ（７．２３ｇ，３５．１ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の攪拌溶液に、０℃、窒素雰囲気下で、酸９（５．７９ｇ，３５．１ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の溶液を加えた。反応混合物を４５分間にわたって攪拌した後、アニリン１５９（２．３４ｇ，７．０１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＡ（１８ｍＬ）中の懸濁液を加えた。次いで、ジ−イソ−プロピルエチルアミン（di-iso-propylethylamine：ＤＩＰＥＡ）（６．１１ｍＬ，３５．１ｍｍｏｌ）を加え、最終反応混合物を０℃で４５分間にわたって攪拌した後、４０％ジメチルアミン水溶液（１０．６ｍＬ，８４．０ｍｍｏｌ）を加えた。さらに２０分後、氷水（１００ｍＬ）、続いて、冷２％炭酸ナトリウム水溶液（４００ｍＬ）を加えた。生成物を酢酸エチル（６００ｍＬ）中に抽出し、これを水（３００ｍＬ）、冷２％炭酸ナトリウム水溶液（３００ｍＬ）および水（３００ｍＬ）で逐次洗浄した。酢酸エチル溶液を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、減圧下で蒸発させ、固体を得、この固体を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１００：０から１５：１への勾配）を用いて溶出するシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーによって精製し、（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（１６１）（２．４ｇ，７７％）を得た。

（方法Ｃ：アミドカップリング、続いてのHorner Wadsworth Emmonsカップリング）
ＣＤＩ（８．４４ｇ，５２．０ｍｍｏｌ）および無水ＴＨＦ（３２ｍＬ）の攪拌混合物に、室温、窒素雰囲気下で、２−（ジエトキシホスホリル）酢酸（１０．２ｇ，５２．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２８ｍＬ）中の溶液を加えた。添加後、反応混合物を４０℃（浴槽）で２０分間にわたってさらに攪拌した（それによりガスの発生は停止した）。化合物１５９（１３．４ｇ，４０．０ｍｍｏｌ）の、無水ＴＨＦ（４５ｍＬ）およびＤＭＡ（５０ｍＬ）の混液中の溶液を加え、反応物を４０℃でさらに攪拌した。反応は、ＴＬＣ（酢酸エチル）によってモニタリングされ、１．５時間後に約７０％しか完了していないことが分かった。そこで、無水ＴＨＦ（１６ｍＬ）中のＣＤＩ（４．２２ｇ，２６．０ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（７ｍＬ）中の２−（ジエトキシホスホリル）酢酸（５．１０ｇ，２６．０ｍｍｏｌ）に加えることによって、別のバッチの試薬を調製した。この追加試薬を反応混合物に加えた後、それを２時間にわたって４０℃でさらに攪拌し、次いで、水（１，０００ｍＬ）中に注ぎ、石油エーテル（１，５００ｍＬ）とともに室温で１６時間にわたって攪拌した。次いで、石油エーテル層をデカントした。さらなる石油エーテル（８００ｍＬ）を加え、混合物を１５分間にわたって攪拌した。固体を、ろ過により集め、水で洗浄し（５×２００ｍＬ）、乾燥させ、２−（４−（３−ブロモ−４−フルオロフェニルアミノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イルアミノ）−２−オキソエチルホスホン酸ジエチル（１６０）（２０．１ｇ，９８％）を得た。

m.p.214〜217℃。¹H NMR δ (CDCl₃) 9.45(s, 1H), 9.03(s, 1H), 8.73(s, 1H), 8.55(s, 1H), 8.13(dd, J=6.0, 2.6Hz, 1H), 7.77(s, 1H), 7.70-7.63(m, 1H), 7.18(dd, J=8.7, 8.2Hz, 1H), 4.31-4.18(m, 4H), 3.15(d, J=21.0Hz, 2H), 1.39(t, J=7.1Hz, 6H).C₁₉H₂₀BrFN₅O₄P.0.2H₂Oの分析計算値:C, 44.24 ;H, 3.99 ;N, 13.58%.実測値:C, 44.00 ;H, 4.09 ;N, 13.42%.
２，２−ジエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（１５．７ｇ，９７．５ｍｍｏｌ）および水（１６．４ｍＬ）の攪拌混合物に、室温、窒素雰囲気下で、３７％ＨＣｌ水溶液（１６．４ｍＬ，１９５ｍｍｏｌ）を加えた。添加後、混合物を４０℃（浴槽）で２５時間にわたって攪拌した。次いで、それを０℃（浴槽）に冷却し、溶液Ａを得た。ＫＯＨ（１４．０ｇ，２５０ｍｍｏｌ）を水（７５ｍＬ）に室温、窒素雰囲気下で溶解させた。次いで、それを０℃（浴槽）に冷却し、溶液Ｂを得た。化合物１６０（１９．９７ｇ，３９．０ｍｍｏｌ）の攪拌不均一混合物に、室温、窒素雰囲気下で、最小量のＤＭＡ（６０ｍＬ）を加え、均一溶液を得た。次いで、ＬｉＣｌ（１．６５ｇ，３９．０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を０℃（浴槽）で１５分間にわたって攪拌した。次いで、冷溶液Ｂを加え、反応物を０℃で２分間にわたって攪拌した。次いで、冷溶液Ａを加え、最終反応混合物を０℃、窒素雰囲気下でさらに攪拌した。反応は、ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０：１）によってモニタリングされた。３０分後、さらなるＫＯＨ（５．０ｇ，８９ｍｍｏｌ）を加え、反応物を０℃で１．５時間にわたってさらに攪拌した。次いで、それを水（１，０００ｍＬ）中に注いだ。石油エーテル（１，０００ｍＬ）を加え、混合物を室温で２０分間にわたって攪拌した。石油エーテル層をデカントした後、さらなる石油エーテル（６００ｍＬ）を加え、混合物を再度１５分間にわたって攪拌した。固体を、ろ過により集め、水（５×２００ｍＬ）で洗浄し、減圧下にシリカゲル／ＫＯＨにより乾燥させ、（２Ｅ）−Ｎ−［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（１６１）（１６．９ｇ，９７％）を得た。

（Ｂ．１．１．１．２（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝−２−ブテナミド（１７０））
６−フルオロピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（９３）（４．９０ｇ，２９．６８ｍｍｏｌ）の、ＳＯＣｌ_２（２５０ｍＬ）、ＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）およびＤＭＦ（８滴）中の懸濁液を３時間にわたって還流加熱した。次いで、溶媒を真空蒸留によって除去し、残渣を蒸発乾固させた。得られた粗４−クロロ−６−フルオロピリド［３，４−ｄ］ピリミジンを、ＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）および^ｉＰｒＯＨ（１２０ｍＬ）に溶解させ、それに、４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリン（５．８５ｇ，３２．６６ｍｍｏｌ）を加えた後、溶液を、空気冷却器を使用して、８４℃で３０分間にわたって還流加熱した。還流中にＣＨ_２Ｃｌ_２を蒸発させ、残留する^ｉＰｒＯＨから淡黄色の固体として粗生成物が沈殿した。混合物を室温に冷却し、５％Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液の氷冷ビーカー中に注ぎ、０℃で１５分間にわたって攪拌した。固体を、ろ過により集め、水、次いで、ヘキサンで数回洗浄した後、真空炉内（４５℃）で終夜乾燥させ、６−フルオロ−Ｎ−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（１６３）（９．６８ｇ，１００％）を、黄色の固体として得た。

m.p.247〜249℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 10.25(s, 1H), 8.99(s, 1H), 8.75(s, 1H), 8.34(dd, J=6.5, 2.7Hz, 1H), 8.26-8.30(m, 1H), 8.24(s, 1H), 7.60(t, J=9.7Hz, 1H).C₁₄H₇F₅N₄の分析計算値:C, 51.54 ;H, 2.16 ;N, 17.17%;実測値:C, 51.37 ;H, 2.30 ;N, 16.93%.
化合物１６３（１４．３０ｇ，４３．８７ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（９０ｍＬ）中の攪拌溶液を、４−メトキシベンジルアミン（５７．３ｍＬ，４８２．５２ｍｍｏｌ）を窒素下、７０℃でゆっくりと添加することにより処理した。得られた混合物を７０〜７５℃で４８時間にわたって攪拌し、次いで、室温に冷却し、氷水（１Ｌ）のビーカー中に攪拌しながら注いだ。得られた固体を、ろ過により集め、水で洗浄し、真空炉内（４５℃）で２時間にわたって乾燥させた。粗生成物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２を用いてすり潰し、Ｎ^４−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−Ｎ^６−（４−メトキシベンジル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（１６６）（１４．４０ｇ，７４％）を、黄色の固体として得た。

m.p.202〜204℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 9.83(s, 1H), 8.77(s, 1H), 8.38(s, 1H), 8.27-8.30(m, 1H), 8.21-8.24(m, 1H), 7.55(t, J=9.7Hz, 1H), 7.28-7.34(m, 3H), 7.17(s, 1H), 6.86-6.90(m, 2H), 4.50(d, J=6.3Hz, 2H), 3.71(s, 3H).C₂₂H₁₇F₄N₅Oの分析計算値:C, 59.59 ;H, 3.86 ;N, 15.79%;実測値:C, 59.31 ;H, 4.07 ;N, 15.46%.
化合物１６６（１．０ｇ，２．２６ｍｍｏｌ）のＴＦＡ（２０ｍＬ）中の攪拌溶液を、アニソール（４９０μＬ，４．５１ｍｍｏｌ）により室温で処理した。混合物を終夜攪拌し、次いで、酢酸エチルで希釈し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、ヘキサンを用いてすり潰し、次いで、アンモニア水（５Ｎ，１００ｍＬ）により、３０分間にわたり攪拌しながら処理した。得られた固体を、ろ過により集め、水で洗浄し、真空下で乾燥させ、Ｎ^４−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（１６８）（７２０ｍｇ，９９％）を、黄色の固体として得た。

m.p.252〜255℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 9.90(s, 1H), 8.72(s, 1H), 8.38(s, 1H), 8.34(dd, J=6.5, 2.6Hz, 1H), 8.24-8.28(m, 1H), 7.54(t, J=9.7Hz, 1H), 7.14(s, 1H), 6.30(s, 2H).C₁₄H₉F₄N₅.0.55EtOAcの分析計算値:C, 52.35 ;H, 3.63 ;N, 18.84%;実測値:C, 51.96 ;H, 3.70 ;N, 18.46%.
ＤＣＣ（６３３ｍｇ，３．０７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）中の攪拌溶液を、窒素下で、酸９（５０６ｍｇ，３．０７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中の溶液により０℃で処理した。混合物を２時間にわたって攪拌し、次いで、ＤＭＡ（２ｍＬ）中の化合物１６８（２００ｍｇ，０．６２ｍｍｏｌ）、続いて、ジ−イソ−プロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５３５μＬ，３．０７ｍｍｏｌ）で処理した後、さらに３時間にわたって０℃で攪拌した。このようにして形成された、得られた粗（Ｅ）−４−ブロモ−Ｎ−（４−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニルアミノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル）ブタ−２−エナミドをin situで４０％ジメチルアミン水溶液（９４２μＬ，１８．６０ｍｍｏｌ）により０℃で、攪拌しながら１時間にわたって処理した。次いで、混合物を、酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、次いで、氷水（６００ｍＬ）のビーカー中に注ぎ、１０分間にわたって攪拌し、次いで、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機抽出物を、２％冷Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液、水および食塩水で洗浄した後、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、減圧下で濃縮した。残渣を、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（９：１）を用いて溶出するシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーによって精製した。次いで、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ジイソプロピルエーテルからの再結晶化によって、（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝−２−ブテナミド（１７０）（１７５ｍｇ，６５％）を、淡黄色の固体として得た。

