CN110869486B - 微组织区室装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微组织区室装置，其包括区室结构(1)，所述区室结构(1)具有以下：上表面(2)以及与其基本上共面的下表面(3)，以及适合于容纳液体体积中的一种或多种微组织(5)的至少两个孔(4)，每个孔具有含有给定直径的下部区段(4a)，与其同轴地定向的具有扩大直径的上部区段(4b)，以及将至少两个孔彼此流体连接的至少一个导管(6)，以及布置在孔上方的至少一个空间(13)。至少一个孔在其上部区段具有溢流结构(9)，所述溢流结构防止所述孔中包含的液体体积扩散或溢流到空间(13)内(图4A)。

Description

微组织区室装置
技术领域
本发明涉及3D组织培养及其在药物测试中的应用领域。
背景技术
3D组织培养越来越多地用于测试或筛选化合物的毒性、免疫原性或疗效。在一个具体实施方案中，使彼此连接的一系列不同或相似的3D组织培养物暴露于相同的测试化合物，以(i)调查化合物对不同组织之一具有的不同效应，并且(ii)能够考虑响应此类暴露，在不同组织之间的潜在通讯或串扰。
这些装置有时被称为“芯片上的器官(organ-on-a-chip)”，甚至被称为“芯片上的生物”或“芯片上的机体”。最近，它们被概括为“微生理系统”。微生理系统将微流体技术与细胞/组织培养组合，并且能够以目的定义在最小生物学可接受规模下，在体外模拟人(或任何其它动物物种的)生物学。
存在根据其公开的许多装置和方法，例如，微组织球状体可以在芯片内部形成，并且在一段时间内处于流动下在其中进行培养。参见Ruppen等人(2015)，Occhetta等人(2015)，Kwapiszewska等人(2014)，Jin等人(2011)，Hsiao等人(2009)，Torisawa等人(2007)或Wu等人2008)。
然而，仅存在少数几种，其中通过使用专用平台在外部形成微组织球状体，然后才将其转移且装载到微流体培养芯片内。
在这些实施方案中，微组织球状体或吸取成大(就微组织的大小而言大)储库(也称为穿透小室(trans-well)，Maschmeyer等人2015)，或使用专门设计的微流体结构进行捕获(Ruppen等人，2014)。
首先，储库具有相对较大的体积，并且如果球状体相互接触，在一段时间内形成较大的组织团块，则存在球状体合并的风险。第二点相当麻烦，取决于流动并且难以施加用于常规使用。球状体的卸载很困难，如果没有破坏则是不可能的。
Kim等人(2015，2016)公开了垂直于微流体通道的装载通道，微组织通过所述装载通道被引导到微区室内。在这个装置中，必须将平台倾斜以将球状体向前推入区室内，所述球状体非固定地位于其中。在一段时间内，球状体可以在培养期间逃逸回到装载通道内，该装载通道构成相对较大的死体积，并且球状体不能直接接近，且因此难以卸载。装载通道通过插入装载端口内的销钉封闭。这是手动的、非自动化的过程，易于将气泡引入系统内，由于在引入过程中的泵效应而置换微组织球状体，并且具有由于并非完全紧密配合而泄漏的风险。
相同的考虑因素适用于类器官，其是在体外产生的器官的微型化和简化版本，且意欲模拟器官的微观解剖学，以及精密组织切片(precision cut tissue slice)，其是组织的离体的活外植体，具有可复制性、明确定义的厚度，以及3D组织球状体、拟胚体和小岛状物。
为此，在下文中将微组织球状体、类器官精密组织切片、3D组织球状体、拟胚体和小岛状物称为“微组织”。本文关于微组织球状体的所有公开内容和结论同样确实适用于类器官和精密组织切片。
发明内容
本发明的一个目的是提供允许同步培养两种或更多种微组织，并且使其同步暴露于一种或多种测试化合物的装置，所述装置允许微组织简单无误且自动化兼容地沉积在各个培养孔中，并且将其取出用于下游分析。
本发明的另一个目的是提供允许在两个或更多个微组织区室之间的连续或变化以及单向或双向流动条件下，在微组织区室中培养微组织的装置。
本发明的另一个目的是提供允许同步培养两种或更多种微组织，并且使其同步暴露于一种或多种测试化合物的装置，所述装置可以是预制的，并且在装置运送至第三方之前，预装载有合适的微组织。
这些和进一步目的通过独立权利要求的主题来实现，而从属权利要求以及说明书公开了进一步的优选实施方案。
具体实施方式
在详细描述本发明之前，应理解，本发明并不限于所述装置或组合物的特定组成部分或结构特征、或者所述方法的工艺步骤，因为此类装置和方法可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不预期是限制性的。某些措施在互不相同的从属权利要求中叙述的简单事实并不指示不能有利地使用这些措施的组合。权利要求中的任何参考标记都不应该被解释为限制范围。必须注意，如在说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括单数和/或复数指示物，除非上下文另外明确说明。进一步地，在权利要求中，词语“包括”并不排除其它元件或步骤。某些措施在互不相同的从属权利要求中叙述的简单事实并不指示不能有利地使用这些措施的组合。
