CN102558185B

CN102558185B - 吡啶并吡咯三嗪化合物、其制备方法和用途

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Publication number: CN102558185B
Application number: CN201010581702.5A
Authority: CN
Inventors: 王嘉; 蒙凌华; 杨春皓; 王祥; 丁健; 谢毓元
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2030-12-09
Also published as: CN102558185A

Abstract

本发明涉及一种磷脂酰肌醇-3激酶和雷帕霉素靶蛋白的新型的双重抑制剂，其制备方法和用途，具体而言，涉及一种具有通式I所示结构的吡啶并吡咯三嗪化合物，该化合物的制备方法，及其作为磷脂酰肌醇-3激酶和雷帕霉素靶蛋白的双重抑制剂在制备治疗磷脂酰肌醇-3激酶相关疾病如肿瘤的药物中的应用。

Description

吡啶并吡咯三嗪化合物、其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种磷脂酰肌醇-3激酶和雷帕霉素靶蛋白的新型的双重抑制剂，其制备方法和用途，具体而言，涉及一种吡啶并吡咯三嗪(Pyrido[3’，2’：3，4]pyrrolo[1，2-f][1，2，4]triazine)化合物，该化合物的制备方法，及其作为磷脂酰肌醇-3激酶和雷帕霉素靶蛋白的双重抑制剂在制备治疗磷脂酰肌醇-3激酶相关疾病如肿瘤的药物中的应用。

背景技术

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)能特异性地催化磷脂酰肌醇(PI)的3位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质，并激活多种细胞内的靶蛋白，参与正常细胞的增殖、分化、存活和迁移。近年的研究表明PI3K及其下游蛋白激酶B(Akt)所组成的信号通路与人类肿瘤的发生密切相关。约三分之二的肿瘤在PI3K及其下游信号通路上表达异常。许多癌症病人放化疗产生耐受性与PI3K/Akt通路激活有关。PI3K抑制剂有可能成为临床上克服放疗耐受性、提高疗效的有效手段。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是蛋白激酶B的重要底物之一，为丝苏氨酸激酶。蛋白激酶B通过两种途径激活雷帕霉素靶蛋白：直接磷酸化mTOR；或者通过失活抑癌基因TSC2来间接增强mTOR的激活。激活的mTOR主要通过调控核蛋白体S6激酶(S6K1，或称P70S6K)、真核细胞翻译起始因子4E(eIF-4E)结合蛋白1(4E-BP1)、信号转导及转录激活因子3(STAT3)等下游信号通路，直接或间接地参与了翻译起始阶段、转录、微丝重组、膜转运、蛋白降解、蛋白激酶C(PKC)通路，核糖体蛋白合成和tRNA合成等多个与细胞增殖和生长有关的环节的调控。因此mTOR是一个细胞生长和增殖的中心调节蛋白，已成为新的抗肿瘤靶点。mTOR的抑制剂以雷帕霉素衍生物为主，尽管取得了很好的进展，但进一步的研究表明，雷帕霉素及其衍生物只能抑制雷帕霉素复合物1(mTORComplex1)，不能抑制雷帕霉素复合物2(mTORComplex2)，而雷帕霉素复合物2可以使蛋白激酶B的Ser473位点磷酸化并直接激活Akt，同时间接激活雷帕霉素复合物1，从而导致耐药性的产生。

目前报道的PI3K-mTOR的双重抑制剂主要有NVP-BEZ235、XL765、PI103、PF-05212384等，其中三种双重抑制剂进入临床抗肿瘤研究：PF-05212384(I期临床)，XL765(II期临床)，BEZ-235(II期临床)。而PI103由于代谢很快(CancerRes2007；67：5840-5850)，未能进入临床研究。近年来有关PI3K-mTOR抑制剂的综述可参考：CurrentOpinioninInvestigationalDrugs201011(6)：615-628；CurrentPharmaceuticalDesign，2010，16(12)：1410-1416。这些文献均未包括或覆盖本发明所涉及的新型化合物的结构、合成方法和用途。由于目前尚无PI3K-mTOR的双重抑制剂被批准上市，寻找新型的PI3K-mTOR抑制剂具有重要意义。