mp 170〜172℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 10.93(s, 1H), 10.42(s, 1H), 9.04(s, 1H), 9.01(s, 1H), 8.64(s, 1H), 8.24-8.28(m, 2H), 7.56(t, J=9.6Hz, 1H), 6.88(dt, J=15.4, 6.0Hz, 1H), 6.53(d, J=15.4Hz, 1H), 3.10(dd, J=6.0, 1.1Hz, 2H), 2.19(s, 6H).C₂₀H₁₈F₄N₆O.0.4CH₂Cl₂の分析計算値:C, 52.32 ;H, 4.05 ;N, 17.94%;実測値: C, 51.99; H, 4.28; N, 18.07%.
（Ｂ．１．１．１．３（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］−２−ブテナミド（１７１））
６−フルオロピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（９３）（６．６４ｇ，４０．２ｍｍｏｌ）、塩化チオニル（１５０ｍＬ）および触媒量のＤＭＦ（５滴）の懸濁液を還流下に３０分間にわたって攪拌し、均一混合物を得、この混合物を減圧下、４５℃（浴温）で蒸発させ、明るい褐色の固体を得た。この固体に、３−エチニルアニリン（６．５６ｇ，４４．２ｍｍｏｌ）および無水ＤＭＡ（４０ｍＬ）の混合物を加えた。次いで、反応混合物を室温で４０分間にわたって攪拌した後、５％炭酸水素ナトリウム溶液（５００ｍＬ）を加え、得られた混合物を室温で１５分間にわたって攪拌した。固体を、ろ過により集め、水、次いで、ヘキサンでそれぞれ数回洗浄した。次いで、固体を真空下、シリカゲルにより乾燥させ、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６−フルオロピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（１６４）（１０．５ｇ，９９％）を得た。

mp 225〜227℃;¹H NMR δ[(CD₃)₂SO] 10.06(s, 1H), 8.96(s, 1H), 8.74(s, 1H), 8.28(d(不十分な分解), J=0.6Hz, 1H), 8.10(t, J=1.7Hz, 1H), 7.95-7.90(m, 1H), 7.46(t, J=7.9Hz, 1H), 7.32-7.27(m, 1H), 4.22(s, 1H).C₁₅H₉BrFN₄の分析計算値:C, 68.18 ;H, 3.43 ;N, 21.20%.実測値:C, 67.80 ;H, 3.50 ;N, 20.81%.
化合物１６４（８．９０ｇ，３３．７ｍｍｏｌ）および４−メトキシベンジルアミン（４４．２ｍＬ，３３７ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＳＯ（８０ｍＬ）中の混合物を窒素下、７０℃（浴温）で１５８時間にわたって攪拌した。得られた溶液を簡単に冷却し、次いで、石油エーテルと共に、室温で１５分間にわたって攪拌した後、石油エーテル層をデカントした（２×４００ｍL）。水（４００ｍＬ）をＤＭＳＯ層に加え、混合物を室温で３時間にわたって攪拌した。そのようにして沈殿させた固体を、ろ過により集め、水で洗浄した（５×１００ｍＬ）後、乾式吸引し、次いで、石油エーテルで洗浄し（２×１００ｍＬ）、再度乾式吸引した。得られた褐橙色の固体を温アセトン（４００ｍＬ）に溶解させ、水（５００ｍＬ）を加えた。次いで、混合物を室温で１時間にわたって攪拌し、得られた固体を、ろ過により集め、アセトン／水（１：１，５×８０ｍＬ）で洗浄し、真空でシリカゲル上で乾燥させ、Ｎ^４−（３−エチニルフェニル）−Ｎ^６−（４−メトキシベンジル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（１６７）（１０．３ｇ，８０％）を、黄色／橙色の固体として得た。

mp 200〜203℃;¹H NMR δ [(CD₃)₂SO] 9.63(s, 1H), 8.75(s, 1H), 8.38(s, 1H), 8.03(br s, 1H), 7.94-7.88(m, 1H), 7.41(t, J=7.9Hz, 1H), 7.34(br d, J=8.6Hz, 2H), 7.28-7.21(m, 2H), 7.19 (s,1H), 6.92-6.85(m, 2H), 4.50(d, J=6.3Hz, 2H), 4.19(s, 1H), 3.71(s, 3H).C₂₃H₁₉N₅Oの分析計算値:C, 72.42 ;H, 5.02 ;N, 18.36%.実測値:C, 72.28 ;H, 5.05 ;N, 18.22%.
化合物１６７（１２．３ｇ，３２．３ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（３２５ｍＬ）中の攪拌均一溶液に、トリフルオロ酢酸（２４．５ｍＬ，３２３ｍｍｏｌ）、続いて、アニソール（７．１１ｍＬ，６４．６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、室温で７０時間にわたって攪拌し、次いで、石油エーテル（１Ｌ）中に注ぎ、室温で約３０分間にわたって攪拌した。石油エーテル層をデカントし、廃棄した。この処理を、さらなる石油エーテル（８００ｍＬ）を用いて繰り返した。残った残渣を、アセトン／水（１：１，２００ｍＬ）に溶解させ、５ＭＮＨ_３（５００ｍＬ）とともに室温で１時間にわたって攪拌した。固体を、ろ過により集め、アセトン／水（１：４、５×１００ｍＬ）、次いで、石油エーテル／酢酸エチル（３：１、５×１００ｍＬ）で逐次洗浄した後、真空で乾燥させ、Ｎ^４−（３−エチニルフェニル）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（１６９）（８．５６ｇ，９８％）を得た。

mp 220〜225℃(分解);¹H NMR δ [(CD₃)₂SO] 9.69(s, 1H), 8.70(s, 1H), 8.38(s, 1H), 8.08(t, J=1.7Hz, 1H), 7.95-7.89(m, 1H), 7.40(t, J=7.9Hz, 1H), 7.34(br d, J=7.7Hz, 1H), 7.16(s, 1H), 6.25(s, 2H), 4.17(s, 1H).C₁₅H₁₁N₅.2H₂O.0.2CH₃COCH₃の分析計算値:C, 60.65 ;H, 5.29 ;N, 22.67%. 実測値:C, 60.54 ;H, 5.01 ;N, 22.56%.
ＤＣＣ（７．２３ｇ，３５．１ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２５ｍｌ）中の溶液に、０℃、窒素下で、固体酸９（５．７９ｇ，３５．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で３５分間にわたって攪拌した後、固体アニリン１６９（１．８３ｇ，７．０１ｍｍｏｌ）、続いて、無水ＤＭＡ（２０ｍＬ）およびジ−イソ−プロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（６．１１ｍＬ，３５．１ｍｍｏｌ）を加えた。最終反応混合物を０℃で４５分間にわたって攪拌した後、−１５〜−２０℃（浴槽）に冷却した。次いで、４０％ジメチルアミン水溶液（１０．６ｍＬ，８４．０ｍｍｏｌ）を加え、２５分後に反応混合物を冷２％炭酸ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）中に注ぎ、生成物を酢酸エチル（６００ｍＬ）中に抽出し、これを、水（３００ｍＬ）、冷２％炭酸ナトリウム水溶液（３００ｍＬ）および水（３００ｍＬ）で逐次洗浄した。酢酸エチル溶液を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、減圧下で蒸発させ、固体を得、この固体を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１００：０から１５：１への勾配）を用いて溶出するシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーによって精製し、（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］−２−ブテナミド（１７１）（１．３３ｇ，５１％）を、黄色／橙色の固体として得た。

mp 163〜166℃;¹H NMR δ[(CD₃)₂SO] 10.89(s, 1H), 10.25(s, 1H), 9.02(s, 1H), 9.00(s, 1H), 8.63(s, 1H), 8.02(br s, 1H), 7.94-7.87(m, 1H), 7.42(t, J=7.9Hz, 1H), 7.26(br d, J=7.7Hz, 1H), 6.88(dt, J=15.4, 6.0Hz, 1H), 6.52(br d, J=15.4Hz, 1H), 4.19(s, 1H), 3.09(dd, J=6.0, 1.2Hz, 2H), 2.19(s, 6H).C₂₁H₂₀N₆O.0.2H₂Oの分析計算値:C, 67.08 ;H, 5.47 ;N, 22.35%.実測値:C, 66.88 ;H, 5.47 ;N, 22.22%.
（Ｂ．１．１．２還元的トリガーα−メチルブロミドの合成）
（Ｂ．１．１．２．１５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（スキーム８、ルート３））
化合物１０１（２０．０ｇ，１５７．３６ｍｍｏｌ）（Chauviere et al., J. Med. Chem., 2003, 46, 427〜440の方法に従って調製）およびＫ_２ＣＯ_３（３２．６２ｇ，２３６．０４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２００ｍＬ）中の懸濁液に、０℃で、ヨウ化メチル（１４．７０ｍＬ，２３６．０４ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、室温に加温し、次いで、２時間にわたって攪拌した後、過剰のヨウ化メチルを室温で蒸発させた。沈殿物をろ過により除去し、ＤＭＦろ液を減圧下、４５〜５０℃で濃縮した。得られた残渣をＭｅＣＮ／ＤＣＭ（１：９）で完全に抽出し、合わせた抽出物を、シリカゲルのショートカラムを通してろ過した。溶媒を除去した後、粗生成物をＭｅＣＮおよびトルエンから再結晶化させ、化合物１１１を、灰白色の結晶性固体として得た（１５．７４ｇ，７１％）。m.p.161〜163℃。¹H NMR(CDCl₃) δ 7.33(s, 1H), 3.65(s, 3H), 2.63(s, 3H)。これまでに報告されているものと同一である（Hosmane et al., J. Org. Chem., 1985, 50(26), 5892〜5）。

化合物１１１（４．００ｇ，２８．３４ｍｍｏｌ）およびＮＢＳ（５．３０ｇ，２９．７８ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２００ｍＬ）中の溶液を、還流下に２時間にわたって、１０００Ｗタングステンハロゲン化物ランプで照射した。溶媒のおよそ半分を真空で除去した後、水（１００ｍＬ）を加えた。減圧下でのさらなる濃縮によって、白色の沈殿物を得、この沈殿物を、ろ過により集め、水で洗浄し、真空下で乾燥させ、５−（ブロモメチル）−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１０５）（４．６９ｇ，７５％）を、白色の固体として得た。¹H NMR(CDCl₃) δ 7.44(s, 1H), 4.89(s, 2H), 3.78(s, 3H).これまでに報告されているものと同一である（Stribbling et al., PCT国際特許公報WO2008/039087）。

（Ｂ．１．１．２．２５−（ブロモメチル）−１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１２２）（スキーム１０））
化合物１１８（５０．０ｇ，３９３．３９ｍｍｏｌ）およびＫ_２ＣＯ_３（８１．５５ｇ，５９０．０８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３００ｍＬ）中の懸濁液に、０℃で、ヨウ化メチル（３６．７４ｍＬ，５９０．０８ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、室温に加温させ、次いで、２時間にわたって攪拌した後、過剰のヨウ化メチルを室温で蒸発させた。沈殿物をろ過により除去し、ＤＭＦろ液を減圧下、４５〜５０℃で濃縮した。得られた残渣を、ＭｅＣＮ／ＤＣＭ（１：９）で完全に抽出し、シリカゲルのショートカラムを通してろ過した。溶媒を除去した後、粗生成物をＭｅＣＮ（少量のＭｅＯＨを含有）およびトルエンから再結晶化させ、化合物１１９（５２．２２ｇ，９４．０％）を、白色の結晶性固体として得た。¹H NMR(CDCl₃) δ 7.66(s, 1H), 3.67(s, 3H), 2.43(s, 3H).LR-MS(APCI +ve):m/e 142.5 (M+1).これまでに報告されているものと同一であった（Rav-Acha and Cohen, J. Org. Chem., 1981, 46(23), 4717〜4720）。

