JP5731464B2 - ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヘモグロビン類のカラム充填剤への非特異吸着を低減し、高精度な測定が可能であるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。

ヘモグロビン（Ｈｂともいう）類、なかでも糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃともいう）は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。

従来、ＨｂＡ１ｃの測定は、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、免疫法、電気泳動法等により行なわれてきた。このうち、臨床検査分野で多く用いられているのは液体クロマトグラフィー法である。液体クロマトグラフィー法では、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、少なくともこのレベルの性能が必要とされている。

ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定するためのカラム充填剤としては、例えば特許文献１には、（メタ）アクリル酸エステルの重合体を基材とするカチオン交換用カラム充填剤が開示されている。このようなカチオン交換用カラム充填剤は、素材が安価で入手しやすく、選択の幅が広いことから、様々な改質を行い分離性能を最適化できるという利点がある。

しかし、従来のカチオン交換用カラム充填剤を用いてヘモグロビン類の測定を行った場合、カラム充填剤の基材を構成する部分、即ちカチオン交換基以外の部分にヘモグロビンが非特異吸着を起こすことがあった。このような非特異吸着は、ピークの分離性能の低下、測定の再現性の低下、カラム寿命の短縮等、種々の問題を引き起こすものである。

非特異吸着を防止する方法としては、一般に、カラム充填剤の親水化する方法が知られている（例えば、特許文献１〜７等）。しかしながら、これまでのところヘモグロビンの非特異吸着を防止する有効な方法は知られていなかった。

特公平０８−００７１９７号公報 特開平０１−０９８９６５号公報 特開平０９−２１０９８１号公報 特開平１１−０２３５５１号公報 特開昭６３−０６８６０３号公報 特開昭６３−１５９７５４号公報 特開平０４−０５０７６５号公報

本発明は、上記現状に鑑み、ヘモグロビン類のカラム充填剤への非特異吸着を低減し、高精度での測定が可能であるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法を提供することを目的とする。

本発明は、カチオン交換クロマトグラフィー法によるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、カラム充填剤として、（メタ）アクリル酸エステルの架橋重合体の少なくとも表面にカチオン交換基及び糖構造を導入したものを用いるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、鋭意検討の結果、カラム充填剤として、（メタ）アクリル酸エステルの架橋重合体からなり、少なくとも表面にカチオン交換基及び糖構造を有するものを用いて液体クロマトグラフィー法による分析を行った場合には、単に非特異吸着抑制できるのみでなく、ヘモグロビン類の測定精度を著しく向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明のヘモグロビン類の測定方法においては、カラム充填剤として、架橋性単量体を重合した架橋重合体からなり、少なくとも表面にカチオン交換基及び糖構造を有するものを用いる。
上記架橋性単量体としては特に限定されないが、架橋性の（メタ）アクリル酸エステルが好適である。

上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステルとしては特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等のポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類；プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類；ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１、３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１、４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１、６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１、９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等のアルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類；２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレー、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等のヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類；トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等のｘアルカロールアルカンｙ（メタ）アクリレート類等が挙げられる。これらの架橋性の（メタ）アクリル酸エステルは、単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

上記カラム充填剤を構成する架橋重合体は、上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステルと非架橋性単量体との共重合体であってもよい。
上記非架橋性単量体としては特に限定されないが、非架橋性の（メタ）アクリル酸エステル類が好適である。
上記非架橋性の（メタ）アクリル酸エステル類としては特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル等の（メタ）アクリル酸アルキル類；（メタ）アクリル酸−２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸−２−エチルヘキシル等のアクリル酸誘導体等が挙げられる。
エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等のポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類；プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等のポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート類；ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、リコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等のアルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類；グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２、３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２、３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等の水酸基を有する（メタ）アクリレート類が挙げられる。これらの非架橋性の（メタ）アクリル酸エステルは、単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。

上記カラム充填剤を構成する架橋重合体が、上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステルと非架橋性単量体との共重合体である場合、上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステル１００重量部に対する上記非架橋性単量体の配合量の好ましい上限は５０重量部である。５０重量部を超えると、上記基材を構成する架橋重合体の架橋度が低く、膨潤や収縮をしやすくなることから、液体クロマトグラフィー法による測定において緩衝液を切り替えたときの平衡化に時間がかかり、測定時間が長くなってしまうことがある。より好ましい上限は２０重量部である。

