JP2010041960A - 捕捉シャーレ、マイクロインジェクション装置、及び、マイクロインジェクション方法 - Google Patents

Abstract

【課題】捕捉シャーレ、マイクロインジェクション装置及びマイクロインジェクション方法において、吸引捕捉した被導入体を鮮明に撮像する。
【解決手段】導入物質を被導入体（３）に導入するマイクロインジェクションに用いられる捕捉シャーレ１において、透明な材料上に設けられたウエル部２と、被導入体（３）を吸引により捕捉するための開口部５ａがウエル部２の側壁２ａに設けられた流路５と、を有する構成とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞その他の微小な生体等（被導入体）に、例えば、薬剤等を媒介に混合・拡散させた液体状の物質等（導入物質）を導入するマイクロインジェクションに用いられる捕捉シャーレ、並びにマイクロインジェクション装置及びマイクロインジェクション方法に関する。

従来、医学、遺伝子工学、創薬などの研究分野における細胞への物質導入において、一般には、人間が顕微鏡観察しながら、吸引ノズルにより細胞等の被導入物質を捕捉シャーレ等に吸引固定し、その吸引側と対向する方向から薬剤を充填した微小針を挿入し、この微小針から導入物質を吐出させることで被導入物質に導入を行っている（例えば、特許文献１〜３参照）。

図１２は、従来の捕捉シャーレを示す要部断面図である。
同図に示す捕捉シャーレ９１は、上面に微小な吸引孔９２が複数個形成されている。吸引孔９２は、捕捉シャーレ９１の内部に形成された流路９５と連通している。吸引孔９２上には、流路９５を介した培養液９４の吸引により、マウス卵細胞９３が吸引捕捉される。

吸引捕捉されたマウス卵細胞９３は、顕微鏡９７を用いて拡大観察され、キャピラリ９６によって遺伝子等の導入物質が導入される。
なお、吸引孔９２は、一般的に、ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）技術（フォトリソグラフィ、エッチング）によりシリコン基板（捕捉シャーレ９１）に設けられる。
特開２００６−２８０２３１号公報 特開２００６−１０９７１５号公報 特開２００７−２２２１３２号公報

しかしながら、捕捉シャーレにシリコン基板を用いると、微小吸引孔上の細胞を可視光で透過観察することができない。また、赤外線による透過撮像もシリコン基板が１０μｍ以下の厚さでなければできない。

更には、細胞への遺伝子導入では、導入部位（例えば前核）の識別のために微分干渉光学系による撮像が有効であり、可視光の光路（図１２に示す例では捕捉位置下方）に、細胞を捕捉するための微小吸引孔など形状変化のある構造があると、その映像は不鮮明となってしまう。

本発明の課題は、上記従来の実情に鑑み、吸引捕捉した被導入体を鮮明に撮像することができる捕捉シャーレ、マイクロインジェクション装置及びマイクロインジェクション方法を提供することである。

上記課題を解決するために、捕捉シャーレは、導入物質を被導入体に導入するマイクロインジェクションに用いられる捕捉シャーレにおいて、透明な材料上に設けられたウエル
部と、上記被導入体を吸引により捕捉するための開口部が上記ウエル部の側壁に設けられた流路と、を有することを要件とする。

上記課題を解決するために、マイクロインジェクション装置は、導入物質を被導入体に導入するためのマイクロインジェクション装置において、透明な材料上に設けられたウエル部、及び、上記被導入体を捕捉するための開口部が上記ウエル部の側壁に設けられた流路、を有する捕捉シャーレと、上記ウエル部の上記開口部に上記流路を介して上記被導入体を吸引捕捉する吸引機構と、上記被導入体を透過観察するための透過観察光学系と、を備えることを要件とする。

上記課題を解決するために、マイクロインジェクション方法は、導入物質を被導入体に導入するマイクロインジェクション方法において、透明な材料上に設けられた捕捉シャーレのウエル部に供給した上記被導入体を、上記ウエル部の側壁に設けられた開口部から吸引することにより捕捉する工程と、上記ウエル部の開口部に捕捉した被導入体を透過観察する工程と、を含むことを要件とする。

開示の捕捉シャーレでは、被導入体は、透明な材料上に設けられたウエル部の側壁の開口部において吸引により捕捉される。そのため、開口部において捕捉された被導入体の撮像に際して、流路や不透明な材料が被導入体の観察を妨げるのを防ぐことができる。よって、開示の補足シャーレによれば、吸引捕捉した被導入体を鮮明に撮像することができる。

以下、本発明の実施の形態に係る捕捉シャーレ、マイクロインジェクション装置及びマイクロインジェクション方法について、図面を参照しながら説明する。
＜第１実施形態＞
図１は、本発明の第１実施形態に係る捕捉シャーレ１を示す要部断面図である。

同図に示す捕捉シャーレ１は、プラスチック（樹脂）、ガラス等の透明な材料からなり、上面にウエル部２が形成されている。一般に、ノックアウトマウスのための導入では、１０〜数１０個の卵細胞（被導入体）３への遺伝子（導入物質）の導入を一度の実験で行う。そのため、ウエル部２は、媒介としての培養液（液体）４が供給される培養液槽８内に例えば、１０〜数１０個形成される。