化合物１１９（３３．０ｇ，２３３．８３ｍｍｏｌ）およびｔ−ブチルジクロロアセタート（６４．９０ｇ，３５０．７４ｍｍｏｌ）（ＤＣＭ中、ジクロロアセチルクロリド、ｔ−ブタノールおよびトリエチルアミンから調製）のＤＭＦ（４００ｍＬ）中の溶液を、カリウムｔ−ブトキシド（９１．８３ｇ，８１８．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４００ｍＬ）中の懸濁液に、−３５〜−２５℃（ドライアイス／ＭｅＣＮ浴）で滴下した。得られた混合物を−２５℃でさらに２０分間にわたって攪拌した後、０．５ＮＨＣｌ（およそ１０００ｍＬ）中に注いだ。次いで、標準的な酢酸エチル／水のワークアップおよび酢酸エチル／ヘキサン（３：２）を用いて溶出するシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーによって、粗化合物１２０を、暗色の固体（２３．８３ｇ，３５％）として得、この固体を、さらなる精製を行わずに使用した。LR-MS(APCI +ve)m/e 290.5/292.5(3:1, M+1).
上記のようにして調製された化合物１２０（２３．８３ｇ，８２．２５ｍｍｏｌ）を、還流酢酸（１２０ｍＬ）で４５分間にわたって処理した後、減圧下で濃縮乾固した。次いで、残渣の標準的なＮａＨＣＯ_３／ＤＣＭのワークアップ、続いての、酢酸エチルを用いて溶出するシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーによって、化合物１２１（１０．００ｇ，６４％）を、白色の固体として得た。

¹H NMR(CDCl₃) δ 5.03(s, 2H), 3.67(s, 3H), 2.46(s, 3H).LR-MS(APCI +ve):m/e 190.4/192.4(3:1, M+1).
化合物１２１（１０．００ｇ，５２．７４ｍｍｏｌ）およびＬｉＢｒ（４．８０ｇ，５５．２０ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（５００ｍＬ）中の懸濁液を４時間にわたって還流加熱した後、標準的な酢酸エチル／水のワークアップに付した。そのようにして得られた固体をもう一度、上記のようにＬｉＢｒ／酢酸エチルで処理した。次いで、粗生成物をＤＣＭ／ｉ−Ｐｒ_２Ｏからヘキサンの添加により沈殿させ、５−（ブロモメチル）−１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１２２）（１１．４６ｇ，９３％）を、灰白色の固体として得た。

¹H NMR(CDCl₃) δ 4.88(s, 2H), 3.64(s, 3H), 2.46(s, 3H).C₅H₆BrN₃O₂.4%ヘキサンの分析計算値:C, 28.16 ;H, 2.96 ;N, 18.80%.実測値:C, 27.81 ;H, 3.27 ;N, 19.05%.
LR-MS(APCI +ve):m/e 234.4/236.4(1:1, M+1).
（Ｂ．１．１．２．３５−（ブロモメチル）−２−メトキシ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１２５）（スキーム１１））
化合物１１１（１２．６５ｇ，９０．００ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１００ｍＬ）中の懸濁液に、臭素（５．５３ｍＬ，１０８．００ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。次いで、得られた混合物を２時間にわたって攪拌した後、水（１３０ｍＬ）を加えた。次いで、クロロホルムを蒸留によって除去し、得られた沈殿物を、ろ過により集め、水で洗浄し、真空下で乾燥させ、化合物１２３（１５．５０ｇ，７９％）を、白色の固体として得た。

m.p.180〜181℃；報告された値と同一であった（Pyman and Timmis, J. Chem. Soc., Trans., 1923, 123, 494〜503）。¹H NMR(CDCl₃) δ 3.63(s, 3H), 2.69(s, 3H).
C₅H₆BrN₃O₂の分析計算値:C, 27.29 ;H, 2.75 ;N, 19.10%.実測値:C, 27.56 ;H, 2.83 ;N, 19.10%.LR-MS(APCI +ve):m/e 220.3/222.3(1:1, M+1).
化合物１２３（１．００ｇ，４．５４ｍｍｏｌ）の還流ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）中の溶液を、過剰のＮａＯＭｅ（１．７２ｇ，３１．７８ｍｍｏｌ）で３時間にわたって処理した。次いで、減圧下に溶媒を除去し、得られた残渣を、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：９）に懸濁させ、シリカゲルのショートカラムを通してろ過した。次いで、真空下に溶媒を除去し、化合物１２４（４４２ｍｇ，５７％）を、灰白色の固体として得た。

m.p.103〜105℃。¹H NMR(CDCl₃) δ 4.11(s, 3H), 3.40(s, 3H), 2.59(s, 3H).C₆H₉N₃O₃の分析計算値:C, 42.10 ;H, 5.30 ;N, 24.55%.実測値:C, 42.20 ;H, 5.37 ;N, 24.61%.LR-MS(APCI +ve):m/e 172.5(M+1).
化合物１２４（７５０ｍｇ，４．３８ｍｍｏｌ）およびＮＢＳ（８５８ｍｇ，４．８２ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（３０ｍＬ）中の溶液を、還流下に１０分間にわたって１０００Ｗのタングステンハロゲン化物ランプで照射した。次いで、真空下に溶媒を除去し、残渣を、酢酸エチル／ヘキサン（１：２から２：１への勾配）を用いて溶出するシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーに付し、５−（ブロモメチル）−２−メトキシ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（１２５）（２００ｍｇ，１８％）を、白色の固体として得た。

¹H NMR(CDCl₃) δ 4.85(s, 2H), 4.14(s, 3H), 3.51(s, 3H).LR-MS(APCI +ve):m/e 250.4/252.4(1:1, M+1).
（Ｂ．１．１．２．４３−［５−（ブロモメチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］プロパンニトリル（１１５）（スキーム９，ルート２））
化合物１０１（１．００ｇ，７．８７ｍｍｏｌ）、アクリロニトリル（１．５６ｍＬ，２３．６０ｍｍｏｌ）およびＭＴＢＤ（４８ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１０ｍＬ）中の混合物を終夜（１６時間）還流加熱した。次いで、混合物をろ過し、ある程度の沈殿物を除去し、ろ液にトルエン（１０ｍＬ）を加えた。次いで、得られた溶液を減圧下に部分濃縮し、アセトニトリルを除去し白色の沈殿物を得、この沈殿物を、ろ過により集め、化合物１１７（１．２６ｇ，８９％）を、灰白色の固体として得た。

¹H NMR(d⁶-DMSO) δ 7.84(s, 1H), 4.37(t, J=6.6Hz, 2H), 3.08(t, J=6.6Hz, 2H), 2.61(s, 3H).LR-MS(APCI +ve):m/e 181.4 (M+1).
化合物１１７（５４０ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）およびＮＢＳ（５６０ｍｇ，３．１５ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２０ｍＬ）中の溶液を、還流下に１時間にわたって、１０００Ｗのタングステンハロゲン化物ランプで照射した。真空下に溶媒のおよそ半分を除去した後、水（１０ｍＬ）を加えた。減圧下でのさらなる濃縮によって、白色の沈殿物を得、この沈殿物を、ろ過により集め、水で洗浄し、真空下に乾燥させ、３−［５−（ブロモメチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］プロパンニトリル（１１５）（６８９ｍｇ，８９％）を、灰白色の固体として得た。

¹H NMR(d⁶-DMSO) δ 8.04(s, 1H), 5.08(s, 2H), 4.48(t, J=6.8Hz, 2H), 3.17(t, J=6.8Hz, 2H).LR-MS(APCI +ve):m/e 259.4/261.4(1:1, M+1).
（Ｂ．１．１．２．６３−［５−（ブロモメチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］プロパンアミド（１１６）（スキーム９，ルート２））
３−［５−（ブロモメチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］プロパンニトリル（１１５）（６８０ｍｇ，２．６２ｍｍｏｌ）を９０％硫酸（５ｍＬ）により６５〜７０℃で１時間にわたって処理した後、氷上に注いだ。標準的な酢酸エチル／ＮａＨＣＯ_３のワークアップの後、得られた粗生成物をＴＨＦからｉ−Ｐｒ_２Ｏの添加により沈殿させ、３−［５−（ブロモメチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］プロパンアミド（１１６）（４２０ｍｇ，５８％）を、灰白色の固体として得た。

m.p.139〜141℃。¹H NMR (d⁶-DMSO) δ 7.90(s, 1H), 7.44(br, 1H), 7.00(br, 1H), 5.06(s, 2H), 4.32(t, J=6.8Hz, 2H), 2.70(t, J=6.8Hz, 2H).LR-MS(APCI +ve):m/e 277.5/279.5(1:1, M+1).
（Ｂ．１．１．３四級アンモニウム塩還元的プロドラッグの合成（スキーム１６〜１９））
（方法Ｄ：ＮＭＰ中での四級アンモニウム塩プロドラッグの調製、続いてのＥｔ_２Ｏ沈殿）
ジメチルアミンエフェクタのＮ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中の溶液に、α−メチルブロミドトリガー（０．７〜１．０当量）を、少量ずつ、窒素下に加えた。次いで、得られた混合物を１２時間〜数日間にわたって攪拌した後、ジエチルエーテルを加えた。このようにして形成された沈殿物を、ろ過により集め、ＤＣＭで完全に洗浄した。次いで、粗生成物を、数滴のトリエチルアミンを含有する、アセトニトリルおよびジオキサンの混液からの分別沈殿によってさらに精製した（必要に応じて１〜３回行った）。沈殿生成物を、遠心分離により集め、続いて、母液のデカンテーションを行った。次いで、生成物をＴＨＦ／ＤＣＭ（１：１）、次いで、ヘキサンで洗浄した後、真空下で乾燥させ、プロドラッグを、白色または灰白色の固体として得た。

（方法Ｅ：ＮＭＰ中での四級アンモニウム塩プロドラッグの調製、続いてのＭｅＣＮ沈殿）
ジメチルアミンエフェクタのＮＭＰ溶液に、α−メチルブロミドトリガー（１．０〜１．２当量）を加えた。得られた混合物を終夜（約１５時間）攪拌した。次いで、ＭｅＣＮを反応混合物に、沈殿物の形成が始まるまで攪拌を続けながら滴下した。次いで、得られた混合物をさらに２時間にわたって攪拌した後、沈殿物をろ過によりまたは遠心分離により集め、ＭｅＣＮ、酢酸エチルおよびヘキサンで洗浄した。次いで、真空下で乾燥することによって、プロドラッグを、白色または灰白色の固体として得た。必要な場合には、生成物を、ＮＭＰおよびＭｅＣＮからの再結晶によってさらに精製した。

（Ｂ．１．１．３．１（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４２））
ＮＭＰ（３ｍＬ）中で化合物１６１（５００ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド１０５（２２５ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）と１６時間にわたって方法Ｃに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４２）（６５８ｍｇ，９７％）を得た。

m.p.166〜170℃。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.31(s, 1H), 10.35(s, 1H), 9.07(s, 1H), 9.00(s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.25-8.23(dd, J=6.4, 2.6Hz, 1H), 8.14(s, 1H), 7.90-7.86(m, 1H), 7.44(t, J=8.8Hz, 1H), 7.06-6.99(m, 1H), 6.80(d, J=15.3Hz, 1H), 5.06(br s, 2H), 4.45(d, J=7.2Hz, 2H), 3.88(s, 3H), 3.13(s, 6H).C₂₄H₂₄Br₂FN₉O₃・1.2H₂Oの分析計算値:C, 41.96 ;H, 3.87 ;N, 18.35%.実測値:C, 42.05 ;H, 3.77 ;N, 18.14%.
ＮＭＰ（５ｍＬ）中で化合物１６１（２．０ｇ，４．４９ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド１０５（１１８６ｍｇ，５．３９ｍｍｏｌ）と方法Ｄに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４２）（２．１１ｇ，７０％）を得た。^１ＨＮＭＲは上記と同一である。