上記カラム充填剤は、少なくとも表面にカチオン交換基を有する。
本明細書においてカチオン交換基とは、カチオン交換性を有する官能基を意味する。上記カチオン交換基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。なかでも、スルホン酸基が好適である。
なお、上記カチオン交換基としては、上記官能基（カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等）に付随する構造は問わない。例えば、「カルボキシル基」には、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基等のカルボキシル基が結合する官能基類全てを含む。

上記カチオン交換基は、カチオン交換基を有する単量体（以下、「カチオン交換性単量体」ともいう）に由来するものであることが好ましい。
即ち、上記カラム充填剤を構成する架橋重合体を製造するにあたって、単量体混合物中にカチオン交換性単量体を添加して共重合する方法、又は、上記架橋重合体を形成した後、該架橋性重合体の表面においてカチオン交換性単量体を重合する方法によるものであることが好ましい。

カルボキシル基を有するカチオン交換性単量体としては特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル酸、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルサクシネート、２−（メタ）アクリロイロキシエチルフタル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類；クロトン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、フマル酸等が挙げられる。
リン酸基を有するカチオン交換性単量体としては特に限定されず、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート等の（メタ）アクリル酸誘導体類等が挙げられる。
スルホン酸基を有するカチオン交換性単量体としては特に限定されず、例えば、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類；（３−スルホプロピル）−イタコン酸、アリルスルホン酸等が挙げられる。
これらのカチオン交換性単量体は、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なかでも、上記カチオン交換性単量体としては、（メタ）アクリル酸誘導体類が好適である。

上記カチオン交換性単量体としては、カチオン交換基と糖構造とを有する単量体（以下、「カチオン性糖単量体」ともいう）も好適である。
上記カチオン性糖単量体としては、例えば、上記カチオン交換性単量体に、グルコース、フルクトース等の単糖やグルコシルエチル基等の糖構造を含む官能基、セルロース等の多糖類を導入した単量体類；糖単量体の糖構造部分にカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などのカチオン交換基を導入した単量体類；糖単量体の糖構造以外の部分に上記カチオン交換基を導入した単量体類等が挙げられる。

上記カチオン交換基は、カチオン交換基に変換可能な官能基を有する単量体のカチオン交換基に変換可能な官能基をカチオン交換基に変換したものであってもよい。
即ち、上記カラム充填剤を構成する架橋重合体を製造するにあたって、単量体混合物中にカチオン交換基に変換可能な官能基を有する単量体を添加して共重合した後、該カチオン交換基に変換可能な官能基を公知の化学反応によりカチオン交換基に変換する方法、又は、上記架橋重合体を形成した後、該架橋性重合体の表面においてカチオン交換性単量体を重合し、その後該カチオン交換基に変換可能な官能基を公知の化学反応によりカチオン交換基に変換する方法によるものであってもよい。

上記カチオン交換基に変換可能な官能基としては特に限定されず、例えば、カルボン酸エステル、リン酸エステル、スルホン酸エステル等のエステル基を有する単量体；エポキシ基、グリシジル基を有する単量体等が挙げられる。
上記エステル基を有する単量体に由来するエステル基は、酸又は塩基の存在下で加水分解を行なう公知の手法により、それぞれカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基に容易に変換することができる。
上記エポキシ基、グリシジル基を有する単量体は、エポキシ基を開環後、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基を公知の方法で導入することができる。
これらのカチオン交換基に変換可能な官能基を有する単量体は、単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。

上記カチオン交換性単量体又はカチオン交換基に変換可能な官能基を有する単量体の配合量としては、上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステル（非架橋性単量体を添加する場合にはその合計）１００重量部に対する好ましい下限が１０重量部、好ましい上限が１００重量部である。１０重量部未満であると、カチオン交換基の導入量が少なすぎて充分なカチオン交換反応が行なわれず、測定対象のピークを充分に分離できないことがあり、１００重量部を超えると、重合中に凝集物が発生し重合体が得られないことがある。より好ましい下限は２０重量部、より好ましい上限は８０重量部である。