发明内容

技术问题

本发明被设计用于解决上述问题。本发明的目的是提供磷脂酰肌醇-3激酶和雷帕霉素靶蛋白的新型的双重抑制剂，其可成为临床上克服放疗耐受性、提高疗效的有效手段。

技术方案

本发明的一个方面提供了一种新型的吡啶并吡咯三嗪化合物，其具有如下通式I所示的结构：

其中，R₁为下列任意一种取代基：H；OH；直链或支链的饱和或不饱和C₁～C₁₂烃基羰基氧基；含一个杂原子的饱和或不饱和杂环基羰基氧基，其中所述杂原子为氧、氮或者硫，所述杂环基为芳香性的或非芳香性的，并且为五元或者六元环；直链或支链的C₁～C₁₂烷氧基或卤素；其中，所述卤素为F、Cl、Br或I。

本发明的另一方面是提供通式I化合物的制备方法。

本发明的又一方面提供了通式I化合物在制备磷脂酰肌醇-3激酶和雷帕霉素靶蛋白的双重抑制剂的药物中的应用，即在制备治疗磷脂酰肌醇-3激酶相关疾病的药物中的应用。

有益效果

本发明的化合物为一种新型的PI3K-mTOR的双重抑制剂，其在体外活性方面，对ECV-304(人内皮细胞膀胱癌)、Bel-7402(人肝癌)和MCF-7(乳腺癌)具有较强的抗增殖作用，较PI103有所提高。对于HT-29(人结肠癌)的活性有明显增强。

附图说明

图1为显示本发明的化合物对蛋白激酶B磷酸化的影响的图；

图2为显示本发明的化合物对Rh30(横纹肌肉瘤细胞)抑制的IC₅₀值的图。

具体实施方式

本发明的目在于提供一种新型的吡啶并吡咯三嗪化合物。

本发明所述的新型的吡啶并吡咯三嗪类化合物的结构具有下面通式I所示的结构：

其中，R₁为下列任意一种取代基：H；OH；直链或支链的饱和或不饱和C₁～C₁₂烃基羰基氧基；含一个杂原子的饱和或不饱和杂环基羰基氧基，其中所述杂原子为氧、氮或者硫，所述杂环基为芳香性的或非芳香性的，并且为五元环或者六元环；直链或支链的C₁～C₁₂烷氧基或卤素；所述卤素为F、Cl、Br或I。

优选地，R₁为下列任意一种取代基：OH；直链或支链的饱和或不饱和C₁～C₆烃基羰基氧基；或含一个杂原子的饱和或不饱和杂环基羰基氧基，其中所述杂原子为氧、氮或者硫，所述杂环基为芳香性的或非芳香性的，并且为五元环或者六元环；

进一步地，所述杂环基优选为呋喃基、吡啶基或吡咯基。

更优选地，通式I的化合物为选自如下化合物中：

本发明的另一目的是提供通式I化合物的制备方法。

所述通式I化合物的制备方法包括如下步骤：

a、将4-氮杂吲哚-2-甲酸乙酯(A)在碱作用下和新鲜制备的氯胺反应，得到化合物B；所述碱为NaH或叔丁醇钾；

b、将B与在苯环的3位被R₁取代的苯甲亚胺酸酯盐酸盐在乙醇中回流，得到化合物C，其中，化合物C中，R₁为H、直链或支链的C₁～C₁₂烷氧基或卤素；

c、将C在三氯氧磷中于80～120℃反应得到氯代产物D；

d、将D与吗啉反应，得到化合物I-1，其中，化合物I-1中，R₁为H、直链或支链的C₁～C₁₂烷氧基或卤素；

e、当R₁为直链或支链的C₁～C₁₂烷氧基时的化合物I-1用三溴化硼或者三氯化铝/乙硫醇脱除烷基后得到式I-2的化合物；

f、将式I-2的化合物与酸、酸酐或酰氯缩合得到通式I-3的化合物，其中，通式I-3的化合物中，R₁为直链或支链的饱和或不饱和C₁～C₁₂烃基羰基氧基或者含一个杂原子的饱和或不饱和杂环基羰基氧基，其中所述杂原子为氧、氮或者硫，所述杂环基为芳香性的或非芳香性的，并且为五元或者六元环。