（Ｂ．１．１．３．２（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４３））
ＮＭＰ（３ｍＬ）中で化合物１６１（７００ｍｇ，１．５７ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミドIIa-2（４４２ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）と方法Ｄに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４３）（７５０ｍｇ，７０％）を得た。

m.p.181〜184℃。¹H NMR [(CD₃)₂SO] δ 11.30(s, 1H), 10.36(s, 1H), 9.07(s, 1H), 9.00(s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.25-8.23(dd, J=6.4, 2.6Hz, 1H), 7.90-7.86(m, 1H), 7.44(t, J=8.8Hz, 1H), 7.07-6.99(m, 1H), 6.80(d, J=15.3Hz, 1H), 5.07(br s, 2H), 4.44(d, J=7.0Hz, 2H), 3.76(s, 3H), 3.11(s, 6H), 2.44(s, 3H).C₂₅H₂₆Br₂FN₉O₃・0.1ヘキサン・1.2H₂Oの分析計算値:C, 43.33 ;H, 4.23 ;N, 17.76%.実測値:C, 43.21 ;H, 4.46 ;N, 17.77%.
（Ｂ．１．１．３．３（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−エチル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７２））
ＮＭＰ（３ｍＬ）中で化合物１６１（７００ｍｇ，１．５７ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド２０１（４６８ｍｇ，１．８９ｍｍｏｌ）と方法Ｄに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−エチル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７２）（９３０ｍｇ，８５％）を得た。

m.p.173〜176℃。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.30(s, 1H), 10.35(s, 1H), 9.06(s, 1H), 9.00(s, 1H), 8.65(s, 1H), 8.25-8.23(dd, J=6.4, 2.6Hz, 1H), 7.90-7.86(m, 1H), 7.43(t, J=8.8Hz, 1H), 7.06-6.99(m, 1H), 6.80(d, J=15.3Hz, 1H), 5.07(br s, 2H), 4.44(d, J=7.2Hz, 2H), 3.76(s, 3H), 3.11(s, 6H), 2.79(q, J=7.4Hz, 2H), 1.29(t, J=7.4Hz, 3H).C₂₆H₂₈Br₂FN₉O₃・0.05ヘキサン・2H₂Oの分析計算値:C, 43.05, H, 4.49, N, 17.18%.実測値: C, 43.17 ;H, 4.75 ;N, 17.36%.
（Ｂ．１．１．３．４（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−メトキシ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４４））
ＮＭＰ（３ｍＬ）中で化合物１６１（４８１ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド１２５（２７０ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ）と１５時間にわたって方法Ｃに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−メトキシ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４４）（５３０ｍｇ，７１％）を得た。

m.p.245℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.29(s, 1H), 10.35(s, 1H), 9.06(s, 1H), 9.00(s, 1H), 8.65(s, 1H), 8.25-8.22(m, 1H), 7.90-7.86(m, 1H), 7.43(t, J=8.8Hz, 1H), 7.06-6.99(m, 1H), 6.79(d, J=15.3Hz, 1H), 5.07(br, 2H), 4.42(d, J=7.2Hz, 2H), 4.09(s, 3H), 3.57(s, 3H), 3.12(s, 6H).C₂₅H₂₆Br₂FN₉O₄・0.2ヘキサン・1.5H₂Oの分析計算値:C, 42.55 ;H, 4.33 ;N, 17.04%.実測値:C, 42.47 ;H, 4.14 ;N, 16.89%.
（Ｂ．１．１．３．５（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−｛［１−（２−シアノエチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４９））
ＮＭＰ（２ｍＬ）中で化合物１６１（７００ｍｇ，１．５７ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド１１５（４１１ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ）と１５時間にわたって方法Ｃに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−｛［１−（２−シアノエチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４９）（８９７ｍｇ，８１％）を得た。

m.p.132℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.31(s, 1H), 10.35(s, 1H), 9.07(s, 1H), 9.00(s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.32(s, 1H), 8.25-8.22(dd, J=6.4, 2.8Hz, 1H), 7.90-7.86(m, 1H), 7.44(t, J=8.8Hz, 1H), 7.04-6.97(m, 1H), 6.79(d, J=15.2Hz, 1H), 5.08(br, 2H), 4.61(t, J=6.8Hz, 2H), 4.43(d, J=6.8Hz, 2H), 3.20(t, J=6.8Hz, 2H), 3.11(s, 6H).C₂₆H₂₅Br₂FN₁₀O₃・0.8THF・H₂Oの分析計算値:C, 44.96 ;H, 4.32 ;N, 17.96%.実測値:C, 44.80 ;H, 4.48 ;N, 17.84%.
（Ｂ．１．１．３．６（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（３−アミノ−３−オキソプロピル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４７））
ＮＭＰ（２ｍＬ）中で化合物１６１（４００ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド１１６（２４９ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）と１５時間にわたって方法Ｃに従って反応させることによって、（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（３−アミノ−３−オキソプロピル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４７）（３０６ｍｇ，４７％）を得た。

m.p.168℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.31(s, 1H), 10.36(s, 1H), 9.07(s, 1H), 9.00(s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.25-8.23(m, 2H), 7.90-7.86(m, 1H), 7.46-7.42(m, 2H), 7.05-6.98(m, 2H), 6.80(d, J=15.3Hz, 1H), 5.12(br s, 2H), 4.47-4.41(m, 4H), 3.12(s, 6H), 2.76(t, J=6.2Hz, 2H).C₂₆H₂₇Br₂FN₁₀O₄・0.3THF・1.5H₂Oの分析計算値:C, 42.37 ;H, 4.24 ;N, 18.17%.実測値:C, 42.40 ;H, 4.20 ;N, 18.17%.
（Ｂ．１．１．３．７（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−｛［１−メチル−４−ニトロ−２−（１−プロピニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７３））
ＮＭＰ（０．５ｍＬ）中で化合物１６１（１００ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド２００（６４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）と方法Ｅに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−｛［１−メチル−４−ニトロ−２−（１−プロピニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７３）（９４ｍｇ，６０％）を得た。

m.p.185〜188℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.30(s, 1H), 10.35(s, 1H), 9.07(s, 1H), 9.00(s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.25-8.22(dd, J=6.4, 2.6Hz, 1H), 7.90-7.86(m, 1H), 7.44(t, J=8.8Hz, 1H), 7.05-6.98(m, 1H), 6.79(d, J=15.3Hz, 1H), 5.05(br, 2H), 4.43(d, J=6.9Hz, 2H), 3.86(s, 3H), 3.13(s, 6H), 2.22(s, 3H).分析値:C, 44.59 ;H, 3.92 ;N, 16.97%.C₂₇H₂₆Br₂FN₉O₃・1.5H₂O理論値:C, 44.40 ;H, 4.00 ;N, 17.26%.
（Ｂ１．１．３．８（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−シアノ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４８））
ＮＭＰ（０．５ｍＬ）中で化合物１６１（１００ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド１２７（６３ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）と方法Ｅに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−シアノ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４８）（１３２ｍｇ，８５％）を得、これを、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ／ＴＦＡを用いて溶出する分取ＨＰＬＣによってさらに精製し、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−シアノ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムトリフルオロアセタート（４８ＴＦ）（１１２ｍｇ，６９％）を得た。

m.p.151〜154℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.32(s, 1H), 10.39(s, 1H), 9.06(s, 1H), 9.01(s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.22(s, 1H), 7.86(s, 1H), 7.44(t, J=8.8Hz, 1H), 7.07-7.00(m, 1H), 6.79(d, J=15.2Hz, 1H), 5.15(br, 2H), 4.44(d, J=7.2Hz, 2H), 4.06(s, 3H), 3.15(s, 6H).
（Ｂ１．１．３．９（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７４））
ＮＭＰ（０．５ｍＬ）中で化合物１６１（１００ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を５−（ブロモメチル）−１−メチル−２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（IIIq-1）（５４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）（Everett et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 1267〜1272）と方法Ｅに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７４）（１３１ｍｇ，８８％）を得た。

m.p.197℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.29(s, 1H), 10.36(s, 1H), 9.07(s, 1H), 8.99(s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.24-8.22(dd, J=6.4, 2.6Hz, 1H), 7.89-7.85(m, 1H), 7.56(s, 1H), 7.44(t, J=8.8Hz, 1H), 7.03-6.96(m, 1H), 6.77(d, J=15.2Hz, 1H), 4.87(s, 2H), 4.29(d, J=7.2Hz, 2H), 4.02(s, 3H), 3.09(s, 6H).分析値:C, 41.72 ;H, 3.82 ;N, 18.18%.C₂₄H₂₄Br₂FN₉O₃・1.5H₂O理論値:C, 41.64 ;H, 3.93 ;N, 18.21%.
（Ｂ１．１．３．１０（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（４−エチル−１−メチル−２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７５））
ＮＭＰ（１ｍＬ）中で化合物１６１（２００ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）を５−（ブロモメチル）−４−エチル−１−メチル−２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール（IIIq-2）（１２３ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）（Jiao et al., WO2008151253 A1）と方法Ｅに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（４−エチル−１−メチル−２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７５）（１９８ｍｇ，８４％）を得た。

m.p.181〜184℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.29(s, 1H), 10.36(s, 1H), 9.07(s, 1H), 9.00(s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.24-8.22(dd, J=6.4, 2.6Hz, 1H), 7.89-7.85(m, 1H), 7.44(t, J=8.8Hz, 1H), 7.03-6.96(m, 1H), 6.76(d, J=15.2Hz, 1H), 4.86(s, 2H), 4.33(d, J=7.2Hz, 2H), 3.99(s, 3H), 3.06(s, 6H), 2.75-2.70(q, J=6.6Hz, 2H), 1.23(t, J=6.6Hz, 3H).分析値:C, 43.25 ;H, 4.21 ;N, 17.37%. C₂₆H₂₈Br₂FN₉O₃・1.6H₂O理論値:C, 43.24 ;H, 4.36 ;N, 17.46%.
（Ｂ．１．１．３．１１（２Ｅ）−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５０））
ＮＭＰ（３ｍＬ）中で化合物１７０（７００ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド１０５（４２５ｍｇ，１．９３ｍｍｏｌ）と方法Ｄに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５０）（８９５ｍｇ，８５％）を得た。

m.p.176〜180℃。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.32(s, 1H), 10.48(s, 1H), 9.08(s, 1H), 9.02(s, 1H), 8.67(s, 1H), 8.28-8.23(m, 2H), 8.14(s, 1H), 7.58(t, J=9.7Hz, 1H), 7.06-6.99(m, 1H), 6.81(d, J=15.3Hz, 1H), 5.06(br s, 2H), 4.45(d, J=7.3Hz, 2H), 3.88(s, 3H), 3.13(s, 6H).C₂₅H₂₄BrF₄N₉O₃・0.5(EtOAc)・H₂Oの分析計算値:C, 45.26 ;H, 4.22 ;N, 17.59%.実測値:C, 45.22 ;H, 4.43 ;N, 17.57%.
（Ｂ．１．１．３．１２（２Ｅ）−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５１））
ＮＭＰ（３ｍＬ）中で化合物１７０（７００ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド１２２（４５３ｍｇ，１．９３ｍｍｏｌ）と方法Ｄに従って反応させることによって、（２Ｅ）−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５１）（９０９ｍｇ，８４％）を得た。

m.p.174℃(分解)。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.32(s, 1H), 10.47(s, 1H), 9.08(s, 1H), 9.02(s, 1H), 8.67(s, 1H), 8.27-8.23(m, 2H), 7.57(t, J=9.7Hz, 1H), 7.07-6.99(m, 1H), 6.80(d, J=15.3Hz, 1H), 5.05(br s, 2H), 4.43(d, J=6.9Hz, 2H), 3.75(s, 3H), 3.11(s, 6H), 2.44(s, 3H).C₂₆H₂₆BrF₄N₉O₃・1.5H₂Oの分析計算値:C, 44.90 ;H, 4.20 ;N, 18.13%.実測値:C, 44.95 ;H, 4.42 ;N, 17.98%.
（Ｂ．１．１．３．１３（２Ｅ）−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５８））
ＮＭＰ（３ｍＬ）中で化合物１７１（５８０ｍｇ，１．５６ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド１０５（４１１ｍｇ，１．８６ｍｍｏｌ）と方法Ｄに従って反応させることによって、（２Ｅ）−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５８）（７３０ｍｇ，７９％）を得た。