上記カラム充填剤は、少なくとも表面に糖構造を有する。
本明細書において糖構造とは、アルデヒド基又はケトン基を有する多価アルコール、即ち、ポリヒドロキシアルデヒド（アルドース）構造又はポリヒドロキシケトン（ケトース）構造を有する還元性の単糖構造、該単糖構造を基本単位とする重合体又は共重合体である二糖構造、オリゴ糖構造、多糖構造を意味する。

上記糖構造は、糖構造を有する単量体（以下、「糖単量体」ともいう）に由来するものであることが好ましい。
即ち、上記カラム充填剤を構成する架橋重合体を製造するにあたって、単量体混合物中に糖単量体を添加して共重合する方法、又は、上記架橋重合体を形成した後、該架橋性重合体の表面において糖単量体を重合する方法によるものであることが好ましい。

上記糖単量体としては、公知の重合性単量体に糖構造を導入した単量体が挙げられ、例えば、上記の架橋性単量体又は非架橋性単量体に糖構造を導入した単量体が好適である。具体的には例えば、グリコシド（メタ）アクリレート、グリコシルエチル（メタ）アクリレート、グリコシルプロピル（メタ）アクリレート、グリコシルブチル（メタ）アクリレート、グリコシルエトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｄ−マンノシルエチル（メタ）アクリレート、Ｄ−フルクトシルエチル（メタ）アクリレート、ガラクトシルエチル（メタ）アクリレート、キシロシルエチル（メタ）アクリレート、マルトシルエチル（メタ）アクリレート、およびラクトシルエチル（メタ）アクリレート等の糖化（メタ）アクリレート類等が好適である。なお、上記糖単量体としては、上記カチオン性糖単量体も好適である。

上記糖単量体の配合量としては、上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステル（非架橋性単量体を添加する場合にはその合計）１００重量部に対する好ましい下限が１重量部、好ましい上限が１００重量部である。１重量部未満であると、糖構造の導入量が少なすぎて充分なヘモグロビン類との相互作用が行なわれず、測定対象のピークが充分に分離されないことがあり、１００重量部を超えると、重合中に凝集物が発生し、重合体が得られないことがある。より好ましい下限は５重量部、より好ましい上限は８０重量部である。

上記カラム充填剤を製造する方法としては、例えば、上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステル、非架橋性単量体、カチオン交換性単量体、糖単量体、カチオン交換性糖単量体等の単量体混合物を共重合する方法が挙げられる。具体的には、例えば以下に示した１段階重合法、２段階重合法又は３段階重合法が挙げられる。なかでも、２段階重合法又は３段階重合法が好適である。

上記１段階重合法について説明する。
上記１段階重合法においては、上記単量体混合物に重合開始剤や必要に応じて各種添加剤を添加し、加温することで重合反応を行なう。
重合方法としては、具体的には例えば、乳化重合法、ソープフリー重合法、分散重合法、懸濁重合法、シード重合法等の公知の重合方法が挙げられる。

上記２段階重合法について説明する。
上記２段階重合法においては、まず、上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステル（必要に応じて非架橋性単量体）とカチオン交換性単量体とを混合し、重合開始剤や必要に応じて各種添加剤を添加し、加温して重合反応を行いカチオン交換基を有する架橋重合体を得る。次いで、得られたカチオン交換基を有する架橋重合体の表面で、糖単量体を重合する。
又は、まず、上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステル（必要に応じて非架橋性単量体）と糖単量体とを混合し、重合開始剤や必要に応じて各種添加剤を添加し、加温して重合反応を行い糖構造を有する架橋重合体を得る。次いで、得られた糖構造を有する架橋重合体の表面で、カチオン交換性単量体を重合する。
又は、まず、上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステル（必要に応じて非架橋性単量体）に、重合開始剤や必要に応じて各種添加剤を添加し、加温して重合反応を行い架橋重合体を得る。次いで、得られた架橋重合体の表面で、カチオン交換性単量体と糖単量体との混合物を重合する。

