JP5768055B2 - 基体 - Google Patents

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Description

本発明は、微粒子をトラップする微小吸引孔を備えた基体、及び基体の製造方法に関する。本願は、2010年9月30日に、日本に出願された特願2010−222225号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
生物から採取した細胞、もしくは培養細胞を物理的に捕捉し、細胞の電気生理学的測定を行う方法として、パッチクランプ法が知られている。細胞を物理的に捕捉する従来方法として、樹脂製のウェル108の側面に設けた孔で細胞101を吸引する方法(図49)が知られている(非特許文献1)。非特許文献1には、孔で捕捉した細胞の振る舞いを装置の裏面から高倍率な顕微鏡を用いて直接観察することや、孔で捕捉した細胞の細胞膜等を電気生理学的に測定することが可能な装置が開示されている。これらは、新たな生物的な特性を解明する手段として有効な手段となりつつある。
一般に、パッチクランプ法においては、前記孔の吸着部(開口部)と細胞膜とを密着させて、1ギガオーム以上の強固なシール(高抵抗性シール)を達成することが要求される。このような高抵抗性シールを形成するためには、細胞膜と吸着部とのシールを安定させる必要があり、吸着部の口径の微細化、および段差や継ぎ目の無い孔形状が求められる。
非特許文献1に開示された細胞捕捉用装置は、樹脂(PDMS)で形成される2つの部材を貼り合わせて、その貼り合わせの界面に微細孔を設けた基体を有する。前記基体には流体を溜める空間が設けられている。この空間は、前記基体を打抜く(punching)ことによって形成されている。この打抜きの際、予め基体内に形成されていた前記微細孔を前記空間に開口させる。
前記細胞捕捉用装置は、樹脂を打抜く手法によって製造されているため、細胞を捕捉するための前記微細孔の吸着部(開口部)の形状を、所望の形状に加工することが困難である。また、基体に複数の吸着部(開口部)を形成する場合は、複数の吸着部(開口部)の形状を均一に形成することが困難である。また、前記基体が樹脂であるため、短径2ミクロン程度よりも微小な孔を形成することが難しい。さらに、前記微細孔は2つの部材を貼り合わせて形成されているため、前記吸着部にも2つの部材を張り合わせた継ぎ目や段差が存在する。このような継ぎ目や段差があると、細胞を安定に捕捉し難いことがある。つまり、前記細胞捕捉用装置に形成される微細孔及び吸着部の大きさや形状は精度が低いため、所望どおりに細胞を捕捉することが難しいという問題がある。
また、電気生理学的測定を行う場合においては、細胞膜と吸着部とのシールが不安定となるため、高精度な電気生理学的測定が難しい、という問題がある。
さらに、細胞よりも更にサイズの小さな微生物(短辺がナノオーダー)の微生物を捕捉するためには、前記微細孔の吸着部(開口部)における短辺の径を少なくともナノオーダーで高精度に形成する必要がある。しかしながら、非特許文献1は複数の樹脂基板110,112を貼り合わせて構成しているため、ナノオーダーで吸着部(開口部)を加工することが困難である。
電気生理学的測定を安定的に行い、かつ精度を高めるためには、細胞を捕捉する孔の面積を小さくすることが有効となりうる。このため、従来の孔の口径(2〜4μm程度)よりも小さい口径を有する孔を備えた装置、及び前記装置の製造方法の開発が望まれている。
また、微生物又は細胞を含めた、流体に含まれる微粒子を捕捉して、観察、操作、測定等を行うことができる装置の開発が望まれている。
Adrian Y. Lau, et al. Lab Chip, 2006, 6, 1510-1515
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、流体に含まれる微粒子を捕捉する孔が単一基材によって形成され、捕捉された微粒子の観察が容易な基体、及び基体の製造方法の提供を課題とする。
本発明の第一態様の基体は、基体であって、基材と、前記基材内に設けられ、内壁面を有し、流体を流通させる流路と、前記流路の内壁面を構成する内壁のうち前記流路の側面を構成する内壁に設けられ、前記流路と前記基材の外部とを連通し、前記側面に開口部を有する微小吸引孔と、前記内壁のうち前記微小吸引孔の開口部に近い位置に配置され、前記流体の流れを緩める緩流部と、を含み、前記基材のうち、少なくとも前記微小吸引孔を構成する部位は、単一の部材で形成されており、前記微小吸引孔の開口部の孔の形状が楕円又は略楕円であり、該楕円又は略楕円の長軸が前記基材の上面又は下面に対して略垂直であり、前記基体は、前記微小吸引孔に保持された観察対象物を前記基材の前記上面又は前記下面から観察するために使用される。
本発明の第一態様の基体においては、前記微小吸引孔が前記流路の側面を構成する前記内壁に複数設けられていることが好ましい。
本発明の第一態様の基体においては、前記微小吸引孔の開口部の短径が0.02μm〜5μmであることが好ましい。
本発明の第一態様の基体においては、前記流路の内壁面は、前記緩流部が配置された第一内壁面と、前記微小吸引孔の前記開口部が配置された第二内壁面とを含み、前記第一内壁面と前記第二内壁面は互いに異なることが好ましい。
本発明の第一態様の基体においては、前記流路の内壁面は、前記緩流部が配置された第一内壁面と、前記微小吸引孔の前記開口部が配された第二内壁面とを含み、前記第一内壁面は、前記第二内壁面と同一であることが好ましい。
本発明の第一態様の基体においては、前記緩流部は、前記流路が有する内壁面に形成された凹部であることが好ましい。
本発明の第一態様の基体においては、前記凹部に近い位置に設けられ、前記流路が有する内壁面のうち、前記微小吸引孔が形成されている内壁面とは異なる内壁面から突出している突起部を有することが好ましい。
本発明の第一態様の基体においては、前記凹部は、前記開口部に近い位置に設けられている第一の角部と、前記開口部から離れた位置に設けられている第二の角部とを有し、前記流路の延在方向に沿う、前記微小吸引孔の縦断面において、前記流路の延在方向に直交する方向における前記第一の角部と前記開口部との距離をLで表し、かつ、前記微小吸引孔の延在方向における前記第一の角部と前記開口部との距離をWで表した場合、L/Wの比が0.05〜100の範囲内であることが好ましい。
本発明の第一態様の基体においては、前記開口部が前記観察対象物を捕捉する吸着部を構成することが好ましい。
本発明の第一態様の基体においては、前記単一の部材の材料が、ガラス、石英、又はサファイアであることが好ましい。
本発明に関連する第五態様の基体の製造方法は、第一の態様の基体の製造方法であって、単一の部材を含む基材を準備し、ピコ秒オーダー以下のパスル時間幅を有するレーザーを、前記単一の部材において、少なくとも微小吸引孔が形成される領域と緩流部が形成される領域とに照射することによって、改質部を形成する工程D1と、前記単一の部材に、ドライエッチングによって前記流路および前記緩流部を形成する工程D2と、前記単一の部材から前記改質部をウェットエッチングによって除去することによって前記微小吸引孔を形成する工程D3と、を少なくとも有する。
本発明の基体によれば、基材の外部から微小吸引孔を吸引することによって、微粒子を含む流体が流入された流路に開口する、微小吸引孔の第一端部に形成される吸着部に、前記微粒子を吸着して捕捉することができる。前記吸着部は、単一の部材で形成されるため、継ぎ目がなく、段差を実質的に無くすことができる。このため、トラップした微粒子を前記吸着部に十分に密着し、微粒子がトラップされた状態を安定に継続することができる。したがって、前記微粒子の観察が容易である。さらに、前記微粒子が微生物又は細胞である場合、高精度な電気生理学的測定を行うことが可能である。
また、前記吸着部に近い位置に緩流部が設けられていることによって、前記吸着部に近い位置で、前記流体の流れを緩やかにすることができる。この結果、前記微粒子を、前記吸着部に近い位置に滞留させられるため、前記吸着部に微粒子を捕捉することが容易である。また、捕捉した後においても、微粒子が流体から受ける圧力が低下するため、捕捉した微粒子が流体によって剥ぎ取られることなく、安定して継続的に捕捉することができる。
前記流路において、前記緩流部が前記吸着部とは異なる内壁面に設けられている場合、前記緩流部に対して、流体の流れを緩やかにするという機能以外に、別の機能を付加することが可能である。例えば、流路の底面に、凹部を有する緩流部を設けた場合、前記凹部は、流体の流れを緩やかにすると共に、前記凹部に微粒子を沈殿させて捕集することが可能である。緩流部に捕集された微粒子は、前記緩流部に近い位置に設けられている前記吸着部に吸引されて、前記吸着部に捕捉されうる。つまり、緩流部が微粒子を捕集することによって、吸着部に微粒子を吸引、および吸着することがより容易になるという効果が得られる。
このように、前記緩流部が前記吸着部とは異なる内壁面に設けられる場合において、前記吸着部が流路の一方の側面に設けられているならば、前記緩流部を設置する面の選択肢は、例えば、流路の底面、他方の側面、及び天井面がある。つまり、緩流部の設置面の選択肢が増えるので、流路及び緩流部の設計の自由度が高くなる。
前記流路において、前記緩流部が前記吸着部と同一の内壁面に設けられている場合、前記緩流部と前記吸着部とを一体化することができる。例えば、流路の側面に、凹部を有する緩流部を設けて、さらに、前記凹部の内面に、前記吸着部を形成する構成が可能となる。この場合、流路を流れる流体の本流が、吸着部に対して直接吹き付けられる程度をさらに低減できるため、一度吸着した微粒子が、前記本流によって吸着部から剥ぎ取られる不都合をほとんどなくし、微粒子を安定して継続的に捕捉することができる。
本発明の基体の製造方法によれば、単一の部材に、微小吸引孔を形成し、前記微小吸引孔の第一端部を、前記基体内に設けられる流路に連通させることができる。前記微小吸引孔を形成する方法が、レーザー照射により基材に改質部を形成し、エッチング処理による前記改質部の除去を行う方法である場合、基材に微小吸引孔を精度よく、且つ、高密度で配置した基体を作製することができる。具体的には、前記微小吸引孔の第一端部に含まれる前記吸着部を、ナノオーダーの口径サイズで形成することができる。
本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 図1のA−A線に沿う断面図である。 図2の断面図において、微粒子が吸着部にトラップされた様子を示す模式図である。 基体の一例における緩流部P周辺の要部を示す模式的な斜視図である。 基体の一例における緩流部P周辺の要部を示す模式的な斜視図である。 基体の一例における緩流部P周辺の要部を示す模式的な斜視図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 図11のA−A線に沿う断面図である。 図12の断面図において、微粒子が吸着部にトラップされた様子を示す模式図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 図14のA−A線に沿う断面図である。 図15の断面図において、微粒子が吸着部にトラップされた様子を示す模式図である。 本発明にかかる基体の一例を示す断面図である。 本発明にかかる基体の一例を示す断面図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 図19のA−A線に沿う断面図である。 本発明にかかる基体の一例を示す概略上面図である。 本発明にかかる基体の一例を示す概略上面図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 図23のA−A線に沿う断面図である。 図24の断面図において、微粒子が吸着部にトラップされた様子を示す模式図である。 基体の一例における緩流部P周辺の要部を示す模式的な斜視図である。 基体の一例における微小吸引孔の従断面を示す模式図である。 基体の一例における微小吸引孔の従断面を示す模式図である。 基体の一例における微小吸引孔の従断面を示す模式図である。 基体の一例における微小吸引孔の従断面を示す模式図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 基体の一例における微小吸引孔の従断面を示す模式図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 基体の一例における微小吸引孔の従断面を示す模式図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 基体の一例における微小吸引孔の従断面を示す模式図である。 基体の一例における微小吸引孔の従断面を示す模式図である。 本発明にかかる基体の一例を示す模式的な斜視図である。 基体の一例における微小吸引孔の従断面を示す模式図である。 本発明にかかる基体の一例を示す概略上面図である。 本発明にかかる基体の一例を示す概略上面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 レーザー照射方法αを示す模式的な斜視図である。 レーザー照射エネルギーと形成される改質部(酸素欠乏部)との関係を模式的に示す図である。 レーザー照射エネルギーと形成される改質部(酸素欠乏部)との関係を模式的に示す図である。 レーザー照射エネルギーと形成される改質部(酸素欠乏部)との関係を模式的に示す図である。 レーザー照射エネルギーと形成される改質部(酸素欠乏部)との関係を模式的に示す図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 本発明にかかる基体の製造方法の一例を示す概略断面図である。 従来のパッチクランプ法で使用されている装置構成の一例を示す概略断面図である。
以下、好適な実施の形態に基づき、図面を参照して本発明を説明する。
<基体の第一実施形態>
[基体10A]
図1は、本発明にかかる基体の第一実施形態である基体10Aの斜視図である。図2及び3は、図1のA−A線に沿う断面を示す模式図である。
基体10Aは微粒子Tをトラップする微小吸引孔1を備えた基体である。基体10Aには、基材4内に設けられ、微粒子Tを含む流体Rを流通させる流路3と、流路3と基材4の外部とを連通する微小吸引孔1とを含み、基材4のうち、少なくとも微小吸引孔1を構成する部位は、単一の部材で形成される。さらに、基材4の上面を覆うように基板6が貼り合わされている。基材6を通して観察を行う場合は、前記基材6が可視光を透過することが好ましい。
また、基体10Aにおいて流路3を構成する内壁のうち、微小吸引孔1の第一開口部(開口部)に近い位置に、流体Rの流れを緩める緩流部Pが配置されている。
基体10Aでは、基材4の上面側に流路3が設けられている。前記流路3において、微粒子Tを含む流体Rが、上流側F1から下流側F2へ流通される。
流路3の側面3aに、微小吸引孔1の第一開口部1aが露呈する吸着部Sが形成され、流路3の少なくとも上面3d及び下面3bの一方の少なくとも一部分は、吸着部Sにトラップされた微粒子Tを光学的に観察可能なように、透明な部材6(基板6)で構成されている。
図3は、基体10Aの流路3に流体Rを流通し、前記流体Rに含まれる微粒子Tが吸着部Sに捕捉されている様子を示している。