此外应理解，在给出由数值限定的参数范围的情况下，该范围被认为包括这些限制值。
进一步应理解，本文公开的实施方案并不意味着应理解为并非彼此相关的各个实施方案。与一个实施方案讨论的特征意欲还与本文所示的其它实施方案结合进行公开。如果在一种情况下，特定特征并未由一个实施方案公开，而是由另一个实施方案公开，则本领域技术人员将理解，这不一定意味着所述特征并不意欲由所述另一个实施方案公开。本领域技术人员将理解，本申请的要旨是还对于其它实施方案公开所述特征，但仅出于清楚的目的并且将说明书保持在可管理的范围内，这尚未完成。
此外，本文提及的现有技术文件的内容引入作为参考。这特别指的是针对公开标准或常规方法的现有技术文件。在那种情况下，引入作为参考具有提供足够的实现性公开内容的主要目的，并且避免冗长的重复。
根据本发明的一个实施方案，提供了微组织区室装置，其包括区室结构，所述区室结构具有以下：
(i)上表面以及与其基本上共面的下表面，和
(ii)适合于容纳液体体积中的一种或多种微组织的至少两个孔，每个孔具有
a)具有给定直径的下部区段，
b)与其同轴地定向的具有扩大直径的上部区段，和
(iii)将至少两个孔彼此流体连接的至少一个导管，和
(iv)布置在孔上方的至少一个空间。
至少一个孔在其上部区段具有溢流结构(relief structure)，所述溢流结构防止所述孔中包含的液体体积扩散或溢流到孔上方的所述空间内。
上部区段可以优选地采取漏斗样形状，而下部区段4a可以优选地具有圆形或椭圆形的横截面。
此类溢流结构可以包括不可润湿的区域(即，包括疏水区域、或配备有莲花效应的区域)或防溢边缘。通过液体的表面张力或毛细管钉扎，以及液体与溢流结构的表面之间的内聚力来防止溢流。
孔的上部区段的扩大直径充当装载端口，通过所述装载端口，微组织可以借助于合适的移液器、移液器阵列或移液机器人分配或转移到孔内。
根据本发明的一个实施方案，该装置进一步包括至少一个导管，所述至少一个导管将孔上方的至少一个空间连接到邻近孔上方的另一个空间或外部。这些导管作用于允许气体介质在不同的孔之间循环，并且允许孔上方的不同空间之间的压力平衡。
根据一个实施方案，将球状体装载到移液器尖端内，并且通过重力使其沉降到移液器尖端。然后将尖端置于漏斗内。移液器尖端中的液体与腔室中的液体合并，并且球状体仅通过重力落入腔室内。
漏斗样形状帮助移液器尖端相对于下部区段的可靠定位和居中。这促进手动移液以及移液器阵列或移液机器人的使用。最初将微组织拾取到移液器尖端内。为了转移，将含有“微组织”的移液器尖端垂直置于漏斗内部，使得移液器尖端中的液体和漏斗中的液体合并。微组织通过重力沉降，并且从移液器尖端掉落入微组织区室内，或者被主动吸取到微组织区室内
这允许无需液体转移的微组织转移，并且进一步帮助将携带污染降到最低，减少对转移的微组织的应力，避免对邻近微组织的影响，并且允许独立和平行的微组织装载。
当孔的上部区段和/或孔的下部区段和/或孔上方的空间同轴布置时，这一过程甚至更得到促进。
如下文所述，可以使用上部区段上的专用塞子无缝地关闭装载端口，或在适当的距离处将其打开且盖上，使得液-气界面限定孔的体积。
如本文使用的，术语“微组织”意欲涵盖3D细胞培养模型，包括类器官、3D组织球状体、拟胚体、小岛状物、精密组织切片等等。微组织可以具有天然起源，或者可以从分离的细胞进行工程改造或被动地或主动地重新组装。
这种构造具有超过来自现有技术(Kim等人2015)的装置的几个优点，所述装置提供了大型漏斗样装载端口，所述装载端口连接到L形装载通道，所述装载通道最终通向微组织区室：
(i)通过用从顶部垂直接近的移液器直接沉积，孔中微组织的沉积是简单且稳固的，并且无需进一步的步骤，如微组织的倾斜或重新放置。微组织自动地落入其在孔中的正确位置。对于微组织装载，根据Kim等人2015的装置需要倾斜，使得重力将微组织通过其区室中的装载通道转移，带来堵塞和/或溢出的风险。进一步地，这一过程是耗时的，并且与自动化系统不直接兼容，并且难以并行化。
(ii)微组织的沉积是重力驱动的，并且无需液体流的施加，使得从移液器到装置的培养基转移是最低限度的，将交叉污染降到最低，并且将邻近区室中的流动降到最低，最终对微组织有害。
(iii)由于沿着孔的垂直轴提供了清晰的光路，因此该装置可以容易地置于显微镜台上用于微组织检查。
(iv)该装置具有降到最低的死体积，因而确保所施加的测试液体可以快速交换，冲洗有效，所施加的液体不被稀释，和/或微组织对其的暴露被延迟、或阻碍或受人工假象影响。