上記３段階重合法について説明する。
上記３段階重合法においては、まず、上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステル（必要に応じて非架橋性単量体）に、重合開始剤や必要に応じて各種添加剤を添加し、加温して重合反応を行い架橋重合体を得る。次いで、得られた架橋重合体の表面で、カチオン交換性単量体を重合してカチオン交換基を有する架橋重合体を得る。最後に、得られたカチオン交換基を有する架橋重合体の表面で糖単量体を重合する。
又は、まず、上記架橋性の（メタ）アクリル酸エステル（必要に応じて非架橋性単量体）に、重合開始剤や必要に応じて各種添加剤を添加し、加温して重合反応を行い架橋重合体を得る。次いで、得られた架橋重合体の表面で、糖単量体を重合して糖構造を有する架橋重合体を得る。最後に、得られた糖構造を有する架橋重合体の表面でカチオン交換性単量体を重合する。

上記２段階重合法又は３段階重合法において、カチオン交換性単量体及び／又は糖単量体を架橋性重合体の表面で重合する際には、例えば、架橋性単量体の生成後、得られた架橋性重合体を洗浄した後、重合開始剤を架橋重合体に含浸させ、その後にカチオン交換性単量体及び／又は糖単量体を反応系に添加して重合する方法；架橋性単量体の重合反応の途中で、カチオン交換性単量体及び／又は糖単量体を反応系に添加して重合する方法等を行ってもよい。なお、カチオン交換性単量体及び／又は糖単量体を添加する際には、水や各種の水溶液、有機溶媒等で希釈してもよい。

上記重合法において用いる重合開始剤としては特に限定されず、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤を用いることができる。
上記ラジカル重合開始剤としては、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩；クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２−アゾビスイソブヒロニトリル、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等のアゾ化合物が挙げられる。

上記重合開始剤の使用量としては、単量体の混合物１００重量部に対し好ましい下限が０．０５重量部、好ましい上限が５重量部である。０．０５重量部未満であると、重合反応が不十分となったり、重合反応に長時間要したりすることがあり、５重量部を超えると、急激な反応の進行により凝集物が発生することがある。

上記カラム充填剤は、上記以外にも例えば、カチオン交換基を有する架橋重合体の表面に多糖類を吸着又は結合させる方法、架橋重合体の表面にカチオン交換基を有する多糖類を吸着又は結合させる方法等によっても製造することができる。

上記多糖類としては、公知の多糖類を用いることができ、具体的には例えば、セルロース、マンナン、デンプン、キチン、デキストラン、コンドロイチン等の中性多糖類が好適である。
上記カチオン交換基を有する多糖類としては、例えば、ヒアルロン酸、ムラミン酸、ペクチン酸、アルギン酸等のカルボキシル基を有する多糖類；タイコ酸、ホスホマンナン等のリン酸基を有する多糖類；コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、フコイダン等のスルホン酸基を有する多糖類；上記中性多糖類のカチオン交換基導入誘導体等が挙げられる。なかでもスルホン酸基を有する多糖類が好適である。

上記多糖類又はカチオン交換基を有する多糖類を、架橋重合体の表面に吸着又は結合させる方法としては特に限定されず、例えば、上記多糖類又はカチオン交換基を有する多糖類を溶解した溶液を架橋重合体に接触させ、必要に応じて加温、真空、乾燥状態に置き、更に必要に応じて洗浄等を行う方法等が挙げられる。また、上記多糖類又はカチオン交換基を有する多糖類が有する水酸基、エステル基、アミノ基、カチオン交換基等の官能基と、架橋重合体が有する同様の官能基とを反応させ、化学結合により結合させてもよい。

上記多糖類又はカチオン交換基を有する多糖類を、架橋重合体の表面に吸着又は結合させる場合、これらの多糖類を溶液の状態にて架橋性重合体に反応させることが好ましい。この場合の多糖類の濃度としては、好ましい下限が０．０１重量％、好ましい上限が２０重量％である。０．０１重量％未満であると、多糖類の導入量が小さく充分な効果が得られないことがあり、２０重量％を超えると、反応の際に凝集物が発生しやすく、均一な吸着又は結合を行なうことができないことがある。

本発明のヘモグロビン類の測定方法は、上記カラム充填剤を用いて液体クロマトグラフィー法により測定を行う。
測定は、公知の液体クロマトグラフィーシステム、即ち、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えたシステムに、上記カラム充填剤を充填したカラムを接続して行う。