反应流程1

其中，起始原料4-氮杂吲哚-2-甲酸乙酯(化合物A)是根据文献(Frydman，B.；Reil，S.J.；Boned，J.；Rapoport，H.，SynthesisofSubstituted4-and6-Azaindoles.J.Org.Chem.1968(33)，3762-3766.)制备的。

本发明的再一目的是提供通式I化合物在制备磷脂酰肌醇-3激酶和雷帕霉素靶蛋白的双重抑制剂的药物中的应用，即在治疗磷脂酰肌醇-3激酶相关疾病的药物中的应用。所述磷脂酰肌醇-3激酶相关疾病包括肿瘤。所述肿瘤包括乳腺癌、肝癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤、结肠癌，但不限于此。

此外，本发明提供一种用于治疗磷脂酰肌醇-3激酶相关疾病的药物组合物，其中，该药物组合物包含治疗有效量的一种或多种上述的通式I化合物。所述磷脂酰肌醇-3激酶相关疾病包括肿瘤；所述肿瘤包括乳腺癌、肝癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤和结肠癌。

实施例

通过下述实施例将有助于理解本发明，但本发明的内容并不限于所举实例。在下文中，将更加详细地描述本发明的优选的实施方式。在进行描述前，应该理解在说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应该解释成仅限于通用的或字面的涵义，而是在允许发明人用于最佳解释地适当地限定术语的原则的基础上基于对应本发明的技术方面进行解释。因此，在说明书中提出的描述仅仅为用于解释本发明目的优选实施例，而非意欲限制本发明的范围，因而可以理解在不偏离本发明的实质和范围的情况下，可以对其作出等同替代和修改。

实施例1

1、2-甲基-3-硝基吡啶的制备

将479mg(20.8mmol)钠分批加入到8.6mL(56.8mmol，9g)丙二酸二乙酯中，搅拌15min，然后分批加入3g(18.9mmol)2-氯-3-硝基吡啶，90℃反应7h。减压蒸去大部分的丙二酸二乙酯，然后加入20mL36％硫酸(重量百分比)，105℃反应7h。反应毕，依次用乙醚(50mL×2)和乙酸乙酯(50mL×2)洗涤，弃去有机层，用1N氢氧化钠溶液调节水层pH至8～9，用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，无水硫酸钠干燥，减压蒸干后硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得淡黄色固体2.1g(收率：80.4％)。m.p.28～30℃。

2、2-羟基-3-(3-硝基吡啶-2-基)丙烯酸乙酯的制备

将0.3g(13mmol)钠溶于30mL乙醇中，缓慢滴入12mL(86.9mmol，12.7g)草酸二乙酯，溶液变成淡黄色，滴完加入1.5g(10.9mmol)2-甲基-3-硝基吡啶，溶液变为棕色，室温搅拌过夜，5N盐酸调pH至1，过滤，得红色固体2.1g(收率：80.9％)。m.p.130～132℃。

¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ8.68(dd，J＝5.0，1.4Hz，1H)，8.44(dd，J＝8.3，1.6Hz，1H)，7.40-7.36(dd，J＝8.3，4.9Hz，1H)，7.36(s，1H)，4.39(q，J＝7.1Hz，2H)，1.41(t，J＝7.1Hz，3H)。

3、1H-吡咯并[3，2-b]吡啶-2-甲酸乙酯(A)的制备

将2.4g(12.5mmol)二氯化锡溶于25mL无水乙醇中，缓慢滴入0.586mL(5.2mmol，995mg)四氯化钛，溶液澄清后分批加入500mg(2.1mmol)2-羟基-3-(3-硝基吡啶-2-基)丙烯酸乙酯，加热回流反应。反应毕，减压旋干乙醇，用1N氢氧化钠溶液调pH至中性，接着用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干后，乙醇重结晶得白色固体266mg(收率：66.6％)。m.p.177～178℃。

¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ8.58(dd，J＝4.6，1.4Hz，1H)，7.78(dt，J＝8.4，1.2Hz，1H)，7.41(dd，J＝2.0，0.9Hz，1H)，7.27(dd，J＝9.3，3.7Hz，2H)，4.45(q，J＝7.1Hz，2H)，1.43(t，J＝7.1Hz，3H).MS(EI)：m/e(％)190(80，M⁺)，144(100)，116(30)。