なお、捕捉シャーレ１は、ウエル部２下方からの顕微鏡（対物レンズ）１１による透過観察を行うために、少なくともウエル部２の下方が、透明な材料からなるようにすると共に流路や凹凸部等の形状変化のない構造とするとよい。なお、図１に示す捕捉シャーレ１の場合、捕捉シャーレ１全体が透明な材料からなっている。

ウエル部２は、卵細胞３の直径（１００μｍ〜２００μｍ）の１．５〜５倍の直径Ｄ１で、卵細胞３の半径と同等又はそれよりもやや大きい高さＨの円柱形状に形成されている。

ウエル部２の側壁２ａには、流路５の開口部５ａが形成されている。この開口部５ａは、図示しない吸引機構によって流路５を介して卵細胞３をウエル部２内に吸引捕捉するために設けられている。本実施形態の流路５は、鉛直断面が円形状を呈する。

流路５の開口部５ａは、卵細胞３の捕捉安定を優先する場合、卵細胞３の中心高さに合わせた位置に設けるとよいが、マウスの卵細胞３のように導入部位（前核）３ａが細胞外
形に対して小さく、姿勢変更を優先する必要がある場合には、図１に示すようにウエル部２の底面位置に設け、吸引（及び後述する吐出）により卵細胞３を回転しやすくするとよい。開口部５ａの径Ｄ２（或いは高さや幅）は、被導入物質の大きさ（卵細胞３の径）の１／４〜１／２程度とするとよい。

捕捉シャーレ１のうちウエル部２及び流路５が形成されるベース部分は、ウエル部２が貫通するように形成され底面に流路５が形成された上側プレート６と、この上側プレート６の下部に配設される下側プレート７とから構成されている。

上側プレート６と下側プレート７との接合は、これらがプラスチックの場合、接着・超音波接合・拡散接合などの方法があるが、流路５が微細な場合には拡散接合が適している。また、上側プレート６及び下側プレート７がガラスの場合、接着・溶融接合・陽極接合などの方法があり、陽極接合が適している。

また、上側プレート６及び下側プレート７のうち一方がＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン：polydimethylsiloxane）で他方がガラスの場合、表面活性させた後の常温接合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）が適している。

マイクロインジェクション装置の構成及び動作については後述する実施形態において説明することとし、以下、卵細胞３への遺伝子の導入について、捕捉シャーレ１のウエル部２及び流路５に関係する部分について説明する。

まず、培養液４が培養液槽８に供給され、ウエル部２が培養液４で満たされる。次に、ウエル部２内に卵細胞３が供給される。このとき、図示しないマイクロインジェクション装置の吸引機構により、流路５の開口部５ａから卵細胞３が吸引され開口部５ａに吸引捕捉される。なお、流路５の径Ｌ２が例えば３０μｍ程度である場合、数ｎｌ／ｍｉｎオーダの流量を吸引機構により吸引するとよい。

そして、開口部５ａに捕捉した卵細胞３を顕微鏡１１により透過観察しながら、キャピラリ１２により卵細胞３の導入部位３ａに遺伝子を導入する。この遺伝子の導入を、顕微鏡１１、キャピラリ１２等を各ウエル部２に順次移動させながら行う。

以上説明した本実施形態では、卵細胞３は、透明な材料上に設けられたウエル部２の側壁２ａの開口部５ａにおいて吸引により捕捉される。そのため、開口部５ａにおいて捕捉された卵細胞３の撮像に際して、流路５や不透明な材料が卵細胞３の観察を妨げるのを防ぐことができる。よって、本実施形態によれば、吸引捕捉した卵細胞３を鮮明に撮像することができる。

なお、シリコンからなるウエル部の底面に吸引孔５ａ´を形成した従来のシャーレを用いた図２Ｂに示す卵細胞３´の観察画像に対して、本実施形態では、図２Ａに示すように卵細胞３を鮮明に撮像することができる。

なお、本実施形態では、ウエル部２が円柱形状に形成される例について説明したが、ウエル部２が凹部（くぼみ）となるものであればウエル部２の形状は限定されない。また、流路５の開口部５ａは、ウエル部２の側壁２ａ、例えば、水平面と交差する曲面又は平面に形成されればよい。
また、本実施形態では、被導入物質として卵細胞３を用いる例について説明したが、細胞その他の微小な生体など、卵細胞３以外の被導入物質を用いることも可能である。

＜第２実施形態＞
本実施形態では、ウエル部２２の形状のみ上記第１実施形態と相違し、その他の点については上記第１実施形態と概ね同様であるため、上記第１実施形態と同一又は同様の部材（部分）については図面に同一の符号を付して説明を省略する。