本発明のヘモグロビン類の測定方法においては、溶離液として公知の塩化合物を含む緩衝液を用いることができる。このような緩衝液としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸及びその塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸及びその塩類、グッドの緩衝液類等が挙げられる。また、上記緩衝液には、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等の従来公知の添加物を適宜添加してもよい。
上記緩衝液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍＭ、好ましい上限は１０００ｍＭである。１０ｍＭ未満であると、イオン交換反応が行なわれず、ヘモグロビンを分離することができないことがあり、１０００ｍＭを超えると、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。

上記カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィー法によれば、上記ヘモグロビンＡ１ｃ以外にも、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ等の異常ヘモグロビン類、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）、ヘモグロビンＡ２等も高い精度で測定することができる。

本発明によれば、ヘモグロビン類のカラム充填剤への非特異吸着を低減し、高精度での測定が可能であるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法を提供することができる。

実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。 比較例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。 比較例３のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。 実施例６のカラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。 実施例６のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。

以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。

（実施例１）
トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）３００ｇ、トリメチロールエタントリアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）５０ｇ、メタクリル酸（カチオン交換性単量体：和光純薬製）１００ｇおよびグリコシルエチルメタクリレート（糖単量体）５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤：ナカライテスク製）１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（ゴーセノールＧＨ−２０：日本合成化学製）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１２時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。得られた充填剤を、内径３ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、カラムを得た。

得られたカラムを、ＨＰＬＣシステム（島津製作所製ＬＣ−１０Ａ）に接続した。測定試料として、フッ化ナトリウム採血したヒト健常人血液を、０．０５重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により２００倍に溶血希釈したものを用いた。溶離液として、溶離液Ａ：２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）および溶離液Ｂ：４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の２種を用い、流速１．０ｍＬで送液してステップワイズグラジエント法により分離し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。上記試料を測定した結果、図１のクロマトグラムを得た。図１中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡｏである。ヘモグロビンＡ１ｃが他のヘモグロビン分画と短時間内に良好に分離された。