(v)液-气界面限定了“微组织”区室的上边界，使得区室可直接由移液器接近，并且一旦移液器再次移开就具有“自密封”机制，且液-气界面重新建立。不需要另外的机械盖子或塞子，其通常是类似种类的所有现有技术系统中所需要的。
(v)开放的顶部构造允许直接和局部氧交换，并且避免了气泡的截留或发展，所述气泡干扰了微组织培养和液体流动。与其形成对比，根据Kim等人2015的构造具有截留气泡的风险，并且此外约束了区室中的氧交换。
(vi)开放的顶部构造进一步允许通过将其抽吸到移液器尖端内，来简单地取出微组织(取决于设计，取出1-20μL体积)。
在一个实施方案中，该装置进一步包括具有上表面以及与其基本上共面的下表面的基部结构，所述基部结构可释放地或不可释放地附接到区室结构的下表面。
在这个实施方案中，微组织区室装置基本上包括两个部分，即区室结构和基部结构。基部结构形成区室结构的孔的底部，即，在微组织区室中形成的孔是开放式末端的，并且本身没有底部。
此类两部分结构可以例如通过合适材料的压铸、模制、压花或3D打印方法来产生，合适材料例如热塑性塑料包括聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)等。
一般地，该装置也可以是单部分结构，即不含分开的基部结构。此类单部分结构可以例如通过3D打印产生。
在根据本发明的装置的一个实施方案中，至少一个导管或在区室结构中或在任选的基部结构中提供。
优选地，至少一个导管基本上由通过两个侧壁限定的纵向沟槽组成。
在具有布置在区室结构中的导管的第一实施方案中，将导管布置在区室结构的下表面上，而基部结构仅形成导管的底部。
在具有布置在基部结构中的导管的第二实施方案中，当两者彼此附接时，将导管布置在基部结构的上表面上，而区室结构的下表面形成导管的顶板。
在根据本发明的装置的一个实施方案中，至少一个孔的上部区段是基本上漏斗形的，其直径在向上的方向上延伸。
这种布置促进孔的装载，其可以通过使用漏斗结构以非常简单的方式实现：将球状体装载到移液器尖端内，并且通过重力使其沉降到移液器尖端。然后将尖端置于漏斗内。移液器尖端中的液体与腔室中的液体合并，并且球状体仅通过重力落入腔室内。
漏斗帮助移液器尖端的定位，因为它提供了自动居中结构。这促进手动移液以及移液器阵列或移液机器人的使用。
在根据本发明的装置的一个实施方案中，至少一个孔具有基本上椭圆形或圆形的横截面。
两个实施方案均允许弯曲的液-气界面或液滴在孔的顶部、在与孔上方的空间13的边界处形成，这是由于在孔上方的空间13中的液体和气体介质之间的压力平衡。所述气体介质是例如空气、氧或富含CO2的空气。在本文中，所述气体介质简称为“空气”。弯曲区域增加了液-气界面的尺寸，且因而改善了培养液和周围气体介质之间的气体交换。
在根据本发明的装置的另一个实施方案中，至少一个孔的底部结构-或布置在区室结构中或在基部结构中-具有与孔同心布置或布置在孔内的椭圆形或圆形凹坑。
所述凹坑作用于容纳微组织的下部部分，因而使其居中。以这种方式，促进了显微镜调查，并且使得对液体培养基的暴露更可再现。
在根据本发明的装置的另一个实施方案中，至少一个孔具有从区室结构的下表面向下延伸的至少一个唇状结构，所述唇状结构突出到导管内，并且以这种方式，使流过导管的液体以偏离由导管的纵轴所确定的方向的方向进入孔。以这种方式，避免了液体流直接撞击微组织，其可以使液体流暴露于过高的剪切力和/或导致其错位，且因而阻碍任何测量或对液体中包含的测试试剂的暴露的可再现性。
在根据本发明的装置的另一个实施方案中，区室结构或基部结构包括借助于导管流体地连接到至少一个孔的至少一个储库。
类似于连接孔的导管，所述导管可以或在区室结构中或在基部结构中，在其中它可以基本上由通过两个侧壁限定的纵向沟槽和底部或顶板组成。
在所述储库中，可以提供不同类型的液体培养基：
a)用于培养微组织的培养基
b)用于洗涤微组织、或从整个系统中冲洗出其它培养基的洗涤培养基
c)包含微组织暴露于其的一种或多种测试化合物的测试培养基
通过使储库不被覆盖，可以在每一个所需的时间点对培养基进行采样用于分析。任选地，所述储库可以用密封结构或盖子可逆地关闭，以避免液体的污染或溢出。在这种情况下，分别的密封可以任选地以这样的方式进行，使得它可以由移液管尖端刺穿，使得它无需被取下用于采样。
整个系统的灌注，即培养基通过至少一个孔从至少一个储库到第二储库的转运可以是无泵的。孔具有开放的顶部构造。因此，整个装置可以置于倾斜装置(有时称为“摇杆”)上，使得通过周期性地或永久性地倾斜装置，液体遵循重力的方向通过导管转运。
该系统的灌注可以借助于连接到至少一个导管的外部泵来实现。
如其它地方讨论的，根据本发明的装置提供了在孔的所述溢流结构处建立液-气界面的可能性。液体的表面张力提供了压力屏障，其防止液体扩散到上部空间内并且保存孔作为液体区室的功能。