m.p.179〜182℃。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.29(s, 1H), 10.30(s, 1H), 9.06(s, 1H), 9.02(s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.14(s, 1H), 8.02(t, J=1.6Hz, 1H), 7.90-7.88(dd, J=8.3, 1.1Hz, 1H), 7.43(t, J=8.0Hz, 1H), 7.27(d, J=7.4Hz, 1H), 7.07-6.99(m, 1H), 6.80(d, J=15.3Hz, 1H), 5.06(br s, 2H), 4.45(d, J=7.2Hz, 2H), 4.20(s, 1H), 3.88(s, 3H), 3.13(s, 6H).C₂₆H₂₆BrN₉O₃・1.3H₂Oの分析計算値:C, 50.71 ;H, 4.68 ;N, 20.47%.実測値:C, 50.63 ;H, 4.82 ;N, 20.26%.
（Ｂ．１．１．３．１４（２Ｅ）−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５９））
ＮＭＰ（３ｍＬ）中で化合物１７１（５８０ｍｇ，１．５６ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド１２２（４３７ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）と方法Ｄに従って反応させることによって、（２Ｅ）−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５９）（７０５ｍｇ，７５％）を得た。

m.p.177〜181℃。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.28(s, 1H), 10.31(s, 1H), 9.06(s, 1H), 9.02(s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.02(s, 1H), 7.89(d, J=8.2Hz, 1H), 7.43(t, J=8.0Hz, 1H), 7.27(d, J=7.6Hz, 1H), 7.07-6.99(m, 1H), 6.80(d, J=15.3Hz, 1H), 5.06(br s, 2H), 4.43(d, J=7.0Hz, 2H), 4.20(s, 1H), 3.75(s, 3H), 3.11(s, 6H), 2.44(s, 3H).
C₂₇H₂₈BrN₉O₃・1.3H₂Oの分析計算値:C, 51.48 ;H, 4.90 ;N, 20.01%.実測値:C, 51.54 ;H, 4.92 ;N, 19.88%.
（Ｂ．１．１．３．１５（２Ｅ）−Ｎ−［（２−エチル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７６））
ＮＭＰ（３ｍＬ）中で化合物１７１（４７５ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）をα−メチルブロミド２０１（３７５ｍｇ，１．５２ｍｍｏｌ）と方法Ｄに従って反応させることによって、（２Ｅ）−Ｎ−［（２−エチル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７６）（５９５ｍｇ，７５％）を得た。

m.p.173〜177℃。¹H NMR[(CD₃)₂SO] δ 11.29(s, 1H), 10.30(s, 1H), 9.06(s, 1H), 9.02(s, 1H), 8.66(s, 1H), 8.02(t, J=1.7Hz, 1H), 7.90-7.88(m, 1H), 7.43(t, J=8.0Hz, 1H), 7.27(d, J=7.7Hz, 1H), 7.07-6.99(m, 1H), 6.81(d, J=15.2Hz, 1H), 5.06(br s, 2H), 4.43(d, J=6.8Hz, 2H), 4.20(s, 1H), 3.76(s, 3H), 3.11(s, 6H), 2.79(q, J=7.4Hz, 2H), 1.29(t, J=7.4Hz, 3H).C₂₈H₃₀BrN₉O₃・1.2H₂Oの分析計算値:C, 52.37 ;H, 5.09 ;N, 19.63%.実測値:C, 52.31 ;H, 4.93 ;N, 19.76%.
（Ｂ．２．プロドラッグの有効性）
不可逆性erbB1、2、4インヒビター（１６１、１７０、１７１）が、フラグメント化還元的トリガーIIId-1（化合物１０５）を有するそれらの四級アンモニウム塩プロドラッグ（４２、５０、５８）と比較された。プロドラッグの不活性化の程度、低酸素下の細胞におけるそれらの活性化、一電子還元の際のそれらのフラグメント化および種々の腫瘍異種移植片におけるそれらの有効性を評価するために種々のアッセイが採用された。

（実験：方法および材料）
（Ｂ．２．１細胞erbB1阻害実験）
５％ウシ胎仔血清を含有するα最小必須培地（α−ＭＥＭ）で増殖する、ヒトA431類表皮癌腫細胞およびSKOV3卵巣癌腫細胞を、様々な濃度の試験化合物に１時間にわたって曝露し、その後、総細胞ライセートを調製した。細胞を、３００μＬの改変ＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４、１ｍＭのＮａＦおよび１×プロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma，１００ｘ））に溶解させ、氷上で３０分間にわたってインキュベートした。サンプルのタンパク質濃度を決定するためにＢＣＡアッセイを採用した。１５．６２５〜１０００μｇ／ｍＬの範囲のアルブミン標準（Pierce）を使用してＢＳＡ較正曲線を作成した。標準およびサンプルを、０．１ＭＮａＯＨに希釈する。タンパク質サンプルを、後のウエスタンブロット解析のために−２０℃の冷凍機中に保存する。erbB1およびerbB2の発現並びにそれらのリン酸化度を、適当な抗体を使用するウエスタンブロットによって決定した。erbB1/2の検出には、５μｇの総タンパク質／ウェルおよび５μＬのKaleidoscopeタンパク質標準（Biorad）を１５ウェルの７．５％ＰＡＧＥゲルにロードする。サンプルを、１００Ｖで、青色の先端がゲルの底に到達するまで流す。電気泳動の後、タンパク質を０．４５μｍのニトロセルロース膜（Biorad）に移し、TBS-Tween ０．１％中の２％ＢＳＡを用いて１時間にわたってブロックする。抗体を示されるようにTBS-Tween ０．１％に希釈する。タンパク質をSupersignal West Pico Chemiluminescent Substrate（Pierce/Thermo Scientific）を使用して検出する。リン酸化されたタンパク質の検出の後、Restore Western Blot Stripping Buffer（Pierce/Thermo Scientific）を用いてブロットを１０分間にわたってストリッッピングし、洗浄し、総タンパク質に対する抗体とともにインキュベートする。ImageJソフトウェアを用いて、ブロットの濃度測定を実施する。SigmaPlot 10を使用して値をプロットする。ＢＣＡアッセイによって（記載されるように）同等なタンパク質ローディングを決定し、総erbB1/2シグナル強度によって確認し、バンド強度を濃度測定（ImageJ）によって算出し、それから、ＩＣ_５０値を決定した。

（Ｂ．２．２細胞増殖阻害実験）
５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するα最小必須培地（αＭＥＭ）において対数期指数増殖にあるヒトA431、H1975およびSKOV3癌腫細胞を、トリプシン処理（１×トリプシン／ＥＤＴＡ、Gibco Brl）によって回収し、カウントし、９６ウェルプレート（Nunc）中に８００〜１５００細胞／ウェルの範囲の細胞密度で播種した。細胞サンプルの半量を、プレートに播種した。このプレートは、予備平衡化され、無酸素環境下（９０％Ｎ_２、５％Ｈ_２、５％ＣＯ_２、３７℃；無酸素チャンバ， Coy Laboratory Products）に維持されていた。有酸素（２１％Ｏ_２）または無酸素（＜１０ｐｐｍＯ_２）条件のいずれかの下で３時間接着させた後、細胞を、適切な希釈範囲にわたる濃度のプロドラッグまたはエフェクタに４時間にわたって曝露した。この期間の最後に、無酸素プレートを、有酸素チャンバから回収し、正常酸素状態下に標準ＣＯ_２インキュベータ（３７℃）中２０時間にわたって維持した。すべてのプレートを洗浄して化合物不含有とし、細胞をさらに４日間にわたって５％ＦＢＳ＋抗生物質を含有するαＭＥＭ中で増殖させた。細胞をトリクロロ酢酸中に固定し（３０分）、洗浄し、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）で染色し（６０分）、その後、酸性化水で洗浄した。ＳＲＢを可溶化し、吸収を４５０ｎｍで読み取って、細胞密度を算出した。増殖の阻害は、未処理のコントロールウェルに対して算出された。

（Ｂ．２．３インビボ有効性実験）
特定病原体不含有のホモ接合型の雌のNIH-IIIヌードマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、H1975細胞の単一の細胞懸濁液を皮下播種した（５×１０^６細胞／１００μＬ；右脇腹）。H1975腫瘍異種移植片が確立された時点で（通常、８〜１２日）、マウスを処理群に無作為化した。すべての化合物を、乳酸塩バッファ（ｐＨ４）中に調製した。マウスに、示されたスケジュールおよび用量レベルを使用して腹腔内注射（０．０１〜０．０３ｍＬ／ｇ）によって投薬した。増殖遅延実験のために、マウスを処理に対して無作為化し、腫瘍容量［π（長さ×幅^２）／６］および体重を、処理後毎日測定した。腫瘍が処理前の容積に対して４倍の容積に増大する中央値時間を求め（ＲＴＶ^４）、腫瘍増殖阻害（Tumor Growth Inhibition：ＴＧＩ）を、処理対コントロールについてのＲＴＶ^４における増大率（％）として算出した。ＲＴＶ^４の相違を、統計的差異について、SigmaStat v3.5を用いるマンホイットニーのＵ検定によって試験した。

（Ｂ．２．４ SKOV3異種移植片実験）
特定病原体不含有のホモ接合型の雌のNIH-IIIヌードマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、SKOV3細胞の単一細胞懸濁液を（１×１０^７細胞／１００μＬ；右脇腹）皮下播種した。SKOV3腫瘍異種移植片が確立された時点で（通常、５０〜６５日）、マウスを処理群に無作為化した。化合物４２および１６１を、乳酸塩バッファ（ｐＨ４）中に調製した。マウスは、示されたスケジュールおよび用量レベルを使用して腹腔内注射（０．０１〜０．０３ｍＬ／ｇ）によって投薬された。腫瘍の大きさおよび体重を、一定の間隔で測定した。腫瘍の容積を、π（長さ×幅^２）／６として算出した。腫瘍が処理前の容積に対して４倍の容積に増大する時間（ＲＴＶ^４）を求め、腫瘍増殖阻害の％（％ＴＧＩ）を、処理対コントロールのＲＴＶ^４における中央値増大率（％）として算出した。ＲＴＶ^４の差異を、SigmaStat v3.5を用いるマンホイットニーのＵ検定によって統計的差異について試験した。

（Ｂ．２．５血漿および組織薬物動態学実験）
化合物４２を、２０μｍｏｌ／ｋｇの名目上の低用量で、H1975腫瘍異種移植片を有する９匹の雌のNIH-IIIマウスに、ＤＭＳＯ／５％デキストロース（２０：８０）中の溶液として、静脈内注射を介して投薬した。血液サンプルを、Ｔ＝２、６および２４時間で、末端出血（terminal bleed）（コホートあたりｎ＝３）によって、イソフルラン麻酔下に採取した。H1975腫瘍、皮膚および肝臓サンプルを、Ｔ＝２、６および２４時間で採取し（コホートあたりｎ＝３）、液体窒素中で直ちに凍結させ、−８０℃で保存し、その後、薬物分析のためにサンプル調製した。それぞれの組織各々の小片（約１００ｍｇ）をbiopulveriserウェル（予め液体窒素中で冷却される）に入れ、スチール乳棒の強打で小さくして微細粉末にした。次いで、凍結粉末を、予め秤量された微量遠心機管（ドライアイス上に維持される）中に回収した。組織粉末から薬物を抽出するために、４容積の氷冷アセトニトリル（内部標準として０．５μＭのＤ６−１６１を含有する）を、各サンプルに加えた。次いで、微量遠心機管を、１３，０００ｒｐｍで１０分間にわたって回転させて、細胞デブリおよびタンパク質を沈殿させた。１０μＬの血漿（ＥＤＴＡ中に採取）に、４０μＬの氷冷アセトニトリル（内部標準として０．５μＭのＤ６−１６１を含む）を加えた。得られた溶液を混合し、次いで、１３，０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離した。次いで、上清（４０μＬ）をＨＰＬＣインサートに移し、８０μＬの４５ｍＭホルマートバッファ（ｐＨ４．５）と混合し、次いで、化合物４２および化合物４２を投与されたマウスからのサンプル中の化合物１６１の濃度を、ダイオードアレイ吸収検出器（ＤＡＤ）を質量検出器に合わせて備えたAgilent 6410 LC-MS/MSにより測定した。エレクトロスプレーポジティブモードのマルチモードイオン源検出器を構成することによって分析を行い、乾燥ガス流５Ｌ／分、ネブライザー圧力６０ｐｓｉ、乾燥ガス温度２７５℃、気化器温度１５０℃、キャピラリー電圧２０００Ｖ、充電電圧２０００Ｖであり、ＤＡＤ検出は、３２２ｎｍ、８ｎｍバンド幅であった。定量化は、５８４＞４００のｍ／ｚ（プロドラッグ４２）および４４５＞４００のｍ／ｚ（化合物１６１）および４５１＞４００のｍ／ｚ（Ｄ６−１６１内
部標準）でのＭＲＭ遷移をベースとしていた。１００％アセトニトリルおよび０．０１％ギ酸−水の勾配を用いて分析物をZorbax SB C-18（迅速分解ＨＴ３．０×５０ｍｍ，１．８ミクロン）（Agient）ＨＰＬＣカラム上で溶出させ、その際の流量を０．６ｍＬ／分とした。

