JP5681494B2 - 氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物およびその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明における乾燥工程により、植物の有する氷結晶化阻害物質の活性を著しく向上させることができる。植物から氷結晶化阻害物質を抽出する前に乾燥することでより優れた氷結晶化阻害活性を有する植物抽出液が得られるということは、これまで全く報告の無かった新たな知見である。
次に、上記乾燥工程において植物内で活性が向上した氷結晶化阻害物質を抽出する。
以上の工程を経て得られた氷結晶化阻害物質を含む抽出物は、さらに吸着体で処理してもよい。その詳しい条件などは、後述する第二方法で説明する。
本発明に係る第二方法では、植物から氷結晶化阻害物質を抽出する。その詳しい条件などは、第一方法の説明と同様のものとすることができる。また、抽出工程の前に、第一方法と同様に植物の乾燥工程を行ってもよいし、さらに乾燥工程前に低温馴化工程を行ってもよい。
本発明に係る第二方法では、抽出工程で得られた抽出物と吸着体を接触させることにより、氷結晶化阻害物質以外の不純物の量を低減する。かかる吸着体処理により植物抽出液中の不要分を選択的に除去し、所要の氷結晶化阻害物質の精製度を著しく向上させることができる。さらに、除去される不要分には多くの植物抽出物が有する色素成分や香気成分なども含まれることから、植物抽出物の脱色・脱臭の効果も併せて期待できる。
市販のマスタードスプラウト(村上農園製,40g)を−80℃の冷凍庫内で一晩凍結した後に、凍結乾燥機(東京理化機器製,品番:FD−5N)で乾燥し、乾燥物(2.0g)を得た。この乾燥物に水(80mL)を加え、105℃、0.12MPaで20分間加圧抽出した。濾紙(アドバンテック社製,保留粒子径:5μm)を用いて濾過した後、回収した濾液を減圧濃縮装置(東京理化機器製ロータリーエバポレーター,品番:N−1000−S−W)で減圧乾燥し、抽出物(820mg)を得た。さらにこの抽出物を濃度が100mg/mLとなるように水に溶解した。この溶液のタンパク質濃度を、ピアース社製のBCAキットを用い、BCA法によって測定したところ、27.8mg/mLであった。
実施例1に記載のマスタードスプラウト(40g)を金属製トレーにとり、温度40℃の恒温乾燥機内にて温風乾燥し、乾燥物(1.8g)を得た。実施例1に記載の方法と同様に、この乾燥物を熱水抽出した後に濾液を濃縮し、得られた抽出物(920mg)を濃度が100mg/mLとなるように水に溶解した。この溶液のタンパク質濃度をBCA法によって測定したところ、25.4mg/mLであった。
実施例1に記載のマスタードスプラウト(40g)を乾燥せず、そのまま水(80mL)を加えた以外は実施例1と同様にして、105℃、0.12MPaで20分間加圧抽出し、抽出物(860mg)を得た。この抽出物を濃度が100mg/mLとなるよう水に溶解し、溶液のタンパク質濃度をBCA法で測定したところ、30.1mg/mLであった。
実施例1、2および比較例1で得た抽出物の水溶液を、60w/v%のショ糖溶液と1:1(v/v)の割合で混合した。当該混合物(1μL)をカバーガラスで挟み込んだ。加熱冷却載物台(LINKAM社製,LK‐600PM)を備えた光学顕微鏡(OLYMPUS社製,BX50)のガラスシャーレを20℃に保ち、その上に上記カバーガラスを載せて、100℃/minの速度で−40℃まで冷却した。次に、100℃/minの速度で−6℃まで温度を上げた。−6℃になった時を0分として、その後、光学顕微鏡をそのままの状態に保ち、30分後の画像を取り込んだ。得られた画像中に存在する氷結晶の平均面積を算出し、これを氷結晶化阻害活性の指標とした。この結果を表1に示す。表1は、それぞれの水溶液について測定して得られた画像中の氷結晶の平均面積を、比較例1の平均面積に対する比として数値化した結果である。
市販のマスタードスプラウトを15℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害物質を誘導した。馴化10日目のマスタードスプラウト(25g)を実施例1に記載の方法と同様にして凍結乾燥し、乾燥物(1.3g)を得た。この乾燥物に水(50mL)を加え、105℃、0.12MPaで20分間加圧抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物(330mg)を得た。この抽出物を濃度が100mg/mLとなるように溶解し、溶液のタンパク質濃度をBCA法によって測定したところ、26.6mg/mLであった。