図３は、本発明の第２実施形態に係る捕捉シャーレ２１を示す要部断面図である。
同図に示す捕捉シャーレ２１のウエル部２２は、図４Ａに示すように、その側壁２２ａの下側部分２２ｂが円柱状（鉛直面）に形成され、上側部分２２ｃが、下端側から上端側にかけて徐々に拡径する円錐形状（傾斜面）に形成されている。上側部分２２ｃの傾斜面は、卵細胞３が引っかからないように滑らかであり、かつ、卵細胞３が転がり落ちるだけの角度が必要である。そのため、上側部分２２ｃの傾斜面は、水平に対し３０度以上傾けることで、卵細胞３を転がりやすくするとよい。

なお、上側部分２２ｃである傾斜面としては、例えば、図４Ｂに示す多角錐状（１２角錐状）の傾斜面、自由曲面や半球等の曲面状の傾斜面等とすることができる。
また、上側部分２２ｃ´を図４Ｂに示すような多角錐状（１２角錐状）の傾斜面とする場合、下側部分２２ｂ´を上記多角錐状と同一角数の多角柱（１２角柱状）とするとよい。

また、図４Ｃに示すように、上側部分２２ｃ´´のうち一部を、下端側から上端側にかけて徐々に拡径する傾斜面２２ｃ´´−１とし、他の一部を、流路５の開口部５ａ側に位置し傾斜面２２ｃ´´−１に対向する鉛直面２２ｃ´´−２として、傾斜面２２ｃ´´−１及び鉛直面２２ｃ´´−２が半楕円錐状に形成されるようにしてもよい。なお、図４Ｃに示す鉛直面２２ｃ´´−２に代えて、この鉛直面２２ｃ´´−２に対する傾斜角が上記傾斜面２２ｃ´´−１よりも小さい傾斜面を採用してもよい。このようにする場合、傾斜面は、ウエル部２２の形状等に応じて、鉛直面２２ｃ´´−２に対し傾斜面２２ｃ´´−１と同一方向の傾きにしても反対方向の傾きにしてもよい。

また、図４Ｄに示すように、徐々に拡径する３つの傾斜面２２ｃ´´´−１及び１つの鉛直面２２ｃ´´´−２が角Ｒ付きの半多角錐状に形成されるようにしてもよい。
以上説明した本実施形態においても、卵細胞３は、透明な材料上に設けられたウエル部２２の側壁２２ａの開口部５ａにおいて吸引により捕捉される。よって、本実施形態によっても、吸引捕捉した卵細胞３を鮮明に撮像することができる。

また、本実施形態では、ウエル部２２の側壁２２ａは、下端側から上端側にかけて徐々に拡径する傾斜面（上側部分２２ｃ）と、この傾斜面の下部に位置し開口部５ａが設けられた鉛直面（下側部分２２ｂ）とを含む。そのため、卵細胞３を転がりなどにより開口部５ａに誘導することができる。

また、本実施形態では、ウエル部２２´の側壁２２ａ´の少なくとも一部（上側部分２２ｃ´）は、下端側から上端側にかけて徐々に拡径する多角錐状（図４Ｂ参照）又は曲面状の傾斜面からなる。そのため、卵細胞３を転がりなどにより開口部５ａに誘導することができる。

また、本実施形態では、図４Ｃ及び図４Ｄに示すように、側壁２２ａ´´，２２ａ´´´は、下端側から上端側にかけて徐々に拡径する傾斜面２２ｃ´´−１，２２ｃ´´´−１と、流路５の開口部５ａ側に位置し上記傾斜面２２ｃ´´−１，２２ｃ´´´−１に対向する面２２ｃ´´−２，２２ｃ´´´−２とを含み、この面は、鉛直面２２ｃ´´−２，２２ｃ´´´−２、又は、鉛直面２２ｃ´´−２，２２ｃ´´´−２に対する傾斜角が上記傾斜面２２ｃ´´−１，２２ｃ´´´−１よりも小さい傾斜面、である。

そのため、ウエル部２２´´，２２´´´の大型化を防ぎながら、卵細胞３を転がりなどになどにより開口部５ａに有効に誘導することができる。
また、本実施形態では、傾斜面２２ｃ´´−１，２２ｃ´´´−１及び鉛直面２２ｃ´´−２，２２ｃ´´´−２は、半楕円錐状（図４Ｃ参照）又は角Ｒ付きの半多角錐状（図４Ｄ参照）を構成するように形成されている。そのため、転がりなどになどにより卵細胞３を開口部５ａに、より有効に誘導することができる。

＜第３実施形態＞
本実施形態では、上記第１及び第２実施形態と同一又は同様の部材（部分）については図面に同一の符号を付して説明を省略する。

図５は、本発明の第３実施形態に係る捕捉シャーレ３１を示す断面図である。
同図に示す捕捉シャーレ３１は、シリコーンチューブ１３（弾性の吸引機構側パイプ）と捕捉シャーレ３１の流路５との間に配設される接続部３２を有する。シリコーンチューブ１３は、流路５を介して卵細胞３を吸引捕捉する図示しない吸引機構に接続されている。接続部３２は、例えばステンレス等の硬質材料で形成されたパイプであり、本実施形態では長手方向中央部分で９０度に屈曲した形状を呈する。