（実施例２）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）２５０ｇ、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（非架橋性単量体：和光純薬製）５０ｇ、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体：東亞合成化学製）１００ｇおよびグリコシルエチルメタクリレート（糖単量体）５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を実施例１と同様の方法により重合し、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例３）
ジエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグルコシル３−スルホプロピルアクリル酸（カチオン交換性糖単量体）の混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を実施例１と同様の方法により重合し、カラム充填剤を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例４）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）３００ｇおよびトリメチロールプロパントリアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、メタクリル酸（カチオン交換性単量体：和光純薬製）１００ｇおよびマルトシルエチルアクリレート（糖単量体）５０ｇの混合物を反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例５）
トリエチレングリコールジメタクリレート２５０ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、グリセロールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）５０ｇおよび２−ヒドロキシエチルメタクリレート（非架橋性単量体：和光純薬製）５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１５０ｇおよびグリコシルエチルメタクリレート（糖単量体）６０ｇの混合物を反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例６）
トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１４０ｇおよびグリコシルエトキシエチルメタクリレート（糖単量体）６０ｇの混合物を反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例７）
テトラエチレングリコールジメタクリレート４５０ｇに、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、（２−アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート（カチオン交換性単量体：日本油脂製）１６０ｇおよびグリコシルエチルメタクリレート（糖単量体）４０ｇの混合物を反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例８）
トリエチレングリコールジメタクリレート２５０ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、グリセロールジメタクリレート５０ｇおよび２−ヒドロキシエチルメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、グルコシル３−スルホプロピルアクリル酸（カチオン交換性糖単量体）１５０ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例９）
トリエチレングリコールジメタクリレート２５０ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート５０ｇ、グリセロールジメタクリレート５０ｇおよび２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、グリコシルエトキシエチルメタクリレート（糖単量体）１５０ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例１０）
トリエチレングリコールジメタクリレート２５０ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート５０ｇ、グリセロールジメタクリレート５０ｇおよびグリコシルエトキシエチルメタクリレート（糖単量体）１５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１５０ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例１１）
トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１４０ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して重合反応を行なった。０．５時間後、グリコシルエトキシエチルメタクリレート（糖単量体）６０ｇを反応系に添加し、更に１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例１２）
トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、グリコシルエトキシエチルメタクリレート（糖単量体）６０ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して重合反応を行なった。０．５時間後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１４０ｇを反応系に添加し、更に１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例１３）
トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇ、グリセロールジメタクリレート５０ｇおよびメタクリル酸（カチオン交換性単量体）２００ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１２時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄した後、２重量％デキストラン（多糖類）の水溶液に重合体を浸漬し、４０℃で２４時間加温することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例１４）
トリエチレングリコールジメタクリレート３００ｇ、トリメチロールエタントリアクリレート５０ｇおよび２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１２時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄した後、１．５重量％セルロース（多糖類）の水溶液に重合体を浸漬し、４０℃で２４時間加温することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例１５）
トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１５０ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄した後、２重量％デキストラン（多糖類）の水溶液に重合体を浸漬し、４０℃で２４時間加温することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例１６）
トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄した後、２重量％デキストラン（多糖類）の水溶液に重合体を浸漬し、４０℃で２４時間加温することにより多糖類被覆架橋重合体を得た。
得られた多糖類被覆架橋重合体３００ｇを１重量％の過酸化ベンゾイルを含むアセトン溶液１Ｌに分散させ、１０時間攪拌した。過酸化ベンゾイルが吸収された重合体を４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、更に２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１５０ｇを反応系に添加した。攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、３時間重合反応を行なうことにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例１７）
トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄した後、重合体を２重量％のコンドロイチン硫酸（和光純薬製：カチオン交換性多糖類）水溶液１Ｌに浸漬し、４０℃で２４時間加温することにより、カチオン性多糖類で被覆された架橋重合体、すなわちカチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例１８）
トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄した後、２重量％のデキストラン硫酸（カチオン交換性多糖類）水溶液１Ｌに重合体を浸漬し、４０℃で２４時間加温することにより多糖類被覆架橋重合体を得た。
得られた多糖類被覆架橋重合体３００ｇを１重量％の過酸化ベンゾイルを含むアセトン溶液１Ｌに分散させ、１０時間攪拌した。過酸化ベンゾイルが吸収された重合体を４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、更に２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１５０ｇを反応系に添加した。攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、３時間重合反応を行なうことにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（実施例１９）
トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１５０ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄した後、１．５重量％のコンドロイチン硫酸（カチオン交換性多糖類）水溶液１Ｌに重合体を浸漬し、４０℃で２４時間加温することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図１と同様のクロマトグラムを得た。

（比較例１）
糖単量体を用いなかった以外は実施例１と同様にしてカラム充填剤を調製した。
即ち、トリエチレングリコールジメタクリレート３００ｇ、トリメチロールエタントリアクリレート５０ｇおよびメタクリル酸（カチオン交換性単量体）１００ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤：ナカライテスク製）１．０ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、実施例１の方法に準じて重合することにより、カチオン交換基を有し、かつ糖構造を有しない架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図２のクロマトグラムを得た。図２中、ピーク１がヘモグロビンＡ１ｃ、ピーク２がヘモグロビンＡｏである。実施例１に比べてヘモグロビンＡ１ｃ分離が不良であった。

（比較例２）
糖単量体を用いなかった以外は実施例２と同様にしてカラム充填剤を調製した。
即ち、テトラエチレングリコールジメタクリレート２５０ｇ、２−ヒドロキシエチルメタクリレート５０ｇ、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１００ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を実施例１の方法に準じて重合することにより、カチオン交換基を有し、かつ糖構造を有しない架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムを得た。

（比較例３）
カチオン交換性単量体を用いなかった以外は実施例２と同様にしてカラム充填剤を調製した。
即ち、テトラエチレングリコールジメタクリレート２５０ｇ、２−ヒドロキシエチルメタクリレート５０ｇおよびグリコシルエチルメタクリレート（糖単量体）５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を実施例１の方法に準じて重合することにより、糖構造を有し、かつカチオン交換基を有しない架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図３のクロマトグラムを得た。カチオン交換基を有しない、本比較例のカラム充填剤では、ヘモグロビンＡ１ｃを分離することはできなかった。