4、1-氨基吡咯并[3，2-b]吡啶-2-甲酸乙酯(B)的制备

将3g(56mmol)氯化铵加入到110mL乙醚中，反应体系冷却到-5℃后，滴加4.7mL浓氨水。滴液漏斗缓慢滴加72mL次氯酸钠溶液(1.8M)，保持反应温度在-10℃，滴毕继续反应15min，有机层分离后用0℃左右的饱和食盐水溶液洗涤(1×25mL)。向有机层中加入氯化钙，并置于冰箱中干燥1h，得到的是氯胺的乙醚溶液，浓度约为0.15M。

将100mg(0.53mmol)1H-吡咯并[3，2-b]吡啶-2-甲酸乙酯溶于3mL无水DMF中，0℃下缓慢加入118mg(1.06mmol)叔丁醇钾，室温搅拌1h后，氮气保护下加入4.2mL新制的氯胺的乙醚溶液，室温反应。反应完毕后，用饱和硫代硫酸钠溶液淬灭，然后加水，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得棕色固体90mg(82.8％)。m.p.108～110℃。

¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ8.58-8.48(m，1H)，7.94(dd，J＝8.4，4.6Hz，1H)，7.35-7.19(m，3H)，5.35(s，2H)，4.42(q，J＝7.1Hz，2H)，1.47-1.38(t，J＝7.1Hz，3H).MS(EI)：m/e(％)205(75，M⁺)，177(35)，159(100)。

5、2-(3-甲氧基苯基)吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪-4-醇的制备

将300mg(1.46mmol)1-氨基吡咯并[3，2-b]吡啶-2-甲酸乙酯溶于5mL无水乙醇，加入946mg(4.39mmol)3-甲氧基苯甲亚胺酸酯盐酸盐，加热回流反应。反应完毕后，减压蒸干乙醇，残余物用去离子水洗涤，然后用乙醚洗涤，接着将其溶于甲醇，硅胶柱分离(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)，得白色固体210mg(收率：49.2％)。m.p.272～274℃。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ12.38(s，1H)，8.69(dd，J＝4.4，1.5Hz，1H)，8.48-8.41(m，1H)，7.70(ddd，J＝7.7，1.6，1.0Hz，1H)，7.68-7.64(m，1H)，7.53-7.45(dd，J＝12.3，4.5Hz，1H)，7.49(s，1H)，7.36(d，J＝0.9Hz，1H)，7.16(ddd，J＝8.3，2.6，0.9Hz，1H)，3.88(s，3H).MS(EI)：m/e(％)292(100，M⁺)。

6、4-氯-2-(3-甲氧基苯基)吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪的制备

将256mg(0.88mmol)化合物2-(3-甲氧基苯基)吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪-4-醇加入到5mL三氯氧磷中，加热回流3h。反应完毕后，蒸除三氯氧磷，将剩余物倾入冰中，用饱和碳酸钾溶液调节pH至中性，抽滤，得淡黄色固体239mg(收率：88.1％)。m.p.140～141℃。

¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ8.89(dd，J＝4.4，1.5Hz，1H)，8.62-8.56(m，1H)，8.04-7.99(m，1H)，7.95(dd，J＝2.6，1.6Hz，1H)，7.47(dd，J＝5.5，3.1Hz，1H)，7.43(t，J＝4.9Hz，1H)，7.38(d，J＝0.8Hz，1H)，7.06(ddd，J＝8.2，2.6，0.9Hz，1H)，3.94(s，3H).MS(EI)：m/e(％)312(33)，310(100，M⁺)。

7、4-吗啉基-2-(3-甲氧基苯基)吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪的制备

将150mgD和0.16mL(1.83mmol，160mg)吗啉加入到10mL无水四氢呋喃中，回流反应5h。反应毕，旋干四氢呋喃，水洗，得黄色固体158mg(收率：90.3％)。m.p.180～182℃。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.73(dd，J＝4.4，1.4Hz，1H)，8.57(d，J＝8.1Hz，1H)，7.97-7.92(m，1H)，7.88(dd，J＝2.3，1.4Hz，1H)，7.52(s，1H)，7.48-7.44(m，1H)，7.44-7.40(m，1H)，7.08(dd，J＝8.6，3.0Hz，1H)，4.25-4.18(t，J＝4.2Hz，4H)，3.86(s，3H)，3.84(t，J＝4.7Hz，4H).MS(EI)：m/e(％)361(100，M⁺)，304(30)。