接続部３２は、例えば、捕捉シャーレ３１の上側プレート６に上面から嵌入され、流路５と連通するようになっている。また、接続部３２は、シリコーンチューブ１３に圧入されている。

接続部３２の外径Ｄ３は、シリコーンチューブ１３の内径ｄの約１．５倍程度の大きさとなっている。
以上説明した本実施形態においても、卵細胞３は、透明な材料上に設けられたウエル部２２の側壁２２ａの開口部５ａにおいて吸引により捕捉される。よって、本実施形態によっても、吸引捕捉した卵細胞３を鮮明に撮像することができる。

また、本実施形態では、捕捉シャーレ３１は、シリコーンチューブ（弾性の吸引機構側パイプ）１３と流路５との間に配設される接続部３２を有する。更には、接続部３２は、硬質材料で形成されたパイプである。

そのため、シリコーンチューブ１３と接続部３２とを確実に接続することができるため、吸引時等にシリコーンチューブ１３が捕捉シャーレ３１から外れてしまうのを防ぐことができる。

また、本実施形態では、接続部３２の外径Ｄ３は、シリコーンチューブ１３の内径ｄの約１．５倍程度の大きさとなっている。そのため、吸引時等にシリコーンチューブ１３が捕捉シャーレ３１から外れてしまうのをより有効に防ぐことができる。

＜第４実施形態＞
本実施形態では、上記第１〜第３実施形態と同一又は同様の部材（部分）については図面に同一の符号を付して説明を省略する。

図６Ａ及び図６Ｂは、本発明の第４実施形態に係るマイクロインジェクション装置１０を示す部分拡大図及び概略斜視図である。
マイクロインジェクション装置１０は、捕捉シャーレ４１、上述のキャピラリ１２、このキャピラリ１２が先端に設けられたマニピュレータ１４、コントローラ１５、吸引機構及び吐出機構を兼ねるアクチュエータ１６、吸引・吐出ポンプ１７、培養液補充タンク１８等を備える。

捕捉シャーレ４１の下側プレート７には、上側プレート６の底面に設けられた流路５と一体の空間を形成する凹部７ａが設けられている。凹部７ａの下部（底部）は、凹部７ａを設けたことにより厚さの薄い膜部７ｂとなっている。膜部７ｂの下部には、膜部７ｂから鉛直下方に突出するようにピン７ｃが一体形成されている。

アクチュエータ１６には、ピン７ｃを挟持して昇降する昇降部１６ａが設けられている。アクチュエータ１６は、コントローラ１５の制御により昇降部１６ａを昇降させることで、ピン７ｃを上下動させる。このピン７ｃの上下動により、膜部７ｂも上下動することになる。

膜部７ｂが上下動すると、凹部７ａの体積が変動する。膜７ｂが下がって凹部７ａの体積が増えると、培養液４がウエル部２２から流路５に流れ込み、卵細胞３が開口部５ａに吸引捕捉される。一方、膜７ｂが上がって凹部７ａの体積が減少すると、培養液４が流路５からウエル部２２に流れ込み卵細胞３に向かって吐出される。

下側プレート７の凹部７ａ、膜部７ｂ及びピン７ｃは、各流路５に設けられている。なお、各流路５には逆止弁４２が設けられ、膜部７ｂの上下動により培養液４が吸引・吐出ポンプ１７側に流れ込まないようになっている。

図７に示すようにウエル部２２の開口部５ａが設けられる部分の直径（幅）Ｄ１は、卵細胞３（被導入体）の直径（大きさ）の１．５倍〜５倍の広さとなっている。
卵細胞３への遺伝子の導入の際に、吸引捕捉した卵細胞３の姿勢（導入部位３ａの位置）が顕微鏡１１を用いた透過観察により遺伝子導入に適さないことが判明した場合には、まず流路５の逆止弁４２を閉じる。

そして、アクチュエータ１６によりピン７ｃ（膜部７ｂ）を上方に移動させることで、流路５の培養液４をウエル部２２に流れ込ませ、卵細胞３を開口部５ａからリリースさせる。これにより卵細胞３は、培養液槽８内を浮遊する（卵細胞３−１参照）。なお、培養液４の吐出に際しては、マウス卵細胞３の場合、数ｎｌをパルス的に吐出するようにするとよい。

卵細胞３は、捕捉位置である開口部５ａからリリースされて浮遊した後、沈降し、ウエル部２２の側壁２２ａに設けられた傾斜面（上側部分２２ｂ）を転がり落ちる（卵細胞３−２参照）。

そして、アクチュエータ１６によりピン７ｃ（膜部７ｂ）を下方に移動させることで、ウエル部２２の培養液４を流路５側に吸引する。これにより、卵細胞３は、ウエル部２２の底面に沿って移動し（卵細胞３−３参照）、再び開口部５ａに吸引捕捉される。