（比較例４）
糖単量体を用いなかった以外は実施例６と同様にしてカラム充填剤を調製した。
即ち、トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１４０ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基を有し、かつ糖構造を有しない架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムを得た。

（比較例５）
カチオン交換性単量体を用いなかった以外は実施例６と同様にしてカラム充填剤を調製した。
即ち、トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、グリコシルエトキシエチルメタクリレート（糖単量体）６０ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、糖構造を有し、かつカチオン交換基を有しない架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図３と同様のクロマトグラムを得た。

（比較例６）
カチオン交換性単量体を用いなかった以外は実施例１４と同様にしてカラム充填剤を調製した。
即ち、トリエチレングリコールジメタクリレート３００ｇおよびトリメチロールエタントリアクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１２時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄した後、１．５重量％セルロース（多糖類）の水溶液に重合体を浸漬し、４０℃で２４時間加温することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図３と同様のクロマトグラムを得た。

（比較例７）
糖単量体の代わりに非糖構造のポリヒドロキシル基を有する単量体を用いた以外は実施例６と同様にしてカラム充填剤を調製した。
即ち、トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１４０ｇおよび２、３−ジヒドロキシプロルメタクリレート（糖構造以外のヒドロキシル基を有する単量体：和光純薬製）６０ｇの混合物を反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムを得た。

（比較例８）
糖単量体の代わりに非糖構造のポリヒドロキシル基を有する単量体を用いた以外は実施例１５と同様にしてカラム充填剤を調製した。
即ち、トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１５０ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄した後、２重量％のポリエチレングリコール（平均分子量約２０、０００：糖構造以外のポリヒドロキシル基を有する化合物：和光純薬製）水溶液に重合体を浸漬し、４０℃で２４時間加温することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムを得た。

（比較例９）
カチオン交換性多糖類の代わりに非糖構造のカチオン交換性多糖類を用いた以外は実施例１９と同様にしてカラム充填剤を調製した。
即ち、トリエチレングリコールジメタクリレート２００ｇ、テトラメチロールメタントリアクリレート１００ｇ、テトラメチロールメタンテトラアクリレート（架橋性単量体：新中村化学製）１００ｇおよびグリセロールジメタクリレート５０ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル１．２ｇを溶解した。
得られた単量体混合物を、４重量％のポリビニルアルコール水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（カチオン交換性単量体）１５０ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた重合体をイオン交換水およびアセトンで洗浄した後、５重量％のポリメタクリル酸（分子量約１００、０００：糖構造を有しないカチオン交換性化合物：和光純薬製）水溶液１Ｌに重合体を浸漬し、４０℃で２４時間加温することにより、カチオン交換基および糖構造を有する架橋重合体（カラム充填剤）を得た。
実施例１と同様の方法により、ヒト血液を測定したところ、図２と同様のクロマトグラムを得た。

（カラム充填剤の評価１：回収率試験）
得られたカラム充填剤を用いて、回収率試験を実施した。回収率試験は、カラムの代わりに内径０．２５ｍｍ、長さ１０００ｍｍのＰＥＥＫ製配管をＨＰＬＣに取り付け、上記試料を測定した場合のピーク総面積を１００％とし、カラムを取り付けて測定した場合のピーク総面積の上記ＰＥＥＫ配管時に対する比率により求めた。得られた結果を表１、２に示した。

（カラム充填剤の評価２：修飾ヘモグロビン類の分離性能評価）
上記実施例に用いた健常人血の代わりに、修飾ヘモグロビン類を含む試料を人為的に調製し測定して、そのヘモグロビンＡ１ｃピークとの分離性能を評価した。
修飾ヘモグロビン類としては、レイバイルヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
即ち、試料Ｌは、健常人全血に、グルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人全血に、アセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。

上記修飾ヘモグロビン試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）及び修飾ヘモグロビンの調製に用いた健常人血（非修飾品）を、得られたカラム充填剤を用いて測定し、ヘモグロビンＡ１ｃの測定値を比較した。
分離性能は、修飾ヘモグロビン試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から非修飾品のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより行なった。得られたΔ値を表１、２に示した。