本発明の基体が捕捉する微粒子Tは、流体Rに含まれており、かつ、流路3を流通可能であれば特に制限されない。例えば、微生物、細胞、有機物質で形成される粒子、無機物質で形成される粒子等が挙げられる。前記微生物としては、細菌、真菌、黴、大型のウイルス等が例示できる。前記細胞としては、赤血球、白血球等の浮遊培養が可能な細胞が例示できる。前記有機物質で形成される粒子としては、樹脂または多糖類等の高分子で構成される粒子、活性炭粒子等が例示できる。前記無機物質で形成される粒子としては、シリカ粒子または金コロイド粒子等の金属粒子が例示できる。
前記有機物質で形成される粒子、及び前記無機物質で形成される粒子は、その表面又は内部に抗体分子等を結合させた機能性粒子であってもよい。
前記有機物質で形成される粒子の形状、及び前記無機物質で形成される粒子の形状は、特に制限されない。例えば、球、立方体、直方体、多面体、ドーナッツ形の立体、もしくはひも状の立体等、あらゆる立体形状の粒子が本発明の微粒子に含まれる。
前記有機物質で形成される粒子、及び前記無機物質で形成される粒子の大きさは、前記吸着部を有する微小吸引孔の第一端部の開口径(短径)よりも大きければよく、特に制限されない。つまり、微小吸引孔を通過しない大きさであればよい。
本発明の基体が捕捉する微粒子としては、微生物又は細胞が好ましい。微生物又は細胞は、表面形状が比較的柔軟である。このため、吸着部Sに充分に密着させて、より強力に吸着することが可能である。さらに、前記微粒子が微生物又は細胞である場合、高精度な電気生理学的測定を行うことが可能である。
図3のように流路3の側面3aに微小吸引孔1が開口している場合、基材4の下面側または基材4の上面側から観察した際に、微小吸引孔1と観察対象物とが重ならないため、微粒子Tを容易に観察することができる。
図4は、基材4の下面に対して、顕微鏡の対物レンズMを近づけて、微粒子Tを光学的に観察する様子を示している。なお、図4においては、基体10Aにおける緩流部P周辺の要部のみが示されている。
捕捉した微粒子を基材の下面から観察する場合、観察対象と対物レンズとの距離(ワーキングディスタンス)を調整して観察対象物に焦点を合わせる。しかしながら、基材下面と観察対象物との距離が、観察するのに必要とされるワーキングディスタンスより大きい場合、観察対象物に焦点を合わせることができない。その様な事態を避けるため、基材下面を研磨することなどによって基材厚さを薄くし、基材下面と観察対象物との距離を短くすることができる。しかしながら、流路3の下面3bに開口する微小吸引孔を形成した場合、流路3の下面3bと基材下面との間に微小吸引孔が存在するため、基材下面を研磨することなどによって基材を薄くすることは難しい場合がある。したがって、基体10Aのように、微小吸引孔は流路3の側面3aに開口していることが好ましい。
本発明において、観察対象である微粒子Tを含む流体Rは特に制限されず、例えば血液、細胞培養液、飲料用液体、河川水等が挙げられる。また、黴等を含む空気も流体Rに含まれる。
本発明で「流路3に流体Rを流通させる」とは、基体10Aの外部から流路3に流体Rを入れて流すことを意味する。流入された流体Rは、流路3を流通し続けても良いし、必要に応じて、一時的に流通を停止させても良い。流路3を流れる流体Rは最終的には基体10Aの外部へ排出されるが、必要に応じて、同じ流体Rを流路3へ再度流入させて、循環させてもよい。このことは、本発明にかかる基体の全てに適用される。
基体10Aの流路3において、緩流部Pが配置された第一内壁面3b(下面3b)と、微小吸引孔1の第一開口部1aが配置された第二内壁面3a(側面3a)とは、異なる内壁面である。つまり、緩流部Pに含まれる凹部Cが設けられた下面3bと、微小吸引孔1の第一端部1aが開口する側面3aとは、流路3において、それぞれ異なる内壁面に形成される。
吸着部Sに近い位置に設けられた緩流部Pは、流路3の下面(底面)3bにおいて、吸着部Sの直下に配置された凹部Cを有する。
凹部Cが配置された緩流部Pにおける、前記凹部Cの内部、或いは前記凹部Cに近い位置で、流体Rの流れの中に、例えば、上昇流、下降流、逆流、及び渦流等の成分を含む乱流が生じる。すなわち、前記凹部Cの内部或いは前記凹部Cに近い位置において、流体Rは非直線的に流れるため、流体Rの流れが緩やかになる。流体R中の微粒子Tが、緩流部Pに近い位置を通過する際に、前記乱流に巻き込まれうるので、本発明における流路は、前記微粒子Tが緩流部Pに近い位置に滞留する時間を、緩流部Pが設けられていない流路と比べて、長くすることができる。この結果、緩流部Pに近い位置に設けられた吸着部Sが、前記微粒子Tを容易に捕捉することができる。
本発明における緩流部Pにおいて、微小吸引孔1の第一開口部1aと、前記第一開口部1aに近い方の凹部Cが有する角部における、開口部が形成されている側の端部e1との最短距離lは、0〜500μmであることが好ましく、0.001μm〜250μmであることがより好ましく、0.01μm〜100μmであることがさらに好ましい(図5参照)。
最短距離lが上記範囲であると、緩流部Pで発生する前記乱流の勢力圏内に吸着部Sが設けられるため、吸着部Sが微粒子をより容易に捕捉することができる。このとき、流体Rはどちら方向に流れていてもよい。
なお、図5では、基体10Aにおける緩流部P周辺の要部のみが示されている。
流路3において、凹部Cは、側面3a,3b、下面3b、もしくは上面3dのいずれの面に設けられてもよい。凹部Cを下面3bに配置した場合、凹部C内に微粒子Tが一時的に引っかかって留まることがある。一時的に留められた微粒子Tは、凹部Cに近い位置に配置された第一開口部1aに吸引されて捕捉され易くなる。このため、凹部Cは流路3の下面3bに配置されることが好ましい。
微小吸引孔1において第一開口部1aを配置する高さは、図5に示すように凹部Cに含まれていなくても良いし、図6に示すように凹部Cに含まれていても良い。
第一開口部1aの少なくとも一部が凹部Cに含まれている場合、吸着部Sを凹部C内に配置することになる。この場合、凹部C内に一時的に留まっている微粒子Tを、より確実に、吸着部Sに引き寄せて捕捉できるので好ましい。
本発明の緩流部Pにおいて、凹部Cの深さは、0.5μm〜50μmの範囲であることが好ましく、1μm〜25μmの範囲であることがより好ましく、1μm〜10μmの範囲であることがさらに好ましい。上記範囲であると、緩流部Pにおいて、十分に前記乱流を発生させられる。
凹部Cの幅としては、0.5μm〜100μmの範囲であることが好ましく、1μm〜50μmの範囲であることがより好ましく、5μm〜25μmの範囲であることがさらに好ましい。上記範囲であると、緩流部Pにおいて、十分に前記乱流を発生させられる。
図1に示す基体10Aにおいては、前記単一の部材は、微小吸引孔1を備えるだけでなく、基材4全体を構成していることが好ましい。
前記単一の部材の材料としては、例えばシリコン、ガラス、石英、もしくはサファイアなどが挙げられる。なかでも、結晶方位による加工異方性の影響を受けにくい非結晶質である材料が好ましい。これらの材料を用いた場合、微小吸引孔1の加工精度をさらに高めることができ、吸着部Sをナノオーダーの口径で形成することが好ましい。このため、トラップした細胞T(微粒子T)と吸着部Sとの間で高抵抗性シールを形成することが、比較的容易である。この際、微小吸引孔1に形成されている吸着部Sがガラス、石英、もしくはサファイアで形成される場合、絶縁性を付与する処理を行う工程を必要としないので好ましい。高抵抗性シールを形成し、トラップした細胞Tの電気生理学的測定を行う場合は、前記細胞Tの内外の電位差(膜電位)等を測定する方法を、前記基体に適宜用いて測定することも可能である。吸着部Sを形成する材料がガラス、石英である場合、トラップした細胞Tの電気生理学的測定を行う場合は、前記細胞Tと吸着部Sとのギガオームオーダーの高抵抗シールが実現されるため、より高精度の測定が可能である。
前記単一の部材の材料は、波長0.1μm〜10μmを有する光のうち少なくとも一部の波長を有する光を透過することが好ましい。
具体的には、加工用レーザーとして使用される一般的な光(波長0.1μm〜10μm)の、少なくとも一部を透過することが好ましい。このようなレーザー光を透過することによって、後述するように、レーザー照射して前記部材に改質部を形成することができる。
また、前記単一の部材の材料は、可視光領域(波長約0.36μm〜約0.83μm)の光を透過することが、より好ましい。可視光領域の光を透過することによって、捕捉した微粒子Tを、前記単一部材を透して光学顕微鏡等の光学的手法を用いて容易に観察することができる。
さらに、前記単一の部材の材料が、前記波長の光のうち少なくとも一部の紫外光あるいは可視光線(0.1μm〜0.83μm)を透過する場合には、蛍光色素によって染色された微生物又は細胞(微粒子T)内の組織を蛍光観察することができる。
なお、本発明における「透過(透明)」とは、前記部材に光を入射して、前記部材から透過光が得られる状態の全てをいう。
図1では、基材4を構成する単一の部材は透明なガラス基板である。
図2及び図3に示すように、微小吸引孔1は流路3と基材4の外部とを連通する。微小吸引孔1の第一端部1aは流路3の側面3aに露呈し(開口し)、吸着部Sを構成する。微小吸引孔1の第二端部1bは基材4の側面に露呈している。
本発明において、微小吸引孔1が、流路3と基材4の外部とを連通する際、図1の基体10Aように微小吸引孔1の第二開口部1bが基材4の側面(外部)に露呈しても良い。
さらに、例えば後述する基体10F(図11)における微小吸引孔1のように、微小吸引孔1の第二開口部1bが、第二の流路7に開口し、その第二の流路7を介して、前記微小吸引孔1が基材4の外部へ連通しても良い。
上述した「微小吸引孔1は流路3と基材4の外部とを連通する」の意味は、本発明にかかる基体の全てに適用される。
基材4の外部に露呈する、微小吸引孔1の第二開口部1b側から、流路3内の流体Rを吸引することによって、流体Rに含まれる微粒子Tを、吸着部Sに捕捉することができる。前記吸引の動力は特に制限されないが、例えばシリンジもしくはポンプ等の吸引機構(不図示)を微小吸引孔1の第二開口部1bに接続することによって吸引することができる。
基体10Aにおいて、微小吸引孔1は、単一のガラス基板4(基材4)に形成されており、継ぎ目又は貼り合わせ面を有さない貫通孔である。当然に、微小吸引孔1の端部における吸着部Sについても、継ぎ目または貼り合わせ面は存在しない。このため、微粒子Tと吸着部Sとの密着力を十分に高められる。また、ガラス基板4の変形及び薬液による侵食等の外力が加えられた場合、微小吸引孔1、或いは微小吸引孔1の周辺には貼り合わせ面が存在しないため、貼り合わせ面における剥離もしくは破損が生じない。よって、ガラス基板4に対して、加熱消毒もしくは薬液消毒を繰り返して行った場合であっても、ガラス基板4が破損しない。これは、日常的に加熱消毒もしくは薬液消毒を行う、微生物又は細胞(微粒子T)を捕捉する基体にとって、特に優れた特徴である。更には、微小吸引孔1の周辺に屈折率差が生じないので、吸着部Sからの光をより集光させ易くなる。そのため、捕捉された微粒子を、容易に観察することができる。ここで「吸着部S」とは、流路3の側面3aにおける、微粒子Tが接触若しくは近接する領域をいう。
吸着部Sを有する、微小吸引孔1の第一開口部1aの、流路3の側面3aにおける孔の形状は、どの様な形状でもよく、例えば、円、略円、楕円、略楕円、矩形、又は三角形等とすることができる。孔の形状が円又は略円の場合には、その直径が0.02μm〜5μmの範囲であればよい。その中でも、細胞よりもサイズの小さい微生物(微粒子T)に対しては、直径が0.02〜0.8μmの範囲であることがより好ましい。楕円又は略楕円の場合には、前記孔の短径(最も短い口径)が0.02μm〜5μmの範囲であれば、微生物又は細胞T(微粒子T)をトラップすることができる。つまり、前記孔の短径は、微粒子Tが微小吸引孔1を通り抜けることができない程度にすればよい。例えば赤血球細胞(6〜8μm)をトラップする場合には、前記短径が1μm程度であればよく、納豆菌(枯草菌;0.7〜2μm)をトラップする場合には、前記短径が0.2μm程度であればよい。
前記短径の範囲としては、好適には0.02μm〜2μmである。その中でも、細胞よりもサイズの小さい微生物(微粒子T)の捕捉のためには、直径が0.02〜0.8μmの範囲であることがより好ましい。
上記範囲の下限値未満であると、吸着部Sの吸引力が弱すぎて微粒子Tをトラップすることができない恐れがある。上記範囲の上限値超であると、微粒子Tが、微小吸引孔1を通り抜けてしまい、トラップできない恐れがある。
一方、前記孔の長径(最も長い口径)は、トラップする微粒子Tの大きさによって適宜調整すればよく、例えば0.2μm〜10μmの範囲が挙げられる。さらに電気生理学的な測定を行う場合には、長径を細胞及び微生物のサイズよりも小さくすることが好ましく、例えば0.2〜5μmの範囲が挙げられる。
さらに、前記孔の孔径の短辺をナノオーダー(nm単位)で高精度に加工する場合、細胞よりも更にサイズの小さな微生物(微粒子)を捕捉することが可能であるため、従来、集団として観察されていた微生物を単独、あるいは数匹のみで観察することが可能である。これにより、今まで解明されてこなかった微生物の様々な生体的な特性を確認することが可能である。さらに孔の吸着部の径を微小化することにより、細胞の電気生理学的特性を測定する際に、細胞膜と吸着部との安定したシール性が実現されるため、電気生理学的特性の測定を安定して行うことが可能である。
図2及び図3において、微小吸引孔1は、流路3の側面3aに対して略垂直となるように形成されている。しかし、必ずしも略垂直である必要はなく、基体10Aの設計に合わせて、単一のガラス基板4において自由に配置可能である。
更には微小吸引孔1の第一開口部1aに近い位置の口径を微小吸引孔1の口径よりもわずかに広げて加工することも可能である。このとき微粒子Tの一部が微小吸引孔1の第一開口部1aに入り込んだ状態で捕捉が可能となるため、流路3に流れがあるときでもより安定して長時間の捕捉が可能となる場合がある。
微小吸引孔1は、基体10Aに複数配置されていてもよい。各々の微小吸引孔1に対して吸着部Sが各々備わるため、複数の微粒子Tをトラップすることができる。
基体10Aでは、流路3の下面3bはガラス基板で形成される基材4に設けられている。一方、前記下面3bに対向する、流路3の上面はガラスで形成される基板6によって蓋をされている。少なくとも下面3b及び上面3dの一方から、顕微鏡等の光学的観察機構によって、吸着部Sにトラップされた微粒子Tを観察することができる。なお、上面3dは必ずしも蓋で覆われている必要はなく、開口された無蓋であってもよい。通常は、圧力をかけて流体Rを流路3内に流通させるため、流路3の上面3dは蓋で覆われている方が好ましい。
流路3の上面3dを構成する材料は、特に制限されず、例えばPDMS、PMMA等の樹脂基板、シリコン基板、及びガラス基板が挙げられる。特に前記材料が、可視光又は紫外光を透過する材料である場合、微粒子Tを容易に観察できるので好ましい。また、基板6の材料が基材4と同じ材料である場合、基材4と基板6とが容易に貼り合わせることができるので好ましい。また、この貼り合せは公知の方法で行えばよい。
流路3のうち、吸着部Sの周辺を観察できると、前記吸着部Sにおける微粒子Tの捕捉が行われたことを確認できる。この場合、例えば、微生物もしくは細胞(微粒子T)を捕捉するときには微小吸引孔1の吸引力を強くし、捕捉された後は、微生物もしくは細胞Tの細胞膜が破れない程度に、前記吸引力を弱くする等、吸着部Sにおける微粒子Tの状態に応じて適切に吸引力を調整することが可能である。