以上の卵細胞３のリリース・再捕捉によって卵細胞３が所望の姿勢になった場合には、マニピュレータ１４のキャピラリ１２により卵細胞３に遺伝子を導入する。一方、卵細胞３が所望の姿勢にならない場合には、再度、リリース・再捕捉を行えばよい。

以上説明した本実施形態においても、卵細胞３は、透明な材料上に設けられたウエル部２２の側壁２２ａの開口部５ａにおいて吸引により捕捉される。よって、本実施形態によっても、吸引捕捉した卵細胞３を鮮明に撮像することができる。

また、本実施形態では、アクチュエータ１６は、ウエル部２２の開口部５ａに流路５を介して卵細胞３を吸引捕捉すると共に、培養液４を卵細胞３に対し吐出する。
そのため、吸引した卵細胞３を捕捉位置である開口部５ａからリリースし、再度、吸引捕捉することで、卵細胞３の捕捉姿勢を変えることができる。一般に、卵細胞３内の前核（導入部位３ａ）にインジェクションするとき、細胞捕捉時に前核３ａがキャピラリ１２側にないと、キャピラリ１２挿入時の変形などにより細胞内容物が押され、前核３ａが動き、導入位置がズレたり、前核３ａを傷つけるなどの問題があったが、本実施形態によれば、卵細胞３の捕捉姿勢を変えることにより、前核３ａを傷つけるなどの問題を解消することができる。

また、本実施形態の捕捉シャーレ４１のウエル部２２では、開口部５ａが設けられる部分の直径Ｄ１が卵細胞３の直径の１．５倍〜５倍の広さとなっている。そのため、リリースした卵細胞３を吸引・吐出ポンプ１７により確実に吸引することができ、したがって、より有効に卵細胞３の捕捉姿勢を変えることができる。

また、本実施形態では、吸引・吐出を同一の流路５にて行っている。そのため、より多くのウエル部２２及び流路５を捕捉シャーレ４１に設けることができる。
また、本実施形態では、吸引・吐出を行うアクチュエータ１６が、複数の流路５のそれぞれに配置されている。そのため、各流路５の吸引及び吐出を独立して制御することができる。
また、本実施形態では、捕捉シャーレ４１は、流路５に配置された逆止弁４２を有する。そのため、アクチュエータ１６による吸引・吐出を有効に行うことができる。

＜第５実施形態＞
本実施形態では、上記第１〜第４実施形態と同一又は同様の部材（部分）については図面に同一の符号を付して説明を省略する。

図８は、本発明の第５実施形態に係るマイクロインジェクション装置１０を示す部分拡大図である。
本実施形態のマイクロインジェクション装置１０の捕捉シャーレ５１の上側プレート６の底面には、流路５と一体の空間を形成する凹部６ａが形成されている。この凹部６ａの上方で且つ上側プレート６上には、電磁石５２が配置されている。また、凹部６ａには、電磁石５２の磁力により、凹部６ａと流路５とに移動する弁体５３が配置されている。これら電磁石５２及び弁体５３は、各流路５に配置され、開閉機構である電磁弁として機能する。

弁体５３は、例えば、磁石及びこの磁石にコーティングされたプラスチック材料からなり、コントローラ１５の制御による電磁石５２への電圧印加によって、凹部６ａに収容されて流路５における培養液４の流れを妨げない位置と、流路５を塞ぎ培養液４の流れを妨げる位置とに移動する。

以上説明した本実施形態においても、卵細胞３は、透明な材料上に設けられたウエル部２２の側壁２２ａの開口部５ａにおいて吸引により捕捉される。よって、本実施形態によっても、吸引捕捉した卵細胞３を鮮明に撮像することができる。

また、本実施形態では、弁体５３は、電磁石５２の磁力によって、流路５における培養液４の流れを妨げない位置と、流路５を塞ぎ培養液４の流れを妨げる位置とに移動する。そのため、吸引・吐出を行う所望の流路５のみの弁体５３を凹部６ａに退避させることで、流路５の数よりも少ない数の吸引機構・吐出機構によって、目的の流路５のみにおいて吸引・吐出の制御を行うことができる。

＜第６実施形態＞
本実施形態では、上記第１〜第５実施形態と同一又は同様の部材（部分）については図面に同一の符号を付して説明を省略する。

図９は、本発明の第６実施形態に係るマイクロインジェクション装置６０を示す要部断面図である。
本実施形態のマイクロインジェクション６０は、捕捉シャーレ６１、上述のシリコーンチューブ１３及び吸引・吐出ポンプ１７等に加え、ウエル部２２に培養液４を供給する媒介供給手段としての培養液補充タンク１８、及び、ウエル部２２に過剰供給された培養液４を排出する媒介排出手段としての吸引ポンプ６３を備える。

培養液４が充填された培養液補充タンク１８は、シリコーンチューブ６４及びこの先端に配設された硬質パイプ６５を通して培養液４を培養液槽８に供給する。
捕捉シャーレ６１の培養液槽８には、一定高さの仕切り８ａが設けられ、この仕切り８ａを越える高さまで過剰供給された培養液４が余剰培養液貯留部８ｂに溜まるようになっている。