実施例4で低温馴化したマスタードスプラウト(25g)を金属製トレーに取り、実施例2に記載の方法と同様にして40℃で温風乾燥し、乾燥物(1.2g)を得た。この乾燥物に水(50mL)を加え、105℃、0.12MPaで20分間加圧抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物(240mg)を得た。この抽出物を濃度が100mg/mLとなるように溶解し、溶液のタンパク質濃度をBCA法によって測定したところ、30.1mg/mLであった。
実施例4で低温馴化したマスタードスプラウト(25g)を金属製トレーに取り、温度90℃の恒温乾燥機内にて熱風乾燥し、乾燥物(2.3g)を得た。この乾燥物に水(50mL)を加え、105℃、0.12MPaで20分間加圧抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物(300mg)を得た。この抽出物を濃度が100mg/mLとなるように溶解し、溶液のタンパク質濃度をBCA法によって測定したところ、22.5mg/mLであった。
実施例4で低温馴化したマスタードスプラウト(25g)を乾燥せず、そのまま水(50mL)を加え、105℃、0.12MPaで20分間加圧抽出し、抽出物(350mg)を得た。この抽出物を濃度が100mg/mLとなるように水に溶解し、溶液のタンパク質濃度をBCA法で測定したところ、24.6mg/mLであった。
実施例4、5、6および比較例2で得た抽出物の水溶液について、それぞれ実施例3に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。得られた画像中の氷結晶の平均面積を比較例2の抽出物の水溶液について得られた氷結晶の平均面積に対する比として数値化した。この結果を表2に示す。
市販のマスタードスプラウトを15℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害物質を誘導した。馴化10日目のマスタードスプラウト(50g)を金属製トレーに取り、実施例2に記載の方法と同様にして40℃で温風乾燥し、乾燥物(4.1g)を得た。この乾燥物に水(100mL)を加え、50℃で2時間加熱抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物(800mg)を得た。この抽出物のタンパク質濃度がBCA法により10mg/mLとなるように溶解し、抽出液(22mL)を得た。
実施例8で低温馴化したマスタードスプラウト(50g)を乾燥せず、そのまま水(100mL)を加え、50℃で2時間加熱抽出し、抽出物(880mg)を得た。この抽出物のタンパク質濃度がBCA法で10mg/mLとなるように溶解し、抽出液(26mL)を得た。
実施例8および比較例3で得た抽出液について、それぞれ実施例3に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。得られた画像中の氷結晶の平均面積を比較例3の抽出物の水溶液について得られた氷結晶の平均面積に対する比として数値化した結果、その値は0.88であり、乾燥後に抽出して得られる抽出液の水溶液の氷結晶の平均面積(実施例8)は、乾燥処理を施していない比較例3の抽出物の水溶液の氷結晶の平均面積よりも小さくなっていた。この結果からも、低温馴化による氷結晶化阻害活性の誘導後にこれを乾燥することによって、マスタードスプラウト中の氷結晶化物質の氷結晶化阻害活性が向上すること
は明らかである。
実施例8で得られたタンパク質濃度10mg/mLの抽出液(22mL)に活性炭(二村化学工業社製,太閤FC,220mg)を添加し、150rpmにて30分間振とうしてこれを混合した。遠心分離機(日立ハイテクノロジーズ社製、品番:CR22G)により10,000×gで30分間遠心分離して活性炭を除去し、上清(19mL)を得た。
実施例10で得た抽出液について、タンパク質濃度をBCA法で測定した。また、実施例3に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。この結果を実施例8の活性炭処理前の抽出液と比較して表3に示す。表3の氷結晶化阻害活性の数値は、それぞれの溶液を測定して得られた画像中の氷結晶の平均面積を、水を試料として同様に測定したときの氷結晶の平均面積に対する比として数値化した相対値である。この数値が小さいほど氷結晶化阻害活性が強いことを示している。