トラップした微生物又は細胞Tの電気生理学的測定を行う場合には、例えば流路3及び微小吸引孔1の第二開口部1b側にそれぞれ電極(不図示)を配置すればよい。或いは、細胞外バッファーや細胞内液などを介した外部の電極を用いてもよい。吸着部Sは単一のガラス基板4で形成されるので、細胞Tの細胞膜に対して高抵抗性シールを形成することが可能である。したがって、従来公知のパッチクランプ法が適用できる。このとき、吸着部Sを有する微小吸引孔1の第一開口部1aの孔の口径を、従来のパッチピペット等の孔の口径(2〜4μm程度)よりも小さくすることによって、従来よりも精度の高い電気生理学的測定を行うことができる。
[基体10B]
本発明の基体の他の実施形態としては、図7に示す基体10Bが挙げられる。図7では、前述の基体10Aと同様の構成には同じ符号を付してある。図7のA−A線に沿う断面図は、図2及び図3と同様である。
基体10Bにおいて、基体10Aと異なる点は、複数の微小吸引孔1が平行に配されている点である。基体10Bの他の構成については、基体10Aと同様である。
各微小吸引孔1の第一開口部1aは、それぞれ吸着部Sを有する。各吸着部Sの直下には、凹部Cが配置されている。前記凹部Cによって、基体10Aと同様の効果が基体10Bにおいても得られる。
基体10Bのように、基材4内に微小吸引孔1を複数配置する場合は、隣り合う各微小吸引孔1の間隔を、捕捉する微粒子Tの大きさを考慮して設けることが好ましい。例えば、大きさが3μm程度の微粒子Tを捕捉する場合は、隣り合う各微小吸引孔1の間隔を、6μm以上とする。その結果、捕捉した複数の微粒子T同士が近接しないため、観察および電気生理学的測定を容易に行うことができる。
流路3に対して、複数の微小吸引孔1がそれぞれ開口するとき、各微小吸引孔1の第二開口部1bに、それぞれ独立したシリンジもしくはポンプ等の吸引機構(不図示)を接続することによって、各微小吸引孔1の吸引を個別に制御することが可能である。そのため、各微小吸引孔1による微粒子Tの捕捉を独立して制御可能である。
さらに各微小吸引孔1の孔の口径は、それぞれ同じであっても、それぞれ異なっていても良い。
また、基材4がシリコン、ガラス、石英、又はサファイアなどで形成される場合には、微小吸引孔の加工精度を高めることができるため、複数の微小吸引孔1を密集させて配置することが可能である。
[基体10C]
本発明の基体の他の実施形態としては、図8に示す基体10Cが挙げられる。図8では、前述の基体10Aと同様の構成には同じ符号を付してある。
基体10Cにおいて、基体10Aと異なる点は、複数の微小吸引孔1が平行に配置され、複数の凹部Cが流路3の下面3bに配置されている点である。基体10Cの他の構成については、基体10Aと同様である。
各微小吸引孔1の第一開口部1aは、それぞれ吸着部Sを有する。各吸着部Sの直下には、各々について凹部Cが配置されている。前記凹部Cによって、基体10Aと同様の効果が基体10Cにおいても得られる。また、凹部Cが複数配置されているため、基体10Bの場合と比べて、緩流部P周辺を流れる流体Rに生じうる乱流の程度を大きくすることができる。つまり、緩流部Pの周辺に、微粒子Tを留める時間を長くできるので、吸着部Sに前記微粒子Tをより容易に捕捉することができる。
基体10Cにおいても、基体10Bと同様に、隣り合う各微小吸引孔1の間隔を、捕捉する微粒子Tの大きさを考慮して設けることが好ましい。例えば、大きさが3μm程度の微粒子Tを捕捉する場合は、微小吸引孔1同士の間隔を、6μm以上とする。その結果、捕捉した複数の微粒子T同士が近接しないため、観察および電気生理学的測定を容易に行うことができる。
各微小吸引孔1の孔の口径は、それぞれ同じであっても、それぞれ異なっていても良い。
また、各凹部Cの大きさは、それぞれ同じであっても、それぞれ異なっていても良い。
さらに、基材4がシリコン、ガラス、石英、又はサファイアなどで形成される場合、微小吸引孔の加工精度を高めることができるので、複数の微小吸引孔1および複数の凹部Cを密集させて配置することが可能である。
[基体10D]
本発明の基体の他の実施形態としては、図9に示す基体10Dが挙げられる。図9では、前述の基体10Aと同様の構成には同じ符号を付してある。
基体10Dにおいて、基体10Aと異なる点は、凹部Cの、微小吸引孔1の延在方向に沿う長さが半減し、凹部Cの容積が半減している点である。基体10Dの他の構成については、基体10Aと同様である。
微小吸引孔1の第一開口部1aは、吸着部Sを有する。吸着部Sの直下には、凹部Cが配置されている。前記凹部Cによって、基体10Aと同様の効果が基体10Dにおいても得られる。ただし、凹部Cの容積が半減したことによって、前記凹部Cの内部或いは前記凹部C周辺を流れる流体Rに発生する乱流の程度が、上述の実施形態と比較して小さくなる。このため、緩流部Pにおける流体Rの流れが緩まる程度も上述の実施形態と比較して小さくなる。
[基体10E]
本発明の基体の他の実施形態としては、図10に示す基体10Eが挙げられる。図10では、前述の基体10Aと同様の構成には同じ符号を付してある。
基体10Eにおいて、基体10Aと異なる点は、流路3において、凹部Cを挟む側面3a及び側面3cの両方に、それぞれ微小吸引孔1の第一開口部1aが配置されている点である。基体10Eの他の構成については、基体10Aと同様である。
各微小吸引孔1の第一開口部1aは、それぞれ吸着部Sを有する。各吸着部Sの直下には、共通の凹部Cが配置されている。前記凹部Cによって、基体10Aと同様の効果が基体10Bにおいても得られる。
[基体10F]
本発明の基体の他の実施形態としては、図11に示す基体10Fも挙げられる。図12及び図13は、図11のA−A線に沿う断面を示す模式図である。図11〜図13では、前述の基体10Bと同様の構成には同じ符号を付してある。
基体10Fにおいて、基体10Bと異なる点は、複数配置された微小吸引孔1の第一開口部1aが、流路3(第一の流路3)の側面3aにそれぞれ開口し、第二開口部1bが、基材4の上面4aにそれぞれ開口している点である。基板6において、その第二開口部1bと対向する位置に、第二の流路7が設けられている。この構成によれば、第二の流路7に直接的又は間接的に吸引機構を接続することによって、第一の流路3内の流体Rを、微小吸引孔1を介して、第二の流路7へ引き込んで吸引することができる。この際、流体R中の微粒子を吸着部Sにおいて捕捉できる。基体10Fの他の構成については、基体10Bと同様である。
[基体10G]
本発明の基体の他の実施形態としては、図14に示す基体10Gも挙げられる。図15及び図16は、図14のA−A線に沿う断面を示す模式図である。図14〜図16では、前述の基体10Bと同様の構成には同じ符号を付してある。
基体10Gにおいて、基体10Bと異なる点は、複数配置された微小吸引孔1の第一開口部1aが、流路3(第一の流路3)の側面3aにそれぞれ開口し、第二開口部1bが、第三の流路8の側面8aにそれぞれ開口している点である。基材4の上面4aに配置された第一の流路3と第三の流路8とは、微小吸引孔1を介して連通している。ここで、微小吸引孔1の第一開口部1aおよび第二開口部1bは、直接には基材4の外部に開口していない。しかし、第三の流路8は基材4の外部に通じているので、第一の流路3は、微小吸引孔1を介して、基材4の外部へ連通している。
この構成によれば、第三の流路8に直接的又は間接的に吸引機構を接続することによって、第一の流路3内の流体Rを、微小吸引孔1を介して、第三の流路8へ引き込んで吸引することができる。この際、流体R中の微粒子を吸着部Sにおいて捕捉できる。
基体10Gの他の構成については、基体10Bと同様である。
基体10Gの変形例として、第三の流路8の下面4aにおいて、微小吸引孔1の第二開口部1bの直下に、別の凹部Cを配置した構成が挙げられる。この構成の場合、第三の流路8から第一の流路3へ、微小吸引孔1を介して、流体Rを吸引する。この吸引によって、基材4の外部から第三の流路8へ流入された流体Rに含まれる微粒子Tを、微小吸引孔1の第二開口部1bに吸着することができる。この際、凹部Cが前記第二開口部1bの直下に配置されていることにより、微粒子Tをより容易に捕捉しうる。
したがって、第三の流路8の内部に別の凹部Cを配置することによって、基材4の外部から第一の流路3へ流体Rを流しこむ方法ではなく、基材4の外部から第三の流路8へ流体Rを流し込む方法も可能である。すなわち、第三の流路8の内部に別の凹部Cを配置することによって、基体10Gの利便性を高められる。
また、図17に示される、基材4の上面を部材9が覆う構成も例示できる。この場合、第一の流路3の一部、および第三の流路8の一部を部材9が構成する。部材9の厚みを調整し、第一の流路3の径を適宜調整することによって、第一の流路3を流通する流体Rの流量を適宜制御することができる。また、複数の部材9a,9b,9cの貼り合わせによって部材9を構成する場合、各部材9a,9b,9cの貼り合わせ方を変更することによって、部材9内に第三の流路8を所望の経路で設けることができる。
例えば、各部材9a,9b,9cを複数積層することによって、第三の流路8の径を大きくすることができる。さらに、積層した各部材9a,9b,9cの高さ(厚さ)を利用して、図17に示すように第三の流路8の外部に通じる側を基体10Gの上面に配置することも可能である。
部材9の材料としては特に制限されず、PDMS、PMMA等の樹脂基板や、ガラス基板を使用することができる。部材9は、観察に用いられる光線(例えば可視光線)を透過する材料で形成されても、透過しない材料で形成されても良い。微粒子の捕捉のみを目的とする場合は、必ずしも観察に用いられる光線を透過する必要はない。観察に用いられる光線を透過する部材であれば、上面から光学的に観察が可能となるため好ましい。
トラップした微生物又は細胞Tの電気生理学的測定を行う場合には、例えば図18に示すように、第一の流路3及び第三の流路8にそれぞれ電極K1,K2を配置することができる。または、細胞外バッファーもしくは細胞内液などを介して、外部の電極を用いて電気生理学的測定を行うことができる。吸着部Sは単一のガラス基板4(基材4)で形成されるので、細胞Tの細胞膜に対して高抵抗性シールを形成することが可能である。したがって、従来公知のパッチクランプ法が適用できる。このとき、吸着部Sを有する微小吸引孔1の第一開口部1aの孔の口径を、従来のパッチピペット等の孔の口径(2〜4μm程度)よりも小さくすることによって、従来よりも精度の高い電気生理学的測定を行うことができる。
なお、電極K1,K2は、第一の流路3及び第三の流路8に連通する別の流路、例えば後述する第四の流路及び第五の流路、に配置されていてもよい。
[基体10H]
本発明の基体の他の実施形態としては、図19に示す基体10Hも挙げられる。図20は、図19のA−A線に沿う断面を示す模式図である。図19〜図20では、前述の基体10Gと同様の構成には同じ符号を付してある。
基体10Hにおいて、基体10Gと異なる点は、第一の流路3の下面3bおよび第三の流路8の下面8bは、部材9で形成される点である。この場合にも、微小吸引孔1は、単一の材料で構成される基材4に形成されている。基板6と部材9とに挟まれた基材5は、基材4と同じ材料で形成される。また、基材5の材料は、基板6や部材9と同じ材料であってもよい。凹部Cは、部材9の上面に形成されており、流路3における吸着部Sの直下に配置されている。基体10Hの他の構成については、基体10Gと同様である。
図21は、本発明にかかる基体の一例である基体20Aの模式的な上面図(上面から見た透視図)である。この上面図における第一の流路3、微小吸引孔1、及び第二の流路7若しくは第三の流路8の配置構成は、前述の基体10F〜基体10H等に適用可能である。
ガラス基板4には、第一の流路3と第三の流路8を含む複合流路がそれぞれ3セット配置されている。
第一の流路3と第三の流路8とが微小吸引孔1を介して連通していることは、前述の通りである。吸着部Sの位置は、「X」の印で示してある。前記吸着部Sに近い位置に凹部Cを有する緩流部Pが設けられている。
第一の流路3の上流側F1から、流体Rが流入されて、第三の流路8の下流側F2へ流通する。
基体20Aにおいて、一つの第一の流路3に複数の第三の流路8が配置されることも可能であり、この際、一つの第三の流路8に対して微小吸引孔1はそれぞれ少なくとも一つ以上設けられる。このように一つの第一の流路3に複数の第三の流路8が配置される形状である場合、それぞれの第三の流路8に対して、独立にシリンジもしくはポンプ等の吸引機構(不図示)を接続することによって、独立して第三の流路8の吸引を制御することが可能となる。そのため、微小吸引孔1による微粒子Tの捕捉を独立して制御可能である。
図22は、本発明にかかる基体の一例である基体20Bの模式的な上面図(上面から見た透視図)である。この上面図における第一の流路3、微小吸引孔1、第三の流路8、第五の流路12、及び第四の流路11の配置構成は、前述の基体10F〜基体10H等に適用可能である。
ガラス基板4に配置された、第一の流路3と第三の流路8とが微小吸引孔1を介して連通していることは、前述の通りである。吸着部Sの位置は、「X」の印で示してある。
ガラス基板4に配置された第五の流路12は、第三の流路8と連通するように交差している。第五の流路12の上流側F3から下流側F4へ、所望の薬液又はガスを流通させることによって、第三の流路8内にも前記薬液又はガスを拡散流入させることができる。また、第三の流路8内に拡散した薬液をガスへ置換することも可能である。
第五の流路12が第三の流路8に連通する場所及び、第五の流路12の形状は特に限定されない。従って、例えば、微小吸引孔1に近い位置に第五の流路12を配置することも可能であり、第五の流路12と第三の流路8はそれぞれの機能を代替することが可能である。また、第五の流路12はF3側あるいはF4側のみを有する構成も可能であり、F3あるいはF4のいずれかの機能を第三の流路8が果たすことも可能であるし、複数の第五の流路12もしくは複数に分岐した第五の流路12が配置されてもよい。
また、ガラス基板4に配置された第四の流路11は、第一の流路3と連通している。第四の流路11から第一の流路3へ、所望の薬液又はガスを流通させることによって、第一の流路3内にも前記薬液又はガスを拡散流入させることができる。つまり、前記薬液又はガスを、吸着部Sにトラップされた微粒子Tへ接触させることができる。なお、図22では、第一の流路3の上流側はF1で示し、下流側はF2で示してある。
第四の流路11が第一の流路3に連通する場所及び、第四の流路11の形状は特に限定されない。そのため、微小吸引孔1に近い位置に第四の流路11を配置することも可能であり、第四の流路11と第一の流路3の上流側(F1側)はそれぞれの機能を代替することが可能である。また、複数の第四の流路11や複数に分岐した第四の流路11が第一の流路3に連通し配置されることも可能である。
<基体の第二実施形態>
[基体30A]
図23は、本発明にかかる基体の第二実施形態である基体30Aの斜視図である。図24及び図25は、図23のA−A線に沿う断面を示す模式図である。
基体30Aは微粒子Tをトラップする微小吸引孔21を備えた基体である。基体30Aには、基材24内に設けられ、微粒子Tを含む流体Rを流通させる流路23と、流路23と基材24の外部とを連通する微小吸引孔21とが含まれる。また、基材24のうち、少なくとも微小吸引孔21を構成する部位は、単一の部材で形成される。さらに、基材24の上面を覆うように可視光を透過する基板26が貼り合わされている。
また、基体30Aにおいて流路23を構成する内壁のうち、微小吸引孔21の第一開口部21aに近い位置に、流体Rの流れを緩める緩流部Pが設けられている。