8、4-吗啉基-2-(3-羟基苯基)吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪(I-2)的制备

将72mg(0.2mmol)化合物E溶于3mL无水二氯甲烷中，在-10℃下加入0.19mL(2mmol，507mg)三溴化硼，反应体系缓慢升至室温。反应毕，体系中依次加入冰水，10mL5MNaOH溶液，固体消失，然后加入1M盐酸调pH至中性，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，得黄色固体43mg(收率：62.3％)。m.p.297～299℃。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.59(s，1H)，8.72(d，J＝3.9Hz，1H)，8.50(d，J＝8.1Hz，1H)，7.79(d，J＝10.0Hz，2H)，7.50(s，1H)，7.44(dd，J＝8.5，4.4Hz，1H)，7.31(t，J＝7.8Hz，1H)，6.88(d，J＝6.4Hz，1H)，4.25-4.18(t，J＝4.2Hz，4H)，3.85(t，J＝4.2Hz，4H).MS(EI)：m/e(％)347(100，M⁺)，290(35)。

实施例2

乙酸3-(4-吗啉基吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪-2-基)苯酯(WJE02)的制备

将97mg(0.28mmol)化合物I-2、0.040mL(0.43mmol，43mg)三乙胺和3.5mg(0.028mmol)DMAP加入到4mL无水二氯甲烷中，0℃下缓慢加入0.040mL(0.43mmol，43mg)乙酸酐，室温反应。反应毕，饱和食盐水洗(3×10mL)，无水硫酸钠干燥，旋干二氯甲烷，得黄色固体93mg(收率：85.2％)。m.p.147～149℃。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.58(dd，J＝4.3，1.2Hz，1H)，8.12(d，J＝8.0Hz，1H)，8.02(d，J＝7.8Hz，1H)，7.98-7.90(m，1H)，7.87(t，J＝7.9Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.44(dd，J＝8.4，4.3Hz，1H)，7.26(dd，J＝8.3，2.1Hz，1H)，4.25-4.16(t，J＝4.9Hz，4H)，3.88-3.80(t，J＝4.9Hz，4H)，2.28(s，3H).MS(EI)：m/e(％)389(100，M⁺)，347(40)。

实施例3

丙酸3-(4-吗啉基吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪-2-基)苯酯(WJE03)的制备

方法同实施例2，只是用丙酰氯代替了实施例2中的乙酸酐。

黄色固体(收率：83.2％)。m.p.138～139℃。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.58(dd，J＝4.3，1.2Hz，1H)，8.14(d，J＝8.0Hz，1H)，7.99(d，J＝7.8Hz，1H)，7.88-7.81(m，1H)，7.74(t，J＝7.9Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.43(dd，J＝8.4，4.3Hz，1H)，7.28(dd，J＝8.3，2.1Hz，1H)，4.25-4.16(t，J＝4.9Hz，4H)，3.88-3.80(t，J＝4.9Hz，4H)，2.67(q，J＝6.8Hz，2H)，1.32(t，J＝6.8Hz，3H).MS(EI)：m/e(％)403(100，M⁺)，224(50)。

实施例4

丁酸3-(4-吗啉基吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪-2-基)苯酯(WJE04)的制备

方法同实施例2，只是用丁酰氯代替了实施例2中的乙酸酐。

黄色固体(收率：83.2％)。m.p.163～164℃。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.73(dd，J＝4.3，1.2Hz，1H)，8.55(d，J＝8.0Hz，1H)，8.25(d，J＝7.8Hz，1H)，8.04-8.00(m，1H)，7.57(t，J＝7.9Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.44(dd，J＝8.4，4.3Hz，1H)，7.26(dd，J＝8.3，2.1Hz，1H)，4.25-4.16(t，J＝4.9Hz，4H)，3.88-3.80(t，J＝4.9Hz，4H)，2.63(t，J＝7.3Hz，2H)，1.71(dt，J＝14.7，7.2Hz，2H)，1.01(t，J＝7.4Hz，3H).MS(EI)：m/e(％)417(100，M⁺)，347(45)，290(30)。

实施例5

2-丙基戊酸3-(4-吗啉基吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪-2-基)苯酯(WJE05)的制备