市販のレッドキャベツスプラウトを4℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害物質を誘導した。馴化4日目のスプラウト(20g)を金属製トレーに取り、実施例2に記載の方法と同様にして40℃で温風乾燥し、乾燥物(0.8g)を得た。この乾燥物に水(80mL)を加え、50℃で2時間加熱抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物(389mg)を得た。この抽出物を、その濃度が100mg/mLとなるよう水に溶解し、抽出液を得た。
実施例12で低温馴化したレッドキャベツスプラウト(20g)を乾燥せず、そのまま水(80mL)を加え、50℃で2時間加熱抽出し、抽出物(390mg)を得た。この抽出物を、その質濃度が100mg/mLとなるように水に溶解し、抽出液を得た。
市販のケールスプラウトを4℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害物質を誘導した。馴化4日目のスプラウト(20g)を金属製トレーに取り、実施例2に記載の方法と同様にして40℃で温風乾燥し、乾燥物(1.2g)を得た。この乾燥物に水(80mL)を加え、50℃で2時間加熱抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物(577mg)を得た。この抽出物を、その濃度が100mg/mLとなるように水に溶解し、抽出液を得た。
実施例13で低温馴化したケールスプラウト(20g)を乾燥せず、そのまま水(80mL)を加え、50℃で2時間加熱抽出し、抽出物(559mg)を得た。この抽出物を、その質濃度が100mg/mLとなるように水に溶解し、抽出液を得た。
実施例12、13および比較例4、5で得た抽出物の水溶液について、それぞれ実施例3に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。実施例12、13の抽出液で得られた画像中の氷結晶の平均面積を、それぞれ比較例4、5の抽出物の抽出液について得られた氷結晶の平均面積に対する比として数値化した。この結果を表4に示す。
(1) 低温馴化後の抽出
市販のマスタードスプラウト(村上農園製)を15℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害活性を誘導した。馴化10日目のマスタードスプラウト(50g)に水(100mL)を加え、105℃、0.12MPaで20分間加圧抽出した。濾紙(アドバンテック社製,保留粒子径:5μm)を用いて濾過した後、回収した濾液を減圧濃縮装置(東京理化機器製ロータリーエバポレーター,品番:N−1000−S−W)で減圧濃縮した。さらに、得られた濃縮液を遠心分離機(日立ハイテクノロジーズ社製,品番:CR22G)により18,000×gで20分間遠心分離し、上清(80mL)を得た。この抽出液のタンパク質濃度を、Bio−Rad社製のProtein Assay キットを用いたBradford法で測定したところ、1.04mg/mLであった。
上記抽出液(1.0mL)を1.5mLチューブに取り、粉末状活性炭(二村化学工業株式会社製,太閤FC)を、12.5mg、25.0mgまたは50.0mg加えて攪拌・混合した。また、対照として、上記抽出液に活性炭を加えずに同様に攪拌・混合した。それぞれ遠心分離機(日立ハイテクノロジーズ社製,品番:CR22G)により10,000×gで30分間遠心分離して活性炭を除去した上清を回収した。得られた上清をメンブレンフィルター(アドバンテック社製,cellurose acetate,径:0.45μm)に通して得られた活性炭処理溶液を、以下のタンパク濃度測定及び氷結晶化阻害活性測定に供した。
実施例15で得たそれぞれの活性炭処理溶液および対照の溶液について、タンパク質濃度をBradford法で測定した。
(1) 低温馴化後の抽出
市販のマスタードスプラウトを15℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害物質を誘導した。馴化10日目のマスタードスプラウト(50g)に水(100mL)を加え、実施例1に記載の方法と同様にして、105℃、0.12MPaで20分間加圧抽出した。得られた抽出液を減圧濃縮装置で濃縮し、水を除去してこれを固形化することにより抽出物(880mg)を得た。この固形の抽出物を、そのタンパク質濃度がBCA法により10mg/mLとなるように水に再度溶解し、抽出液(26mL)を得た。
上記抽出液(1.0mL)を1.5mLチューブに取り、これに活性炭(二村化学工業株式会社製,太閤FC)を、2.5mg、5.0mgまたは10.0mg加え、攪拌・混合した。また、対照として、上記抽出液に活性炭を加えずに同様に攪拌・混合した。それぞれ10,000×gで30分間遠心分離して活性炭を除去した上清を回収した。