化合物４２および化合物１６１を、それらのそれぞれのq3dx4 MTD（それぞれ１００μｍｏｌ／ｋｇおよび３１．６μｍｏｌ／ｋｇ）の７５％で、A431腫瘍異種移植片を有する３０匹の雌のNIH-IIIマウスに、乳酸塩バッファ中の溶液として、腹腔内注射を介して投与した。血液サンプルを、Ｔ＝２、６、２４、４８および７２時間で、末端出血によってイソフルラン麻酔下に採取した（コホートあたりｎ＝３）。A431腫瘍サンプルを、Ｔ＝２、６、２４、４８および７２時間で採取し（コホートあたりｎ＝３）、液体窒素中で直ちに凍結させ、−８０℃で保存し、その後、上記のように薬物分析のためにサンプル調製した。

（Ｂ．２．６放射線分解還元実験）
パルス放射線分解を使用して、プロドラッグ４２の一電子還元および安定性をリアルタイムでモニタリングした。迅速分光光度計検出システムを備えた、高エネルギー電子の短パルス（４ＭｅＶの２００ｎｓで２〜３Ｇｙ）を送達する線形加速器を使用した（Anderson et al., J. Phys. Chem. A, 101, 9704〜9709, 1997）。試験化合物を、上記のホルマートイオンを含有するＮ_２Ｏ飽和溶液に溶解させ、これにより、パルス放射線分解の後、数マイクロ秒内に化合物のラジカルアニオンが迅速に形成された。フラグメント化の速度を、トリガー部分のベンジルタイプのラジカルの形成に相当する波長で動力学的遷移を分析することによって決定した（Bays et al, J. Am. Chem. Soc., 105, 320〜324, 1983;Anderson et al., J. Phys. Chem. A, 101, 9704〜9709, 1997）。

（結果および考察）
（Ｂ．２．７細胞酵素阻害活性）
化合物１６１、１７０および１７１並びにそれらのそれぞれのプロドラッグ４２、５０および５８を、ＥＧＦ刺激されたA431細胞においてerbB1の自己リン酸化を阻害するそれらの能力について、ホスホ−erbB1状態のウエスタン免疫ブロット測定によって試験した（表８）。化合物１６１およびそのプロドラッグ４２を、同様に、SKOV3細胞においてホスホ−erbB2の基礎レベルを阻害するそれらの能力について試験した。化合物１６１、１７０および１７１は、細胞erbB1の強力なインヒビターであると示された（それぞれ、５、８および８ｎＭのＩＣ_５０）。対照的に、四級アンモニウム塩誘導体プロドラッグ４２、５０および５８は、無傷のA431細胞におけるerbB1自己リン酸化の阻害において、それぞれ、８２倍、１２１倍および６４倍より低い有効性であった。化合物１６１も、SKOV3細胞において細胞erbB2の強力なインヒビターであると示された（６ｎＭのＩＣ_５０）が、対照的に、四級アンモニウム塩プロドラッグ４２は、この点で３５倍より低く有効であった。プロドラッグについての細胞erbB1/2阻害効力のこの喪失は、主に、正荷電四級アンモニウム塩の存在によるプロドラッグの細胞排除に起因する。

（Ｂ．２．８細胞erbB1阻害：不可逆性の洗い流しアッセイ）
erbB1、2、4インヒビター１６１およびその四級アンモニウム塩プロドラッグ４２を、不可逆性erbB1/2インヒビターBIBW-2992（Minkovsky and Berezov. Current Opinion in Investigational Drugs, 2008, 9(12), 1336〜1346）および可逆性erbB1インヒビターエルロチニブ（Sanborn and Davies, Expert Review of Clinical Pharmacology, 2009, 2(1), 15〜36）と並行して、無傷のA431細胞においてerbB1自己リン酸化を不可逆的に阻害するそれらの能力について評価した。細胞を、１時間にわたって薬物（１μＭ）に継続的に曝露し、次いで、組換え上皮成長因子（epidermal growth factor：ＥＧＦ； Invitrogen, NZ)で刺激するか、または１時間にわたって薬物（１μＭ）に曝露し、次いで、洗浄により非結合薬物不含有とし（１５回）、その後にＥＧＦ刺激を行うかのいずれかとした。全細胞ライセートを調製し、ホスホ−erbB1の検出を、抗ホスホチロシンポリクローナル抗体（Upstate Biotech, #06-427）を用いるウエスタンブロッティングによって可視化した（図１９）。多数の不可逆性erbB1インヒビターについてこれまでに記載されたように（Fry et al., PNAS, 1998, 95(20), 12022〜12027;Smaill et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 1803〜1815;Smaill et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 429〜440;Tsou et al., J. Med. Chem., 2001, 44, 2719〜2734;Wissner et al., J. Med. Chem., 2003, 46, 49〜63;Tsou et al., J. Med. Chem., 2005, 48, 1107〜1131;Klutchko et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 1475〜1485）、BIBW-2992は、細胞がＥＧＦ刺激に先行して洗浄により非結合薬物不含有とされたかどうかにかかわらず、A431細胞においてerbB1自己リン酸化を完全に阻害し、インヒビター１６１について示される観察結果も、erbB1の不可逆性阻害が起こったという解釈を強力に支持する。対照的に、エルロチニブ（細胞erbB1自己リン酸化の既知可逆性インヒビター）は、マイケル受容基により６位で置換されていないので、酵素アルキル化することができない。したがって、エルロチニブは、洗浄により薬物不含有とされていない細胞においてerbB1自己リン酸化の有意な阻害を示したが、洗浄により薬物不含有とされた細胞は、ＥＧＦ刺激に応じてerbB1を自己リン酸化するそれらの能力において十分に回復させられた。同様の傾向が、プロドラッグ４２について観察されたが、この場合、洗浄により薬物不含有とされた細胞は、十分に回復させらたerbB1を自己リン酸化するそれらの能力を有しており、このことは、プロドラッグ４２がerbB1の可逆性インヒビターであることと一致する。

図１９は、それぞれ可逆性および不可逆性erbB1インヒビターである、エルロチニブおよびBIBW-2992に対する、化合物１６１および４２についてのA431細胞erbB1自己リン酸化阻害を示す。細胞に、１μＭの試験化合物への１時間の曝露を与え、ＥＧＦを用いて直接的に刺激し、溶解させ、ＥＧＦＲ（erbB1）およびＥＧＦ刺激ホスホチロシン（すなわち、ホスホ−erbB1）についてウエスタンブロッティングするか、または、ＥＧＦ刺激、細胞溶解およびウエスタンブロッティングに先行して薬物不含有培地により広範囲に洗浄して試験化合物を除去するかのいずれかとした。

（Ｂ．２．９細胞増殖阻害活性）
表９の化合物を、文献の前例との比較を提供するように選択された３種のヒト癌腫細胞株の増殖を阻害するそれらの能力について試験した：A431（類表皮腫）；これはerbB1を過剰発現する；H1975（非小細胞肺）；これは、承認された可逆性erbB1インヒビターであるエルロチニブに対する抵抗性を付与することが知られているerbB1の二重突然変異形態であるerbB1^{L858R, T790M}を過剰発現するおよびSKOV3（卵巣）；これは、erbB2を過剰発現する。細胞を、試験化合物に、有酸素条件下に２４時間にわたって、または、無酸素下に４時間にわたって、次いで、有酸素条件下に２０時間にわたって曝露した。次いで、それらを、洗浄により薬物不含有とし、さらに４日間にわたってインキュベートし、その後、スルホローダミンＢにより細胞生存について染色した。

不可逆性erbB1、2、4インヒビター１６１、１７０および１７１は、A431細胞の増殖を、H1975細胞およびSKOV3細胞よりも強力に阻害し（A431細胞においてＩＣ_５０＝０．０２７〜０．２４μＭ；H1975細胞においてＩＣ_５０＝１．１５〜１．７０μＭ；SKOV3細胞においてＩＣ_５０＝０．５５〜０．９９μＭ）、細胞に４時間の無酸素を与えた場合には、効力において何等の有意な変化を示さなかった。

それらのそれぞれのキナーゼインヒビター（１６１、１７０および１７１）に対して、四級アンモニウム塩プロドラッグ（４２、５０および５８）は、A431細胞の増殖の阻害において５６〜７４倍より低い有効性であり；H1975細胞の増殖の阻害において３０〜８６倍より低い有効性であり；SKOV3細胞の増殖の阻害において４２〜１３３倍より低い有効性であった。さらに、表９のプロドラッグ（４２、５０および５８）のすべては、細胞が４時間の無酸素を与えられた後に３種の細胞株のすべての増殖の阻害において有意により強力であった。低酸素細胞毒性比（ＨＣＲ）は、A431細胞において６０．０〜７７．９、H1975細胞において１０．８〜７７．７およびSKOV3細胞において２０．３〜３８．５の範囲であり、ニトロヘテロ環還元的トリガーの低酸素選択的還元と、それに続く、不可逆性erbB1、2、4インヒビターを放出するトリガーフラグメント化と一致する。

（Ｂ．２．１０放射線分解還元）
電子親和性プロドラッグは、正常組織における正常酸素圧条件下と対照的に、固形腫瘍の低酸素領域において、一電子プロセスによって選択的に還元され得る（Brown and Wilson, Nature Rev. Cancer, 2004, 4,437〜447）。プロドラッグは、ＮＨＥに対して−０．６〜−０．２Ｖ、好ましくは、−０．５〜−０．３Ｖの一電子還元電位Ｅ（１）を有するべきである。多数の化合物のＥ（１）値は、文献（例えば、Wardman, P. J. Phys. Chem. Ref. Data, 1989, 18, 1637〜1755）から得られ得るか、または多くの方法によって決定され得る。例えば、パルス放射線分解法は、プロドラッグの、それらの一電子還元の際に形成されるラジカルアニオンと、ビオローゲンおよびキノン化合物等の参照基準との間の平衡定数を測定し、そのデータから化合物のＥ（１）値が算出され得る（Meisel and Czapski. J. Phys. Chem., 1975, 79, 1503〜1509）。プロドラッグ４２のＥ（１）値を、パルス放射線分解法によって測定し、−０．４２５±０．００８Ｖであると決定し、これを、生物学的背景で、プロドラッグラジカルアニオンの酵素的に形成できる適当なＥ（１）値であると考える。

還元的プロドラッグが、トリガー部分の一電子還元の際に制御されたフラグメント化速度定数を有するように選択されることが望ましい。腫瘍細胞の低酸素領域において高濃度の細胞毒性エフェクタを放出する迅速なフラグメント化が望ましいが、これは、酸素正常状態下の正常組織細胞にとってはそうなっていない。一電子還元型ニトロアレンベースのプロドラッグの逆酸化の速度定数ｋＯ_２は、以下の表現によって与えられる。：

（Wardmanet al., Biochem. Soc. Symp., 1995, 61, 171〜194;Andersonet al, Org. Biomol. Chem. 2005, 3,2167〜2174）。

