JP5620632B2 - ルシフェラーゼ酵素活性を保護する方法、非発光酵素に対する試験化合物の影響を決定する方法、及びキット - Google Patents

Description

本発明は概して、生物発光に関する。より詳細には本発明は、化合物ライブラリーの高スループット・スクリーニング用のルシフェラーゼ・アッセイの精度を「誤った的中」の数を減らすことによって改善するための、方法、組成物、およびキットに関する。本発明は、細胞系または無細胞系においてある種の生物特異的反応の発生または生成物を定量するために生物発光を使用するアッセイおよび試験用キットに、非常によく適している。

（相互参照）
本出願は、いずれもその全容を本願明細書に援用する、２００２年１２月２３日に出願された米国仮出願第６０／４３６，１７３号；２００３年１月３１日に出願された同第６０／４４４，２６４号；および２００３年２月１３日に出願された同第６０／４４７，３３４号の優先権の特典を主張するものである。

（発明の背景）
生物学的、生物医学的および薬剤科学の進展によって、過去とは比較にならないレベルまで研究および診断のペースが加速してきている。全ゲノムの配列が早急かつ首尾よく利用可能になるにつれて、大規模な小分子ライブラリーの構築、薬剤開発の推進能力、臨床診断試験、および還元主義から全体系的手法までの基本的研究全てにおいて、高スループット分析を容易にするアッセイが早急に必要とされている。単独のプロセスに対する分子の影響に関して、もはや分子を個々に分析する必要はない。その代りに、適切で、迅速で、信頼性が高く、かつ正確なアッセイが利用可能であれば、いくつかの生物系に対する多くの分子の影響について同時に研究することが可能である。

無細胞環境中のある種の生物特異的事象、例えば酵素阻害の発生を決定するため、あるいは細胞の生存能力を評価するための、有効で、信頼が高く、かつ正確なアッセイを使用して、潜在的な新しい薬剤物質を早急に発見し、細胞に対するこのような物質の細胞毒性または細胞増殖効果を決定することが可能である。例えば、薬剤学的な癌研究は、癌細胞の主な特徴である急速に分裂する細胞を選択的に殺傷する化合物を同定しようと試みることが多い。化合物ライブラリーの高スループット・スクリーニングを、有効な細胞生存能力アッセイと併用して、潜在的な制癌剤のような化合物を即座に同定することが可能である。細胞の生存能力に対する候補化合物の有効性は、ＡＴＰを検出することによってアッセイすることが可能である。なぜなら、ＡＴＰ生成は代謝が活発な生細胞においてのみ実現し；残留ＡＴＰは壊死性細胞死によってすぐに分解されるからである。その全容を本願明細書に援用する、「改良型ＡＴＰ検出法（Improved Method for detection of ATP）」という表題の、２００１年３月１９日に出願された特許文献１（譲受人：プロメガ（Promega ））を参照のこと。他の例では、薬剤開発の過程において進展すべき潜在的な薬剤化合物の同定を、チトクロムＰ−４５０酵素活性に対するこれらの化合物の影響を決定することによって行うことが可能である。その全容を本願明細書に援用する、「チトクロムＰ−４５０活性を測定するためのルシフェラーゼを用いる方法およびプローブ（Luminescence-based methods and probes for measuring cytochrome P-450 activity ）」という表題の、２００３年９月１９日に出願された特許文献２（譲受人：プロメガ）を参照のこと。最後の例では、プロテアーゼが、血液凝固、炎症、生殖、繊維素溶解、および免疫応答を含めた多様な生理学的プロセスに関与する巨大で重要な酵素群に相当する。プロテアーゼ阻害剤を同定することは、特定のプロテアーゼの活性の変化によって引き起こされるか、あるいは該変化によって特徴付けられる病状を、調査、治療または管理するために有用である可能性がある。その全容を本願明細書に援用する、「プロテアーゼの生物発光アッセイ（Bioluminescent Protease Assay ）」という表題の、２００２年２月１日に出願された特許文献３（譲受人：プロメガ）を参照のこと。これらと同様のアッセイ系は、細胞環境中の細胞の生存能または増殖に対する、あるいは生物特異的反応の発生に対する物質の評価を容易にするだけでなく、数千の化合物を迅速に試験することが可能な高スループット・スクリーニングをも可能にし、新たな薬剤の発見を合理化する。

分子事象を定性的または定量的に調べるためにレポーター分子または標識を使用することは、医学的診断、産業環境中の毒素および他の物質の検出、ならびに生物学、生物医学および生物化学の基礎および応用研究のために使用されるアッセイでは、充分に確立されている。このようなアッセイ系におけるレポーター分子または標識には、放射性同位体、蛍光物質、ルシフェラーゼなどの光生成酵素を含めた酵素がある。いかなるレポーター分子系においても望ましい特徴には、安全、迅速かつ信頼性高く適用および検出することが挙げられる。発光系が最も望ましい。なぜならそれらは、特に安全で感度がよいからである。