基体30Aでは、基材24の上面側に流路23が設けられている。前記流路23において、微粒子Tが含まれる流体Rを、上流側F1から下流側F2へ流通させる。
流路23の側面23aに緩流部Pを構成する凹部Dが設けられ、前記凹部D内の側面23aに、微小吸引孔21の第一開口部21aが有する吸着部Sが形成されている。また、少なくとも流路23の上面23d及び下面23bの一方の少なくとも一部分は、吸着部Sにトラップされた微粒子Tを光学的に観察可能なように、透明な部材26(基板26)で構成されている。
図25は、基体30Aの流路23に流体Rを流通し、前記流体Rに含まれる微粒子Tが吸着部Sに捕捉されている様子を示している。
本発明の基体が捕捉する微粒子Tとしては、流体Rに含まれており、流路23を流通することが可能であれば特に制限されない。例えば、微生物、細胞、もしくは有機物質で形成される粒子、無機物質で形成される粒子等が挙げられる。前記微生物としては、細菌、真菌、黴、および大型のウイルス等が例示できる。前記細胞としては、赤血球、および白血球等の浮遊培養することが可能な細胞が例示できる。前記有機物質で形成される粒子としては、樹脂もしくは多糖類等の高分子で形成される粒子、および活性炭粒子等が例示できる。前記無機物質で形成される粒子としては、シリカ粒子および金コロイド粒子等の金属粒子が例示できる。
前記有機物質で形成される粒子、及び前記無機物質で形成される粒子は、その表面又は内部に抗体分子等を結合させた機能性粒子であってもよい。
前記有機物質で形成される粒子の形状、及び前記無機物質で形成される粒子の形状は、特に制限されない。例えば、球、立方体、直方体、多面体、ドーナッツ形の立体、もしくはひも状の立体等、あらゆる立体形状の粒子が本発明の微粒子に含まれる。
前記有機物質で形成される粒子、及び前記無機物質で形成される粒子の大きさは、前記吸着部を有する微小吸引孔の第一端部の孔の開口径(短径)よりも大きければ、特に制限されない。つまり、微小吸引孔を通過しない大きさであればよい。
本発明の基体が捕捉する微粒子としては、微生物又は細胞が好ましい。微生物又は細胞は、表面形状が比較的柔軟である。このため、吸着部Sに充分に密着させて、より強力に吸着することが可能である。さらに、前記微粒子が微生物又は細胞である場合、高精度な電気生理学的測定を行うことが可能である。
図25のように流路23の側面23aに緩流部Pを構成する凹部Dが設けられ、前記凹部D内の側面23aに、微小吸引孔21が開口していると、基材24の下面側または基材24の上面側から観察した際に、微小吸引孔21と観察対象物が重ならないため、微粒子Tを容易に観察することができる。
図26は、基材24の下面に対して、顕微鏡の対物レンズMを近づけて、微粒子Tを光学的に観察する様子を示している。なお、図26では、基体30Aにおける緩流部P周辺の要部のみが示されている。
捕捉した微粒子を基材の下面から観察する場合、観察対象と対物レンズとの距離(ワーキングディスタンス)を調整して観察対象物に焦点を合わせる。しかしながら、基材下面と観察対象物との距離が、観察するのに必要とされるワーキングディスタンスより大きい場合、観察対象物に焦点を合わせることができない。その様な事態を避けるため、基材の下面を研磨することなどによって、基材の厚さを薄くすることによって、基材の下面と観察対象物との距離を短くすることができる。しかしながら、流路23の下面23bに開口する微小吸引孔を形成した場合、流路23の下面23bと基材の下面との間に微小吸引孔が存在するため、基材の下面を研磨することなどによって、基材を薄くすることは難しい場合がある。したがって、基体30Aのように、微小吸引孔は流路23の側面23aに開口していることが好ましい。
本発明において、観察対象である微粒子Tを含む流体Rは特に制限されず、例えば血液、細胞培養液、飲料用液体、河川水等が挙げられる。また、黴等を含む空気も流体Rに含まれる。
本発明で「流路23に流体Rを流通させる」とは、基体30Aの外部から流路23に流体Rを入れて流すことを意味する。流入された流体Rは、流路23を流通し続けても良いし、必要に応じて、一時的に流通を停止させても良い。流路23を流れる流体Rは最終的には基体30Aの外部へ排出されるが、必要に応じて、同じ流体Rを流路23へ再度流入させて、循環させてもよい。このことは、本発明にかかる基体の全てに適用される。
基体30Aの流路23において、緩流部Pが設けられた第一内壁面23a(側面23a)と、微小吸引孔21が開口する第二内壁面23a(側面23a)とが、同一である。つまり、緩流部Pを構成する凹部Dが設けられた側面23aと、微小吸引孔21の第一開口部21aが開口する側面23aとが、流路23において、同一の内壁面に形成される。
吸着部Sに近い位置に設けられた緩流部Pは、流路23の側面23aに設けられた凹部Dを有する。前記凹部Dは流路23の一部を囲む形状を構成しており、その囲まれた部分の流路23の側面23aに吸着部Sが配置される。
凹部Dが配置された緩流部Pにおける、前記凹部Dに近い位置で、流体Rの流れの中に、例えば、上昇流、下降流、逆流、及び渦流等の成分を含む乱流が生じる。すなわち、前記凹部Dに近い位置において、流体Rは非直線的に流れるため、流体Rの流れが緩やかになる。流体R中の微粒子Tが、緩流部Pに近い位置を通過する際に、前記乱流に巻き込まれうるので、本発明における流路は、前記微粒子Tが緩流部Pに近い位置に滞留する時間を、緩流部Pが設けられていない流路と比べて、長くすることができる。この結果、緩流部Pに近い位置に設けられた吸着部Sが、前記微粒子Tを容易に捕捉することができる。
また、吸着部Sに微粒子Tを捕捉した後は、前記微粒子Tをより安定に捕捉し続けることができる。この理由は、吸着部Sが凹部D内の奥に設けられているため、微粒子Tを凹部D内に取り囲むことができ、流路53を流通する流体Rの本流の影響を抑え、微粒子Tを保護できるからである。
図27は、基体30Aの上面側から見た、緩流部P周辺の要部拡大図であり、流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面を示す。前記従断面は、図26におけるA−A線に沿う断面である。
この流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面において、凹部Dは2つの角部を有している。前記第一開口部21aに近い位置に設けられている角部を第一の角部e2、前記開口部から離れた位置に設けられている角部を第二の角部e3とした場合、第一の角部e2と、前記第一開口部21aとの距離を、奥行きの長さLと幅の長さWとで表すとき、L/Wの比が0.05〜100の範囲内であることが好ましい。この際、奥行きの長さLは1μm〜100μmであることが好ましく、幅の長さWは0.1μm〜50μmであることが好ましい。
ここで、奥行きの長さLは、流路23の延在方向に直交する方向における前記第一の角部e2と前記第一開口部21aとの距離を示しており、幅の長さWは、流路23の延在方向における前記第一の角部e2と前記第一開口部21aとの距離を示している。また、流体Rの流れる方向は問わない。
上記範囲であると、緩流部Pで発生する前記乱流の勢力圏内に吸着部Sが設けられるため、吸着部Sが微粒子をより容易に捕捉することができる。さらに、捕捉した微生物又は細胞T(微粒子)が分裂増殖した場合に、娘細胞が乱流によって速やかに緩流部Pから離脱することが可能である。つまり、凹部D内が娘細胞によって混雑する状態を避けられる。
図23に示す基体30Aにおいては、前記単一の部材は、微小吸引孔21を備えるだけでなく、基材24全体を構成していてもよい。
前記単一の部材の材料としては、例えばシリコン、ガラス、石英、もしくはサファイアなどが挙げられる。特に、結晶方位による加工異方性の影響を受けにくい非結晶質である材料が好ましい。これらの材料を用いた場合、微小吸引孔21の加工精度をさらに高めることができ、吸着部Sをナノオーダーの口径で形成することが可能である。このため、トラップした細胞Tと吸着部Sとの間で高抵抗性シールを形成することが、比較的容易である。この際、微小吸引孔21に形成される吸着部Sがガラス、石英、もしくはサファイアで形成される場合、絶縁性を付与する処理を行う工程必要としないので好ましい。高抵抗性シールを形成し、トラップした細胞Tの電気生理学的測定を行う場合は、前記細胞Tの内外の電位差(膜電位)等を測定する方法を、前記基体に適宜用いて測定することも可能である。吸着部Sを形成する材料がガラス、石英である場合、トラップした細胞Tの電気生理学的測定を行う場合は、前記細胞Tと吸着部Sとのギガオームオーダー(GΩ単位)の高抵抗シールが実現されるため、より高精度の測定が可能である。
前記単一の部材の材料は、波長0.1μm〜10μmを有する光のうち少なくとも一部の波長を有する光を透過することが好ましい。
具体的には、加工用レーザーとして使用される一般的な光(波長0.1μm〜10μm)の、少なくとも一部を透過することが好ましい。このようなレーザー光を透過することによって、後述するように、レーザー照射して前記部材に改質部を形成することができる。
また、前記単一の部材の材料は、可視光領域(波長約0.36μm〜約0.83μm)の光を透過することが、より好ましい。可視光領域の光を透過することによって、捕捉した微粒子Tを、前記単一部材を透して光学顕微鏡等の光学的手法を用いて容易に観察することができる。
さらに、前記単一の部材の材料が、前記波長の光のうち少なくとも一部の紫外光あるいは可視光線(0.1μm〜0.83μm)を透過する場合には、蛍光色素によって染色又は標識された微粒子を蛍光観察することができる。
なお、本発明における「透過(透明)」とは、前記部材に光を入射して、前記部材から透過光が得られる状態の全てをいう。
図23では、基材24を構成する単一の部材は透明なガラス基板である。
図24及び図25に示すように、微小吸引孔21は流路23と基材24の外部とを連通する。微小吸引孔21の第一開口部21aは流路23の側面23aに露呈し(開口し)、吸着部Sを構成する。微小吸引孔21の第二開口部21bは基材24の側面に露呈している。
本発明において、微小吸引孔21が、流路23と基材24の外部とを連通する際、図23の基体30Aように微小吸引孔21の第二開口部21bが基材24の側面(外部)に露呈し、開口しても良い。
基材24の外部に露呈する、微小吸引孔21の第二開口部21b側から、流路23内の流体Rを吸引することによって、流体Rに含まれる微粒子Tを、吸着部Sに捕捉することができる。前記吸引の動力は特に制限されないが、例えばシリンジやポンプ等の吸引機構(不図示)を微小吸引孔21の第二開口部21bに接続することによって供給することができる。
基体30Aにおいて、微小吸引孔21は、単一のガラス基板24(基材24)に形成されており、継ぎ目又は貼り合わせ面を有さない貫通孔である。当然に、微小吸引孔21の端部における吸着部Sについても、継ぎ目または貼り合わせ面は存在しない。このため、微粒子Tと吸着部Sとの密着力を十分に高められる。また、ガラス基板24の変形及び薬液による侵食等の外力が加えられた場合、微小吸引孔21、或いは微小吸引孔21の周辺には貼り合わせ面が存在しないため、貼り合わせ面における剥離もしくは破損が生じない。よって、ガラス基板24に対して、加熱消毒もしくは薬液消毒を繰り返して行った場合であっても、ガラス基板24が破損しない。これは、日常的に加熱消毒もしくは薬液消毒を行う、微生物又は細胞(微粒子)を捕捉する基体にとって、特に優れた特徴である。更には、微小吸引孔21に近い位置に屈折率差が生じないので、吸着部Sからの光をより集光させ易くなる。そのため、捕捉された微粒子を、容易に観察することができる。ここで「吸着部S」とは、流路23の側面23aにおける、微粒子Tが接触若しくは近接する領域をいう。
吸着部Sを有する、微小吸引孔21の第一開口部21aの、流路23の側面23aにおける孔の形状は、どの様な形状でもよく、例えば、円、略円、楕円、略楕円、矩形、又は三角形、とすることができる。孔の形状が円又は略円の場合には、その直径が0.02μm〜5μmの範囲であればよい。その中でも、細胞よりもサイズの小さい微生物に対しては、直径が0.02〜0.8μmの範囲であることがより好ましい。楕円又は略楕円の場合には、前記孔の短径(最も短い口径)が0.02μm〜5μmの範囲であれば、微生物又は細胞Tをトラップすることができる。つまり、前記孔の短径は、微粒子Tが微小吸引孔1を通り抜けることができない程度にすればよい。例えば赤血球細胞(6〜8μm)をトラップする場合には、前記短径が1μm程度であればよく、納豆菌(枯草菌;0.7〜2μm)をトラップする場合には、前記短径が0.2μm程度であればよい。
前記短径の範囲としては、好適には0.02μm〜2μmである。その中でも、細胞よりもサイズの小さい微生物の捕捉のためには、直径が0.02〜0.8μmの範囲であることがより好ましい。
上記範囲の下限値未満であると、吸着部Sの吸引力が弱すぎて微粒子Tをトラップすることができない恐れがある。上記範囲の上限値超であると、微粒子Tが、微小吸引孔21を通り抜けてしまい、トラップできない恐れがある。
一方、前記孔の長径(最も長い口径)は、トラップする微粒子Tの大きさによって適宜調整すればよく、例えば0.2μm〜10μmの範囲が挙げられる。さらに電気生理学的な測定を行う場合には、長径を細胞及び微生物のサイズよりも小さくすることが好ましく、例えば0.2〜5μmの範囲が挙げられる。
さらに、前記孔の孔径の短辺をナノオーダー(nm単位)で高精度に加工する場合、細胞よりも更にサイズの小さな微生物を捕捉することが可能であるため、従来、集団として観察されていた微生物を単独、あるいは数匹のみで観察することが可能である。これにより、今まで解明されてこなかった微生物の様々な生体的な特性を確認することが可能である。さらに孔の吸着部の径を微小化することにより、細胞の電気生理学的特性を測定する際に、細胞膜と吸着部との安定したシール性が実現されるため、電気生理学的特性の測定を安定して行うことが可能である。
図24及び図25において、微小吸引孔21は、流路23の側面23aに対して略垂直となるように形成されている。しかし、必ずしも略垂直である必要はなく、基体30Aの設計に合わせて、単一のガラス基板24において自由に配置可能である。
更には微小吸引孔21の第一開口部21aに近い位置の口径を微小吸引孔21の口径よりもわずかに広げて加工することも可能である。このとき微粒子Tの一部が微小吸引孔21の第一端部21aに入り込んだ状態で捕捉が可能となるため、流路23に流れがあるときでもより安定して長時間の捕捉が可能となる場合がある。
微小吸引孔21は、基体30Aに複数配置されていてもよい。各々の微小吸引孔21に対して吸着部Sが各々備わるため、複数の微粒子Tをトラップすることができる。
基体30Aでは、流路23の下面23bはガラス基板で形成される基材24に設けられている。一方、前記下面23bに対向する、流路23の上面はガラスで形成される基板26によって蓋をされている。少なくとも下面23b及び上面23dの一方から、顕微鏡等の光学的観察機構によって、吸着部Sにトラップされた微粒子Tを観察することができる。なお、上面23dは必ずしも蓋で覆われている必要はなく、開口された無蓋であってもよい。通常は、圧力をかけて流体Rを流路23内に流通させるため、流路23の上面23dは蓋で覆われている方が好ましい。
流路23の上面23dを構成する材料は、特に制限されず、例えばPDMS、PMMA等の樹脂基板、シリコン基板、及びガラス基板が挙げられる。特に前記材料が、可視光又は紫外光を透過する材料である場合、微粒子Tを容易に観察できるので好ましい。また、基板26の材料が基材24と同じ材料である場合、基材24と基板26とが容易に貼り合わせることができるので好ましい。また、この貼り合せは公知の方法で行えばよい。