由于基于摇杆的灌注设置中的流体静力，最下面的孔中出现的液滴将膨胀，而最上面的孔中的液滴将收缩。因而，随着平台的每次倾斜，在微组织区室中出现另外的微型泵送效应，其支持微组织对培养基的暴露，以及区室中的死体积的有效培养基交换，所述效应在其中不存在此类液-气界面的根据本领域的装置中不出现。
优选地，至少一个孔具有≤3mm至≥0.3mm的直径，其中0.4；0.5；0.6；0.7；0.8；0.9；1；1.1；1.2；1.3；1.4；1.5；1.6；1.7；1.8；1.9；2；2.1；2.2；2.3；2.4；2.5；2.6；2.7；2.8或2.9mm为优选直径。
在一个优选实施方案中，导管的高度小于孔中包含的微组织的直径，以便避免将微组织从其孔中冲洗出来。人造微组织通常具有100μm至500μm的直径。
优选地，至少一个导管具有≤1mm至≥0.03mm的高度，其中0.06；0.09；0.12；0.15；0.18；0.21；0.24；0.27；0.3；0.33；0.36；0.39；0.42；0.45；0.48；0.51；0.54；0.57；0.6；0.63；0.66；0.69；0.72；0.75；0.78；0.81；0.84；0.87；0.9；0.93；0.96或0.99为优选高度。
导管的高度例如由包括在区室结构或基部结构中的沟槽侧壁的高度确定。
在根据本发明的装置的另一个实施方案中，该装置包括至少一行3个或更多个孔，其以9mm、4.5mm或2.25mm的网格间距模式彼此间隔开。
术语“以X mm的网格间距模式彼此间隔开”确定所涉及的孔的中心之间的距离。
这遵循如由ANSI标准ANSI SLAS 4-2004(R2012)(以前公认为ANSI/SBS 4-2004)确定的微量滴定板的标准尺度。
板类型 网格间距模式
96 9mm
384 4.5mm
1536 2.25mm
在根据本发明的装置的另一个实施方案中，该装置进一步包括用于从其区室结构的上侧密封孔的一个或多个密封结构。
密封保护微组织，避免污染，避免或减少液体的蒸发。此类密封结构进一步促进了预装载的或空的微组织区室装置的运送，因为它们避免了其污染或者液体或微组织的损失。
优选地，密封结构是选自以下的至少一种：
·插入孔上方的空间内的塞子，和/或
·附接至区室结构的上表面的密封薄膜。
重要的是应理解，这两个实施方案在空的微组织区室装置中，以及在预装载有液体、任选地预装载有微组织的微组织区室装置中均是有意义的。
密封薄膜仅避免液体的蒸发和孔或其内容物的污染。而且，在此类实施方案中，可以维持液-气界面，以确保液相和周围的气体介质之间的气体交换，因而确保例如对于微组织的足够氧供应。进一步地，密封结构与液体之间不存在接触。优选地，所述密封薄膜由透气膜例如硅酮制成。
除此之外，如果塞子深深地插入孔上方的空间内，则可以另外有效地密封孔，以便避免液体的溢出。为了仍然产生足够的氧供应，此类塞子可以包括例如由硅酮制成的透气膜。
优选地，所述塞子被设计为或通过太深地插入孔内、或通过压缩孔上方空间中的气体介质，最低限度地置换孔中的液体。
优选地，密封薄膜或塞子是透明的，以便允许光通过。在这种情况下，微组织可以容易地用就位的密封薄膜或塞子以光学方式检查，并且甚至可以例如在倒置显微镜下用显微镜检查。
优选地，密封薄膜或塞子以这样的方式进行制备，使得它可以用移液管尖端刺穿，使得它无需被取下用于微组织装载或在实验结束时去除。
密封薄膜可以例如由非织造的人造丝材料制成，如例如由Sigma Aldrich以商标名称Breathe-Easier提供，或由聚氨酯制成，如例如由Sigma Aldrich以商标名称Breathe-Easy提供。
根据本发明的另一个方面，提供了适合于设置在与微量滴定板标准兼容的框架结构中的测试条。该测试条容纳根据上文描述的至少一个微组织区室装置或区室结构。
根据本发明的另一个方面，提供了与微量滴定板标准兼容的框架结构，所述框架结构包括根据上文描述的至少一个测试条、或者至少一个微组织区室装置或区室结构。
因而，包括孔和储库的多重测试条或区室结构可以在框架结构中并排对齐，以平行执行实验，即，用不同的测试试剂或不同浓度的相同测试试剂。
术语“与微量滴定板标准兼容的框架结构”确定此类框架遵循ANSI标准SLAS 1-2004(R2012)(以前公认为ANSI/SBS 1-2004)中阐明的规则。
根据本发明的另一个方面，提供了芯片上的模型生物，根据上文描述，所述模型生物包括至少一个微组织区室装置或区室结构、或至少一个测试条、或至少一个框架结构，其中在区室装置的孔中布置两种或更多种不同的微组织。