一電子還元型プロドラッグのフラグメント化についての速度定数ｋｆｒａｇは、パルス放射線分解を用いて測定されて、トリガーのフラグメント化によって生じたベンジルタイプのラジカルの吸収スペクトルの形成が観察され得る（Anderson et al., J. Phys. Chem. A, 1997, 101, 9704〜9709）。プロドラッグ４２のｋｆｒａｇ値は、パルス放射線分解によって測定され、５０±１０ｓ^−１であると決定され、A431、H1975およびSKOV3細胞ベースの抗増殖アッセイにおいて低酸素細胞毒性比（ＨＣＲ）をインビトロで示すプロドラッグ４２と一致する望ましい範囲での低酸素下の一電子還元の際のフラグメント化速度であると考えられる（表８）。

（Ｂ．２．１１プロドラッグ４２、５０および５８の溶解度および安定性）
四級アンモニウム塩プロドラッグ４２、５０および５８が、ＨＰＬＣにより、様々な溶質における溶解度および化学安定性について研究された（表１０）。すべて、優れた溶解度および安定性を水中において示した。プロドラッグ５８は、特に、プロドラッグ４２および５０（これらは、それでもこれらの溶質において許容される溶解性を有する）よりα−ＭＥＭおよびＰＢＳに可溶性であった。プロドラッグの全てはまた、α−ＭＥＭおよびＰＢＳにおいて許容される安定性を示し、各々＞２４時間の半減期を有する。

（Ｂ．２．１２ H1975異種移植片における化合物４２、５０および５８のインビボの有効性）
プロドラッグ４２、５０および５８が、H1975異種移植片における有効性について、それらのそれぞれの最大耐量（ＭＴＤ）において、乳酸塩バッファ中のＩＰ投薬の後のq3dx4スケジュールで比較された（図２０）。

図２０は、それらのそれぞれのＭＴＤにおいてq3dx4スケジュールで試験された場合の、H1975異種移植片に対する化合物４２、５０および５８の有効性を示す。

プロドラッグ４２（q3dx4 ＭＴＤ＝１３３μｍｏｌ／ｋｇ／用量）は、H1975異種移植片において相当な有効性を実証した（算出された腫瘍増殖阻害ＴＧＩ＝２２９％）が、プロドラッグ５０（q3dx4 ＭＴＤ＝３１６μｍｏｌ／ｋｇ／用量）は、弱く活性であり（ＴＧＩ＝１１４％）、プロドラッグ５８（q3dx4 ＭＴＤ＝７５μｍｏｌ／ｋｇ／用量）は、中間の活性（ＴＧＩ＝１７１％）を示した。各プロドラッグは、同一の還元的トリガー（１０５）をベースとし、採用されるエフェクタの性質のみが異なる。プロドラッグについて活性のランク順序（４２＞５８＞５０）は、H1975細胞においてそれぞれのエフェクタのインビトロで観察された効力に呼応してプロドラッグの観察された用量耐性と一致する。

（Ｂ．２．１３ SKOV3およびH1975異種移植片に対する化合物４２および１６１のインビボの有効性）
図２１は、SKOV3異種移植片に対する化合物４２および１６１の有効性を示す。プロドラッグ４２が、ＳＫＯＶ３異種移植片における有効性について化合物１６１と、等毒性用量（１００および３１．６μｍｏｌ／ｋｇ／用量）において、乳酸塩バッファ中のＩＰ投薬の後のq3dx9スケジュールで直接的に比較された。

プロドラッグ４２は、増殖遅延によって化合物１６１より優れた有効性を示し、化合物１６１で処理されたマウスについて１／７の死亡が観察され、プロドラッグ４２で処理されたマウスについて０／７の死亡が観察された。

図２２は、NIHIIIヌードマウス中で増殖したH1975腫瘍異種移植片に対する化合物４２および１６１の有効性を示す。プロドラッグ４２は、化合物１６１と、H1975異種移植片における有効性について、等毒性用量（それぞれ、１３３および４２．２μｍｏｌ／ｋｇ／用量）において、乳酸塩バッファ中のＩＰ投薬の後のq3dx4スケジュールで直接的に比較された。プロドラッグ４２は、増殖遅延によって化合物１６１よりも優れた有効性を示し、化合物１６１で処理されたマウスについて１００％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）が観察され、プロドラッグ４２で処理されたマウスについて１８８％のＴＧＩ値が観察された。

（Ｂ．２．１４ H1975およびA431異種移植片に対するプロドラッグ４２のインビボの有効性）
図２３は、NIHIIIヌードマウス中で増殖した大きなH1975腫瘍異種移植片に対するプロドラッグ４２の有効性を示す。プロドラッグ４２は、１３３、１００または７５μｍｏｌ／ｋｇ／用量において乳酸塩バッファ中のＩＰ投与後のq3dx8スケジュールで投与された。プロドラッグ４２のすべての用量レベルが、H1975増殖遅延によって有効性を示し、乳酸塩処理されたコントロールに対してそれぞれ２７５％、２１３％および１５４％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）であった（ｐ＜０．０１）。したがって、プロドラッグ４２は、ＭＴＤを下回る用量で優れた抗腫瘍活性を有しており、治療域（therapeutic window）の存在を確立した。

図２４は、NIHIIIヌードマウス中で増殖した大きなA431腫瘍異種移植片に対するプロドラッグ４２の有効性を示す。プロドラッグ４２は、８０、６０、４０または２０ｍｇ／ｋｇ／用量において、乳酸塩バッファ中のＩＰ投与後のq3dx8スケジュールで投薬された。プロドラッグ４２のすべての用量レベルが、A431増殖遅延によって有効性を示し、乳酸塩処理されたコントロールに対して、それぞれ、８４３％、７８６％、８００％および４００％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）であった（ｐ＜０．０１）。したがって、プロドラッグ４２は、ＭＴＤを下回る用量で優れた抗腫瘍活性を有しており、治療域の存在を確立した。

（Ｂ．２．１５プロドラッグ４２のマウスの毒性および薬物動態学）
表１０は、q3dx4最大耐量（ＭＴＤ）および組織および血漿の薬物動態学を記載する。プロドラッグ４２は、時折の軟便を伴う体重減少を実証し、このことは、胃腸毒性が用量制限であり得ることを示唆する。体重減少が、出発重量の＞１５％であった場合には、人道的選別を実施した。ＭＴＤ値は、すべての薬物関連原因による７中１未満の死亡として定義される。プロドラッグ４２は、多用量スケジュールで良好に耐容されることが決定され、唯一の観察可能な毒性として体重減少があった。

プロドラッグ４２および化合物１６１の血漿および組織薬物動態学（プロドラッグ４２を用いる投薬に起因する）を、ＤＭＳＯ／５％デキストロース（１５：８５）中の単回静脈内投薬（２０μｍｏｌ／ｋｇ）後に測定した。プロドラッグ４２は、それぞれ２４．７、１２３、２５６．２および１９７．７μＭ．ｈｒの血漿、H1975腫瘍、肝臓および皮膚における曲線下面積（ＡＵＣ_{０−２４ｈｒ}）を示した。化合物１６１（プロドラッグ４２に由来する）は、それぞれ、０．６、７．６、１４．６および４．４μＭ．ｈｒの血漿、H1975腫瘍、肝臓および皮膚において曲線下面積（ＡＵＣ_{０−２４ｈｒ}）を示した。

図２５は、雌のA431腫瘍保有NIHIIIマウスが、単回用量（ｉｐ）の各試験化合物を、q3dx4 ＭＴＤ（それぞれ１００および３１．６μｍｏｌ／ｋｇ）の約７５％で投与された場合の、血漿およびA431腫瘍における、化合物４２および化合物１６１（化合物４２の投薬に由来し、直接的に投薬された場合）の濃度を時間の関数として示す。プロドラッグ４２は、２１５μｍｏｌ−ｈ／Ｌの血漿ＡＵＣ_{０−７２ｈ}を与え、これはインヒビター１６１の投与について達成されたもの（８μｍｏｌ−ｈ／Ｌ）より約２７倍大きかった。後者は、４９μｍｏｌ−ｈ／ｋｇの腫瘍ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}を与えた。対照的に、プロドラッグ４２は、２８２１μｍｏｌ−ｈ／ｋｇの腫瘍ＡＵＣ_{０−７２ｈ}を与え、７２時間まで約３０μｍｏｌ／ｋｇの安定な腫瘍組織濃度を有し、その結果、ｔ_１／２は、決定され得なかった。この長いプロドラッグ残留と一致して、プロドラッグ２０から放出されたインヒビター１６１も、腫瘍組織において長期のｔ_１／２を示し、７２μｍｏｌ−ｈ／ｋｇのＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}を提供した。したがって、A431腫瘍におけるインヒビター１６１のＡＵＣは、プロドラッグ４２の投与後に、等価の毒性でのインヒビター１６１自体の投与後よりも少なくとも１．５倍高かった。

（Ｂ．２．１６要約）
集められたデータにより、マイケル受容基に隣接する第三アミンを有する不可逆性erbB1、2、4インヒビターの四級アンモニウム塩プロドラッグが、有酸素条件下で実施される細胞ベースのターゲット調節および抗増殖アッセイにおいてより低い活性であることが示される。一電子還元の際に所望の速度定数でフラグメント化して第三アミン保有の不可逆性erbB1、2、4インヒビターを放出するように適切に選択されたフラグメント化還元トリガーを採用するプロドラッグは、無酸素条件下に行われる細胞ベースの抗増殖アッセイにおいて選択的により強力であり、十分な耐量でマウスに送達され得、A431、SKOV3およびH1975腫瘍異種移植片実験において有意な抗腫瘍活性を有する。

（産業上の利用）
本発明は、還元された時にフラグメント化して、キナーゼインヒビターを放出するトリガーを特徴とする一連のプロドラッグを提供する。本発明のプロドラッグは、持続性の正電荷を有する。この特徴は、正電荷が、それらを、それが由来する親のキナーゼインヒビターよりも細胞に対して透過性を低くする点で重要である。

何等の特定の理論に結び付けられることを望むことなく、この透過性の減少が、細胞内キナーゼターゲットから離れてプロドラッグを区画化することによって親のキナーゼインヒビターに対してプロドラッグの細胞キナーゼ阻害効力を弱めることが信じられる。この活性の減弱の利益は、キナーゼインヒビターの用量制限毒性が健常な組織における関連キナーゼの阻害に由来する場合に、プロドラッグが、親キナーゼインヒビターよりも高い曝露レベルで動物に投与されることを可能にすることである。したがって、キナーゼインヒビターを放出するための腫瘍におけるプロドラッグの効率的な還元的フラグメント化は、親キナーゼインヒビターの全身投与を通じて達成され得るより高い濃度のキナーゼインヒビターを腫瘍中に送達する。同様に、親キナーゼインヒビターに対してより優れた有効性も達成される。

また、本発明のプロドラッグの正電荷は、長時間にわたる持続性腫瘍滞留につながることも信じられる。今までの結果は、実質的に安定な腫瘍組織濃度が、長時間にわたって（少なくとも２４時間にわたって、最大７２時間）達成可能であることを示す。これは、低酸素が生じ得るいつでもおよび腫瘍内のどこでもプロドラッグが一電子還元によって放出されかつ活性化されるために利用可能であることを意味する。これは、多くの腫瘍内の低酸素の一過性のおよび移動する性質を考えると、特に有利である。

適切なＥ（１）およびフラグメント化速度定数（ｋｆｒａｇ）を有するトリガー／キナーゼインヒビターの組合せの選択も、低酸素選択性を補助することおよび活性なキナーゼインヒビターをプロドラッグからゆっくりと放出させることによって、その結果、十分なプロドラッグが腫瘍内における、腫瘍細胞の種々の部分に現れる低酸素のターゲット領域に長時間にわたって保持されることによって、有効性に寄与すると信じられる。

本発明の化合物は、キナーゼの活性の阻害が望ましいあらゆる治療アプローチにおいて適用を有する。特定の一態様では、本発明は、ヒトをはじめとする哺乳類における異常な細胞増殖の治療方法であって、前記哺乳類に、異常な細胞増殖の治療に有効である量の本発明の化合物（好ましくは、式Iまたは式IIの化合物）を投与する工程を含む方法を提供する。本方法の一実施形態では、異常な細胞増殖は、骨癌、肺癌、乳癌、頭頸部の癌、前立腺癌、膵臓癌、皮膚癌、子宮癌、卵巣癌、慢性または急性白血病、子宮頸部の癌腫、外陰部の癌腫、膣の癌腫、ホジキン病、尿道の癌、副腎の癌、小腸の癌、腎臓の癌、膀胱の癌、脳幹神経膠腫および精巣癌をはじめとする癌であるが、これらに限定されない。