吸引ポンプ６３は、シリコーンチューブ６６を介して余剰培養液貯留部８ｂの培養液４を図示しない廃液収容部に吸い上げる。なお、流路５から培養液４を吸引した状態では、卵細胞３は仕切り８ａを越える高さまで浮遊しにくいため、シリコーンチューブ６６により培養液４のみを吸い上げることができる。

なお、本実施形態の捕捉シャーレ６１にも、硬質材料で形成されたパイプである接続部３２が設けられ、接続部３２及びこの接続部３２が圧入されたシリコーンチューブ１３を介して、ウエル部２２における吸引・吐出を行う構成になっている。

以上説明した本実施形態においても、卵細胞３は、透明な材料上に設けられたウエル部２２の側壁２２ａの開口部５ａにおいて吸引により捕捉される。よって、本実施形態によっても、吸引捕捉した卵細胞３を鮮明に撮像することができる。

ところで、遺伝子研究データの確からしさ向上のため、卵細胞３への遺伝子導入は一般に、１０〜５０個程度を１度に処理する。このとき、卵細胞３の姿勢を修正しながらの導入では作業が３０分以上にわたることもあるが、捕捉維持のためには微少吸引を継続する必要がある。そのため、ウエル部２２の培養液４が減少し、干上がることで卵細胞３へ大きなダメージを与えるおそれがある。

しかしながら、本実施形態では、マイクロインジェクション装置６０は、ウエル部２２に培養液４を供給する培養液補充タンク１８と、ウエル部２２に過剰供給された培養液４を排出する吸引ポンプ６３とを備える。そのため、ウエル部２２からの培養液４の微量吸引を長時間のインジェクション作業中に行っても、ウエル部２２内の培養液４が不足するのを防ぎ、ひいては干上がり等の卵細胞３へのダメージを防ぐことができる。

また、本実施形態では、培養液槽８には余剰培養液貯留部８ｂが設けられ、吸引ポンプ６３は余剰培養液貯留部８ｂの培養液４を吸い上げる構成となっている。そのため、過剰供給された培養液４を有効に排出することができる。

＜第７実施形態＞
本実施形態では、上記第１〜第６実施形態と同一又は同様の部材（部分）については図面に同一の符号を付して説明を省略する。

図１０は、本発明の第７実施形態に係るマイクロインジェクション装置７０を示す要部
断面図である。
本実施形態のマイクロインジェクション装置７０は、培養液補充タンク１８が温度制御槽（ウォーターバス）７１内に配設されている。温度制御槽７１は、温度制御用の液体７２で満たされている。培養液４の温度を調整する温度調整手段としての温度コントローラ７３は温度制御槽７１の外側に配設され、温度コントローラ７３の温度測定部７３ａ及びヒータ７３ｂは液体７２に浸かるように配設されている。

これにより、培養液補充タンク１８に充填される培養液４の温度を調整し、ひいては培養液槽８内の培養液４の温度を調整することが可能となる。
なお、培養液補充タンク１８に接続された上述のシリコーンチューブ６４は、断熱材７４に覆われており、培養液４の温度が外気の影響を受けないようになっている。

以上説明した本実施形態においても、卵細胞３は、透明な材料上に設けられたウエル部２２の側壁２２ａの開口部５ａにおいて吸引により捕捉される。よって、本実施形態によっても、吸引捕捉した卵細胞３を鮮明に撮像することができる。

また、本実施形態では、マイクロインジェクション装置７０は、培養液補充タンク１８により供給する培養液４の温度を調整する温度コントローラ７２を備える。そのため、ウエル部２２に充填される培養液４を、卵細胞（被導入体）や導入物質に適した温度にすることができる。

また、本実施形態では、培養液補充タンク１８に接続されたシリコーンチューブ６４は、断熱材７４に覆われている。そのため、シリコーンチューブ６４内の培養液４の温度が外気の影響を受けないようにすることができ、したがって、より有効に温度調整を行うことができる。

＜第８実施形態＞
本実施形態では、上述したマイクロインジェクション装置の全体構成のうち説明していない部分のみについて説明する。また、本実施形態では、上記第１〜第７実施形態と同一又は同様の部材（部分）については図面に同一の符号を付して説明を省略する。

図１１は、本発明の第８実施形態に係るマイクロインジェクション装置８０を示す全体構成図である。
マイクロインジェクション装置８０のコントローラ１５は、上述の吸引・吐出ポンプ１７、培養液補充タンク１８、電磁石５２、吸引ポンプ６３及び温度コントローラ７３に加え、電磁弁８２に接続されている。

電磁弁８２は、培養液補充タンク１８から吸引・吐出ポンプ１７を介して流路５に供給される培養液４の流路、及び、吸引・吐出ポンプ１７によって流路５から吸引される培養液４の流路を開閉する。吸引・吐出ポンプ１７によって吸引される培養液４は、廃液収容部８３に収容される。
また、培養液槽８の余剰培養液貯留部８ｂから吸引ポンプ６３によって吸引される培養液４は、上記廃液収容部８３とは別個の廃液収容部８４に収容される。