在此类装置中，将不同类型的(肝、心脏、肿瘤、脑等)微组织在不同的孔中组合，用于多组织构造。所有孔都通过本文讨论的导管彼此连接，并且因而暴露于相同类型的液体。因而，可以测试给定测试组合物对不同组织或器官模型的作用，并且需要时，可以考虑不同组织或器官模型之间的串扰。
在这个实施方案中，多重孔的组合允许产生生理上接近的状况，其反映了测试生物的不同组织的定量关系。例如，在人中，肝脏:心脏的体积比为6:1。为了说明这种定量关系，来自现有技术的装置(US7288405、US8748180)提供了其为心脏区室6倍的肝脏区室，两者经由微通道连接。
本装置提供了大得多的灵活性，因为例如为了反映上文讨论的定量关系，6个孔中可以装载有肝脏微组织，并且1个孔中可以装载心脏微组织。为了反映其它器官对的定量关系，可以相应地改变孔的装载。
在一个实施方案中，此类芯片上的模型生物可以被预制，然后运送给准备使用的最终用户。
根据本发明的另一个方面，提供了测试一种或多种测试化合物对生理系统的潜在生理或毒性作用的方法，所述方法包括：
a)提供根据上文描述的至少一个微组织区室装置或区室结构、或至少一个测试条、或至少一个框架结构、或至少一种芯片上的模型生物，
b)(任选地)将一种或多种微组织装载到由所述微组织区室装置或区室结构、测试条或框架结构提供的孔内，
c)将液体培养基装载到在微组织区室装置或区室结构中提供的至少一个储库内，所述液体培养基包含至少一种测试化合物，并且用液体培养基灌注孔，和
d)监测或分析至少一种微组织和/或采样和分析液体培养基。
在一个实施方案中，当至少一种微组织仍在装置中时，监测或分析它的生长和/或活力。
在这个实施方案中，可以在暴露于至少一种测试化合物期间或之后监测或分析微组织。
肿瘤微组织的增殖和生长速率可以例如通过在倒置显微镜上使用亮视野显微镜检查进行分析，优选地当微组织仍在孔中时。表达荧光标记物的肿瘤细胞可以使用荧光显微镜检查进行分析。进一步地，在这个实施方案中，微组织可顺应高流通量、高含量的扫描分析系统，包括Celligo、Cell3imager等。
可以根据其形态分析肝脏微组织，其中致密的微组织指示良好的活力，而死细胞倾向于离开微组织，或微组织崩解。这可以优选地当微组织仍在孔中时完成。
微组织也可以通过使用例如活/死染色在孔中进行染色，然后在倒置荧光显微镜上进行分析。关于此类活/死染色测定的实例是通过Promega的CellTiter-Blue CellViability Assay。关于此类方法的进一步实例例如显示于Kijanska和Kelm，2016中。
在另一个实施方案中，从装置中取出至少一种微组织用于分析。在这种情况下，可以用不同的染料对微组织进行染色，并且使用亮视野显微镜、或荧光显微镜检查、或共聚焦显微镜检查、或光片显微镜检查进行分析。
还可以使用裂解活力测定，如CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay来分析微组织。可以使用组织学和分别的染色来分析微组织。
可以在实验期间或结束时对培养基进行采样，并且在采样后进行分析。在此类分析中，不同的标记物、代谢产物、激素或第二信使或细胞因子可能是有利的，例如：
特异性活力标记物如白蛋白的丰度是功能良好的肝细胞的标记物。人白蛋白可以用例如通过Bethyl的Human Albumin ELISA Quantitation Set，E80-129进行定量。
胰岛素分泌量是胰腺胰岛活力的标记物，并且可以用例如
Figure BDA0002356401690000111
ChemiHuman Insulin ELISA，80-INSHU-CH01，ALPCO，USA进行测定。
进一步地，可以根据最初添加的化合物浓度如何在一段时间内变化来分析培养基。
实验和附图
尽管本发明已在附图和前文描述中详细地示出且描述，但此类示出和描述应被视为说明性或示例性的而非限制性的；本发明并不限于所公开的实施方案。本发明不限于所公开的实施方案。根据附图、公开内容和所附权利要求的研究，本领域技术人员在实践本发明时可以理解且实现所公开的实施方案的其它变化。在权利要求中，词语“包括”不排除其它元件或步骤，并且不定冠词“一个”或“一种”不排除多个。某些措施在互不相同的从属权利要求中叙述的简单事实并不指示不能有利地使用这些措施的组合。权利要求中的任何参考标记都不应该被解释为限制范围。
实施例1
使8种肝脏微组织和2种肿瘤微组织与一种或多种肿瘤特异性前药一起温育。肝脏微组织可以例如如WO2015158777A1中公开的产生。肿瘤微组织可以例如如Kelm等人(2003)中公开的产生。
在这种情况下，关于具体定量选择的原因是使用8种肝脏微组织，以具有最大数目的细胞用于代谢前药，而两个肿瘤微组织仅为了具有2个重复用于观察效应。
在其它实施方案中，可以进行定量比的选择，以反映人体中的组织的定量比(例如(肝脏:心脏)或(肝脏:肝癌)。