流路23のうち、吸着部Sの周辺を観察できると、前記吸着部Sにおける微粒子Tの捕捉が行われたことを確認できる。この場合、例えば、微生物もしくは細胞(微粒子)を捕捉するときには微小吸引孔21の吸引力を強くし、捕捉された後は、微生物もしくは細胞Tの細胞膜が破れない程度に、前記吸引力を弱くする等、吸着部Sにおける微粒子の状態に応じて適切に吸引力を調整することが可能である。
トラップした微生物又は細胞Tの電気生理学的測定を行う場合には、例えば流路23及び微小吸引孔21b側にそれぞれ電極(不図示)を配置すればよい。或いは、細胞外バッファーや細胞内液などを介し外部の電極を用いてもよい。吸着部Sは単一のガラス基板24で形成されるので、細胞Tの細胞膜に対して高抵抗性シールを形成することが可能である。したがって、従来公知のパッチクランプ法が適用できる。このとき、吸着部Sを有する微小吸引孔21の第一開口部21aの孔の口径を、従来のパッチピペット等の孔の口径(2〜4μm程度)よりも小さくすることによって、従来よりも精度の高い電気生理学的測定を行うことができる。
[基体30B]
本発明の基体の他の実施形態としては、基体30Bが挙げられる。基体30Bの外観は、基体30Aとほぼ同様であるが、凹部Dの形状が異なる。基体30Bの凹部Dの形状を、図28に示す。図28では、前述の基体30Aと同様の構成には同じ符号を付してある。
図28は、基体30Bの流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面を示す。
つまり、基体30Aの図27に相当する断面である。この従断面において、流路23の側面23aと第一開口部21aが形成されている面との間には、流路23の側面23aに対して傾斜する傾斜面が形成されている。流路23の側面23aと傾斜面との間に、角部が形成されている。基体30Bにおいて、凹部Dは、2つの角部と、傾斜面と、第一開口部21aが形成されている面とによって構成されている。
このように傾斜面を有する凹部Dにおいては、微小吸引孔21の延在方向に直交する方向における互いに対向する2つの前記傾斜面の距離が、第一開口部21aから流路23に向けて徐々に増加している。凹部Dが傾斜面を有することによって、前記緩流部P周辺を流れる流体Rに発生しうる乱流を、基体30Aの緩流部P周辺を流れる流体Rに発生しうる乱流と異ならせることができる。
さらに、凹部Dにおける傾斜面と流路23の側面23aと角度を調節することによって、緩流部P周辺を流れる流体Rに発生する乱流の種類及び強さを調節することができる。基体30Bにおいても、基体30Aと同様の効果が得られる。
基体30Bにおける流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面(図28)において、凹部Dが有する2つの角部e2,e3のうち、微小吸引孔21の第一開口部21aに近い方の第一の角部e2と、前記第一開口部21aとの距離を、奥行きの長さLと幅の長さWとで表すとき、L/Wの比が0.05〜100の範囲内であることが好ましい。この際、奥行きの長さLは1μm〜100μmであることが好ましく、幅の長さWは0.1μm〜50μmであることが好ましい。
ここで、奥行きの長さLの方向は、流路23の延在方向に対して垂直の方向であり、幅の長さWの方向は、流路23の延在方向に対して平行の方向であることとする。また、流体Rの流れる方向は問わない。
[基体30C]
本発明の基体の他の実施形態としては、基体30Cが挙げられる。基体30Cの外観は、基体30Cとほぼ同様であるが、凹部Dの形状が異なる。基体30Cの凹部Dの形状を、図29に示す。図29では、前述の基体30Aと同様の構成には同じ符号を付してある。
図29は、基体30Cの流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面を示す。
つまり、基体30Aの図27に相当する断面である。この従断面において、凹部Dの有する2つの角部e2及びe3は、側面23aに沿うように形成された2つの突起部が設けられている。角部e2及びe3は、突起部の各々の先端に、かつ、側面23a上に位置している。
凹部Dに前記突起部が形成させることによって、前記緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流を、基体30Aの緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流と異ならせることができる。より具体的には、凹部D内で流体Rが滞留する傾向を強められる。基体30Cにおいても、基体30Aと同様の効果が得られる。
基体30Cにおける流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面(図29)において、凹部Dが有する2つの角部e2,e3のうち、微小吸引孔21の第一開口部21aに近い方の第一の角部e2と、前記第一開口部21aとの距離を、奥行きの長さLと幅の長さWとで表すとき、L/Wの比が0.05〜100の範囲内であることが好ましい。この際、奥行きの長さLは1μm〜100μmであることが好ましく、幅の長さWは0.1μm〜50μmであることが好ましい。
ここで、奥行きの長さLの方向は、流路23の延在方向に対して垂直の方向であり、幅の長さWの方向は、流路23の延在方向に対して平行の方向であることとする。
[基体30D]
本発明の基体の他の実施形態としては、基体30Dが挙げられる。基体30Dの外観は、基体30Dとほぼ同様であるが、凹部Dの形状が異なる。基体30Dの凹部Dの形状を、図30に示す。図30では、前述の基体30Aと同様の構成には同じ符号を付してある。
図30は、基体30Dの流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面を示す。
つまり、基体30Aの図27に相当する断面である。この従断面において、凹部Dは、2つの角部e2及びe3を有する。一方の角部e2には流路23の内壁部23a(側面23a)に沿った突起部が形成されている。また、他方の角部e3に近い位置には、傾斜面が形成されている。この傾斜面は、流路23の側面23aと第一開口部21aが形成されている面との間に設けられており、流路23の側面23aに対して傾斜している。
凹部Dが上記の形状を有することによって、前記緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流を、基体30Aの緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流と異ならせることができる。より具体的には、凹部D内で流体Rが滞留する傾向を強めて、微小吸引孔21の第一開口部21aで捕捉した微粒子を、流路23を流れる流体Rの本流から保護する傾向が強められる。基体30Dにおいても、基体30Aと同様の効果が得られる。
基体30Dにおける流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面(図30)において、凹部Dが有する2つの角部e2,e3のうち、微小吸引孔21の第一開口部21aに近い方の第一の角部e2と、前記第一開口部21aとの距離を、奥行きの長さLと幅の長さWとで表すとき、L/Wの比が0.05〜100の範囲内であることが好ましい。この際、奥行きの長さLは1μm〜100μmであることが好ましく、幅の長さWは0.1μm〜50μmであることが好ましい。図30では、微小吸引孔21の第一開口部21aは、凹部Dの深く奥まった位置にあるが、より手前の浅い位置にあってもよい。この場合、幅の長さWを示す矢印は、図30に示した矢印とは反対に向くことがある。この場合においても、前述のL/Wの比の好適な範囲は同様である。
ここで、奥行きの長さLの方向は、流路23の延在方向に対して垂直の方向であり、幅の長さWの方向は、流路23の延在方向に対して平行の方向であることとする。また、流体Rの流れる方向は問わない。
[基体30E]
本発明の基体の他の実施形態としては、基体30Eが挙げられる。図31は、基体30Eの斜視図である。図31では、前述の基体30Aと同様の構成には同じ符号を付してある。
基体30Eの流路23の側面23aには、第一凸部U1および第二凸部U2が配置され、これら2つの凸部U1,U2の間に凹部Dが配置されている。
図32は、基体30Eの流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面を示す。
つまり、基体30Aの図27に相当する断面である。この従断面において、凹部Dの形状は、基体30Aの凹部Dの形状と同様である。しかし、凹部Dに近い位置に2つの凸部U1,U2が形成されているため、前記緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流を、基体30Aの緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流と異ならせることができる。より具体的には、緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流の程度をより強めることができる。この結果、流路23を流れる微粒子が比較的大きくても、前記乱流が微粒子を巻き込むことによって、吸着部Sに微粒子を引き寄せて捕捉することが容易になりうる。基体30Eにおいても、基体30Aと同様の効果が得られる。
流体Rが上流側F1から下流側F2に流れるとき、微小吸引孔21から見て上流側にある第一凸部U1のみを設けることでも同様な効果が得られる。
第一凸部U1と第二凸部U2とが互いに対向している面上にて、第一凸部U1の先端には、角部e3が設けられ、第二凸部U2の先端には、角部e2が設けられている。
基体30Eにおける流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面(図32)において、凹部Dが有する2つの角部e2,e3のうち、微小吸引孔21の第一開口部21aに近い方の第一の角部e2と、前記第一開口部21aとの距離を、奥行きの長さLと幅の長さWとで表すとき、L/Wの比が0.05〜100の範囲内であることが好ましい。この際、奥行きの長さLは1μm〜100μmであることが好ましく、幅の長さWは0.1μm〜50μmであることが好ましい。
ここで、奥行きの長さLの方向は、流路23の延在方向に対して垂直の方向であり、幅の長さWの方向は、流路23の延在方向に対して平行の方向であることとする。また、流体Rの流れる方向は問わない。
[基体30F]
本発明の基体の他の実施形態としては、基体30Fが挙げられる。図33は、基体30Fの斜視図である。図33では、前述の基体30Aと同様の構成には同じ符号を付してある。
基体30Fの流路23の側面23aには、第一凸部U1および第二凸部U2が配置され、これら2つの凸部U1,U2の間に凹部Dが配置されている。2つの凸部U1,U2の形状が、前述の基体30Eの凸部U1,U2とは異なっている。基体30Fの凸部U1,U2は、後述の従断面において、台形状に形成される。
図34は、基体30Fの流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面を示す。
つまり、基体30Aの図27に相当する断面である。この従断面において、凹部Dの形状は、基体30Aの凹部Dの形状と同様である。しかし、凹部Dに近い位置に2つの凸部U1,U2が形成されているため、前記緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流を、基体30Aの緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流とは異ならせることができる。より具体的には、緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流の程度をより強めることができる。この結果、流路23を流れる微粒子が比較的大きな微粒子であっても、前記乱流が微粒子を巻き込むことによって、吸着部Sに微粒子を引き寄せて捕捉することが容易になりうる。基体30Fにおいても、基体30Aと同様の効果が得られる。
流体Rが上流側F1から下流側F2に流れるとき、微小吸引孔21から見て上流側にある第一凸部U1のみを設けることでも同様な効果が期待される。
基体30Fにおける流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面(図32)において、凹部Dが有する2つの角部e2,e3のうち、微小吸引孔21の第一開口部21aに近い方の第一の角部e2と、前記第一開口部21aとの距離を、奥行きの長さLと幅の長さWとで表すとき、L/Wの比が0.05〜100の範囲内であることが好ましい。この際、奥行きの長さLは1μm〜100μmであることが好ましく、幅の長さWは0.1μm〜50μmであることが好ましい。
ここで、奥行きの長さLの方向は、流路23の延在方向に対して垂直の方向であり、幅の長さWの方向は、流路23の延在方向に対して平行の方向であることとする。また、流体Rの流れる方向は問わない。
[基体30G]
本発明の基体の他の実施形態としては、基体30Gが挙げられる。図35は、基体30Gの斜視図である。図35では、前述の基体30Aと同様の構成には同じ符号を付してある。
基体30Gの流路23の下面23bにおいて、微小吸引孔21の第一開口部21aに対向する位置に、突起部Jが配置されている。
図36は、基体30Gの流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面を示す。
つまり、基体30Aの図27に相当する断面である。この従断面において、凹部Dの形状は、基体30Aの凹部Dの形状と同様である。しかし、凹部Dに近い位置に突起部Jが形成されているため、前記緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流を、基体30Aの緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流と異ならせることができる。より具体的には、緩流部P周辺を流れる流体Rで発生しうる乱流の程度をより強めることができる。この結果、流路23を流れる微粒子が比較的大きくても、前記乱流が微粒子を巻き込むことによって、吸着部Sに微粒子を引き寄せて捕捉することが容易になりうる。基体30Gにおいても、基体30Aと同様の効果が得られる。
突起部Jの形状は特に制限されず、立方体、直方体、円柱、もしくは三角柱等の形状を採用できる。また、前記従断面において、図37に示すような、より複雑な断面形状を有する突起部Jを配置してもよい。
突起部Jを配置する位置としては、凹部Dの内側でも良いし、凹部Dの外側でも良い。凹部Dの内側に突起部Jを配置する場合は、突起部Jと吸着部Sとの距離が、捕捉する微粒子の直径よりも十分に長くすることが好ましい。また、突起部Jは一つに限らず、複数の突起部Jを配置しても良い。また、図35において、突起部は、流路の下面に形成されているが、突起部Jが配置される面は、流路23の下面23bに限定されず、前記微小吸引孔が形成されている前記内壁面とは異なる内壁面で、前記凹部に近い位置に設けられていればよい。
[基体30H]
本発明の基体の他の実施形態としては、基体30Hが挙げられる。図38は、基体30Hの斜視図である。図38では、前述の基体30Aと同様の構成には同じ符号を付してある。
基体30Hの凹部D内の側面23aには、微小吸引孔21が平行に3本配置されている。