本発明の化合物は、単独でまたは他の治療剤または治療計画、特に腫瘍を治療するためのものと組み合わせて用いられ得る。これによって、ヒトをはじめとする哺乳類における異常な細胞増殖の治療方法であって、前記哺乳類に、異常な細胞増殖の治療に有効な量の本発明の化合物（好ましくは、式Iまたは式IIの化合物）を、アルキル化剤、代謝拮抗剤、有糸分裂インヒビター、インターカレート剤、増殖因子インヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、細胞周期インヒビター、生物反応調節剤、抗体、細胞毒性物質、抗ホルモン薬および抗アンドロゲン薬からなる群から選択される抗腫瘍剤と組み合わせて投与する工程を含む方法が可能となる。

同様に、本発明はまた、ヒトをはじめとする哺乳類における異常な細胞増殖の治療方法であって、前記哺乳類に、異常な細胞増殖の治療に有効である本発明の化合物（好ましくは、式Iまたは式IIの化合物）を、ターゲッティングされた放射線治療法と組み合わせて投与する工程を含む方法を提供する。

上記のいずれかの方法における使用を対象とする場合に、本明細書の化合物は、ヒトおよび動物に、経口的、直腸性に、非経口的（静脈内、筋肉内、または皮下）、大槽内に、膣内に、腹腔内に、膀胱内に、局所的にまたは口内もしくは鼻腔スプレーとしてのいずれかで投与され得る。

非経口注射に適した組成物は、生理学的に許容される滅菌水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョンおよび滅菌注射用溶液または分散液に再構成するための滅菌散剤を含み得る。適した水性および非水性の担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例として、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、植物油およびオレイン酸エチルが挙げられる。

経口投与用の固形投与形態として、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が挙げられる。このような形態では、活性形態は、当業者に知られているように、少なくとも１種の不活性の通例の担体（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム）または増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、溶液凝結遅延剤、吸着促進剤、吸着剤および滑沢剤と混合され得る。

経口投与用の液体投与形態として、医薬上許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。

本発明の化合物は、１日あたり約０．１〜約３，０００ｍｇの範囲の、医薬上または治療上有効な投与量レベルで患者に投与され得る。採用される投与量は、最終的には、治療されている状態または障害、追跡される治療アプローチに依存することになる。投与量はまた、本発明の化合物が単剤療法として単独でまたは１種以上の他の活性剤または治療計画（放射線照射）との組合せ療法において一緒に投与されるかどうかに応じて変動する。

本明細書の全体を通じて、前後関係が他のものを要求しなければ、語句「含む（comprise）」、「含んでいる（comprising）」などは、排他的な意味とは対照的に包括的な意味で、すなわち、「含むが、それに限定されない」の意味で解釈される。

上記で参照されるすべての刊行物は、その全体が本明細書に援用される。

本明細書における任意の先行技術への参照は、先行技術が共通一般知識の一部を形成するという承認または示唆のあらゆる形態として理解されず、かつ、理解されるべきでない。

以下は、本発明をその好ましい形態を含めて記載する。当業者に明らかであろう変更または改変は、含まれるものとする。

Claims

［式中、
Ｘ ⁻ は、負荷電対イオンであり；
Ｙは、Ｎであり；
Ｚは、ＮまたはＣ−ＣＮであり；
ｎは、０〜６の整数であり；
Ｒ_１は、式IIIｄ

［式中、
^＊は結合点であり；
Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、ＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨMe、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｂｒ、ＮＯ_２およびＣＮから選択され、
；および
Ｒ_９は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択される］
で表される基であり；
Ｒ_２およびＲ_３は独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択されるか、またはＲ_２およびＲ_３は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、非芳香族ヘテロ環式リングを形成してもよく；
Ｒ_５は、アニリン、インドール、インドリン、アミン、アミノインドールおよびアミノインダゾールから選択され、それらの各々は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２、ＣＯＮＨ_２、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＳＯ_２ＮＨ_２およびＳＯ_２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ_６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２および式Vのaまたはb

｛式中、
^＊は、結合点であり；
Ｖは、（ＣＨ_２）_ｋ、Ｏ、ＮＨおよびＮ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択され、ここで、ｋは０〜６の整数であり；
Ｒ_４１は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択される｝
の基から選択される］
の化合物であって、
前記アルキル、前記アルケニル、前記アルキニルおよび前記アルコキシは、直鎖または分枝鎖基、並びに無置換または置換基であってよく、前記置換基はハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、ＣＮ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２、ＣＯＮＨ_２、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＳＯ_２ＮＨ_２およびＳＯ_２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）であってよい、
化合物。
Ｘは、ハリド、メタンスルホナート、トリフルオロメタンスルホナート、アセタート、トリフルオロアセタート、トシラート、ラクタート、シトラートおよびホルマートから選択される、請求項１に記載の化合物。
Ｘは、ハリドである、請求項１に記載の化合物。
Ｘは、臭素または塩素である、請求項１に記載の化合物。
Ｒ_１は、式IIIdの基であり、ここで、Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、ＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｂｒ、ＮＯ_２およびＣＮから選択され、Ｒ_９は、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２およびＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮから選択される、請求項１に記載の化合物。
Ｒ_１は、式IIIdの基であり、ここで、Ｒ_８は、ＨおよびＣ１−Ｃ３アルキルから選択され、Ｒ_９は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択される、請求項１に記載の化合物。
Ｒ_８は、Ｈである、請求項６に記載の化合物。
Ｒ_９は、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキルである、請求項６または７に記載の化合物。
Ｒ_９は、メチルである、請求項６または７に記載の化合物。
Ｒ_９はメチルであり、Ｒ_８はＨである、請求項６に記載の化合物。
Ｒ_１は、式IIIdの基であり、ここで、Ｒ_８は、１−プロピニルであり、Ｒ_９は、ＣＨ_３である、請求項１に記載の化合物。
Ｒ_２およびＲ_３は、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、Ｎ１−メチルピペラジニウムおよびモルホリニウムから選択されるリングを形成する、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の化合物。
Ｒ_５は、式IV：

［式中、
^＊は、結合点であり；
Ｒ_１１、Ｒ_１８、Ｒ_１９、Ｒ_２１、Ｒ_２６、Ｒ_３１およびＲ_３６は独立に、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４、Ｒ_１５、Ｒ_１６、Ｒ_１７、Ｒ_２０、Ｒ_２２、Ｒ_２３、Ｒ_２４、Ｒ_２５、Ｒ_２７、Ｒ_２８、Ｒ_２９、Ｒ_３０、Ｒ_３２、Ｒ_３３、Ｒ_３４、Ｒ_３５、Ｒ_３７、Ｒ_３８、Ｒ_３９およびＲ_４０は独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２、ＣＯＮＨ_２、ＣＯ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＳＯ_２ＮＨ_２およびＳＯ_２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択され；
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｈである］
の基から選択される、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の化合物。
ＹはＮであり、
Ｚは、ＮまたはＣ−ＣＮであり、
Ｒ_１は、式IIIdの基、ここで、（i）Ｒ_８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｂｒ、ＮＯ_２およびＣＮから選択され、Ｒ_９は、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＮＨ_２およびＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮから選択されるか；または（ii）Ｒ_８は、１−プロピニルであり、Ｒ_９は、ＣＨ_３である；
であり、
Ｒ_２およびＲ_３は独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択されるか、または一緒になって、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、Ｎ１−メチルピペラジニウムおよびモルホリニウムから選択されるリングを形成し；
Ｒ_５が、以下：
（ａ）式IVaの基、式中、
^＊は、結合点であり；
Ｒ_１１は、Ｈであり；
Ｒ_１２、Ｒ_１３、Ｒ_１４は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択される；
（ｂ）式IVdの基、式中、
^＊は、結合点であり；
Ｒ_２１は、Ｈであり；
Ｒ_２２およびＲ_２３は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択され；
Ｒ_２４およびＲ_２５は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）_２から選択され；
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｈである；
（ｃ）式IVfの基、式中、
^＊は、結合点であり；
Ｒ_３１は、Ｈであり；
Ｒ_３２およびＲ_３３は、独立に、ＨまたはＦから選択され；
Ｒ_３４およびＲ_３５は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＨ_２Ｆ、ＣＨＦ_２、ＣＦ_３から選択され；
Ｗは、ＮまたはＣ−Ｈである；
から選択され；
Ｒ_６は、Ｈであり；
Ｘ ⁻ は、任意の負荷電対イオンであり；
ｎ＝１または２である、請求項１３に記載の化合物。
（２Ｅ）−４−｛［４−（４−フルオロ−３−メトキシアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（２７Ｂ）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４２）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４３）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−メトキシ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４４）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−エチニル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４５）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−｛［１−メチル−４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４６）、
（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（３−アミノ−３−オキソプロピル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４７）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−シアノ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４８）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−シアノ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムトリフルオロアセタート（４８ＴＦ）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−｛［１−（２−シアノエチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（４９）、
（２Ｅ）−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５０）、
（２Ｅ）−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５１）、
（２Ｅ）−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ−［（２−メトキシ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５２）、
（２Ｅ）−Ｎ−［（２−エチニル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５３）、
（２Ｅ）−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−｛［１−メチル−４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５４）、
（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（３−アミノ−３−オキソプロピル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５５）、
（２Ｅ）−Ｎ−［（２−シアノ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５６）、
（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（２−シアノエチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−（｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝アミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５７）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５８）、
（２Ｅ）−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（５９）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−メトキシ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６０）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−エチニル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６１）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−｛［１−メチル−４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６２）、
（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（３−アミノ−３−オキソプロピル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６３）、
（２Ｅ）−Ｎ−［（２−シアノ−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６４）、
（２Ｅ）−Ｎ−｛［１−（２−シアノエチル）−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（６５）、
２−（４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］エタンアンモニウムブロミド（１４０）、
２−（４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェノキシ）−Ｎ−［（１，２−ジメチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアンモニウムブロミド（１４１）、
４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝−１−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］ピリジニウムブロミド（１４２）、
１−［２−（４−｛［６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−７−オキソ−７，８−ジヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル］アミノ｝フェノキシ）エチル］−１−［（１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］ピペリジニウムブロミド（１４３）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（２−エチル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７２）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−｛［１−メチル−４−ニトロ−２−（１−プロピニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］メチル｝−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７３）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［（１−メチル−２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７４）、
（２Ｅ）−４−｛［４−（３−ブロモ−４−フルオロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ−［（４−エチル−１−メチル−２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７５）および
（２Ｅ）−Ｎ−［（２−エチル−１−メチル−４−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−｛［４−（３−エチニルアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソ−２−ブテン−１−アンモニウムブロミド（１７６）
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
請求項１に記載の化合物の有効な量を、1種以上の医薬上許容される賦形剤または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物。
ヒトを含めた哺乳類における、癌を含めた増殖性疾患の治療において使用するための、請求項１に記載の式IIの化合物の有効な量を、１種以上の医薬上許容される賦形剤または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物。
癌を含む増殖性疾患の治療において使用するための医薬の調製における、請求項１に記載の式IIの化合物の使用。
癌の治療において用いるための化合物であって請求項１に記載の式IIの化合物の調製における、キナーゼインヒビターの使用であって、キナーゼインヒビターが、（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝−２−ブテナミドである、使用。
（２Ｅ）−４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）アニリノ］ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル｝−２−ブテナミドである、請求項１に記載の化合物の調製において使用するのに適したキナーゼインヒビター。
増殖性疾患の治療において用いるための化合物であって請求項１に記載の化合物の調製における、下記式

［式中、Ｘはハロゲン原子、メシル基またはトシル基である。］
の化合物の使用。