前药是首先需要通过肝脏代谢转换被激活成活性的肿瘤特异性试剂的化合物。一种或多种前药在生物激活后的功效和毒性可以使用本文的两组织模型同时进行调查。
根据图7A/7B制备装置，即，各自具有10个孔的12个测试条。每个测试条的8个孔装载有肝脏微组织，并且每个测试条的2个孔装载有肿瘤微组织。
1.不同浓度的相同测试试剂的测试：
各个步骤包括：
1.将常用培养基(例如：通过Insphero的3D InSightTM Cell-Culture Media)装载到系统的储库内
2.在相关孔中装载两种微组织类型(可以制备多重培养基条件、组织比和技术重复)
3.借助于密封薄膜密封孔
4.在培养箱内部的可编程倾斜装置上设置系统
5.将化合物以12种不同浓度施加于12个测试条的储库中
6.在限定时帧内(例如1-30天)，在所有条件下平行的自动倾斜诱导灌注
7.在实验期间
a.用显微镜检查监测肿瘤生长
b.在限定的时间点采样培养基用于分析
c.需要时，添加/交换培养基
d.取出选择的微组织用于分析
8.在实验结束时
a.取出培养基用于分析
b.取出微组织用于分析
9.根据前药和代谢的前药的效应来分析肿瘤微组织。
10.根据前药和代谢的前药的毒性效应来分析肝脏微组织。
11.根据前药和代谢的前药的浓度来分析采样的培养基，给出关于转化效率和化合物半衰期、以及与功能和活力相关的组织特异性标记物的信息。
2.不同的测试试剂的测试：
各个步骤包括：
1.将常用培养基(例如：通过Insphero的3D InSightTM Cell-Culture Media)装载到系统的储库内
2.在相关孔中装载两种微组织类型(可以制备多重培养基条件、组织比和技术重复)
3.借助于合适的密封薄膜密封孔
4.在培养箱内部的可编程倾斜装置上设置系统
5.将12种不同的测试试剂施加于12个测试条的储库中
6.在限定时帧内(例如1-30天)，在所有条件下平行的自动倾斜诱导灌注
7.在实验期间
a.用显微镜检查监测肿瘤生长
b.在限定的时间点采样培养基用于分析
c.需要时，添加/交换培养基
d.取出选择的微组织用于分析
8.在实验结束时
a.取出培养基用于分析
b.取出微组织用于分析
9.根据前药和代谢的前药的效应来分析肿瘤微组织。
10.根据前药和代谢的前药的毒性效应来分析肝脏微组织。
11.根据前药和代谢的前药的浓度来分析采样的培养基，给出关于转化效率和化合物半衰期、以及与功能和活力相关的组织特异性标记物的信息。
附图说明
图1A显示了微组织区室装置，其包括区室结构1，所述区室结构1具有上表面2以及与其基本上共面的下表面3，和
适合于容纳液体体积中的一种或多种微组织的至少两个孔4。
该装置可以进一步包括具有上表面以及与其基本上共面的下表面的基部结构(未示出)，所述基部结构可释放地或不可释放地附接到区室结构的下表面，并且对于区室结构中的孔4提供了底部结构。
图1A进一步显示了在孔4上方的空间13，其包含气体介质，例如空气、氧或富含CO2的空气。在本文中，所述气体介质简称为“空气”。如可以看到的，尽管这是任选特征，但空间13可以与其相应的孔4同轴地布置。
图1A进一步显示了任选通道22，其可以被实现为连接在孔上方的空间，以允许气体介质在不同孔之间循环，并且允许在孔上方的不同空间之间的压力平衡。
图1B显示了所述区室结构的下表面的一个实施方案，所述导管6连接孔4。
有利的是，在一个实施方案中，上文讨论的基部结构可以看起来类似于所述基部结构，即，在导管未在区室结构的下表面中，而是在基部结构的上表面中提供的情况下。
图2A显示了孔4的细节，所述孔4具有含有给定直径的下部区段4a、以及具有扩大直径的与其同轴地定向的上部区段4b、防止所述孔中包含的液体体积扩散或溢流的溢流结构9、以及从区室结构的下表面向下延伸的唇状结构11。唇状结构突出到导管内，并且以这种方式，使流过导管的液体以偏离由导管的纵轴所确定的方向的方向进入孔。图2A进一步显示了在孔上方的空间13，其包含气体介质，例如空气、氧或富含CO2的空气(在本文中简称为“空气”)。
图2B显示了区室结构的下表面的特写，其中导管6连接孔4和唇状结构11。
图3A和3B显示了唇状结构11如何使流过导管6的液体(箭头)以偏离由导管的纵轴所确定的方向的方向进入孔。以这种方式，避免了液体流直接撞击微组织，其可以导致其错位，且因而阻碍任何测量或对液体中包含的测试试剂的暴露的可再现性。
图4A从上方显示了区室结构，其中储库12借助于导管(未示出)流体连接到至少一个孔4。在所述储库中，可以提供不同类型的液体培养基：
a)用于培养微组织的培养基
b)用于洗涤微组织、或从整个系统中冲洗出其它培养基的洗涤培养基
c)包含微组织暴露于其的一种或多种测试化合物的测试培养基
图4A进一步显示了在孔4上方的空间13，其包含气体介质，例如空气、氧或富含CO2的空气(在本文中简称为“空气”)。进一步地，显示了任选的通道22，其连接孔上方的空间。