図39は、基体30Hの流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面を示す。
つまり、基体30Aの図27に相当する断面である。この従断面において、各微小吸引孔21の第一開口部21aは、捕捉する微粒子の直径よりも長い間隔で配置されているので、各吸着部Sにおいて一度に、それぞれ微粒子を捕捉することができる。基体30Hにおいても、基体30Aと同様の効果が得られる。
基体30Hにおける流路23の延在方向に沿う、微小吸引孔21の従断面(図39)において、凹部Dが有する2つの角部e2,e3のうち、各微小吸引孔21の第一開口部21aに近い方の角部e2(又は角部e3)と、前記第一開口部21aとの距離を、奥行きの長さLと幅の長さWとで表すとき、L/Wの比が0.05〜100の範囲内であることが好ましい。この際、奥行きの長さLは1μm〜100μmであることが好ましく、幅の長さWは0.1μm〜50μmであることが好ましい。
ここで、奥行きの長さLの方向は、流路23の延在方向に対して垂直の方向であり、幅の長さWの方向は、流路23の延在方向に対して平行の方向であることとする。また、流体Rの流れる方向は問わない。
以上で説明した基体30A〜30Hでは、流路23が一本だけ配置された例を説明したが、前述の第一の実施形態で説明したように、基体30A〜30Hにおいて、第二〜第五の流路、および電極等を同様に配置することができる。
図40は、本発明にかかる基体の一例である基体40Aの模式的な上面図(上面から見た透視図)である。基体40Aにおける緩流部Pの構成としては、前述の基体30A〜30Hにおける緩流部Pの構成が適用可能である。
ガラス基板24には、第一の流路23と第三の流路28を含む複合流路がそれぞれ3セット配置されている。第一の流路23と第三の流路28とが微小吸引孔21を介して連通していることは、前述の通りである。吸着部Sの位置は、「X」の印で示してある。前記吸着部Sに近い位置に凹部Dを有する緩流部Pが設けられている。
第一の流路23の上流側F1から、流体Rが流入されて、第三の流路28の下流側F2へ流通する。
基体40Aにおいて、一つの第一の流路23に複数の第三の流路28が配置されることも可能であり、この際、一つの第三の流路28に対して微小吸引孔21はそれぞれ少なくとも一つ以上設けられる。このように一つの第一の流路23に複数の第三の流路28が配置される形状である場合、それぞれの第三の流路28に対して、独立にシリンジもしくはポンプ等の吸引機構(不図示)を接続することによって、独立して第三の流路28の吸引を制御することが可能となる。そのため、微小吸引孔21による微粒子Tの捕捉を独立して制御可能である。
図41は、本発明にかかる基体の一例である基体40Bの模式的な上面図(上面から見た透視図)である。基体40Bにおける緩流部Pの構成としては、前述の基体30A〜30Hにおける緩流部Pの構成が適用可能である。
ガラス基板24に配置された、第一の流路23と第三の流路28とが微小吸引孔21を介して連通していることは、前述の通りである。吸着部Sの位置は、「X」の印で示してある。
ガラス基板24に配置された第五の流路32は、第三の流路28と連通するように交差している。第五の流路32の上流側F3から下流側F4へ、所望の薬液又はガスを流通させることによって、第三の流路28内にも前記薬液又はガスを拡散流入させることができる。
また、第三の流路28内に拡散した薬液をガスへ置換することも可能である。
第五の流路32が第三の流路28に連通する場所、及び第五の流路32の形状は特に限定されない。従って、例えば、微小吸引孔21に近い位置に第五の流路32を配置することも可能であり、第五の流路32と第三の流路28はそれぞれの機能を代替することが可能である。また、第五の流路32はF3側あるいはF4側のみを有する構成も可能であり、F3あるいはF4のいずれかの機能を第三の流路28が果たすことも可能であるし、複数の第五の流路32もしくは複数に分岐した第五の流路32が配置されてもよい。
また、ガラス基板24に配置された第四の流路31は、第一の流路23と連通している。
第四の流路31から第一の流路23へ、所望の薬液又はガスを流通させることによって、第一の流路23内にも前記薬液又はガスを拡散流入させることができる。つまり、前記薬液又はガスを、吸着部Sにトラップされた微粒子Tへ接触させることができる。なお、図41では、第一の流路23の上流側はF1で示し、下流側はF2で示してある。
第四の流路31が第一の流路23に連通する場所及び、第四の流路31の形状は特に限定されない。そのため、微小吸引孔21に近い位置に第四の流路31を配置することも可能であり、第四の流路31と第一の流路23の上流側(F1側)はそれぞれの機能を代替することが可能である。また複数の第四の流路31や複数に分岐した第四の流路31が第一の流路23に連通し配置されることも可能である。
以上、本発明にかかる基体の第一実施形態(緩流部が配置された第一内壁面と、微小吸引孔の開口部が配置された第二内壁面とが、異なる形態)と、第二実施形態(緩流部が配置された第一内壁面と、微小吸引孔の開口部が配置された第二内壁面とが、同一である形態)について説明した。これらの第一実施形態と第二実施形態とを、適宜組み合わせた実施形態も可能である。その場合、流路に配置された緩流部Pにおける流体Rの流れが、より緩やかとなり、微粒子を一層容易になる捕捉することが可能である。
次に、本発明にかかる基体の製造方法を説明する。
<基体の製造方法(第一態様)>
本発明の製造方法の第一態様を、前述の基体10Gを例にとって説明する。この場合、前記製造方法は、図42A〜図42Dで示すように、ピコ秒オーダー以下のパルス時間幅を有するレーザーQを、単一の部材59において、微小吸引孔55が形成される領域51、第一の流路57が形成される領域52、および緩流部Pが形成される領域53に照射することによって、第一改質部51,第二改質部52,及び第三改質部53を形成する工程A1と(図42A,図42B)、単一の部材59から改質部をエッチングによって除去する工程A2と(図42C)を少なくとも有する。ここで、レーザー照射によって第一改質部51,第二改質部52,及び第三改質部53を形成する工程においては、第一改質部51,第二改質部52,及び第三改質部53を1回のレーザー照射によって一括して形成されてもよいし、或いは、複数回のレーザー照射によって形成されてもよい。
図42Bにおける工程A1においては、第二の流路58が形成される領域54にも改質部を形成する例が示されている。また、緩流部Pは、第一の流路57の内壁面に形成される凹部Cを有する。
[工程A1]
レーザーQ(レーザー光Q)は、パルス時間幅がピコ秒オーダー以下のパルス幅を有するレーザー光を用いることが好ましい。例えばチタンサファイアレーザー、前記パルス幅を有するファイバーレーザーなどを用いることができる。ただし部材59を透過する波長を使用することが必要である。より具体的には、部材59に対する透過率が60%以上のレーザー光であることが好ましい。
前記レーザーQ(レーザー光Q)は、加工用レーザーとして使用される一般的な波長領域(0.1〜10um)の光を適用することができる。その中でも、被加工部材である部材59を透過する必要がある。部材59を透過する波長のレーザー光を適用することによって、部材59に対して改質部を形成することができる。
部材59の材料は、例えばシリコン、ガラス、石英、及びサファイアなどが挙げられる。これらの材料は、微小吸引孔55を形成する際に、加工性に優れた材料であるので好ましい。なかでも、結晶方位による加工異方性の影響を受けにくい非結晶質である方が好ましい。
更には、顕微鏡等を用いて光学的に微粒子などを観察する場合、ガラス、石英、サファイアは、可視光線(波長0.36μm〜0.83μm)を透過するため、より好ましい。
また、部材59の材料は、波長0.1μm〜10μmを有する光のうち少なくとも一部の波長を有する光を透過することが好ましい。
具体的には、加工用レーザー光として使用される一般的な波長領域(0.1μm〜10μm)の、少なくとも一部領域の光を透過することが好ましい。このようなレーザー光を透過することによって、後述するように、前記部材にレーザーを照射することで改質部を形成することができる。
また、可視光領域(波長約0.36μm〜約0.83μm)の光を透過することが、より好ましい。可視光領域の光を透過することによって、捕捉した微粒子Tを、前記単一部材を透して肉眼で容易に観察することができる。
なお、本発明における「透過(透明)」とは、前記部材に光を入射して、前記部材から透過光が得られる状態の全てをいう。
図42A〜Dでは、単一の部材59は透明なガラス基板である(以下、ガラス基板59と呼ぶ)。
以下では、部材59がガラス基板である場合について説明するが、部材59の材料がその他の部材、例えばシリコン、石英、又はサファイアの場合であっても、同様に行うことができる。後述する行程A2においては、加工性が良好なシリコン、石英、ガラスがより好適である。
ガラス基板59は、例えば石英で形成されるガラス基板、珪酸塩を主成分とするガラス、ホウ珪酸ガラスで形成されるガラス基板等を用いることができる。合成石英で形成されるガラス基板が、加工性が良いため好適である。また、ガラス基板59の厚さは特に制限されない。
レーザー光Qの照射方法としては、図42Aに示す方法が挙げられる。すなわち、ガラス基板59の内部に集光して焦点を結ぶようにレーザー光Qを照射して、前記焦点を矢印方向に走査することによって、ガラスが改質された改質部を形成する。
微小吸引孔55となる領域51に、前記焦点をガラス基板59内部で走査することによって、所望の形状の改質部51を形成することができる。同様に、第一の流路57となる領域52、および凹部Cとなる領域53に、レーザー光Qを集光して走査することによって、第一の流路57および凹部Cが所望の形状となるように、改質部を形成することができる。
ここで、「改質部」とは、エッチング耐性が低くなり、エッチングによって選択的に又は優先的に除去される部分を意味する。

微小吸引孔55が形成される領域51に対してレーザー光Qを照射する際、照射強度をガラス基板59の加工閾値に近い値又は加工閾値未満にすると共に、レーザー光Qの偏波方向(電場方向)を走査方向に対して垂直となるようにすることが好ましい。
本発明において、レーザー光Qの走査方向と、レーザー光Qの偏波方向とのなす角は、88°より大きく90°以下とすることが好ましく、88.5°以上90°以下とすることがより好ましく、89°以上90°以下とすることがさらに好ましく、90°とすることが特に好ましい。このレーザー照射方法を、以下ではレーザー照射方法αと呼ぶ。
レーザー照射方法αを、図43で説明する。レーザー光Qの伝播方向は矢印Zであり、前記レーザー光Qの偏波方向(電場方向)は矢印Yである。レーザー照射方法αでは、レーザー光Qの照射領域を、前記レーザー光の伝播方向と、前記レーザー光の偏波方向に対して垂直な方向により構成される平面59a内とする。これと共に、レーザー照射強度をガラス基板59の加工閾値に近い値又は加工閾値未満とする。
このレーザー照射方法αによって、ガラス基板59内にナノオーダーの口径を有する改質部51(微小吸引孔55となる領域51に形成される改質部)を形成することができる。例えば、短径が20nm程度、長径が0.2μm〜5μm程度の略楕円形状の断面を有する改質部51が得られる。この略楕円形状は、レーザーの伝播方向に沿った方向が長軸で、レーザーの電場方向に沿った方向が短軸となる。レーザー照射の条件によっては、前記断面は矩形に近い形状となることもある。
レーザー照射強度をガラス基板59の加工閾値以上とした場合、得られる改質部51は周期構造を伴って形成される可能性がある。すなわち、ピコ秒オーダー以下のパルスレーザーを加工閾値以上で集光照射させることで、集光部で電子プラズマ波と入射光の干渉が起こり、レーザーの偏波に対して垂直であり、偏波方向に沿って周期性をもつ周期構造が自己形成的に形成される。
形成された周期構造はエッチング耐性の弱い層となる。例えば石英の場合、酸素が欠乏した層と酸素が増えた層が周期的に配列され(図44C及びD図44D)、酸素欠乏部のエッチング耐性が弱くなっており、エッチングを行うと周期的な凹部及び凸部が形成されうる。このような周期的な凹部及び凸部は、本発明における微小吸引孔55の形成においては不要である。
一方、前述のレーザー照射方法αのように、レーザー照射強度をガラス基板59の加工閾値未満、且つガラス基板59を改質してエッチング耐性を低下させうるレーザー照射強度の下限値以上とすれば、前記周期構造は形成されず、レーザー照射によって一つの酸素欠乏部(エッチング耐性の低い層)が形成される(図44A及び図44B)。これのエッチングを行うと、一つの微小吸引孔55を形成することができる。
前述のレーザー照射方法αは、微小吸引孔55の形状を楕円又は略楕円とすることができる。また、エッチングによってその短径をナノオーダーサイズで制御することが可能となる。楕円又は略楕円形状での短径を微粒子サイズよりも小さくすることで、微粒子を捕捉することが出来る。このとき長径はナノオーダーサイズよりも大きくすることもできるため、微小吸引孔55に流入する流体の圧力損失を小さく出来る。また、微粒子を捕捉する前準備として、微小吸引孔55に、あらかじめ流体を充填させる必要がある。この場合、孔が微細であるほど毛細管力が大きくなるため、微小吸引孔55から、流体が空間などの外部に出てこなくなる弊害が発生する場合がある。しかしながら、微小吸引孔55を楕円又は略楕円とすることで、微粒子を捕捉するのに十分な短径においても毛細管力を抑制させ、流体が空間などの外部に出てこなくなる弊害を抑制することができる。
エッチング耐性が低い層(石英又はガラスにおいては酸素欠乏部)がレーザー照射によって一つだけ形成されるときにおいても、前記酸素欠乏部は極めてエッチングの選択性が高い層となる。このことは、本発明者らの鋭意検討によって見出された。
本発明においては、前記エッチングの選択性が高い層を、微小吸引孔55となる領域の改質部51としている。
したがって、前記加工閾値は、前記周期構造が形成されうるレーザー照射強度の下限値(前記周期構造が形成されないレーザー照射強度の範囲における上限値)と定義される。今後、後述する「加工下限閾値」との混同を避けるため、前記加工閾値は、加工上限閾値と呼ぶこととする。
また、前記「ガラス基板59を改質してエッチング耐性を低下させうるレーザー照射強度の下限値(加工下限閾値)」とは、エッチング処理により、ガラス基板59に微小吸引孔55をあけることができる限界値である。この下限値よりも低いと、レーザー照射によってエッチング耐性の低い層が形成出来ないため、微小吸引孔55があかない。
すなわち、「加工上限閾値」とは、基材内に照射したレーザー光の焦点(集光域)において、基材とレーザー光との相互作用によって生じる電子プラズマ波と入射するレーザー光との干渉が起こり、前記干渉によって基材に縞状の改質部が自己形成的に形成されうるレーザー照射強度の下限値である。
また、「加工下限閾値」とは、基材内に照射したレーザー光の焦点(集光域)において、基材を改質した改質部を形成し、後工程であるエッチング処理によって選択的又は優先的にエッチングされうる程度に、前記改質部のエッチング耐性を低下させうるレーザー照射強度の下限値である。この加工下限閾値よりも低いレーザー照射強度でレーザー照射した領域は、後工程であるエッチング処理において選択的又は優先的にエッチングされ難い。このため、エッチング後に微細孔となる改質部を形成するためには、下限閾値以上で上限閾値以下のレーザー照射強度に設定することが好ましい。