表１、２より、実施例のカラム充填剤を用いた場合には、回収率８２％以上、特に好ましい実施態様である２段階重合法により製造したカラム充填剤を用いた場合（実施例４〜１０）、３段階重合法により製造したカラム充填剤を用いた場合（実施例１１、１２）、及び、多糖類被覆法により製造したカラム充填剤を用いた場合（実施例１４〜１９）においては、ほぼ１００％の回収率が得られた。
一方、糖構造を有しないカラム充填剤（比較例１、２、４、９）では回収率が７０％以下と低かった。これは、測定対象であるヘモグロビンがカラム充填剤に非特異的に吸着して溶出してこなかったためと推定される。また糖以外のポリヒドロキシ化合物を重合または被覆した場合（比較例７、８）では７５〜７６％と、糖構造を有しない場合に比較すると多少の改善は見られたが、実施例に比較すると有意に低かった。比較例３、５、６は高い回収率を示したが、これらのカラム充填剤はカチオン交換基を有しないため、ヘモグロビンＡ１ｃを分離することができなかった。

表１、２より、実施例のΔ値は０．３％以下程度であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料のおいても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが測定できることがわかった。特に実施例４〜１９においては、修飾ヘモグロビンの影響はほとんど受けなかった。
一方、比較例のカラム充填剤を用いた場合では、修飾ヘモグロビンが存在するとヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく変動し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を正確に測定することができなかった。

（カラム充填剤の評価３：異常ヘモグロビン類の分離性能評価）
得られたカラム充填剤を用いて、異常ヘモグロビンとしてヘモグロビンＳおよびヘモグロビンＣを含む試料（ＡＦＳＣヘモコントロール：ヘレナ研究所社製）の測定を行った。
実施例６のカラム充填剤を用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図４に示す。図４中、ピーク１はヘモグロビンＨｂＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡｏ、ピーク４はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク５はヘモグロビンＳ、ピーク６はヘモグロビンＣを示す。他の実施例のカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離することはできなかった。

（カラム充填剤の評価４：ヘモグロビンＡ２の分離性能評価）
得られたカラム充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料として、Ａ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を測定した。
実施例６のカラム充填剤を用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図５に示す。図５中、ピーク１はヘモグロビンＨｂＡ１ｃ、ピーク２はヘモグロビンＡｏ、ピーク４はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、ピーク７はヘモグロビンＡ２を示す。他の実施例のカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、ヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。

本発明によれば、ヘモグロビン類のカラム充填剤への非特異吸着を低減し、高精度での測定が可能であるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法を提供することができる。

Claims (8)

1. カチオン交換クロマトグラフィー法によりヘモグロビンＡ１ｃを他のヘモグロビン類から分離して測定するヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、
   カラム充填剤として、（メタ）アクリル酸エステルの架橋重合体の少なくとも表面にカチオン交換基及び糖構造を導入したものを用いる
   ことを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
2. カチオン交換基は、カチオン交換基及び／又はカチオン交換基に変換可能な官能基を有する単量体を重合して得られた重合体に由来するものであることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
3. 糖構造は、糖化（メタ）アクリレート類を重合して得られた重合体に由来するものであることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
4. 糖構造は、（メタ）アクリル酸エステルの架橋重合体の表面に吸着又は結合させた多糖類に由来するものであることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
5. 多糖類は、カチオン交換基及び／又はカチオン交換基に変換可能な官能基を有する化合物であることを特徴とする請求項４に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
6. カチオン交換基及び糖構造は、カチオン交換基及び／又はカチオン交換基に変換可能な官能基を有し、かつ、糖構造を有する単量体を重合して得られた重合体に由来するものであることを特徴とする請求項１に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
7. カラム充填剤は、表面に糖構造を有する（メタ）アクリル酸エステルの架橋重合体の表面において、カチオン交換基を有する単量体及び／又はカチオン交換基に変換可能な官能基を有する単量体を重合させる方法により製造されたものであることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
8. カチオン交換クロマトグラフィー法によりヘモグロビンＡ１ｃを他のヘモグロビン類から分離して測定するヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に用いるカラム充填剤であって、（メタ）アクリル酸エステルの架橋重合体の少なくとも表面にカチオン交換基及び糖構造を導入したものであることを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃ測定用カラム充填剤。
   

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