图4B显示了在其中可以布置几个区室结构的框架结构。
图5A–C显示了区室结构的孔及其周围的横截面，所述区室结构具有孔4、微组织5、导管6、基部结构7、溢流结构9和唇状结构11。
孔具有可以优选地采取漏斗样形状的上部区段4b，以及可以优选地具有圆形或椭圆形横截面的下部区段4b。
进一步地，显示了在孔上方的空间13，其包含气体介质，例如空气、氧或富含CO2的空气(在本文中简称为“空气”)。如所讨论的，导管6可以或在区室结构1的下表面3上、或在基部结构7的上表面上。
进一步显示的是插入孔上方的空间13内的塞子15，以及可替代地，附接到区室结构1的上表面2的密封薄膜16。密封薄膜仅避免液体的蒸发和孔或其内容物的污染。而且，在此类实施方案中，可以维持液-气界面，以确保液相和周围空气之间的气体交换，因而确保对于微组织的足够氧供应。优选地，所述密封薄膜由透气膜例如硅酮制成。
如果塞子15深深地插入孔上方的空间13内，则可以另外有效地密封孔(图5C)，以便避免液体的溢出。为了仍然产生足够的氧供应，在一个实施方案中，此类塞子可以包括例如由硅酮制成的透气膜17。
在一些实施方案中，基部结构包括与孔同心布置的椭圆形或圆形凹坑10，以容纳微组织5的下部部分，因而使其居中。以这种方式，促进了显微镜调查，并且使得对液体培养基的暴露更可再现。
溢流结构9示例性地以防溢边缘的形式显示，其通过建立最大接触角而允许液滴在孔的顶部形成，因此防止了液体通过毛细管钉扎的释放。这种现象增加了液-气界面18的尺寸，且因而改善了培养液和周围气体介质之间的气体交换。
应当指出，溢流结构可以采取不同的形状，具有不同的角度、高度和倒圆角，只要它实现其目的，如上文所述。溢流结构可以可替代地包括不可润湿的区域(即，包括疏水区域、或配备有莲花效应的区域)，以实现相同的效应。
进一步地，当装置倾斜时(参见图9A)，或当例如随着流体流过通道来自储库的泵送活动，在微流体系统中施加压力时，溢流结构避免了液体的溢出。在这两种情况下，在孔的顶部形成的液滴可能在体积中增加或膨胀，但不溢出或溢流。在这方面，产生压力屏障的液体的表面张力具有促进效应。
图6A-C显示了微区室结构1的替代实施例，所述微区室结构1具有储库12、塞子15、孔的上部区段4b和下部区段4a、溢流结构9和唇状结构11。
图7显示了图1和图6的微区室结构可以采用测试条19的形式，所述测试条19可以布置在与微量滴定板标准兼容的框架结构20中。
因而，包括孔和储库的多重测试条或区室结构可以在框架结构中并排对齐，以平行执行实验，即，用不同的测试试剂或不同浓度的相同测试试剂。
如可以看到的，图7A的测试条具有一行孔。可替代地，该测试条可以具有更多行的孔，如例如图4中所示，其中每行具有其自己的储库，并且可以与不同的测试条件一起使用，例如，不同的测试试剂或不同浓度的相同测试试剂。
图8显示了现有技术(Kim等人，2015)的非本发明实施方案形式，其具有孔和装载端口的不同布局，使得微组织装载更加困难且易错。
图9A显示了由具有液-气界面的根据本发明的装置的倾斜引起的所谓的“倾斜孔泵效应”。由于流体静力，最下面的孔中出现的液滴将膨胀，而最上面的孔中的液滴将收缩。因而，随着平台的每次倾斜，出现另外的泵送效应，所述效应在其中不存在此类液-气界面的根据本领域的装置中不出现。
如在图9A中可以看到的，溢流结构9避免了当装置倾斜时液体的溢出。由于倾斜过程，在孔的顶部形成的液滴可能在体积中增加或膨胀，但由于所提供的溢流结构而不溢出或溢流。
在图9A中未显示的是布置在微区室装置的一侧或两侧处的一个或两个任选的储库12。
图9B显示了倾斜装置21，其可以用于容纳一般而言根据本发明的框架结构20、或测试条或微组织区室装置。
图10显示了在装置的一个实施方案中连接孔4上方的空间13的通道22的效应，所述装置或被密封薄膜16(图10A)密封或被塞子15(图10B)密封。
当在不存在此类通道的情况下，例如在初次施加过程中或通过装置经由操作员弄湿，向内戳可能具有一定程度的弹性的密封薄膜时，可以将气体介质压入孔4内(参见箭头)，在其中它可以置换微组织5或在导管6中发展气泡，使孔彼此流体连接。当塞子15被压入孔上方的空间内时，也可以发生同样的情况。由于微组织可能受损，或者培养基、洗涤培养基或测试培养基的供应中断，或者两者同时发生，因此两种效应均具有不希望有的后果。
连接孔4上方的空间13的通道22的提供可以帮助避免这种情况，因为它允许气体介质在不同孔之间循环(参见箭头)，并且允许孔上方的不同空间之间的压力平衡。如图10A中可以看到的，当使用塞子15时，基本上具有相同的优点。
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附图编号
1.区室结构
2.上表面
3.下表面
4.孔
4a.具有给定直径的下部孔区段