加工上限閾値及び加工下限閾値は、レーザー光の波長、レーザー照射対象である基材の材料(材質)及びレーザー照射条件によって概ね決定される。しかし、レーザー光の偏波方向と走査方向との相対的な向きが異なると、加工上限閾値及び加工下限閾値も多少異なる場合がある。例えば、偏波方向に対して走査方向が垂直の場合と、偏波方向に対して走査方向が平行の場合とでは、加工上限閾値及び加工下限閾値が異なる場合がある。したがって、使用するレーザー光の波長及び使用する基材において、レーザー光の偏波方向と走査方向との相対関係を変化させた場合の、それぞれの加工上限閾値及び加工下限閾値を、予め調べておくことが好ましい。
前記偏波としては直線偏波に関して詳細に説明したが、多少の楕円偏波成分を持つレーザーパルスを用いても同様な構造(改質部)が形成されることが容易に想像できる。
微小吸引孔55が形成される領域51に改質部を形成する際の、レーザー光Qの焦点を走査する方法は特に限定されないが、一度の連続走査によって形成できる改質部51は偏波方向(矢印Y方向)に対して垂直な1次元方向と、レーザー光Qの伝搬方向(矢印Z方向)により構成される平面59a内に限定される。この平面方向内であれば任意の形状で改質部を形成できる。
ここで、図43では、レーザー光Qの伝播方向は、ガラス基板59の上面に対して垂直である場合を示したが、必ずしも垂直である必要はない。前記上面に対して所望の入射角で、レーザーQを照射してもよい。
一般に、改質された部分のレーザーの透過率は、改質されていない部分のレーザーの透過率とは異なる。そのため、改質された部分において透過させたレーザー光の焦点位置を制御することは通常困難である。したがって、レーザー照射する側の面から見て、奥に位置する領域から改質部を形成していくことが望ましい。
また、レーザーの偏波方向(矢印Y方向)を適宜変更することによって、ガラス基板59内に、3次元方向に任意形状を有する改質部51を形成することも可能である。
また、図43で示すように、レーザー光Qをレンズを用いて集光して、前述の様に照射することによって改質部51を形成してもよい。
前記レンズとしては、例えば屈折式の対物レンズや屈折式のレンズを使用することができるが、他にも例えばフレネル、反射式、油浸、水浸式で照射することも可能である。また、例えばシリンドリカルレンズを用いれば、一度にガラス基板59の広範囲にレーザー照射することが可能である。また、例えばコニカルレンズを用いればガラス基板59の垂直方向に広範囲に一度にレーザー光Qを照射することができる。ただしシリンドリカルレンズを用いた場合には、レーザー光Qの偏波はレンズが曲率を持つ方向に対して水平である必要がある。
レーザー照射条件Sの具体例としては、以下の各種条件が挙げられる。例えばチタンサファイアレーザー(レーザー媒質としてサファイアにチタンをドープした結晶を使用したレーザー)を用いる。照射するレーザー光は、例えば波長800nm、繰返周波数200kHzを使用し、レーザー走査速度1mm/秒としてレーザー光Qを集光照射する。これらの波長、繰返周波数、走査速度の値は一例であり、本発明はこれに限定されず任意に変えることが可能である。
集光に用いるレンズとしては、例えばN.A.<0.7未満の対物レンズを用いることが好ましい。より微小な微小吸引孔55を形成させるためには、ガラス基板に照射する際のパルス強度は、加工上限閾値に近い値、たとえば80nJ/pulse程度以下のパワーであることが好ましい。それ以上のパワーであると周期構造が形成され、エッチングによってそれらが繋がるため、ナノオーダーの口径を有する微小吸引孔55を形成することが困難となる。ミクロンオーダーの口径になる、あるいは前記周期構造が形成されてしまうことがある。また、N.A.≧0.7であっても加工が可能であるが、スポットサイズがより小さくなり、レーザーフルエンスが大きくなるため、より小さなパルス強度でのレーザー照射が求められる。
一方、微小吸引孔55が形成される領域51以外の領域に対してレーザー光Qを照射する際は、照射強度をガラス基板59の加工上限閾値よりも十分に大きい値に設定してもよい。第一の流路3となる領域52の改質部(改質部52)や第三の流路58となる領域54の改質部(改質部54)は、通常マイクロメーター(μm)の単位で加工するので、レーザー光Qの焦点をナノオーダーの単位で絞る必要がない。このため、加工上限閾値よりも十分大きい照射強度で照射した場合にも、前記周期構造が形成されることがない。
[工程A2]
つぎに、単一のガラス基板59から、工程A1で形成した改質部51をエッチングによって除去する(図42C)。
エッチング方法としては、ウェットエッチングが好ましい。各領域51,52,53,54に形成した改質部は、エッチング耐性が低いため、選択的又は優先的にエッチングすることができる。
このエッチングは、ガラス基板59の改質されていない部分に比べて、改質部が非常に速くエッチングされる現象を利用する方法であり、結果として改質部の形状従って微小吸引孔55、第一の流路57、第三の流路58、および凹部Cを形成することができる。
前記エッチング液は特に限定されず、例えばフッ酸(HF)を主成分とする溶液、フッ酸に硝酸等を適量添加したフッ硝酸系の混酸等を用いることができる。また、部材59の材料に応じて、他の薬液を用いることもできる。
前記エッチングの結果、ナノオーダーの口径を有する微小吸引孔55を、ガラス基板59内の所定位置に、第一の流路57と第三の流路58とを連通するように、形成することができる。また、第一の流路57の所定位置に凹部Cを形成することができる。
微小吸引孔55のサイズとしては、例えば、短径が20nm〜200nm程度、長径が0.2μm〜5μm程度の略楕円形状の断面を有する貫通孔とすることができる。エッチング処理の条件によっては、前記断面は矩形に近い形状となることもある。
前記ウェットエッチングの処理時間を調整することによって、改質部51と微小吸引孔55とのサイズ差を小さくする、もしくは大きくすることが可能である。
前記処理時間を短くすることによって、前記短径を数nm〜数十nmにすることも理論的には可能である。これとは逆に、前記処理時間を長くすることによって、前記短径を1μm〜2μm程度に、前記長径を5μm〜10μm程度にすることもできる。
つぎに、形成された第一の流路57及び第三の流路58、を覆うように、部材56をガラス基板59の上面に貼り合わせることによって、各流路の上面を形成する(図42D)。
部材56とガラス基板59の上面とを貼り合わせる方法は、部材56の材料に応じて、公知の方法で行えばよい。
また、前記貼り合わせの際に、電気生理学的測定用の電極もしくは配線等を、第一の流路57および第三の流路58内に適宜設置することもできる。
部材56の材料としては特に制限されず、PDMS、PMMA等の樹脂基板もしくは、ガラス基板を使用することができる。また、部材56は、観察に用いられる光線(例えば可視光線)を透過する材料で形成されても不透過しない材料で形成されても良い。微粒子の捕捉のみを目的とする場合は、必ずしも観察に用いられる光線を透過する必要はない。観察に用いられる光線を透過する部材であれば、上面から光学的に観察が可能となるため好ましい。
工程A2におけるエッチングとしては、ウェットエッチングもしくはドライエッチングが適用できる。ウェットエッチングは例えば1%以下のフッ酸を用いるのが最も好ましいが、その他の酸または塩基性を持つ物質でもよい。
前記ドライエッチングのうち、等方性エッチング法としては、例えば、バレル型プラズマエッチング、平行平板型プラズマエッチング、又はダウンフロー型ケミカルドライエッチング、などの各種ドライエッチング方式が挙げられる。
異方性ドライエッチング法としては、例えば、反応性イオンエッチング(以下RIE)を用いる方法として例えば、平行平板型RIE、マグネトロン型RIE、ICP型RIE、又はNQD型RIEなどを使用することができ、RIE以外にも例えば、中性粒子ビームを用いたエッチングを使用することが可能である。異方性ドライエッチング法を用いる場合には、プロセス圧力を上げる等の手法によって、イオンの平均自由行程を短くし、等方性エッチングに近い加工も可能となる。
使用するガスとしては例えば、フロロカーボン系、SF系ガス、CHF、フッ素ガス、又は塩素ガス、などの材料を化学的にエッチングすることができるガスが主で、それらに適宜その他の酸素、アルゴン、ヘリウムなどのガスを混合し使用することが可能であり、その他のドライエッチング方式による加工も可能である。
<基体の製造方法(第二態様)>
本発明の製造方法の第二態様を、前述の基体10Gを例にとって説明する。この場合、前記製造方法は、図45A〜Dで示すように、単一の部材69に、第一の流路67、および緩流部Pを形成する工程B1と(図45A〜D)、ピコ秒オーダー以下のパルス時間幅を有するレーザーを、単一の部材69の微小吸引孔65が形成される領域61に照射することによって、前記領域に改質部61を形成する工程B2と(図46A)、単一の部材69から改質部61をエッチングによって除去する工程B3と(図46B)、を少なくとも有する。
なお、工程B1と工程B2の順序は、どちらを先に行っても良い。
部材69の材料は、例えばシリコン、ガラス、石英、及びサファイアなどが挙げられる。これらの材料は、微小吸引孔65を形成する際に、加工性に優れた材料であるので好ましい。なかでも、結晶方位による加工異方性の影響を受けにくい非結晶質である方が好ましい。
更には、顕微鏡等を用いて光学的に微粒子などを観察する場合、ガラス、石英、及びサファイアは、可視光線(波長0.36μm〜0.83μm)を透過するため、より好ましい。
また、部材69の材料は、波長0.1μm〜10μmを有する光のうち少なくとも一部の波長を有する光を透過することが好ましい。
具体的には、加工用レーザー光として使用される一般的な波長領域(0.1μm〜10μm)の、少なくとも一部領域の光を透過することが好ましい。このようなレーザー光を透過することによって、後述するように、前記部材にレーザーを照射することで改質部を形成することができる。
また、可視光領域(約0.36μm〜約0.83μm)の光を透過することが、より好ましい。可視光領域の光を透過することによって、捕捉した微粒子Tを、前記単一部材を透して肉眼で容易に観察することができる。
なお、本発明における「透過(透明)」とは、前記部材に光を入射して、前記基材から透過光が得られる状態の全てをいう。
図45A〜Dでは、単一の部材69は透明なガラス基板である(以下、ガラス基板69と呼ぶ)。
[工程B1]
工程B1は、ガラス基板69の上面に、フォトリソグラフィによってレジスト62をパターニングして配置する(図45A)。つづいて、ドライエッチング、ウェットエッチング、又はサンドブラスト等の方法によって、ガラス基板69の上面におけるレジスト62が配置されていない領域を、所定の深さに達するまでエッチングして除去する(図45B)。最後にレジスト62を剥離すると、第一の流路67および第三の流路68が形成されたガラス基板69が得られる。
つぎに、再びフォトリソグラフィによってレジスト62を、凹部Cが形成される領域以外の箇所に形成する(図45C)。つづいて、ドライエッチング、ウェットエッチング、又はサンドブラスト等の方法によって、ガラス基板69の上面におけるレジスト62が形成されていない領域を、所定の深さに達するまで浸食して除去する。最後に、レジスト62を剥離すると、第一の流路67、第三の流路68、および凹部Cが形成されたガラス基板69が得られる(図45D)。
工程B1では、第一の流路67および第三の流路68を形成する工程と、凹部Cを形成する工程と、の順番を入れ替えることも可能である。すなわち、まず、ガラス基板上に凹部Cが形成される領域が開口するようにレジストを形成し、開口した領域のガラス基板を凹部Cとなる深さまでエッチングする。その後、レジストを除去することで、ガラス基板に凹部Cが形成される。次いで、第一の流路67、第三の流路68となる領域が開口するようにレジスト形成し、開口した領域のガラス基板をエッチングして、第一の流路67と第三の流路68を形成する。
工程B1において、第一の流路67および第三の流路68を形成するために、ドリル(レーザードリル)等の掘削機構を使用してもよい。
[工程B2]
つぎに、ピコ秒オーダー以下のパルス時間幅を有するレーザーQを、単一のガラス基板69の微小吸引孔65が形成される領域に照射することによって、前記領域に改質部61を形成する。
具体的には、本発明の製造方法の第一態様における工程A1と同様に行うことができる。このとき、第一の流路67、および第三の流路68の側面に露呈する部位にレーザー光Qを集光照射して改質部61を形成するので、液浸露光によってレーザー光Qを照射することが、より望ましい(図46A)。前記側面に露呈する部位に形成される改質部61の形状(微小吸引孔65の端部の形状)の精度を高めることができる。
[工程B3]
つづいて、単一のガラス基板69から、工程B2で形成した改質部61を、エッチングによって除去する(図46B)。
エッチング方法としては、ウェットエッチングが好ましい。第一の流路67および第三の流路68の側面に露呈する断面を有する改質部61は、エッチング耐性が低くなっているため、選択的又は優先的にエッチングすることができる。
具体的には、本発明の製造方法の第一態様における工程A2と同様に行うことができる。
前記エッチングの結果、ナノオーダーの口径を有する微小吸引孔65を、ガラス基板69内の所定位置に、第一の流路67と第三の流路68とを連通するように、形成することができる。
つぎに、形成された第一の流路67および第三の流路68を覆うように、部材66をガラス基板69の上面に貼り合わせることによって、第一の流路67の上面および第三の流路68の上面を形成することができる(図46C)。
部材66とガラス基板69の上面とを貼り合わせる方法は、部材66の材料に応じて、公知の方法で行えばよい。
また、前記貼り合わせの際に、電気生理学的測定用の電極もしくは配線等を、第一の流路67および第三の流路68内に適宜設置することもできる。
部材66の材料としては特に制限されず、PDMS、PMMA等の樹脂基板もしくは、ガラス基板を使用することができる。また、部材66は、観察に用いられる光線(例えば可視光線)を透過する材料で形成されても透過しない材料で形成されても良い。微粒子の捕捉のみを目的とする場合は、必ずしも観察に用いられる光線を透過する必要はない。観察に用いられる光線を透過する部材であれば、上面から光学的に観察が可能となるため好ましい。
<基体の製造方法(第三態様)>
本発明の製造方法の第三態様を、前述の基体10Aを例にとって説明する。この場合、前記製造方法は、図47A〜Dで示すように、ピコ秒オーダー以下のパルス時間幅を有するレーザーを、少なくとも、単一の部材79の微小吸引孔が形成される領域71、および第一の流路77が形成される領域の一部に照射することによって、それぞれの領域に改質部71を形成する工程C1と(図47A)、単一の部材79に、第一の流路77および緩流部Pを形成する工程C2と(図47B〜D)、単一の部材79から改質部71をエッチングによって除去する工程C3と、を少なくとも有する。
部材79の材料は、前述の本発明にかかる製造方法の第一態様において説明した部材59と同様でよい。図47A〜Dでは、単一の部材79は透明なガラス基板である(以下、ガラス基板79と呼ぶ)。
[工程C1]
ピコ秒オーダー以下のパルス時間幅を有するレーザーQを、単一のガラス基板79の微小吸引孔が形成される領域71、および第一の流路77が形成される領域、並びに第三の流路78が形成される領域に照射することによって、これらの領域に改質部71を形成する。具体的には、本発明の製造方法の第一態様における工程A1と同様の工程を行えばよい。