方法同实施例2，只是用2-丙基戊酰氯代替了实施例2中的乙酸酐。

黄色固体(收率：83.2％)。m.p.155～157℃。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.74(dd，J＝4.3，1.2Hz，1H)，8.23(d，J＝8.0Hz，1H)，7.87(d，J＝7.8Hz，1H)，7.74-7.60(m，1H)，7.47(t，J＝7.9Hz，1H)，7.44(s，1H)，7.41(dd，J＝8.4，4.3Hz，1H)，7.26(dd，J＝8.3，2.1Hz，1H)，4.15-4.06(t，J＝4.9Hz，4H)，3.88-3.80(t，J＝4.9Hz，4H)，2.25(td，J＝8.7，4.1Hz，1H)，1.65-1.53(m，2H)，1.50(ddd，J＝18.7，10.7，5.6Hz，2H)，1.47-1.32(m，4H)，0.94(t，J＝7.3Hz，6H).MS(EI)：m/e(％)473(100，M⁺)，347(35)。

实施例6

丙烯酸3-(4-吗啉基吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪-2-基)苯酯(WJE06)的制备

将62mg(0.18mmol)的I-2、13mg丙烯酸(0.18mmol)、37mg(0.18mmol)二环己基碳二亚胺和2mg的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)加入到5mL无水二氯甲烷中，室温反应过夜，过滤，滤液依次用20mL水洗，5％乙酸洗涤，20mL水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到黄色固体57mg(收率：80.2％)。m.p.150～152℃。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.58(dd，J＝4.3，1.2Hz，1H)，8.02(d，J＝8.0Hz，1H)，7.98(d，J＝7.8Hz，1H)，7.74-7.63(m，1H)，7.57(t，J＝7.9Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.44(dd，J＝8.4，4.3Hz，1H)，7.26(dd，J＝8.3，2.1Hz，1H)，6.38(d，J＝4.3Hz，2H)，6.08(t，J＝4.0Hz，1H)，4.25-4.16(t，J＝4.9Hz，4H)，3.88-3.80(t，J＝4.9Hz，4H).MS(EI)：m/e(％)401(100，M⁺)，347(40)。

实施例7

呋喃-2-甲酸3-(4-吗啉基吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪-2-基)苯酯(WJE07)的制备

方法同实施例6，只是用呋喃甲酸代替了实施例6中的丙烯酸。

黄色固体(收率：81.5％)。m.p.128～130℃。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.58(dd，J＝4.3，1.2Hz，1H)，8.02(d，J＝8.0Hz，1H)，7.97(d，J＝7.8Hz，1H)，7.94-7.83(m，1H)，7.85(d，J＝4.0Hz，1H)，7.65(t，J＝7.9Hz，1H)，7.57(s，1H)，7.52(d，J＝4.1Hz，1H)，7.44(dd，J＝8.4，4.3Hz，1H)，7.26(dd，J＝8.3，2.1Hz，1H)，6.68(t，J＝4.0Hz，1H)，4.25-4.16(t，J＝4.9Hz，4H)，3.88-3.80(t，J＝4.9Hz，4H).MS(EI)：m/e(％)441(20，M⁺)，224(70)，56(100)。

实施例8

吡啶-4-甲酸3-(4-吗啉基吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪-2-基)苯酯(WJE08)的制备

方法同实施例6，只是用4-吡啶甲酸代替了实施例6中的丙烯酸。

黄色固体(收率：78.5％)。m.p.160～162℃。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.81(d，J＝4.5Hz，2H)，8.63(dd，J＝4.3，1.2Hz，1H)，8.58(d，J＝8.0Hz，1H)，8.05(d，J＝7.8Hz，1H)，7.94-7.87(m，4H)，7.62(t，J＝7.9Hz，1H)，7.54(s，1H)，7.42(dd，J＝8.4，4.3Hz，1H)，7.38(dd，J＝8.3，2.1Hz，1H)，4.25-4.16(t，J＝4.9Hz，4H)，3.88-3.80(t，J＝4.9Hz，4H).MS(EI)：m/e(％)452(100，M⁺)。

实施例9

吡咯-2-甲酸3-(4-吗啉基吡啶并[3’，2’：3，4]吡咯并[1，2-f][1，2，4]三氮嗪-2-基)苯酯(WJE09)