4b.具有扩大直径的上部孔区段
5.微组织
6.将至少两个孔彼此流体连接的导管
7.基部结构
8.框架结构
9.防止所述孔中包含的液体体积扩散或溢流的溢流结构
10.与孔同心布置的凹坑
11.唇状结构
12.储库
13.在孔上方的空间
14.网格间距模式
15.塞子
16.密封薄膜
17.塞子中的膜
18.液-气界面
19.测试条
20.框架结构
21.倾斜装置
22.连接在孔上方的空间的通道

Claims (18)

1.一种微组织区室装置，其包括区室结构(1)，所述区室结构(1)具有：
(i)上表面(2)以及下表面(3)，和
(ii)适合于容纳液体体积中的一种或多种微组织(5)的至少两个孔(4)，每个孔具有
a)具有给定直径的下部区段(4a)，
b)与下部区段(4a)同轴地定向的漏斗样形状的上部区段(4b)，所述上部区段(4b)的直径逐步缩窄至所述下部区段(4a)的直径，和
(iii)将至少两个孔彼此流体连接的至少一个导管(6)，和
(iv)布置在孔上方的至少一个空间(13)，和
其中至少一个孔在其上部区段具有溢流结构(9)，所述溢流结构防止所述孔中包含的液体体积扩散或溢流到空间(13)内，
其中至少一个孔具有从区室结构的下表面(3)向下延伸的至少一个唇状结构(11)，所述唇状结构突出到导管内，并且以这种方式，使流过导管的液体以偏离由导管的纵轴所确定方向的方向进入孔。
2.根据权利要求1的装置，其进一步包括至少一个通道(22)，其将孔上方的至少一个空间连接到邻近孔上方的另一个空间或外部。
3.根据权利要求1中的装置，其进一步包括具有上表面以及下表面的基部结构(7)，所述基部结构可释放地或不可释放地附接到所述区室结构的下表面。
4.根据权利要求1中的装置，其中所述至少一个导管(6)在所述区室结构(1)中提供。
5.根据权利要求3中的装置，其中所述至少一个导管(6)在基部结构(7)中提供。
6.根据权利要求5的装置，其中所述至少一个导管(6)基本上由通过两个侧壁限定的纵向沟槽组成。
7.根据权利要求3的装置，其中：
a)至少一个孔具有基本上椭圆形或圆形的横截面，和/或
b)至少一个孔的底部结构-或布置在所述区室结构(1)中或在所述基部结构(7)中-具有与所述孔同心布置的椭圆形或圆形凹坑(10)。
8.根据权利要求1-6中任一项的装置，其中所述区室结构(1)包括借助于导管流体地连接到至少一个孔的至少一个储库(12)。
9.根据权利要求3或5的装置，其中所述基部结构(7)包括借助于导管流体地连接到至少一个孔的至少一个储库(12)。
10.根据权利要求1-6中任一项的装置，其中，
a)至少一个孔具有<3mm至>0.3mm的直径，或
b)至少一个导管具有<1mm至>0.03mm的高度。
11.根据权利要求1-6中任一项的装置，所述装置，
a)包括至少一行3个或更多个孔，其以9mm、4.5mm或2.25mm的网格间距模式(14)彼此间隔开，或
b)进一步包括用于从其上侧密封所述孔的一个或多个密封结构。
12.根据权利要求11的装置，其中所述密封结构是选自以下的至少一种：
●插入所述孔上方的空间(13)内的塞子(15)，和/或
●附接至所述区室结构的上表面的密封薄膜(16)。
13.一种适合于设置在与微量滴定板标准兼容的框架结构中的测试条(19)，所述测试条容纳至少一个根据权利要求1–12中任一项的微组织区室装置。
14.一种与微量滴定板标准兼容的框架结构(20)，所述框架结构包括至少一个根据权利要求13的测试条、或者至少一个根据权利要求1–12中任一项的微组织区室装置。
15.一种芯片上的模型生物，所述模型生物包括至少一个根据权利要求1–12中任一项的微组织区室装置、或至少一个根据权利要求13的测试条、或至少一个根据权利要求14的框架结构，其中在所述区室装置的孔中布置两种或更多种不同的微组织。
16.一种测试一种或多种测试化合物对生理系统的潜在生理或毒性作用的方法，所述方法包括：
a)提供至少一个根据权利要求1–12中任一项的微组织区室装置、或至少一个根据权利要求13的测试条、或至少一个根据权利要求14的框架结构、或至少一种根据权利要求15的芯片上的模型生物，
b)将液体培养基装载到在微组织区室装置或区室结构中提供的至少一个储库内，所述液体培养基包含至少一种测试化合物，并且用液体培养基灌注孔，和
c)监测或分析至少一种微组织和/或采样和分析液体培养基。
17.根据权利要求16的方法，进一步包括：
a1)将一种或多种微组织装载到由所述微组织区室装置或区室结构、测试条或框架结构提供的孔内。
18.根据权利要求16或17的方法或根据权利要求15的芯片上的模型生物，其中所述微组织是选自微组织球状体、类器官或精密组织切片中的至少一种。
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