[工程C2]
つぎに、ガラス基板79の上面に、フォトリソグラフィによってレジスト72をパターニングして形成する(図47B)。つづいて、ドライエッチング、ウェットエッチング、又はサンドブラスト等の方法によって、ガラス基板79の上面におけるレジスト72が形成されていない領域を、所定の深さに達するまで浸食して除去する。この際、エッチングによって改質部71の一部が除去される。ここで、レジスト72を剥離すると、第一の流路77および第三の流路78、及び改質部71が形成されたガラス基板79が得られる。
この方法によれば、前記エッチングによって形成された第一の流路77の側面および第三の流路78の側面に、改質部71の第一端部と第二端部とをそれぞれ露呈させることができる。
この改質部71を後述のようにウェットエッチングすることによって、第一の流路77の側面、および第三の流路78の側面にそれぞれ開口部を有する、微小吸引孔を形成できる。また、前記微小吸引孔は第一の流路77と第三の流路78とを連通する。
したがって、微小吸引孔となる領域だけにレーザー照射で改質部を形成する方法に比べて、本第三態様の方法では、工程C1におけるレーザー照射位置を容易に制御できる。つまり、微小吸引孔の開口部の位置を、レーザー照射によって調整する必要が無く、レジストパターンおよびエッチングによって調整することができる。
工程C2において、前記レジスト72が配置されていない領域を所定の深さに達するまで侵食して除去する方法としては、ドライエッチングが好ましい。
ドライエッチングを用いると、第一の流路77を形成するとともに、第一の流路77に緩流部Pを構成する凹部Cを形成することができる。これは、工程C1において形成した、第一の流路77が形成される領域に形成した改質部71が、ドライエッチングによって優先的に除去される結果、第一の流路77が形成される際に、優先的に凹部Cが形成されるためである。この改質部71の口径は、微小吸引孔を形成し得るほどに微小であるが、ドライエッチング法では、上述のエッチングガスが前記改質部71を拡大してエッチングを進行するため、十分な容積を有する凹部Cを形成できる。この際のドライエッチングの条件は、通常の条件で行える。
このようにして、第一の流路77および凹部Cをドライエッチングによって形成すると、図47Dに示す断面を有するガラス基板79が得られる。
なお、上記は、第一の流路77に緩流部Pを構成する凹部Cが形成されることについて説明しているが、第三の流路78が形成される領域に改質部71を形成した場合においても同様に、第三の流路78に緩流部を構成する凹部が形成される。
上記ドライエッチングの方法で形成された凹部Cが、所望の大きさではない場合は、つぎに、再びフォトリソグラフィによってレジスト72を、凹部Cが形成される領域以外の箇所に形成する(図47C)。つづいて、ドライエッチング、ウェットエッチング、又はサンドブラスト等の方法によって、ガラス基板79の上面におけるレジスト72が配置されていない領域を、所定の深さに達するまで浸食して除去する。レジスト72を剥離すると、第一の流路77、第三の流路78、緩流部Pを構成する凹部C、および微小吸引孔75となる領域に形成された改質部71が配置されたガラス基板79が得られる(図47D)。
工程C2において、第一の流路77および第三の流路78を形成するために、ドリル(レーザードリル)等の掘削機構を使用してもよい。
[工程C3]
つづいて、単一のガラス基板79から、工程C1及び工程C2で形成した改質部71を、エッチングによって除去する(不図示)。
エッチング方法としては、ウェットエッチングが好ましい。第一の流路77の側面および第三の流路78の側面にそれぞれ露呈する断面を有する改質部71は、エッチング耐性が低くなっているため、選択的又は優先的にエッチングすることができる。
具体的には、本発明の製造方法の第一態様における工程A2と同様に行うことができる。
前記エッチングの結果、ナノオーダーの口径を有する微小吸引孔を、ガラス基板79内の所定位置に、第一の流路77と第三の流路78とを連通するように、形成することができる。
つぎに、形成された第一の流路77および第三の流路78を覆うように、部材をガラス基板79の上面に貼り合わせることによって、第一の流路77の上面および第三の流78の上面を形成することができる(不図示)。
前記部材とガラス基板79の上面とを貼り合わせる方法は、部材76の材料に応じて、公知の方法で行えばよい。
また、前記貼り合わせの際に、電気生理学的測定用の電極又は配線等を、第一の流路77および第三の流路78内に適宜設置することもできる。
前記部材の材料は特に制限されず、PDMS、PMMA等の樹脂基板、もしくはガラス基板を使用することができる。また、前記部材は、観察に用いられる光線(例えば可視光線)を透過する材料で形成されていても、透過しない材料で形成されていてもよい。微粒子の捕捉のみを目的とする場合は、必ずしも観察に用いられる光線を透過する必要はない。観察に用いられる光線を透過する部材であれば、上面から光学的に観察が可能となるため好ましい。
<基体の製造方法(第四態様)>
本発明の製造方法の第四態様を、前述の基体10Aを例にとって説明する。この場合、前記製造方法は、図48A〜Dで示すように、ピコ秒オーダー以下のパルス時間幅を有するレーザーを、少なくとも、単一の部材89の微小吸引孔が形成される領域81、および緩流部Pが形成される領域83に照射することによって、それぞれの領域に第一改質部81,及び第三改質部83を形成する工程D1と(図48A)、単一の部材89に、第一の流路87および緩流部Pを形成する工程D2と(図48B〜D)、単一の部材89から改質部81をエッチングによって除去する工程D3と、を少なくとも有する。
部材89の材料は、前述の本発明にかかる製造方法の第一態様において説明した部材59と同様でよい。図48A〜Dでは、単一の部材89は透明なガラス基板である(以下、ガラス基板89と呼ぶ)。
[工程D1]
ピコ秒オーダー以下のパルス時間幅を有するレーザーQを、単一のガラス基板89の微小吸引孔が形成される領域81、および第三の流路88が形成される領域に照射することによって、これらの領域に第一改質部81を形成する。さらに、緩流部Pを構成する凹部Cが形成される領域83にも、レーザーを照射して第三改質部83を形成する。具体的には、本発明の製造方法の第一態様における工程A1と同様に行えばよい。
微小吸引孔が形成される領域に第一改質部81を形成する場合のレーザー照射条件は、前述のレーザー照射方法αと同様に、レーザー偏波とレーザー走査方向とが垂直になるようにする必要がある。一方、凹部Cとなる領域に第三改質部83を形成する場合のレーザー照射条件は、レーザー照射方法αとは異なる方法であってもよく、レーザー照射によって前記領域を改質できる条件であれば特に制限されず、公知の方法が適用できる。
[工程D2]
つぎに、ガラス基板89の上面に、フォトリソグラフィによってレジスト82をパターニングして配置する(図48B)。つづいて、ドライエッチング、ウェットエッチング、又はサンドブラスト等の方法によって、ガラス基板89の上面におけるレジスト82が配置されていない領域を、所定の深さに達するまで浸食して除去する。この際、エッチングによって第三の流路88が形成される領域に形成した第一改質部81が除去される。また、凹部Cが形成される領域に形成した第三改質部83は、第一の流路87となる、改質されていない領域がエッチングされる速度よりも速くエッチングされる。このため、第一の流路87が形成されると同時、又は第一の流路87が形成されるよりも早く、凹部Cを形成できる(図48C)。
本第四態様の製造方法では、凹部Cが形成される領域を予め改質することによって、第一の流路87を形成するエッチングの際に、凹部Cをエッチングして形成できる。つまり、第一の流路87を形成した後で、再度、レジストのマスクを配置して、凹部Cを別工程のエッチングで形成する必要が無く、製造工程が簡略化されるため好ましい。
レジスト82を剥離すると、第一の流路87、凹部C、および第三の流路88、並びに第一改質部81が形成されたガラス基板89が得られる(図48D)。
また、工程D2において、第一の流路87および第三の流路88を形成するために、ドリル(レーザードリル)等の掘削機構を使用、もしくは併用してもよい。前記掘削機構のみを使用する場合、後述の工程D3において、改質部81をエッチングする際に、第三改質部83も同様にエッチングすることによって、凹部を形成することが好ましい。この場合においても、第一の流路87を形成した後で、再度、レジストのマスクを配置して、凹部Cを別工程のエッチングで形成する必要が無く、製造工程が簡略化されるため好ましい。
[工程D3]
つづいて、単一のガラス基板89から、工程D1及び工程D2で形成した改質部81をエッチングによって除去する(不図示)。
エッチング方法としては、ウェットエッチングが好ましい。第一の流路87の側面および第三の流路88の側面にそれぞれ露呈する断面を有する改質部81は、エッチング耐性が低いため、選択的又は優先的にエッチングすることができる。
具体的には、本発明の製造方法の第一態様における工程A2と同様に行うことができる。
前記エッチングの結果、ナノオーダーの口径を有する微小吸引孔を、ガラス基板89内の所定位置に、第一の流路87と第三の流路88とを連通するように、形成することができる。
つぎに、形成された第一の流路87および第三の流路88を覆うように、部材をガラス基板89の上面に貼り合わせることによって、第一の流路87の上面および第三の流路88の上面を形成することができる(不図示)。
前記部材とガラス基板89の上面とを貼り合わせる方法は、部材86の材料に応じて、公知の方法で行えばよい。
また、前記貼り合わせの際に、電気生理学的測定用の電極または配線等を、第一の流路87および第三の流路88内に適宜設置することもできる。
前記部材の材料としては特に制限されず、PDMS、PMMA等の樹脂基板や、ガラス基板を使用することができる。また、前記部材は、観察に用いられる光線(例えば可視光線)を透過する材料で形成されていても、透過しない材料で形成されていてもよい。微粒子の捕捉のみを目的とする場合は、必ずしも観察に用いられる光線を透過する必要はない。観察に用いられる光線を透過する部材であれば、上面から光学的に観察が可能となるため好ましい。
以上では、凹部Cを配置した基体の製造方法についてそれぞれ説明した。これらと同様の方法によって、凹部Dを配置した基体についても製造することができる。この際、凹部Dは流路の一部として形成される。つまり、基材の上面にレジストを形成する際、流路の側面の一部に、所望の形状の凹部Dが配置されるように、レジストをフォトリソグラフィによって形成すればよい。
本発明の基体及び前記基体の製造方法は、水もしくは空気等に含まれる微生物又は細胞等の微粒子をトラップして、種々の観察、分析、及び測定を行うためのマイクロ流体デバイス等の使用及び製造に広く利用することができる。
1…微小吸引孔、1a…微小吸引孔の第一開口部、1b…微小吸引孔の第二開口部、C…凹部、D…凹部、e1…凹部における角部の端部、e2…第一の角部、e3…第二の角部、J…突起部、K1…電極、K2…電極、Q…レーザー光、M…顕微鏡の対物レンズ、U1…凸部、U2…凸部、P…緩流部、S…吸着部、T…微粒子(微生物又は細胞)、R…流体、L…奥行きの長さ、W…幅の長さ、3…流路、3a…流路の側面、3b…流路の下面、3c…流路の側面、3d…流路の上面、4…基材、6…基板、7…第二の流路、8…第三の流路、9,9a,9b,9c…部材、10A,10B,10C,10D,10E,10F,10G,10H…基体、20A,20B…基体、11…第四の流路、12…第五の流路、30A,30B…基体、21…微小吸引孔、23…流路、23a…流路の側面、23b…流路の下面、23c…流路の側面、23d…流路の上面、24…基材、26…基板、28…第三の流路、31…第四の流路、32…第五の流路、40A,40B…基体、51…微小吸引孔が形成される領域(第一改質部)、52…第一の流路が形成される領域(第二改質部)、53…緩流部が形成される領域(第三改質部)、54…第二の流路が形成される領域、55…微小吸引孔、56…部材、57…第一の流路、58…第三の流路、59…部材(ガラス基板)、61…改質部、62…レジスト、65…微小吸引孔、67…第一の流路、68…第三の流路、69…部材(ガラス基板)、101…細胞、104…電極、105…電極、108…樹脂製ウェル、110…樹脂製基板、112…樹脂製基板。

Claims (10)

  1. 基体であって、
    基材と、
    前記基材内に設けられ、内壁面を有し、流体を流通させる流路と、
    前記流路の内壁面を構成する内壁のうち前記流路の側面を構成する内壁に設けられ、前記流路と前記基材の外部とを連通し、前記側面に開口部を有する微小吸引孔と、
    前記内壁のうち前記微小吸引孔の開口部に近い位置に配置され、前記流体の流れを緩める緩流部と、を含み、
    前記基材のうち、少なくとも前記微小吸引孔を構成する部位は、単一の部材で形成されており、
    前記微小吸引孔の開口部の孔の形状が楕円又は略楕円であり、該楕円又は略楕円の長軸が前記基材の上面又は下面に対して略垂直であり、
    前記基体は、前記微小吸引孔に保持された観察対象物を前記基材の前記上面又は前記下面から観察するために使用されることを特徴とする基体。
  2. 前記微小吸引孔が前記流路の側面を構成する前記内壁に複数設けられていることを特徴とする請求項1に記載の基体。
  3. 前記微小吸引孔の開口部の短径が0.02μm〜5μmであることを特徴とする請求項1又は2に記載の基体。
  4. 請求項1〜3のいずれか一項に記載の基体であって、
    前記流路の内壁面は、前記緩流部が配置された第一内壁面と、前記微小吸引孔の前記開口部が配置された第二内壁面とを含み、
    前記第一内壁面と前記第二内壁面は互いに異なることを特徴とする基体。
  5. 請求項1〜3のいずれか一項に記載の基体であって、
    前記流路の内壁面は、前記緩流部が配置された第一内壁面と、前記微小吸引孔の前記開口部が配置された第二内壁面とを含み、
    前記第一内壁面は、前記第二内壁面と同一であることを特徴とする基体。
  6. 請求項1〜5のいずれか一項に記載の基体であって、
    前記緩流部は、前記流路が有する内壁面に形成された凹部であることを特徴とする基体。
  7. 請求項6に記載の基体であって、
    前記凹部に近い位置に設けられ、前記流路が有する内壁面のうち、前記微小吸引孔が形成されている内壁面とは異なる内壁面から突出している突起部を有することを特徴とする基体。
  8. 請求項6又は7に記載の基体であって、
    前記凹部は、前記開口部に近い位置に設けられている第一の角部と、前記開口部から離れた位置に設けられている第二の角部とを有し、
    前記流路の延在方向に沿う、前記微小吸引孔の縦断面において、前記流路の延在方向に直交する方向における前記第一の角部と前記開口部との距離をLで表し、かつ、前記流路の延在方向における前記第一の角部と前記開口部との距離をWで表した場合、
    L/Wの比が0.05〜100の範囲内であることを特徴とする基体。
  9. 前記開口部が前記観察対象物を捕捉する吸着部を構成することを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項に記載の基体。
  10. 前記単一の部材の材料が、ガラス、石英、又はサファイアであることを特徴とする請求項1〜9の何れか一項に記載の基体。
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