方法同实施例6，只是用脯氨酸代替了实施例6中的丙烯酸。

黄色固体(收率：82.1％)。m.p.120～122℃。

¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.58(dd，J＝4.3，1.2Hz，1H)，8.12(d，J＝8.0Hz，1H)，7.98(d，J＝7.8Hz，1H)，7.68-7.60(m，1H)，7.58(t，J＝7.9Hz，1H)，7.43(s，1H)，7.40(dd，J＝8.4，4.3Hz，1H)，7.30(dd，J＝8.3，2.1Hz，1H)，4.25-4.16(t，J＝4.9Hz，4H)，4.01(m，1H)，3.88-3.80(t，J＝4.9Hz，4H)，3.38-3.21(m，2H)，2.08-1.63(m，4H).MS(EI)：m/e(％)444(100，M⁺)。

活性测试试验

蛋白激酶B(Akt)的磷酸化抑制作用实验

将处于指数生长期的人横纹肌肉瘤细胞株Rh30(2×10⁵个/孔)接种于12孔板。贴壁过夜后，弃孔中培液，加入1ml/孔的新鲜无血清培液，饥饿24h后，加入10μM待测化合物及阳性化合物渥曼青霉素(wortmannin，简称wort)，空白对照中加入等量的二甲基亚砜(DMSO)。用50ng/ml的胰岛素样生长因子(IGF)刺激10min后，弃去培养液。用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS)细清洗孔中细胞，再用1×SDS(十二烷基磺酸钠)凝胶加样缓冲液(50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，即Tris.Cl)(pH6.8)、100mM二硫苏糖醇(DTT)、2％SDS、0.1％溴酚蓝、10％甘油)裂解(重量百分数)，收集于艾朋道夫(Eppendorf)离心管中，煮沸10min，13,000rpm离心10min，至此总蛋白提取完毕。将等量样品上样于10％的聚丙烯酰胺凝胶，在三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸电泳缓冲液(25mMTris、250mM甘氨酸、0.1％SDS)中以80-100V电泳约2～2.5h。用半干法将蛋白从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜。在转移缓冲液(39mM甘氨酸、48mM三羟甲基氨基甲烷、0.037％SDS、20％甲醇)电流50mA转移2h。转移结束，用丽春红(PonceauS)染色确定转移情况和蛋白条带在硝酸纤维素滤膜上的位置，标记后用含5％脱脂奶粉的封闭液[5％脱脂奶粉，20mMTris-HCl(pH7.2-7.4)、150mMNaCl、0.1％(v/v)吐温20(Tween20)]于摇床室温封闭2h。然后，加入特异性一抗于4℃杂交过夜。用TBS-T[20mMTris-HCl(pH7.2-7.4)、150mMNaCl、0.2％(v/v)Tween20]室温洗3次，15min/次。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温置于摇床上平缓摇动1.5h。再用洗液洗三次，15min/次。最后，用化学发光底物(SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrate，Pierce公司产品)发色后曝光、显影、定影、拍照。

按以上操作2次后，测定分析蛋白激酶Bser473的磷酸化水平。结果见图1(其中，阳性对照为渥曼青霉素(Wortmannin)和WJD008(E-2-(3-羟基苯基)-4-(2-二甲氨基乙烯基)-5-腈基-6-嘧啶吗啉)(见参考文献：LiT，WangJ，WangX，YangN，ChenSM，TongLJ，YangCH，MengLH，DingJ.WJD008，aDualPhosphatidylinositol3-Kinase(PI3K)/MammalianTargetofRapamycinInhibitor，PreventsPI3KSignalingandInhibitstheProliferationofTransformedCellswithOncogenicPI3KMutant.J.Pharmacol.Exp.Ther.334：830-838，2010)。

从图1中可以看出，化合物WJE04，WJE08都对蛋白激酶B的磷酸化产生抑制.