実施例17で得たそれぞれの上清について、タンパク質濃度をBCA法で測定した。また、実施例16に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。この結果を表6に示す。表6のタンパク質濃度の数値は、対照の溶液について得られたタンパク質濃度に対する比として数値化した。また表6の氷結晶化阻害活性の数値は、それぞれの溶液を測定して得られた画像中の氷結晶の平均面積を、30w/v%のショ糖溶液を用いて同様に測定したときの氷結晶の平均面積に対する比として数値化した相対値を算出し、さらにその逆数を活性値として、これをタンパク質濃度で除した数値を、対照の活性値に対する比として数値化したものである。この数値が大きいほど氷結晶化阻害物質の比活性が強いことを示している。
上記実施例17(1)で得た抽出液(1.0mL)を1.5mLチューブに取り、これにシリカゲル(和光純薬工業社製,ワコーゲルC−200,200mg)を加えて攪拌・混合した。遠心分離によりシリカゲルを除去した上清を回収した。
上記実施例17(1)で得た抽出液(1.0mL)を1.5mLチューブに取り、これにアクリル系合成吸着体であるダイヤイオンHP2MG(三菱化学株式会社製,200mg)を加えて攪拌・混合した。遠心分離により吸着体を除去した上清を回収した。
上記実施例17(1)で得た抽出液(1.0mL)を1.5mLチューブに取り、これに陽イオン交換樹脂であるダイヤイオンWK20(三菱化学株式会社製,200mg)を加えて攪拌・混合した。遠心分離により吸着体を除去した上清を回収した。
上記実施例17(1)で得た抽出液(1.0mL)を1.5mLチューブに取り、実施例19〜21と同様にしてこれを遠心分離し、上清を回収した。
実施例19〜21および比較例6で得たそれぞれの上清について、タンパク質濃度をBCA法で測定した。また、実施例16に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。この結果を表7に示す。表7のタンパク質濃度の数値は、比較例6の溶液について得られたタンパク質濃度に対する比として数値化した。また表7の氷結晶化阻害活性の数値は、それぞれの溶液を測定して得られた画像中の氷結晶の平均面積を、30w/v%のショ糖溶液を用いて同様に測定したときの氷結晶の平均面積に対する比として数値化した相対値を算出し、さらにその逆数を活性値として、これをタンパク質濃度で除した数値を、比較例6の活性値に対する比として数値化したものである。この数値が大きいほど氷結晶化阻害物質の比活性が強いことを示している。
Claims (13)
- 氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物を製造するための方法であって、
氷結晶化阻害物質を含む植物を乾燥する工程;および
乾燥した植物から氷結晶化阻害物質を抽出する工程;
を含むことを特徴とする製造方法。 - 凍結乾燥法または通風乾燥法により植物を乾燥する請求項1に記載の製造方法。
- さらに、抽出物を吸着体で処理する工程を含む請求項1または2に記載の製造方法。
- 植物としてスプラウトを用いる請求項1〜3のいずれかに記載の製造方法。
- 植物としてアブラナ科植物を用いる請求項1〜4のいずれかに記載の製造方法。
- 植物としてBrassica junceaを用いる請求項5に記載の製造方法。
- 水により氷結晶化阻害物質を抽出する請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。
- さらに、植物を乾燥する前に、低温馴化する工程を含む1〜7のいずれかに記載の製造方法。
- 0℃以上、20℃以下で低温馴化を行う請求項8に記載の製造方法。
- 低温馴化を3日間以上行う請求項8または9に記載の製造方法。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の製造方法により得られる植物抽出物であって、氷結晶化阻害活性を有することを特徴とする植物抽出物。
- 請求項11に記載の植物抽出物であって、ショ糖を30w/v%含む植物抽出物の溶液を−40℃に冷却した後に−6℃まで温度を上げ、顕微鏡により観察した氷結晶の平均面積が、乾燥工程を経ない以外は同様の製造方法で得られる植物抽出物を同様に処理して測定される平均面積に比べて、5%以上低いことを特徴とする植物抽出物。
- 請求項11もしくは12に記載の植物抽出物、または請求項11もしくは12に記載の植物抽出物の乾燥物を含むことを特徴とする氷結晶化阻害物質含有組成物。
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