（付記１）
導入物質を被導入体に導入するマイクロインジェクションに用いられる捕捉シャーレにおいて、
透明な材料上に設けられたウエル部と、
前記被導入体を吸引により捕捉するための開口部が前記ウエル部の側壁に設けられた流路と、
を有することを特徴とする捕捉シャーレ。
（付記２）
前記ウエル部の側壁は、下端側から上端側にかけて徐々に拡径する傾斜面と、該傾斜面の下部に位置し前記開口部が設けられた鉛直面とを含むことを特徴とする付記１記載の捕捉シャーレ。
（付記３）
前記ウエル部の側壁の少なくとも一部は、下端側から上端側にかけて徐々に拡径する多角錐状又は曲面状の傾斜面からなることを特徴とする付記１記載の捕捉シャーレ。
（付記４）
前記側壁は、下端側から上端側にかけて徐々に拡径する傾斜面と、前記開口部側に位置し前記傾斜面に対向する面とを含み、
該傾斜面に対向する面は、鉛直面、又は、該鉛直面に対する傾斜角が前記傾斜面よりも小さい傾斜面である、
ことを特徴とする付記１記載の捕捉シャーレ。
（付記５）
前記傾斜面に対向する面は、前記鉛直面であり、
前記傾斜面及び前記鉛直面は、半楕円錐状又は角Ｒ付きの半多角錐状に形成されている、
ことを特徴とする付記４記載の捕捉シャーレ。
（付記６）
前記流路を介して前記被導入体を吸引捕捉する吸引機構に接続された吸引機構側パイプと前記流路との間に配設される接続部を更に有することを特徴とする付記１記載の捕捉シャーレ。
（付記７）
前記接続部は、硬質材料で形成されたパイプであることを特徴とする付記６記載の捕捉シャーレ。
（付記８）
導入物質を被導入体に導入するためのマイクロインジェクション装置において、
透明な材料上に設けられたウエル部、及び、前記被導入体を捕捉するための開口部が前記ウエル部の側壁に設けられた流路、を有する捕捉シャーレと、
前記ウエル部の前記開口部に前記流路を介して前記被導入体を吸引捕捉する吸引機構と、
前記被導入体を透過観察するための透過観察光学系と、
を備えることを特徴とするマイクロインジェクション装置。
（付記９）
前記被導入体に対し媒介を吐出する吐出機構を更に備えることを特徴とする付記７記載のマイクロインジェクション装置。
（付記１０）
前記捕捉シャーレのウエル部は、前記開口部が設けられる部分の幅が前記被導入体の大きさの１．５倍〜５倍の広さであることを特徴とする付記９記載のマイクロインジェクション装置。
（付記１１）
前記吐出機構は、前記捕捉シャーレの前記流路を介して、前記媒介を前記被導入体に対し吐出することを特徴とする付記９記載のマイクロインジェクション装置。
（付記１２）
前記捕捉シャーレは、複数の前記ウエル部及び複数の前記流路を有し、
前記吸引機構及び前記吐出機構は、前記複数の流路のそれぞれに配置される、
こと特徴とする付記１１記載のマイクロインジェクション装置。
（付記１３）
前記捕捉シャーレは、前記流路に配置され、前記流路を開閉する開閉機構を更に有する
ことを特徴とする付記８記載のマイクロインジェクション装置。
（付記１４）
前記透過観察光学系は、前記ウエル部の下方に配置されていることを特徴とする付記８記載のマイクロインジェクション装置。
（付記１５）
前記ウエル部に媒介を供給する媒介供給手段と、
前記ウエル部に過剰供給された媒介を排出する媒介排出手段と、
を更に備えることを特徴とする付記８記載のマイクロインジェクション装置。
（付記１６）
前記媒介供給手段により供給する媒介の温度を調整する温度調整手段を更に備えることを特徴とする付記１５記載のマイクロインジェクション装置。
（付記１７）
導入物質を被導入体に導入するマイクロインジェクション方法において、
透明な材料上に設けられた捕捉シャーレのウエル部に供給した前記被導入体を、前記ウエル部の側壁に設けられた開口部から吸引することにより捕捉する捕捉工程と、
前記ウエル部の開口部に捕捉した被導入体を透過観察する観察工程と、
を含むことを特徴とするマイクロインジェクション方法。
（付記１８）
前記捕捉した被導入体に対し媒介を吐出する吐出工程を更に含むことを特徴とする付記１７記載のマイクロインジェクション方法。
（付記１９）
前記捕捉工程及び前記吐出工程において、複数の前記ウエル部のそれぞれに位置する被導入体に対し他のウエル部に位置する被導入体と独立して吸引及び吐出を行うことを特徴とする付記１８記載のマイクロインジェクション方法。