光を放出する系は周知であり、多くの発光生物、例えばある種の細菌、原生動物、腔腸動物、軟体動物、魚類、ヤスデ、ハエ、真菌、ぜん虫、甲殻類、および甲虫などから単離されている。甲虫、特にＰｈｏｔｉｎｕｓ属、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ属およびＬｕｃｉｏｌａ属のホタル、ならびＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属のコメツキムシから単離された酵素は、レポーター系における広範囲の用途が見出されている。多くのこれらの生物では、酵素触媒による酸化還元が起こり、この酸化還元において自由エネルギーの変化が用いられて分子が高エネルギー状態まで励起される。励起された分子が自然に基底状態に戻るとき、可視光が放出される。この放出された光は「生物発光」または「発光」と呼ばれる。キナーゼ活性、Ｐ−４５０活性、およびプロテアーゼ活性を調査または測定するために、発光ルシフェラーゼ・アッセイが開発されている。例えば、いずれもプロメガ・コーポレイション（PromegaCorporation ）所有の、２００３年９月１９日に出願された特許文献２（Ｐ−４５０活性）；２００１年３月１９日に出願された特許文献１（キナーゼ活性）；および２００２年２月１日に出願された特許文献３（プロテアーゼ活性）を参照のこと。

遺伝的レポーター系は、真核生物の遺伝子発現および細胞生理を研究するために広く使用されている。適用例には、受容体活性、転写因子、細胞内シグナル、ｍＲＮＡプロセシングおよびタンパク質のフォールディングの研究が挙げられる。現在、広く様々な広範囲の異なる種由来のルシフェラーゼ遺伝子、特にＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（北アメリカの一般的なホタル）、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ（ジャマイカのコメツキムシ）、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）、およびいくつかの細菌（例えばＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓおよびＶｉｂｒｉｏ属の細菌種）のルシフェラーゼ遺伝子が、非常に一般的な発光レポーター遺伝子である。発光レポーター遺伝子のアッセイの概要に関しては、非特許文献１を参照のこと。ホタル・ルシフェラーゼは、ＡＴＰ濃度の一般的なレポーターでもあり、そのレポーターとしての役割で、バイオマスを検出するために広く使用されている。ルシフェラーゼの様々な他のレポーター用途については、前記学術文献中に記載されている。他の酵素をある種の合成基質と混合させて、例えばアルカリホスファターゼをアダマンチルジオキセタンと混合させて、またはホースラディッシュペルオキシダーゼをルミノールと混合させて、発光を生み出すことも可能である。

ルシフェラーゼ遺伝子は、発光アッセイが非放射性であり、感度が良く、かつ極めて直線範囲が広いために、遺伝的レポーターとして広く使用されている。例えば、わずか１０^−２０モルほどのホタル・ルシフェラーゼを検出することが可能である。したがって、ルシフェラーゼの遺伝子活性のアッセイは、原核および真核細胞培養物、トランスジェニック植物および動物、ならびに無細胞発現系を含めた、ほぼ全ての生物学的実験系において使用される。同様に、ＡＴＰのルシフェラーゼ・アッセイは非常に感度がよく、１０^−１６モル未満のＡＴＰの検出を可能にしている。

ルシフェラーゼは、酵素特異的なルシフェリンと呼ばれる基質の酸化によって光を生成する。ホタル・ルシフェラーゼおよびすべての他の甲虫ルシフェラーゼに関しては、光の生成はマグネシウムイオン、酸素、およびＡＴＰの存在下で行われる。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを含めた、花中類のルシフェラーゼに関しては、必要とされるのはルシフェリンと酸素のみである。一般に、遺伝子活性の発光アッセイでは、反応基質および他の発光活性化試薬が、レポーター酵素を発現している疑いのある生物系中に導入される。その結果生成した発光が存在する場合、該発光は照度計または任意の適切な放射エネルギー測定装置を使用して測定される。このアッセイは非常に迅速で感度がよく、早急かつ容易に遺伝子発現データを提供し、放射性試薬は必要としない。遺伝子活性以外のレポーター・アッセイも同様に行われる。

ホタル・ルシフェラーゼを使用する従来型の遺伝子活性アッセイは、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）をアッセイ試薬中に含めて酵素の回転率（ターンオーバー）を高め、したがって発光強度を高めることによって、さらに改善されてきている。（プロメガのルシフェラーゼ・アッセイ試薬、カタログ番号Ｅ１５００、米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ・コーポレイション；１９９４年２月１日に発行された特許文献４を参照のこと。）この試薬を使用して、照度計またはシンチレーション・カウンターでルシフェラーