WO2020066609A1 - 細胞培養チップ - Google Patents

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WO2020066609A1
WO2020066609A1 PCT/JP2019/035653 JP2019035653W WO2020066609A1 WO 2020066609 A1 WO2020066609 A1 WO 2020066609A1 JP 2019035653 W JP2019035653 W JP 2019035653W WO 2020066609 A1 WO2020066609 A1 WO 2020066609A1
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well
cell culture
culture solution
chamber
main surface
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PCT/JP2019/035653
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Inventor
誠 山中
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ウシオ電機株式会社
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    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0406—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces capillary forces

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture chip.
  • Cells are expressed in living organisms and tissues as (i) soluble factors such as growth factors, vitamins and gas molecules, (ii) insoluble factors such as extracellular matrix proteins, hardness and pressure, (iii) cell-cell interactions, Exists in the “extracellular microenvironment” composed of The function of a cell is controlled while these factors are complicated and strictly controlled. In other words, in order to freely control the function of target cells such as human pluripotent stem cells (human ES / iPS cells), which are promising for regenerative medicine, cell transplantation treatment, drug development, etc., this extracellular microenvironment is required. It is essential to freely control.
  • human pluripotent stem cells human ES / iPS cells
  • the size of the extracellular microenvironment is also a very important factor.
  • Cells are controlled in vivo in a microenvironment on a micrometer ( ⁇ m) scale.
  • ⁇ m micrometer
  • Patent Literature 1 As a means for realizing such a three-dimensional cell culture environment, a microchannel chip disclosed in Patent Literature 1 below has conventionally been proposed.
  • FIG. 13 is a perspective view schematically showing the structure of the microchannel chip disclosed in Patent Document 1 below.
  • the microchannel chip 100 includes a base material 101 and a resin film 102, and two openings are formed on the main surface side of the base material 101. These openings serve as an inlet 111 and an outlet 112. Make up. Further, a groove 110 for a flow path is formed so as to communicate with these openings (111, 112). The groove 110 is covered with the resin film 102 and forms a tubular flow path.
  • FIG. 14 is a cross-sectional view schematically illustrating the structure of the microchannel chip 100.
  • the target liquid sample is introduced from the inflow port 111 in the direction d111.
  • This liquid sample flows in the groove 110 toward the outlet 112.
  • Part of the groove 110 also serves as a detection unit.
  • a substance that emits fluorescence in response to a substance to be detected such as a specific protein, is fixed in the middle of the groove 110.
  • the microchannel chip is used for culturing cells in a culture space under a predetermined environment and observing the state of the cells. During the culture, a liquid culture solution is used as a medium.
  • the work of replacing the culture medium (culture solution) for the purpose of maintaining the culture environment, supplying nutrients to the cells, and removing waste products May be required.
  • the culture solution is removed from the inflow port 111 or the outflow port 112, and An operation of replenishing (adding) a new culture solution is performed.
  • the culture solution is removed by performing a vacuum operation from the inflow port 111 or the outflow port 112 using a pipette whose internal pressure is reduced.
  • a description will be given of a case where an operation of extracting a culture solution using a pipette from the inflow port 111 side is performed.
  • FIG. 15 is a drawing schematically showing a change in the remaining amount of the culture solution when the culture solution is sucked from the conventional microchannel chip 100 described above with reference to FIGS. 13 and 14.
  • FIG. 15 schematically illustrates a state in which the remaining amount of the culture solution changes (decreases) in the order of (a), (b), (c), and (d) over time.
  • the region where the culture solution 130 exists is hatched.
  • the culture solution 130 is sucked in the direction d120 with the tip of the pipette 120 inserted into the inlet 111. More specifically, the culture solution 130 is sucked while the tip of the pipette 120 is pressed against the bottom surface of the inflow port 111 or the side wall near the bottom surface. As the suction of the culture solution 130 progresses, the liquid level of the culture solution 130 gradually decreases (see FIGS. 15A and 15B).
  • the suction of the culture solution 130 is performed, for example, for exchanging the culture solution 130. That is, after the culture solution 130 stored on the inlet 111 side is removed, for example, as shown in FIG. 15D, a new culture solution (here, referred to as “culture solution 130a” for convenience) flows. It is introduced from the entrance 111 side. This new culture solution 130a flows into the groove 110 through the inflow port 111. As a result, the old culture solution 130 already existing in the groove 110 is pushed out to the outlet 112 side. Thereby, the culture solution 130 in the groove 110 is exchanged for a new culture solution 130a.
  • culture solution 130a here, referred to as “culture solution 130a” for convenience
  • the new culture medium 130 a in the groove 110 when a new culture medium 130 a in the groove 110 is partially sucked when a new culture medium 130 a is introduced, the new culture medium 130 a Bubbles may remain in the boundary region with the existing culture solution 130.
  • the bubbles move so that the culture solution 130a pushes out the inside of the groove 110.
  • the cells cultured in a state of being attached to the bottom surface of the groove 110 may be detached by the force generated at the interface between the bubbles, and may be flowed together with the culture solution (130 / 130a). is there.
  • the culture medium exchange operation may be completed in a state where the air bubbles are left in the groove 110. It can happen.
  • the volume occupied by the bubbles and the surface of the culture chamber cannot be used for culture, the total number of cells and the total amount of the culture solution are randomly reduced from the original, and accurate cell tests cannot be performed.
  • the flow and diffusion of the original culture solution designed in the shape of the flow path may be inhibited, and the cells may not be cultured in the target environment. For example, there is a risk that the concentration of the culture solution component to be transported to the cells is disturbed, the shear stress applied to the cells changes, waste products and residues generated from the cells remain, and the like.
  • cells release physiologically active substances (eg, cytokines, hormones, lipids, extracellular matrix, microRNA, exosomes, nutrients, or drugs that exhibit endocrine effects).
  • physiologically active substances eg, cytokines, hormones, lipids, extracellular matrix, microRNA, exosomes, nutrients, or drugs that exhibit endocrine effects.
  • the physiologically active substance collides with the wall surface covering the groove 110 and returns to the cell side, it may act on the cell.
  • air bubbles are formed in the groove 110, the flow of the physiologically active substance is hindered, and there is a possibility that the state of cell culture may be affected.
  • the openings are formed in a general cylindrical shape (cylindrical shape). Not considered at all. For this reason, when performing the suction operation of the culture solution 130, the culture solution 130 existing in the groove 110 is removed while removing the culture solution 130 stored in the opening (inlet 111 / outlet 112). Strict adjustment is required, in which the suction operation is interrupted immediately before suction is started.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and has as its object to provide a cell culture chip that allows a liquid stored in an opening to be sucked while a liquid in a flow path remains by a simple operation procedure.
  • the cell culture chip according to the present invention, The bottom, A base portion formed on the upper surface of the bottom portion, A first well formed by opening the base in a first direction toward the bottom from a part of a main surface that is a surface opposite to the bottom of the base, a first well; At a position spaced apart from the first well in a second direction parallel to the main surface, a second well having the base portion opened in the first direction, A tubular chamber that connects the first well and the second well in the second direction by a region sandwiched between the bottom and the base,
  • the first well may have a shape in which a capillary force of the first well is lower than a capillary force of the chamber.
  • capillary force of a well refers to a capillary force generated at a corner where an inner side surface (inner side wall) of the well and a bottom surface (inner bottom wall) of the well intersect.
  • the inner wall of the groove 110 and the bottom surface of the opening (inflow port 111) are both highly hydrophilic, and the surface is thin and wet. For this reason, when the suction operation is continued from the state shown in FIG. 15C, the culture solution 130 stored in the groove 110 having a lower capillary force than the corner portion of the inlet 111 is moved to the inlet 111 having a higher capillary force. It moves along the inner wall of the groove 110 and the bottom surface of the inflow port 111 toward the corner. As a result, as shown in FIG. 15D, the culture solution 130 stored in the corner of the inflow port 111 is hardly sucked, and the suction of the culture solution 130 in the groove 110 is considered to be continued. .
  • the first well has a shape in which the capillary force of the first well is lower than the capillary force of the chamber.
  • the bottom and the base may be formed by being integrally molded of the same material, or may be formed of different materials.
  • the chamber can be a chamber (culturing chamber) that forms a culture space. Further, the chamber may include the culture chamber, and a communication flow path that connects the culture chamber and the first well in the second direction. In the latter case, the capillary force of the first well may be lower than the capillary force of the communication flow path constituting the chamber.
  • the first well is located at a position closer to the bottom than the main surface of the base portion, and has a diameter-reduced region in which an opening diameter continuously decreases without increasing as approaching the bottom. May be provided.
  • the first well has a shape in which the opening diameter near the chamber is smaller than the opening diameter far from the chamber. According to such a shape, the capillary force at the position of the bottom surface of the first well can be reduced.
  • the first well has an inner wall composed of the base portion,
  • the inner wall may include a curved surface or a plane that is not parallel to the main surface in the reduced diameter region of the first well.
  • the first well has an inclined surface formed at the corner near the bottom surface, and the corner angle between the inclined surface and the bottom surface of the first well is obtuse. As a result, the capillary force at the corner of the first well is reduced.
  • the cell culture chip is formed continuously with the first well in the first direction, and connects the reduced diameter region of the first well and the chamber in the first direction, and has a communication well.
  • the communication well may have the bottom as a bottom surface and an opening diameter smaller than the reduced diameter region of the first well.
  • the first well has the diameter-reduced region, and thus has a shape in which the opening diameter decreases at a position near the bottom as the position approaches the bottom. For this reason, at the position where the opening diameter is the smallest, the thickness of the base portion becomes small, which may cause difficulty during molding.
  • the thickness of the base portion located around the communication well is ensured, so that molding is facilitated.
  • this communication well has a smaller opening diameter than the reduced diameter region of the first well, it does not hinder the suction of only the liquid stored in the first well when sucking the liquid. No. That is, even if a part of the liquid remains in the communication well, the liquid stored in the first well can be substantially completely sucked. In other words, it is possible to substantially completely aspirate the liquid stored in the first well without aspirating the liquid stored in the chamber, even in the configuration in which the communication well is provided. Becomes
  • the bottom surface of the first well may be constituted by the bottom portion.
  • the second well may have a shape in which the capillary force of the second well is lower than the capillary force of the chamber. In this case, the liquid can be sucked from any of the first well and the second well while the liquid is stored in the chamber.
  • the second well may have a reduced-diameter region at a position closer to the bottom portion than the main surface of the base portion, the opening diameter decreasing continuously without increasing the opening diameter as approaching the bottom portion. Absent.
  • the cell culture chip according to the present invention, The bottom, A base portion formed on the upper surface of the bottom portion, A first well formed by opening the base in a first direction toward the bottom from a part of a main surface that is a surface opposite to the bottom of the base, a first well; At a position spaced apart from the first well in a second direction parallel to the main surface, a second well having the base portion opened in the first direction, A tubular chamber that connects the first well and the second well in the second direction by a region sandwiched between the bottom and the base, The first well has a reduced diameter region in which the opening diameter is continuously reduced without increasing the opening diameter at a position closer to the bottom portion than the main surface of the base portion.
  • the cell culture chip of the present invention it is possible to aspirate the liquid stored in the opening while leaving the liquid in the flow path by a simple operation procedure.
  • FIG. 3 is a partially enlarged view of FIG. 2. It is a figure which shows typically the state where the culture solution was filled in the cell culture chip. It is a figure which shows typically the state which is aspirating the culture solution filled in the cell culture chip. It is the figure which showed typically the state which is aspirating the culture solution filled in the cell culture chip
  • 5B is a drawing schematically showing a state in which the culture solution filled in the cell culture chip is being sucked, and corresponds to a state in which suction has progressed from FIG. 5B. It is a drawing schematically showing a state in which a culture solution filled in a conventional microchannel chip is sucked. It is sectional drawing which shows typically some structures of another embodiment of a cell culture chip. It is a top view which shows typically the structure of another embodiment of a cell culture chip. It is sectional drawing which shows typically the structure of another embodiment of a cell culture chip. It is sectional drawing which shows typically the structure of another embodiment of a cell culture chip. It is a top view which shows typically the structure of another embodiment of a cell culture chip.
  • FIG. 1 is a plan view schematically showing the structure of an embodiment of a cell culture chip.
  • FIG. 2 is a schematic sectional view when the cell culture chip 1 shown in FIG. 1 is cut along the line A1-A1 in FIG.
  • FIG. 1 corresponds to an XZ plan view when the cell culture chip 1 is viewed from the Y direction
  • FIG. 2 is a view when the cell culture chip 1 is cut along the XY plane when viewed from the Z direction. The following description will be made assuming that the XY plan view of FIG.
  • the cell culture chip 1 includes a bottom 3 and a base 5.
  • the base portion 5 includes a first well 10 and a second well 20 that are opened in the Y direction from a part of the surface (main surface 5a) opposite to the bottom 3 toward the bottom 3. That is, the first well 10 has an opening surface 10 a on the main surface 5 a side of the base portion 5, and is opened in the Y direction toward the bottom 3.
  • the second well 20 has an opening surface 20 a on the main surface 5 a side of the base portion 5, and is opened in the Y direction toward the bottom 3. That is, the Y direction corresponds to the “first direction”.
  • the opening surface 10a of the first well 10 and the opening surface 20a of the second well 20 are arranged at positions separated from each other in a direction parallel to the main surface 5a of the base portion 5.
  • the X direction corresponds to the “second direction”.
  • the opening 10a of the first well 10 and the opening 20a of the second well 20 may be separated in the Z direction, or may be separated in the X and Z directions.
  • the “second direction” corresponds to a direction from the opening surface 10 a of the first well 10 toward the opening surface 20 a of the second well 20.
  • the base portion 5 has a tubular concave portion at the position on the bottom portion 3 side, and a chamber 7 is formed by a region sandwiched between the concave portion and the bottom portion 3.
  • the chamber 7 forms a space for culturing cells.
  • one end of the chamber 7 is connected to the first well 10 via the communication well 19, and the other end is connected to the second well 20 via the communication well 29.
  • the communication well 19 is connected to the first well 10 in the Y direction, and the bottom 3 forms a bottom surface of the communication well 19.
  • the communication well 29 is connected to the second well 20 in the Y direction, and the bottom 3 forms the bottom surface of the communication well 29.
  • the first well 10 and the second well 20 each have a region at a position closer to the bottom portion 3 than the main surface 5a, and the opening diameter decreases without increasing as approaching the bottom portion 3. This will be described with reference to FIG.
  • FIG. 3 is an enlarged view of the vicinity of the first well 10 of FIG.
  • the first well 10 has an opening diameter at a position closer to the bottom 3 than the main surface 5 a of the base 5, as it approaches the bottom 3, that is, as it proceeds in the + Y direction. 10b decreases without increasing. This region is hereinafter referred to as “diameter reduction region 11”.
  • the opening diameter 10b of the first well 10 is substantially uniform at a position closer to the main surface 5a of the base portion 5 than the reduced diameter region 11. That is, in the first well 10, the inner wall 10 c forms an inclined surface in the reduced diameter region 11.
  • FIG. 4 is a drawing schematically showing a state in which the culture solution 30 is filled in the cell culture chip 1 of the present embodiment.
  • the region where the culture solution 30 is present is hatched, and the bottom 3 and the base 5 are not hatched.
  • the region where the culture solution 30 is present is specified, it is illustrated in the same manner.
  • the culture solution 30 When filling the cell culture chip 1 with the culture solution 30, the culture solution 30 is injected from the first well 10 side or the second well 20 side. For example, when the culture solution 30 is injected from the first well 10 side, the culture solution 30 flows into the second well 20 side via the communication well 19 and the chamber 7. By injecting a predetermined amount or more of the culture solution 30 into the cell culture chip 1, the inside of the chamber 7 located between the first well 10 and the second well 20 is filled with the culture solution 30. Thus, cells can be cultured in the chamber 7.
  • FIGS. 5A to 5C are diagrams schematically showing a state in which the culture solution 30 is sucked using the pipette 31.
  • FIG. FIG. 5A, FIG. 5B, and FIG. 5C show a state in which the suction of the culture solution 30 is progressing.
  • the liquid level of the culture solution 30 starts to gradually decrease (see FIG. 5A), and eventually falls into the reduced diameter region 11 (see FIG. 5A). 5B). Thereafter, when the suction operation is further continued, the liquid level of the culture solution 30 drops to the inside of the communication well 19 (see FIG. 5C).
  • the suction operation is continued with the suction force within the range of not less than the suction force capable of completely sucking the culture solution 30 stored in the first well 10 and not more than the predetermined suction force, the culture solution 30 Is further lowered, and the bottom 3 is exposed (see FIG. 5C). At this time, a liquid pool of the culture solution 30 is formed at the corner portion in the communication well 19 (reference numeral 30a). However, even if the suction operation is further continued, the suction of the culture solution 30 does not progress.
  • the culture solution 30 flows from the chamber 7 toward the first well 10 immediately after the suction of the culture solution 30 stored in the first well 10 is completed. None be. Then, even if the suction operation from the pipette 31 is continued with a constant suction force, the suction of the culture solution 30 does not progress.
  • the present inventor considers the reason why such a phenomenon has occurred as follows.
  • FIG. 6 is a drawing schematically showing a state in which the culture solution 130 filled in the conventional microchannel chip 100 is sucked, and is substantially the same as FIG. 15C.
  • the angle of the corner portion of the inflow port 111 (hereinafter, referred to as “opening 111”) is ⁇ , and the angle of the portion where the meniscus of the culture solution 130 (130a) stored in the corner portion is in contact with the corner portion.
  • opening 111 The angle of the corner portion of the inflow port 111 (hereinafter, referred to as “opening 111”) is ⁇ , and the angle of the portion where the meniscus of the culture solution 130 (130a) stored in the corner portion is in contact with the corner portion.
  • D1 the capillary force P1 generated in the meniscus of the culture solution 130a
  • ⁇ indicates the surface tension
  • ⁇ indicates the contact angle of the culture solution 130 (130a).
  • the capillary force P2 generated in the meniscus of the culture solution 130 (130b) stored in the groove 110 is similarly expressed by the following equation using ⁇ and ⁇ . .
  • the ⁇ component is 0. Is calculated as P2 ⁇ 2 ⁇ ⁇ cos ( ⁇ ) / (D2 / 2) (2)
  • the capillary force P1 generated in the meniscus of the culture solution 130a is larger than the capillary force P2 generated in the meniscus of the culture solution 130b stored in the groove 110, and P1> P2.
  • the capillary force of the meniscus of the culture solution 30 stored in the corner portion of the first well 10 is made smaller than the capillary force of the meniscus of the culture solution 30 in the chamber 7. This indicates that the culture solution 30 can be prevented from flowing out of the chamber 7 even if the culture solution 30 in the first well 10 is sucked with a suction force that can suck all of the culture solution 30.
  • the cell culture chip 1 of the present embodiment has a reduced diameter in which the opening diameter 10 b decreases on the bottom 3 side of the first well 10 as it proceeds in the + Y direction.
  • An area 11 is provided.
  • the corner angle ⁇ of the corner portion in the reduced diameter region 11 is an obtuse angle as shown in FIG. 5B and is larger than the opening 111 of the conventional microchannel chip shown in FIG.
  • the value of cos ( ⁇ + ⁇ / 2) in the above equation (1) decreases. Therefore, in the state of FIG.
  • the value of the capillary force P1 generated in the meniscus of the culture solution 30 stored in the corner portion in the reduced diameter region 11 is stored in the corner portion of the opening 111 in the conventional structure shown in FIG. Is lower than the value of the capillary force P1 generated in the meniscus of the culture solution 130 (130a).
  • the capillary force P1 generated in the meniscus of the culture solution 30 stored in the corner portion in the reduced diameter region 11 is smaller than the capillary force P2 of the meniscus of the culture solution 30 in the chamber 7.
  • the cell culture chip 1 of the present embodiment includes a communication well 19, and the corner angle of the corner portion of the communication well 19 is, for example, similar to the opening 111 of the conventional microchannel chip 100. , Approximately 90 °.
  • the culture solution 30 (30a) is stored in the corner portion of the communication well 19.
  • the suction operation is continued from the state of FIG. 5B, the culture solution 30 (30a) is stored in the corner portion of the communication well 19.
  • the suction operation is terminated, and a new culture medium for replacement is obtained. Can be introduced from the first well 10 side.
  • the length D of the inclined surface when the inner wall 10 c in the reduced diameter region 11 of the first well 10 is viewed from the Z direction (the chamfered portion) The preferable minimum value of (length) is as shown in Table 1 below.
  • Specific dimensions of the cell culture chip 1 are as follows. -The height (length in the Y direction) of the base portion 5 is 1 mm or more and 20 mm or less, and is 3 mm as an example. The height of the bottom 3 (the length in the Y direction) is 0.1 mm or more and 5 mm or less, and is 1 mm as an example. The height of the chamber 7 (the length in the Y direction) is not less than 200 ⁇ m and not more than 2000 ⁇ m, for example, 400 ⁇ m.
  • the opening diameter 10b on the opening surface 10a side of the first well 10 is 0.5 mm or more and 40 mm or less, for example, 2 mm.
  • the minimum value of the opening diameter 10b in the reduced diameter region 11 is 0.5 mm or more and 40 mm or less, and is 1.75 mm as an example.
  • the length of the inclined surface of the inner wall 10c in the reduced diameter region 11 when viewed from the Z direction is not less than 20 ⁇ m and not more than 2000 ⁇ m, for example, 180 ⁇ m.
  • the opening diameter of the communication well 19 is not less than 0.2 mm and not more than 39 mm, for example, 1.75 mm.
  • the height (length in the Y direction) of the communication well 19 is not less than 0.2 mm and not more than 3 mm, and is, for example, 0.6 mm.
  • the distance between the central axis of the first well 10 and the central axis of the second well 20 is 2 mm or more and 40 mm or less, and is 9 mm as an example.
  • the opening diameter on the opening surface 20a side of the second well 20 is 0.5 mm or more and 40 mm or less, for example, 1 mm.
  • the minimum value of the opening diameter in the reduced diameter region is 0.5 mm or more and 40 mm or less, and is 0.75 mm as an example.
  • the length of the inclined surface of the inner wall 10c in the reduced diameter region 11 when viewed from the Z direction is not less than 20 ⁇ m and not more than 2000 ⁇ m, for example, 180 ⁇ m.
  • the opening diameter of the communication well 29 is not less than 0.2 mm and not more than 39 mm, for example, 0.7 mm.
  • the height (the length in the Y direction) of the communication well 19 is not less than 0.2 mm and not more than 2000 mm, and is, for example, 0.6 mm.
  • the cell culture chip 1 of the above-described embodiment has a structure in which the second well 20 also has a reduced diameter region similar to the reduced diameter region 11 of the first well 10.
  • the culture solution 30 is kept stored in the chamber 7 for the same reason. It is possible to remove the culture solution.
  • the present invention does not exclude a structure having a reduced diameter region only on one of the wells (first well 10 / second well 20).
  • FIG. 3 shows a case where the inner wall 10c of the first well 10 in the diameter reduction region 11 of the cell culture chip 1 is a flat surface.
  • the inner wall 10c does not necessarily need to be a flat surface, and may be formed as a curved surface.
  • FIG. 7 is a drawing schematically showing the structure near the first well 10 in a case where the inner wall 10c of the first well 10 in the reduced diameter region 11 has a curved surface, following FIG. .
  • FIGS. 2 and 3 show a case in which the first well 10 has a mode in which the opening diameter 10 b decreases symmetrically with respect to the central axis in the reduced diameter region 11.
  • the first well 10 may have an eccentric shape because the central axis in the reduced diameter region 11 and the central axis on the main surface 5a side of the base portion 5 are different from the central axis in the reduced diameter region 11.
  • FIGS. 8 and 9 show the cell culture chip 1 having such a structure, as shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
  • the inner wall in the reduced diameter region 11 may be formed of a curved surface, or the reduced diameter region 11 exists only in the first well 10 and the reduced diameter region 11 is formed in the second well 20 side. It may not have a diameter region.
  • the cell culture chip 1 may not include the communication well (19/29). Also in this configuration, since the first well 10 has the reduced diameter region, the culture solution 30 in the first well 10 is substantially not sucked from the chamber 7 side for the above-described reason. Can be removed.
  • the cell culture chip 1 when the cell culture chip 1 includes the communication well (19/29), the height of the communication well (19/29) A considerable thickness (thickness) is secured. For this reason, from the viewpoint of enabling stable molding during the production of the cell culture chip 1, it is preferable to provide the communication well (19/29).
  • the chamber 7 provided in the cell culture chip 1 includes a culture chamber 7a which substantially forms a space for culturing cells, and the culture chamber 7a and each well (10/20).
  • the communication channel (7b / 7c) having a smaller opening diameter than the culture chamber 7a may be included.
  • the reduced diameter region 11 may be formed such that the capillary force of the first well 10 is smaller than the capillary force of the communication channel 7b.
  • the chamber 7 forms a space for culturing cells as described above. That is, the chamber 7 corresponds to the culture chamber.
  • the bottom 3 and the base 5 provided in the cell culture chip 1 are described as being made of different members. However, the bottom 3 and the base 5 are formed by integrally molding the same member. It may be done.
  • the first well 10 of the cell culture chip 1 described with reference to FIG. 3 has a substantially uniform opening diameter 10b at a position closer to the main surface 5a of the base portion 5 than the reduced diameter region 11. It was assumed that. However, the first well 10 may have a structure having a reduced-diameter region 11 in which the opening diameter 10b decreases over the entirety from the opening surface 10a toward the bottom 3 side.
  • the culture solution 30 filled therein is extracted from the first well 10 side or the second well 20 side while keeping the culture solution 30 in the chamber 7. It has been described that it is possible to do that.
  • the contents to be extracted from the cell culture chip 1 while remaining in the chamber 7 are not limited to the culture solution 30 and may be liquids.
  • the suction method is not limited to the pipette 31.
  • the cell culture chip 1 of the present invention employs another general method of arranging the tip of a suction device on one side of the well (for example, the first well 10) and aspirating the culture solution 30 stored in the well. It is possible to adopt.
  • the cell culture chip 1 in which the pair of wells (10, 20) are connected by the chamber 7 has been described.
  • the number of wells and the number of chambers are not limited.
  • FIGS. 12A to 12D are plan views schematically showing the cell culture chip 1 of another embodiment, following FIG.
  • the cell culture chip 1 shown in FIG. 12A three wells (10, 20, 41) are formed in series, and chambers (7, 7) are formed so as to communicate between the wells. .
  • the cell culture chip 1 shown in FIG. 12B has three wells (10, 20, 41). However, unlike the cell culture chip 1 shown in FIG. 12A, the chamber 7 that connects the well 10 and the well 20 and the chamber 7 that connects the well 10 and the well 41 are connected to each other.
  • the cell culture chip 1 shown in FIG. 12C includes four wells (10, 20, 41, and 42), and a chamber 7 that connects the well 10 and the well 20, and a chamber 7 that connects the well 10 and the well 41. , And the chamber 7 communicating the well 10 and the well 42 are formed independently of each other.
  • the cell culture chip 1 shown in FIG. 12D has six wells (10, 20, 41, 42, 43, 44), and the chamber 7 is formed so as to connect adjacent wells. However, all the wells (10, 20, 41, 42, 43, 44) are connected in series and annularly by each chamber 7.
  • the capillary force of the well (10, 20, 41, 42, 43, 44) has a shape lower than the capillary force of the chamber 7. . Since a more specific example of the structure is common to the above-described embodiment, the description is omitted.
  • the communication wells (19, 29) are described as connecting the wells (10, 20) and the chamber 7 in the Y direction. did. However, the communication wells (19, 29) are formed so as to connect the wells (10, 20) and the chamber 7 also in a direction (for example, X direction) parallel to the main surface 5a of the base portion 5. No problem. That is, the end of the chamber 7 is not disposed immediately below the wells (10, 20), and the communication wells (19, 29) also extend in the X direction. It may be formed so as to communicate with the chamber 7.

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Abstract

簡易な作業手順によって流路内の液体を残存させながらも開口部内に貯留された液体を吸引することを可能にする、細胞培養チップを提供する。　本発明に係る細胞培養チップは、底部と、底部の上面に形成された基体部と、基体部の主面の一部から底部に向かう第一方向に基体部を開口されてなる、第一ウェルと、第一ウェルに対して主面に平行な第二方向に離間した位置において、第一方向に基体部を開口されてなる第二ウェルと、底部と基体部とで挟まれた領域によって第一ウェルと第二ウェルとを第二方向に連絡する管状のチャンバとを有し、第一ウェルは、第一ウェルの毛細管力がチャンバの毛細管力よりも低い形状を呈する。

Description

細胞培養チップ
　本発明は、細胞培養チップに関する。
　細胞は、生体・組織内において、（i）成長因子、ビタミン、ガス分子などの可溶性因子、（ii）細胞外マトリックスタンパク、硬さ、圧力などの不可溶性因子、（iii）細胞間相互作用、などで構成される「細胞外微小環境」中に存在する。細胞は、これらの因子が複雑且つ厳密に制御されながら、その機能が制御される。つまり、再生医療、細胞移植治療、薬剤開発などに有望視されているヒト多能性幹細胞（ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞）などの目的細胞の機能を自在に制御するためには、この細胞外微小環境を自在に制御することが必須となる。
　従来、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を含む細胞の培養や実験は、培養ディッシュやプレートを用いた２次元環境下で行われていた。しかし、本来、細胞は３次元環境下に置かれており、２次元環境下では本来の機能を発現することができないと考えられる。ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を用いた組織工学においても、３次元環境を整えることは非常に重要である。
　また、細胞外微小環境の大きさも非常に重要な因子となる。細胞は、生体内において、マイクロメートル（μｍ）スケールの微小環境下で制御される。しかし、従来の培養方法では、このように微小空間内において因子を制御することが困難であった。更に、これらの因子を網羅的に解析することは、ほぼ不可能であった。このような事情により、従来方法では困難であった、３次元での細胞培養環境を作製する手法が望まれていた。
　このような３次元での細胞培養環境を実現する手段として、従来、下記特許文献１に開示された、マイクロ流路チップが提案されている。
　図１３は、下記特許文献１に開示されたマイクロ流路チップの構造を模式的に示す斜視図である。マイクロ流路チップ１００は、基材１０１と樹脂フィルム１０２とを含み、基材１０１の主面側には、２箇所に開口部が形成され、これらの開口部が流入口１１１及び流出口１１２を構成している。また、これらの開口部（１１１，１１２）と連絡されるように、流路用の溝１１０が形成されている。溝１１０は、樹脂フィルム１０２で覆われており、管状の流路を構成している。図１４は、マイクロ流路チップ１００の構造を模式的に示す断面図である。
　検査時には、対象とする液体試料が流入口１１１から方向ｄ１１１の向きに導入される。この液体試料は、流出口１１２に向けて溝１１０内を流れる。溝１１０の一部箇所は、検出部を兼ねている。例えば、溝１１０の途中には、特定のタンパク質などの、検出対象物質に反応して蛍光を発する物質が固定化されている。当該箇所（検出部）に対して蛍光顕微鏡を用いた観察が行われることで、液体試料内に特定の検出対象物質が含まれるか否かが判定される。
特開２０１８－０４７６１４号公報
　マイクロ流路チップは、所定の環境下で培養空間内に細胞を培養し、この細胞の状態を観察する用途で利用される。培養に際しては、培地として液体の培養液が利用される。
　ある一定以上の時間（日数）にわたって特定の環境下で細胞を培養するに際しては、培養環境の維持、細胞に対する栄養の供給、老廃物の除去などの目的で、培地（培養液）を交換する作業が必要となる場合がある。例えば図１３に示したマイクロ流路チップ１００を用いて細胞を培養している場合において、培養液を交換する必要が生じた際には、流入口１１１又は流出口１１２から培養液を除去すると共に、新たに培養液を補充（追加）する作業が行われる。具体的には、内部を減圧したピペットを用いて流入口１１１又は流出口１１２からバキューム操作が行われることで、培養液が除去される。以下では、流入口１１１側からピペットを用いて培養液を抽出する作業を行う場合について説明するが、流出口１１２側から抽出する場合も同様である。
　流入口１１１側にピペットの先端を位置させた状態で、ピペットによる培養液の吸引作業を行う場合、吸引力が厳密に調整されていない場合には、流入口１１１内の培養液のみならず溝１１０内の培養液についても吸引されてしまう。この点につき、図１５を参照して詳述する。
　図１５は、図１３及び図１４を参照して上述した、従来のマイクロ流路チップ１００から培養液を吸引する場合において、培養液の残量の変化を模式的に示す図面である。図１５では、時間の経過と共に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の順に培養液の残量が変化（減少）している様子が模式的に示されている。また、図１５では、培養液１３０が存在する領域に対してハッチングが施されている。
　従来のマイクロ流路チップ１００から培養液を吸引する場合、ピペット１２０の先端を流入口１１１に挿入した状態で、培養液１３０がｄ１２０方向に吸引される。より詳細には、ピペット１２０の先端を流入口１１１の底面や底面近傍の側壁に押し当てながら、培養液１３０が吸引される。培養液１３０の吸引が進行するに連れて、培養液１３０の液面が徐々に低下する（図１５（ａ）、（ｂ）参照）。
　培養液１３０の吸引が更に進行すると、図１５（ｃ）に示すように、流入口１１１の底面が露出する状態となる。この時点において、図１５（ｃ）に示すように、流入口１１１のコーナ部分にはわずかに培養液１３０が残存した状態となる。
　図１５（ｃ）の状態から更に培養液１３０の吸引を進行させると、図１５（ｄ）に示すように、流入口１１１のコーナ部分には培養液１３０をそのまま残しながら、流路を構成する溝１１０内に存在していた培養液１３０が、溝１１０の内壁を伝って流入口１１１側へと導かれ（ｄ１２１方向）、その後にピペット１２０によって吸引される。この結果、図１５（ｄ）に示すように、溝１１０内の培養液１３０の一部がピペット１２０によって吸引される。
　上述したように、培養液１３０の吸引は、例えば培養液１３０を交換するために行われる。すなわち、流入口１１１側に貯留されていた培養液１３０が例えば図１５（ｄ）に示すように除去された後、新たな培養液（ここでは便宜上「培養液１３０ａ」と記載する。）が流入口１１１側から導入される。この新たな培養液１３０ａは、流入口１１１を通じて溝１１０内に流入する。この結果、すでに溝１１０内に存在していた古い培養液１３０は、流出口１１２側へと押し出される。これにより、溝１１０内の培養液１３０が新たな培養液１３０ａに交換される。
　しかし、図１５（ｄ）に示すように、新たな培養液１３０ａを流入させる際に、溝１１０内の培養液１３０が一部吸引されていると、溝１１０内において、新たな培養液１３０ａと既存の培養液１３０との境界領域に気泡が残存してしまう場合がある。この気泡が存在している状態で新たな培養液１３０ａが徐々に流入されると、培養液１３０ａによって気泡が溝１１０内を押し出されるように移動する。このとき、溝１１０内において、より詳細には溝１１０の底面に付着した状態で培養されている細胞が、気泡の界面に生じる力によって剥離され、培養液（１３０／１３０ａ）と共に流されるおそれがある。
　また、培養液の交換作業の実行時に細胞を溝１１０内に留めることができた場合であっても、気泡が溝１１０内に残されたままの状態で培養液の交換作業が完了する場合が起こり得る。この場合、気泡が占める容積と培養チャンバ表面は培養に使用できなくなるため、本来の総細胞数と総培養液量から無秩序に減少し、正確な細胞試験ができなくなる。また、流路形状で設計した本来とする培養液の流動や拡散が阻害され、目的とする環境下で細胞を培養できなくなるおそれがある。例えば、細胞への輸送する培養液成分の濃度攪乱される、細胞にかかるシェアストレスが変化する、細胞から生じた老廃物や残渣が残留する、などのおそれがある。
　例えば、細胞からは生理活性物質（例えば、内分泌作用を示すサイトカイン、ホルモン、脂質、細胞外基質、マイクロＲＮＡ、エクソソーム、栄養素、又は薬剤など）が放出される。この生理活性物質は、溝１１０を覆う壁面に衝突して細胞側に戻されると、この細胞に対して作用することがある。しかし、溝１１０内に気泡が形成されてしまうと、この生理活性物質の流れが妨げられ、細胞の培養状態に影響が生じるおそれがある。
　以上のような事情が存在することから、培養液１３０を交換する際には、溝１１０内の培養液１３０を吸引しないように、吸引力を調整しながら行う必要がある。しかし、従来のマイクロ流路チップ１００において、開口部（流入口１１１／流出口１１２）は一般的な筒形状（円筒形状）で構成されており、培養液１３０の吸引力を調整することについては何ら考慮されていない。このため、培養液１３０の吸引作業を行うに際しては、開口部（流入口１１１／流出口１１２）内に貯留されている培養液１３０は除去しながらも、溝１１０内に存在する培養液１３０の吸引が開始される直前に吸引作業を中断するという、厳密な調整が必要となる。
　従って、吸引作業を行うに際しては、作業員に厳密な調整スキルが要求されるところ、再現性が乏しいという問題がある。また、かかる事情の存在が、吸引作業を自動化することへの障害ともなる。
　本発明は、上記の課題に鑑み、簡易な作業手順によって流路内の液体を残存させながらも開口部内に貯留された液体を吸引することを可能にする、細胞培養チップを提供することを目的とする。
　本発明に係る細胞培養チップは、
　底部と、
　前記底部の上面に形成された基体部と、
　前記基体部の前記底部とは反対側の面である主面の一部から前記底部に向かう第一方向に前記基体部を開口されてなる、第一ウェルと、
　前記第一ウェルに対して前記主面に平行な第二方向に離間した位置において、前記第一方向に前記基体部を開口されてなる第二ウェルと、
　前記底部と前記基体部とで挟まれた領域によって、前記第一ウェルと前記第二ウェルとを前記第二方向に連絡する管状のチャンバとを有し、
　前記第一ウェルは、前記第一ウェルの毛細管力が前記チャンバの毛細管力よりも低い形状を呈することを特徴とする。
　本明細書において、「ウェルの毛細管力」という用語は、ウェルの内側面（内側壁）とウェルの底面（内底壁）とが交差するコーナ部分に生じる毛細管力を指す。
　図１５を参照して上述したように、従来のマイクロ流路チップ１００に培養液１３０を充填させた状態でピペット１２０による吸引動作を継続すると、開口部（流入口１１１）内に一部の培養液１３０が残存しているにもかかわらず、流路（溝１１０）内に貯留されている培養液１３０の吸引が開始されてしまう。これは、図１５（ｃ）に示すように、流入口１１１のコーナ部に形成された培養液１３０の液溜まり部分の毛細管力が、溝１１０の毛細管力よりも高いためであると考えられる。
　溝１１０の内壁、及び開口部（流入口１１１）の底面は、いずれも親水性が高く、その表面は薄く濡れた状態となっている。このため、図１５（ｃ）の状態から吸引動作を継続すると、毛細管力が流入口１１１のコーナ部よりも低い、溝１１０内に貯留された培養液１３０が、毛細管力の高い流入口１１１のコーナ部側に向かって、溝１１０の内壁及び流入口１１１の底面を伝って移動する。この結果、図１５（ｄ）に示すように、流入口１１１のコーナ部に貯留された培養液１３０はほとんど吸引されず、溝１１０内の培養液１３０の吸引が継続されてしまうものと考えられる。
　これに対し、本発明に係る細胞培養チップによれば、第一ウェルが、当該第一ウェルの毛細管力がチャンバの毛細管力よりも低くなる形状を呈している。この結果、第一ウェル側から吸引を開始すると、第一ウェル内に貯留されている液体（培養液）の吸引が実質的に完了するまで、チャンバ内に貯留されている液体の吸引が開始されることはない。従って、作業員は、単に、第一ウェル内に貯留されている液体が吸引できる程度の吸引力で液体の吸引を行うと共に、当該第一ウェルの吸引が完了した時点で吸引作業を停止すればよく、吸引作業に際して、吸引力や吸引時間を厳密に調整する必要がなくなる。
　これにより、従来のチップに対して培養液を交換する作業に比べて、作業員の作業は簡素化され、専門的なスキルが不要となるため、作業性が向上する。また、第一ウェル内に貯留されている液体を吸引できる程度の吸引力で吸引するだけでよく、厳密な調整が不要となるため、吸引作業の自動化が可能となる。
　前記細胞培養チップにおいて、前記底部と前記基体部とは、同一材料によって一体成型されることで構成されていても構わないし、異なる材料によって構成されていても構わない。
　前記チャンバは、培養空間を構成するチャンバ（培養チャンバ）とすることができる。また、前記チャンバは、前記培養チャンバと、前記培養チャンバと前記第一ウェルとを第二方向に連絡する連絡用の流路とを含んで構成されても構わない。後者の場合、前記第一ウェルの毛細管力が、前記チャンバを構成する前記連絡用の流路の毛細管力よりも低い構成とすることができる。
　前記細胞培養チップにおいて、前記第一ウェルは、前記基体部の前記主面よりも前記底部に近い位置において、前記底部に近づくに連れて開口径が増加することなく連続的に減少する縮径領域を有するものとしても構わない。
　上記の構成によれば、第一ウェルは、チャンバに近い位置の開口径が、チャンバに対して遠い位置の開口径よりも小さい形状を示す。かかる形状によれば、第一ウェルの底面の位置における毛細管力を小さくすることができる。
　前記第一ウェルは、前記基体部からなる内壁を有してなり、
　前記内壁は、前記第一ウェルの前記縮径領域において曲面又は前記主面とは非平行な平面を含むものとしても構わない。
　かかる構成によれば、第一ウェルは、底面の近傍において、コーナ部分に傾斜面が形成され、この傾斜面と第一ウェルの底面との間のコーナ部分のコーナ角が鈍角となる。これにより、第一ウェルのコーナ部分の毛細管力が低下する。
　前記細胞培養チップは、前記第一方向に関して前記第一ウェルに連続して形成され、前記第一ウェルの前記縮径領域と前記チャンバとを前記第一方向に連絡する、連絡用ウェルを有し、
　前記連絡用ウェルは、前記底部を底面とし、開口径が前記第一ウェルの前記縮径領域よりも狭いものとしても構わない。
　上述したように、前記第一ウェルは、前記縮径領域を有することで、前記底部に近い位置において、前記底部に近づくほど開口径が小さくなる形状を呈している。このため、開口径が最も小さい位置においては、基体部の肉厚が小さくなり、成型時に困難さを伴う可能性がある。
　これに対し、上記の構成のように連絡用ウェルを設けたことで、連絡用ウェルの周囲に位置する基体部の肉厚が確保されるため、成型が容易化される。また、この連絡用ウェルは、第一ウェルの縮径領域よりも開口径を小さくしているため、液体の吸引時において第一ウェル内に貯留されている液体のみを吸引することに対する妨げとはならない。すなわち、連絡用ウェル内に一部の液体を残存させている状態であったとしても、第一ウェル内に貯留されていた液体を実質的に完全に吸引することができる。言い換えれば、連絡用ウェルを設けた構成であっても、チャンバ内に貯留している液体を吸引することなく、第一ウェル内に貯留されていた液体を実質的に完全に吸引することが可能となる。
　前記細胞培養チップにおいて、前記第一ウェルの底面が前記底部からなるものとしても構わない。
　また、前記細胞培養チップにおいて、前記第二ウェルは、前記第二ウェルの毛細管力が前記チャンバの毛細管力よりも低い形状を呈するものとしても構わない。この場合、第一ウェルと第二ウェルのいずれのウェルからでも、チャンバ内に液体を貯留させたままで液体の吸引を行うことができる。
　前記第二ウェルは、前記基体部の前記主面よりも前記底部に近い位置において、前記底部に近づくに連れて開口径が増加することなく連続的に減少する縮径領域を有するものとしても構わない。
　また、本発明に係る細胞培養チップは、
　底部と、
　前記底部の上面に形成された基体部と、
　前記基体部の前記底部とは反対側の面である主面の一部から前記底部に向かう第一方向に前記基体部を開口されてなる、第一ウェルと、
　前記第一ウェルに対して前記主面に平行な第二方向に離間した位置において、前記第一方向に前記基体部を開口されてなる第二ウェルと、
　前記底部と前記基体部とで挟まれた領域によって、前記第一ウェルと前記第二ウェルとを前記第二方向に連絡する管状のチャンバとを有し、
　前記第一ウェルは、前記基体部の前記主面よりも前記底部に近い位置において、開口径が増加することなく連続的に減少する縮径領域を有することを特徴とする。
　本発明の細胞培養チップによれば、簡易な作業手順によって流路内の液体を残存させながらも開口部内に貯留された液体を吸引することが可能となる。
細胞培養チップの一実施形態の構造を模式的に示す平面図である。 細胞培養チップの一実施形態の構造を模式的に示す断面図である。 図２の一部拡大図である。 細胞培養チップ内に培養液が充填された状態を模式的に示す図面である。 細胞培養チップ内に充填されていた培養液を吸引している状態を模式的に示す図面である。 細胞培養チップ内に充填されていた培養液を吸引している状態を模式的に示した図面であり、図５Ａから吸引が進行した状態に対応する。 細胞培養チップ内に充填されていた培養液を吸引している状態を模式的に示した図面であり、図５Ｂから吸引が進行した状態に対応する。 従来のマイクロ流路チップに充填されていた培養液を吸引している状態を模式的に示す図面である。 細胞培養チップの別の実施形態の一部構造を模式的に示す断面図である。 細胞培養チップの別の実施形態の構造を模式的に示す平面図である。 細胞培養チップの別の実施形態の構造を模式的に示す断面図である。 細胞培養チップの別の実施形態の構造を模式的に示す断面図である。 細胞培養チップの別の実施形態の構造を模式的に示す平面図である。 細胞培養チップの別の実施形態の構造を模式的に示す平面図である。 細胞培養チップの別の実施形態の構造を模式的に示す平面図である。 細胞培養チップの別の実施形態の構造を模式的に示す平面図である。 細胞培養チップの別の実施形態の構造を模式的に示す平面図である。 従来のマイクロ流路チップの構造を模式的に示す斜視図である。 従来のマイクロ流路チップの構造を模式的に示す断面図である。 従来のマイクロ流路チップから培養液を吸引する場合において、培養液の残量の変化を模式的に示す図面である。
　本発明に係る細胞培養チップの実施形態につき、図面を参照して説明する。なお、以下の各図面はあくまで模式的に図示されたものである。すなわち、図面上の寸法比と実際の寸法比とは必ずしも一致しておらず、また、各図面間においても寸法比は必ずしも一致していない。
　図１は、細胞培養チップの一実施形態の構造を模式的に示す平面図である。図２は、図１に示す細胞培養チップ１を、図１内のＡ１－Ａ１線で切断したときの模式的な断面図である。なお、以下において、図１は、細胞培養チップ１をＹ方向から見たときのＸＺ平面図に対応し、図２は、細胞培養チップ１をＸＹ平面で切断したものをＺ方向から見たときのＸＹ平面図に対応するものとして説明する。
　細胞培養チップ１は、底部３と基体部５とを備える。基体部５は、底部３とは反対側の面（主面５ａ）の一部から、底部３に向かってＹ方向に開口された第一ウェル１０及び第二ウェル２０を備える。すなわち、第一ウェル１０は、基体部５の主面５ａ側に開口面１０ａを有し、底部３に向かってＹ方向に開口されている。同様に、第二ウェル２０は、基体部５の主面５ａ側に開口面２０ａを有し、底部３に向かってＹ方向に開口されている。すなわち、Ｙ方向が「第一方向」に対応する。
　第一ウェル１０の開口面１０ａと第二ウェル２０の開口面２０ａとは、基体部５の主面５ａに平行な方向に離間した位置に配置されている。ここでは、両者が相互にＸ方向に離間した位置に配置されているものとして説明する。この場合、Ｘ方向が「第二方向」に対応する。なお、第一ウェル１０の開口面１０ａと、第二ウェル２０の開口面２０ａとは、Ｚ方向に離間していても構わないし、Ｘ方向且つＺ方向に離間していても構わない。「第二方向」とは、第一ウェル１０の開口面１０ａから第二ウェル２０の開口面２０ａに向かう方向に対応する。
　基体部５は、底部３側の位置において管状の凹部を有しており、この凹部と底部３とで挟まれた領域によってチャンバ７が形成されている。本実施形態では、チャンバ７が細胞を培養する空間を構成する。
　本実施形態において、チャンバ７は、一方の端部が連絡用ウェル１９を介して第一ウェル１０に連絡されており、他方の端部が連絡用ウェル２９を介して第二ウェル２０に連絡されている。なお、連絡用ウェル１９は、第一ウェル１０とＹ方向に連絡されており、底部３が連絡用ウェル１９の底面を構成している。同様に、連絡用ウェル２９は、第二ウェル２０とＹ方向に連絡されており、底部３が連絡用ウェル２９の底面を構成している。
　本実施形態において、第一ウェル１０及び第二ウェル２０は、主面５ａよりも底部３に近い側の位置において、底部３に近づくに連れて開口径が増加することなく減少する領域を有する。この点につき、図３を参照して説明する。図３は、図２の第一ウェル１０の近傍を拡大した図面である。
　図３に示すように、第一ウェル１０は、基体部５の主面５ａよりも底部３に近い側の位置において、底部３に近づくに連れて、すなわち＋Ｙ方向に進むに連れて、開口径１０ｂが増加することなく減少している。この領域を、以下では「縮径領域１１」と称する。なお、本実施形態では、第一ウェル１０は、縮径領域１１よりも基体部５の主面５ａに近い側の位置においては、開口径１０ｂが実質的に均一である。すなわち、第一ウェル１０は、縮径領域１１内において内壁１０ｃが傾斜面を構成する。
　図４は、本実施形態の細胞培養チップ１内に培養液３０が充填された状態を模式的に示す図面である。図示の都合上、図４では、培養液３０が存在する領域にハッチングを施し、底部３及び基体部５にはハッチングを施していない。以下の図面においても、培養液３０の存在する領域を明示する場合には、同様の方法で図示される。
　細胞培養チップ１に対して培養液３０を充填するに際しては、第一ウェル１０側又は第二ウェル２０側から培養液３０が注入される。例えば第一ウェル１０側から培養液３０が注入されることで、この培養液３０は、連絡用ウェル１９、チャンバ７を介して第二ウェル２０側へと流入する。細胞培養チップ１内に培養液３０が所定量以上注入されることで、第一ウェル１０と第二ウェル２０との間に位置するチャンバ７内が培養液３０で充填される。これにより、チャンバ７内で細胞の培養を行うことができる。
　図４に示すように、細胞培養チップ１に培養液３０が充填された状態から、ピペット３１を用いて培養液３０を抜き出す場合の態様について、説明する。以下では、第一ウェル１０側からピペット３１を用いて培養液３０を吸引することで、培養液３０が抜き出される場合について説明する。
　図５Ａ～図５Ｃは、ピペット３１を用いて培養液３０を吸引している状態を模式的に示した図面である。図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃの順に培養液３０の吸引が進行している態様が示されている。
　ピペット３１の先端を第一ウェル１０内に挿入し、吸引動作を開始すると、培養液３０の液面が徐々に低下し始め（図５Ａ参照）、やがて縮径領域１１内にまで低下する（図５Ｂ参照）。その後、更に吸引動作を継続すると、培養液３０の液面が連絡用ウェル１９内にまで低下する（図５Ｃ参照）。なお、第一ウェル１０内に貯留されていた培養液３０を完全に吸引できる吸引力以上であって、所定の吸引力以下の範囲内の吸引力のまま、吸引動作を継続すると、培養液３０の液面が更に低下し、やがて底部３が露出する（図５Ｃ参照）。このとき、連絡用ウェル１９内のコーナ部分に培養液３０の液溜まりが形成される（符号３０ａ）。しかし、これ以上吸引動作を継続しても、培養液３０の吸引が進行しない。
　すなわち、本実施形態の構成によれば、第一ウェル１０内に貯留されていた培養液３０の吸引が完了した直後の時点において、チャンバ７から培養液３０が第一ウェル１０側に向かって流入されることがない。そして、一定の吸引力のままでピペット３１からの吸引動作を継続したとしても、培養液３０の吸引が進行しない。
　このような現象が生じた理由につき、本発明者は以下のように考えている。
　図６は、従来のマイクロ流路チップ１００に充填されていた培養液１３０を吸引している状態を模式的に示す図面であり、図１５（ｃ）と実質的に同一の図面である。
　流入口１１１（以下、ここでは「開口部１１１」と記載する。）のコーナ部分の角度をφ、前記コーナ部分に貯留する培養液１３０（１３０ａ）のメニスカスがコーナ部分に接触している箇所の両端間の距離をＤ１とすると、培養液１３０ａのメニスカスに生じる毛細管力Ｐ１は、以下の（１）式によって表される。なお、下記（１）式内において、γは表面張力、θは培養液１３０（１３０ａ）の接触角を示す。
　Ｐ１≒２・γcos（θ＋φ／２）／（Ｄ１／２）　・・・・（１）
　一方、溝１１０の内径をＤ２とすると、溝１１０内に貯留されている培養液１３０（１３０ｂ）のメニスカスに生じる毛細管力Ｐ２は、同様にγ及びθを用いて、以下の式で表される。ただし、下記（２）式では、溝１１０が平行に向かい合う内壁面を有しており、培養液１３０ｂのメニスカスが接触している箇所の両端間の角度は０°であるため、φ成分が０であるものとして計算している。
　Ｐ２≒２・γcos（θ）／（Ｄ２／２）　・・・・（２）
　例えば、培養液１３０の接触角θを２０°とし、溝１１０の内径Ｄ２を４００μｍとすると、培養液１３０ａのメニスカスが開口部１１１のコーナ部分に接触している箇所の両端間の距離Ｄ１≒１８０μｍのときに、Ｐ１＝Ｐ２を満たす。言い換えれば、前記距離Ｄ１＜１８０μｍの場合には、培養液１３０ａのメニスカスに生じる毛細管力Ｐ１は、溝１１０内に貯留されている培養液１３０ｂのメニスカスに生じる毛細管力Ｐ２よりも大きく、Ｐ１＞Ｐ２となる。
　このことは、図６に示す従来のマイクロ流路チップ１００において、開口部１１１から培養液１３０ａを取り出すべく、開口部１１１のコーナ部分に残存していた培養液１３０ａを吸引しようとすると、前記培養液１３０ａは吸引されずに、溝１１０内の培養液１３０ｂの方が吸引されてしまうことを意味する。この状態は、図１５（ｄ）を参照して上述した事実に合致する。
　この事実を踏まえると、図３に示す構造において、チャンバ７内の培養液３０のメニスカスの毛細管力よりも、第一ウェル１０のコーナ部分に貯留される培養液３０のメニスカスの毛細管力を小さくすることで、第一ウェル１０内の培養液３０を全て吸引できる程度の吸引力で吸引しても、チャンバ７側から培養液３０を流出させることが防止できることが分かる。
　ここで、図３を参照して上述したように、本実施形態の細胞培養チップ１は、第一ウェル１０の底部３側において、＋Ｙ方向に進行するに連れて開口径１０ｂが減少する縮径領域１１を備えている。この縮径領域１１内におけるコーナ部分のコーナ角φは、図５Ｂに示すように鈍角となり、図６に示す従来のマイクロ流路チップの開口部１１１と比べて大きい。この結果、上記（１）式内のcos（θ＋φ／２）の値が低下する。従って、図５Ｂの状態において、縮径領域１１内におけるコーナ部分に貯留される培養液３０のメニスカスに生じる毛細管力Ｐ１の値は、図６に示す従来構造における、開口部１１１のコーナ部分に貯留される培養液１３０（１３０ａ）のメニスカスに生じる毛細管力Ｐ１の値よりも低下する。
　この結果、縮径領域１１内におけるコーナ部分に貯留される培養液３０のメニスカスに生じる毛細管力Ｐ１は、チャンバ７内の培養液３０のメニスカスの毛細管力Ｐ２よりも小さい値となる。これにより、図５Ｂの状態からピペット３１で培養液３０の吸引を持続しても、第一ウェル１０のコーナ部分に培養液３０を貯留することなく、培養液３０の吸引が継続され、図５Ｃに示す状態へと進行させることができる。
　ところで、本実施形態の細胞培養チップ１は、連絡用ウェル１９を備えており、この連絡用ウェル１９のコーナ部分のコーナ角は、例えば、従来のマイクロ流路チップ１００の開口部１１１と同様に、ほぼ９０°であるものとしてもよい。この場合、図５Ｂの状態から吸引動作を継続すると、連絡用ウェル１９のコーナ部分に培養液３０（３０ａ）が貯留された状態となる。しかし、図５Ｃの状態よりも前の状態において、少なくとも第一ウェル１０内の培養液３０については完全に除去ができているため、この時点で吸引動作を終了し、交換用の新たな培養液を第一ウェル１０側から導入することが可能である。
　培養液３０の接触角θと、チャンバ７の高さを既定した場合において、第一ウェル１０の縮径領域１１内における内壁１０ｃをＺ方向から見たときの傾斜面の長さＤ（面取り部の長さ）の好ましい最小値は、以下の表１に示すとおりである。縮径領域１１内における内壁１０ｃを、表に記載された値よりも大きい傾斜面とすることで、第一ウェル１０内のコーナ部分の毛細管力をチャンバ７の毛細管力よりも低下させることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　具体的な細胞培養チップ１の寸法例は、以下の通りである。
　・基体部５の高さ（Ｙ方向に係る長さ）は、１ｍｍ以上、２０ｍｍ以下であり、一例として３ｍｍである。
　・底部３の高さ（Ｙ方向に係る長さ）は、０．１ｍｍ以上、５ｍｍ以下であり、一例として１ｍｍである。
　・チャンバ７の高さ（Ｙ方向に係る長さ）は、２００μｍ以上、２０００μｍ以下であり、一例として４００μｍである。
　・第一ウェル１０の開口面１０ａ側における開口径１０ｂは、０．５ｍｍ以上、４０ｍｍ以下であり、一例として２ｍｍである。
　・第一ウェル１０のうち、縮径領域１１内の開口径１０ｂの最小値は、０．５ｍｍ以上、４０ｍｍ以下であり、一例として１．７５ｍｍである。また、この縮径領域１１内における内壁１０ｃをＺ方向から見たときの傾斜面の長さは、２０μｍ以上、２０００μｍ以下であり、一例として１８０μｍである。
　・連絡用ウェル１９の開口径は、０．２ｍｍ以上、３９ｍｍ以下であり、一例として１．７５ｍｍである。また、連絡用ウェル１９の高さ（Ｙ方向に係る長さ）は、０．２ｍｍ以上、３ｍｍ以下であり、一例として０．６ｍｍである。
　・第一ウェル１０の中心軸と第二ウェル２０の中心軸との離間距離は、２ｍｍ以上、４０ｍｍ以下であり、一例として９ｍｍである。
　・第二ウェル２０の開口面２０ａ側における開口径は、０．５ｍｍ以上、４０ｍｍ以下であり、一例として１ｍｍである。
　・第二ウェル２０のうち、縮径領域内の開口径の最小値は、０．５ｍｍ以上、４０ｍｍ以下であり、一例として０．７５ｍｍである。また、この縮径領域１１内における内壁１０ｃをＺ方向から見たときの傾斜面の長さは、２０μｍ以上、２０００μｍ以下であり、一例として１８０μｍである。
　・連絡用ウェル２９の開口径は、０．２ｍｍ以上、３９ｍｍ以下であり、一例として０．７ｍｍである。また、連絡用ウェル１９の高さ（Ｙ方向に係る長さ）は、０．２ｍｍ以上、２０００ｍｍ以下であり、一例として０．６ｍｍである。
　（変形例）
　本実施形態の細胞培養チップ１は、種々の変形が可能である。以下、説明する。
　〈１〉上述した本実施形態の細胞培養チップ１は、第二ウェル２０側においても、第一ウェル１０の縮径領域１１と同様の縮径領域を有する構造であった。これにより、第二ウェル２０側からピペット３１によって培養液３０を吸引した場合であっても、同様の理由により、チャンバ７内に培養液３０を貯留させたままの状態で第二ウェル２０内の培養液を除去することが可能である。ただし、本発明は、一方のウェル（第一ウェル１０／第二ウェル２０）側にのみ縮径領域を有する構造を排除しない。
　〈２〉図３には、細胞培養チップ１が縮径領域１１内における第一ウェル１０の内壁１０ｃが平坦面である場合が図示されている。しかし、第一ウェル１０のコーナ部分における毛細管力を低下させる観点からは、必ずしも当該内壁１０ｃが平坦面である必要はなく、曲面で構成されていても構わない。図７は、縮径領域１１内における第一ウェル１０の内壁１０ｃが曲面で構成されている場合における、第一ウェル１０の近傍の構造を、図３にならって模式的に示した図面である。
　〈３〉図２及び図３には、第一ウェル１０が、縮径領域１１内において開口径１０ｂが中心軸に対して対称性を有して減少する態様である場合について図示されている。しかし、縮径領域１１内における中心軸と、縮径領域１１よりも基体部５の主面５ａ側における中心軸が異なることで、第一ウェル１０が偏心した形状を呈していても構わない。図８及び図９は、かかる構造を示す細胞培養チップ１につき、それぞれ、図１及び図２にならって図示したものである。なお、この態様において、図７のように縮径領域１１内における内壁が曲面からなるものとしても構わないし、縮径領域１１が第一ウェル１０にのみ存在し、第二ウェル２０側には縮径領域を有しないものとしても構わない。
　〈４〉図１０に示すように、細胞培養チップ１は、連絡用ウェル（１９／２９）を備えないものとしても構わない。かかる構成においても、第一ウェル１０は、縮径領域を備えているため、上述した理由により、チャンバ７側から培養液３０を実質的に吸引することなく、第一ウェル１０内の培養液３０を除去することができる。
　ただし、図２に示したように、細胞培養チップ１が連絡用ウェル（１９／２９）を備えることで、当該箇所に位置する基体部５には、連絡用ウェル（１９／２９）の高さ相当分の厚み（肉厚）が確保される。このため、細胞培養チップ１の製造時に、安定的な成型を可能にするという観点からは、連絡用ウェル（１９／２９）を備えるのが好ましい。