本発明の第１実施形態に係る捕捉シャーレを示す要部断面図である。 本発明の第１実施形態に係る捕捉シャーレ上の卵細胞の画像を示す図である。 従来の捕捉シャーレ上の卵細胞の画像を示す図である。 本発明の第２実施形態に係る捕捉シャーレを示す要部断面図である。 本発明の第２実施形態に係る捕捉シャーレのウエル部を示す斜視図である。 本発明の第２実施形態の第１変形例に係る捕捉シャーレのウエル部を示す斜視図である。 本発明の第２実施形態の第２変形例に係る捕捉シャーレのウエル部を示す斜視図である。 本発明の第２実施形態の第３変形例に係る捕捉シャーレのウエル部を示す斜視図である。 本発明の第３実施形態に係る捕捉シャーレを示す断面図である。 本発明の第４実施形態に係るマイクロインジェクション装置を示す部分拡大図である。 本発明の第４実施形態に係るマイクロインジェクション装置を示す概略斜視図である。 本発明の第４実施形態に係るマイクロインジェクション装置による卵細胞の姿勢変更を説明するための断面図である。 本発明の第５実施形態に係るマイクロインジェクション装置を示す部分拡大図である。 本発明の第６実施形態に係るマイクロインジェクション装置を示す要部断面図である。 本発明の第７実施形態に係るマイクロインジェクション装置を示す要部断面図である。 本発明の第８実施形態に係るマイクロインジェクション装置を示す全体構成図である。 従来の捕捉シャーレを示す要部断面図である。

符号の説明

１ 捕捉シャーレ
２ ウエル部
２ａ 側壁
３ 卵細胞
３ａ 導入部位
４ 培養液
５ 流路
５ａ 開口部
６ 上側プレート
６ａ 凹部
７ 下側プレート
７ａ 凹部
７ｂ 膜部
７ｃ ピン
８ 培養液槽
８ａ 仕切り
８ｂ 余剰培養液貯留部
１０ マイクロインジェクション装置
１１ 顕微鏡
１２ キャピラリ
１３ シリコーンチューブ
１４ マニピュレータ
１５ コントローラ
１６ アクチュエータ
１６ａ 昇降部
１７ 吸引・吐出ポンプ
１８ 培養液補充タンク
２１ 捕捉シャーレ
２２ ウエル部
２２ａ 側壁
２２ｂ 下側部分
２２ｃ 上側部分
３１ 捕捉シャーレ
３２ 接続部
４１ 捕捉シャーレ
４２ 逆止弁
５１ 捕捉シャーレ
５２ 電磁石
５３ 弁体
６０ マイクロインジェクション
６１ 捕捉シャーレ
６３ 吸引ポンプ
６４，６６ シリコーンチューブ
６５ 硬質パイプ
７０ マイクロインジェクション
７１ 温度制御槽
７２ 液体２
７３ 温度コントローラ
７３ａ 温度測定部
７３ｂ ヒータ
７４ 断熱材
８０ マイクロインジェクション装置
８１ 捕捉シャーレ
８２ 電磁弁
８３，８４ 廃液収容部

Claims (7)

1. 導入物質を被導入体に導入するマイクロインジェクションに用いられる捕捉シャーレにおいて、
   透明な材料上に設けられたウエル部と、
   前記被導入体を吸引により捕捉するための開口部が前記ウエル部の側壁に設けられた流路と、
   を有することを特徴とする捕捉シャーレ。
2. 前記側壁は、下端側から上端側にかけて徐々に拡径する傾斜面と、前記開口部側に位置し前記傾斜面に対向する面とを含み、
   該傾斜面に対向する面は、鉛直面、又は、該鉛直面に対する傾斜角が前記傾斜面よりも小さい傾斜面である、
   ことを特徴とする請求項１記載の捕捉シャーレ。
3. 導入物質を被導入体に導入するためのマイクロインジェクション装置において、
   透明な材料上に設けられたウエル部、及び、前記被導入体を捕捉するための開口部が前記ウエル部の側壁に設けられた流路、を有する捕捉シャーレと、
   前記ウエル部の前記開口部に前記流路を介して前記被導入体を吸引捕捉する吸引機構と、
   前記被導入体を透過観察するための透過観察光学系と、
   を備えることを特徴とするマイクロインジェクション装置。
4. 前記被導入体に対し媒介を吐出する吐出機構を更に備えることを特徴とする請求項３記載のマイクロインジェクション装置。
5. 前記ウエル部に媒介を供給する媒介供給手段と、
   前記ウエル部に過剰供給された媒介を排出する媒介排出手段と、
   を更に備えることを特徴とする請求項３記載のマイクロインジェクション装置。
6. 導入物質を被導入体に導入するマイクロインジェクション方法において、
   透明な材料上に設けられた捕捉シャーレのウエル部に供給した前記被導入体を、前記ウエル部の側壁に設けられた開口部から吸引することにより捕捉する工程と、
   前記ウエル部の開口部に捕捉した被導入体を透過観察する工程と、
   を含むことを特徴とするマイクロインジェクション方法。
7. 前記捕捉した被導入体に対し媒介を吐出する吐出工程を更に含むことを特徴とする請求項６記載のマイクロインジェクション方法。