对Rh30细胞的增殖抑制

在96孔板中按一定密度种下Rh30细胞，待贴壁后，加入一定浓度待测化合物培养液作用72h，弃掉培养液，加入三氯醋酸固定，蒸馏水洗五次，干燥，加入磺酰罗丹明B染色，用1％冰醋酸洗五次，干燥，加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液，酶标仪560nm波长下测OD值，计算抑制率。结果显示，除WJE09之外，该系列化合物对于Rh30的细胞增殖抑制IC₅₀均小于10μM，WJE04、WJE05、WJE06、WJE08等活性优于阳性对照渥曼青霉素。从图2中可以看出除了I-2和WJE09，其它化合物的IC₅₀值均低于阳性对照渥曼青霉素。

对其它肿瘤细胞的增殖抑制：

实验过程同Rh30细胞。结果见表1。

表1

可以表1中可以看出，它们对ECV-304(人内皮细胞膀胱癌)，Bel-7402(人肝癌)和MCF-7(乳腺癌)具有较强的抗增殖作用。化合物I-2对ECV-304、Bel-7402、MCF-7的活性与PI103相当，对HT-29(人结肠癌)的活性比PI103有明显提高。WJE04和WJE05对ECV-304的活性与PI103相比分别提高了3.5倍和1.5倍，对MCF-7的活性与PI103相比也分别提高了2.6倍和2倍。所有化合物除WJE02以外，对HT-29(人结肠癌)的作用均较PI103有所增强。

Claims

1.一种吡啶并吡咯三嗪化合物，其具有通式Ⅰ所示结构：

其中，R₁为下列任意一种取代基：OH；直链或支链的饱和或不饱和C₁～C₁₂烃基羰基氧基；含一个杂原子的饱和或不饱和杂环基羰基氧基，其中所述杂环基为呋喃基、吡啶基或吡咯基；直链或支链的C₁～C₁₂烷氧基或卤素；所述卤素为F、Cl、Br或I。

2.根据权利要求1所述的吡啶并吡咯三嗪化合物，其中，通式Ⅰ中：R₁为下列任意一种取代基：OH；直链或支链的饱和或不饱和C₁～C₆烃基羰基氧基；或含一个杂原子的饱和或不饱和杂环基羰基氧基，其中所述杂环基为呋喃基或吡啶基。

3.具有如下结构式的吡啶并吡咯三嗪化合物：

4.一种权利要求1～3中任一项所述的吡啶并吡咯三嗪化合物的制备方法，其包括如下步骤：

a、将4-氮杂吲哚-2-甲酸乙酯(A)在碱作用下和新鲜制备的氯胺反应，得到化合物B；

b、在碱作用下，将B与在苯环的3位被R₁取代的苯甲亚胺酸酯盐酸盐在乙醇中回流，得到化合物C，其中，化合物C中，R₁为H、直链或支链的C₁～C₁₂烷氧基或卤素；

c、将C在三氯氧磷中于80～120℃反应得到氯代产物D；

d、将D与吗啉反应，得到化合物Ⅰ-1，其中，化合物Ⅰ-1中，R₁为H、直链或支链的C₁～C₁₂烷氧基或卤素；

e、当R₁为直链或支链的C₁～C₁₂烷氧基时的化合物Ⅰ-1用三溴化硼或者三氯化铝/乙硫醇脱除烷基后得到式Ⅰ-2的化合物；

f、将式Ⅰ-2的化合物与酸、酸酐或酰氯缩合得到通式Ⅰ-3的化合物，其中，通式Ⅰ-3的化合物中，R₁为直链或支链的饱和或不饱和C₁～C₁₂烃基羰基氧基或者含一个杂原子的饱和或不饱和杂环基羰基氧基，其中所述杂环基为呋喃基、吡啶基或吡咯基；

反应流程如下所示：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，在步骤a中所使用的碱为NaH或叔丁醇钾。

6.一种用于治疗磷脂酰肌醇-3激酶相关疾病的药物组合物，其中，该药物组合物包含治疗有效量的一种或多种根据权利要求1～3中任一项所述的化合物。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述磷脂酰肌醇-3激酶相关疾病为肿瘤；所述肿瘤选自乳腺癌、肝癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤和结肠癌。

8.权利要求1～3中任一项所述的吡啶并吡咯三嗪化合物在制备磷脂酰肌醇-3激酶和雷帕霉素靶蛋白的双重抑制剂的药物中的应用。

9.权利要求1～3中任一项所述的吡啶并吡咯三嗪化合物在制备治疗磷脂酰肌醇-3激酶相关疾病的药物中的应用。