　〈５〉図１１に示すように、細胞培養チップ１が備えるチャンバ７は、実質的に細胞を培養する空間を構成する培養チャンバ７ａと、この培養チャンバ７ａと各ウェル（１０／２０）とを連絡する、培養チャンバ７ａよりも開口径の狭い連絡用流路（７ｂ／７ｃ）とを含む構成としても構わない。この場合、第一ウェル１０の毛細管力が、連絡用流路７ｂの毛細管力よりも小さくなるように、縮径領域１１が形成されているものとすればよい。
　なお、図１及び図２に示した細胞培養チップ１の構造においては、上述したように、チャンバ７が細胞を培養する空間を構成する。すなわち、チャンバ７が培養チャンバに対応する。
　［別実施形態］
　以下、別実施形態につき説明する。
　〈１〉上記実施形態において、細胞培養チップ１が備える底部３と基体部５とは別部材からなるものとして説明したが、底部３と基体部５とは同一部材が一体成型されることで構成されていても構わない。
　〈２〉図３を参照して説明した細胞培養チップ１が有する第一ウェル１０は、縮径領域１１よりも基体部５の主面５ａに近い側の位置では開口径１０ｂが実質的に均一であるものとした。しかし、第一ウェル１０は、開口面１０ａから底部３側に向かう全体にわたって、開口径１０ｂが減少する縮径領域１１を有する構造であってもよい。
　〈３〉上記各実施形態の細胞培養チップ１によれば、内部に充填されていた培養液３０を、チャンバ７内に培養液３０を留めながら第一ウェル１０側又は第二ウェル２０側から抜き出すことを可能にすることについて説明した。しかし、チャンバ７内に留めながらも細胞培養チップ１から抜き出す対象となる内容物については、培養液３０に限定されず、液体であればよい。
　〈４〉上記実施形態において、細胞培養チップ１から培養液３０を吸引する際にピペット３１を用いる場合を例示して説明したが、吸引方法はピペット３１に限定されない。本発明の細胞培養チップ１は、一方のウェル（例えば第一ウェル１０）側に吸引器具の先端を配置し、当該ウェル内に貯留されている培養液３０を吸引するその他の一般的な方法を採用することが可能である。
　〈５〉上記実施形態では、一対のウェル（１０，２０）がチャンバ７によって連絡されてなる細胞培養チップ１について説明した。しかし、本発明の細胞培養チップ１において、ウェルの数やチャンバの数は限定されない。
　図１２Ａ～図１２Ｄは、別実施形態の細胞培養チップ１を、図１にならって模式的に図示した平面図である。
　図１２Ａに示す細胞培養チップ１は、３つのウェル（１０，２０，４１）が直列的に形成されており、それぞれのウェル間を連絡するように、チャンバ（７，７）が形成されている。図１２Ｂに示す細胞培養チップ１は、３つのウェル（１０，２０，４１）が形成されている。ただし、図１２Ａに示す細胞培養チップ１とは異なり、ウェル１０とウェル２０とを連絡するチャンバ７と、ウェル１０とウェル４１とを連絡するチャンバ７とが相互に連絡されている。
　図１２Ｃに示す細胞培養チップ１は、４つのウェル（１０，２０，４１，４２）を備えており、ウェル１０とウェル２０とを連絡するチャンバ７、ウェル１０とウェル４１とを連絡するチャンバ７、ウェル１０とウェル４２とを連絡するチャンバ７が、それぞれ独立して形成されている。
　図１２Ｄに示す細胞培養チップ１は、６つのウェル（１０，２０，４１，４２，４３，４４）を備えており、隣接するウェル同士を連絡するようにチャンバ７が形成されている。ただし、各チャンバ７によって、全てのウェル（１０，２０，４１，４２，４３，４４）が直列的に環状に連絡されている。
　図１２Ａ～図１２Ｄの各図に示される細胞培養チップ１においても、ウェル（１０，２０，４１，４２，４３，４４）の毛細管力が、チャンバ７の毛細管力よりも低い形状を呈している。より具体的な構造の例については、上述した実施形態と共通であるため、説明を割愛する。
　〈６〉上記図２を参照して説明した細胞培養チップ１において、連絡用ウェル（１９，２９）は、各ウェル（１０，２０）とチャンバ７との間をＹ方向に連絡するものとして説明した。しかし、連絡用ウェル（１９，２９）は、各ウェル（１０，２０）とチャンバ７とを基体部５の主面５ａに平行な方向（例えばＸ方向）にも連絡するように形成されていても構わない。すなわち、チャンバ７の端部がウェル（１０，２０）の直下には配置されておらず、連絡用ウェル（１９，２９）がＸ方向にも延在することで、ウェル（１０，２０）とチャンバ７とを連絡するように形成されていても構わない。
　　　　１　　　：　　細胞培養チップ
　　　　３　　　：　　底部
　　　　５　　　：　　基体部
　　　　５ａ　　：　　基体部の主面
　　　　７　　　：　　チャンバ
　　　　７ａ　　：　　培養チャンバ
　　　　７ｂ，７ｃ　　　：　　連絡用流路
　　　１０　　　：　　第一ウェル
　　　１０ａ　　：　　第一ウェルの開口面
　　　１０ｂ　　：　　第一ウェルの開口径
　　　１０ｃ　　：　　第一ウェルの内壁
　　　１１　　　：　　縮径領域
　　　１９　　　：　　連絡用ウェル
　　　２０　　　：　　第二ウェル
　　　２０ａ　　：　　第二ウェルの開口面
　　　２９　　　：　　連絡用ウェル
　　　３０，３０ａ　　　：　　培養液
　　　３１　　　：　　ピペット
　　　４１，４２，４３，４４　　　　：　　ウェル
　　１００　　　：　　従来のマイクロ流路チップ
　　１０１　　　：　　基材
　　１０２　　　：　　樹脂フィルム
　　１１０　　　：　　溝
　　１１１　　　：　　流入口
　　１１２　　　：　　流出口
　　１２０　　　：　　ピペット
　　１３０，１３０ａ　　　：　　培養液

Claims (10)

  1. 　底部と、
    　前記底部の上面に形成された基体部と、
    　前記基体部の前記底部とは反対側の面である主面の一部から前記底部に向かう第一方向に前記基体部を開口されてなる、第一ウェルと、
    　前記第一ウェルに対して前記主面に平行な第二方向に離間した位置において、前記第一方向に前記基体部を開口されてなる第二ウェルと、
    　前記底部と前記基体部とで挟まれた領域によって、前記第一ウェルと前記第二ウェルとを前記第二方向に連絡する管状のチャンバとを有し、
    　前記第一ウェルは、前記第一ウェルの毛細管力が前記チャンバの毛細管力よりも低い形状を呈することを特徴とする、細胞培養チップ。
  2. 　前記第一ウェルは、前記基体部の前記主面よりも前記底部に近い位置において、前記底部に近づくに連れて開口径が増加することなく連続的に減少する縮径領域を有することを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養チップ。
  3. 　前記第一ウェルは、前記基体部からなる内壁を有してなり、
    　前記内壁は、前記第一ウェルの前記縮径領域において曲面又は前記主面とは非平行な平面を含むことを特徴とする、請求項２に記載の細胞培養チップ。
  4. 　前記第一方向に関して前記第一ウェルに連続して形成され、前記第一ウェルの前記縮径領域と前記チャンバとを前記第一方向に連絡する、連絡用ウェルを有し、
    　前記連絡用ウェルは、前記底部を底面とし、開口径が前記第一ウェルの前記縮径領域よりも狭いことを特徴とする、請求項２又は３に記載の細胞培養チップ。
  5. 　前記第一ウェルの底面が前記底部からなることを特徴とする、請求項２又は３に記載の細胞培養チップ。
  6. 　前記第二ウェルは、前記第二ウェルの毛細管力が前記チャンバの毛細管力よりも低い形状を呈することを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養チップ。
  7. 　前記第二ウェルは、前記基体部の前記主面よりも前記底部に近い位置において、前記底部に近づくに連れて開口径が増加することなく連続的に減少する縮径領域を有することを特徴とする、請求項６に記載の細胞培養チップ。
  8. 　底部と、
    　前記底部の上面に形成された基体部と、
    　前記基体部の前記底部とは反対側の面である主面の一部から前記底部に向かう第一方向に前記基体部を開口されてなる、第一ウェルと、
    　前記第一ウェルに対して前記主面に平行な第二方向に離間した位置において、前記第一方向に前記基体部を開口されてなる第二ウェルと、
    　前記底部と前記基体部とで挟まれた領域によって、前記第一ウェルと前記第二ウェルとを前記第二方向に連絡する管状のチャンバとを有し、
    　前記第一ウェルは、前記基体部の前記主面よりも前記底部に近い位置において、開口径が増加することなく連続的に減少する縮径領域を有することを特徴とする、細胞培養チップ。
  9. 　前記第一ウェルは、前記基体部からなる内壁を有してなり、
    　前記内壁は、前記第一ウェルの前記縮径領域において曲面又は前記主面とは非平行な平面を含むことを特徴とする、請求項８に記載の細胞培養チップ。
  10. 　前記第二ウェルは、前記基体部の前記主面よりも前記底部に近い位置において、開口径が増加することなく連続的に減少する縮径領域を有することを特徴とする、請求項８又は９に記載の細胞培養チップ。
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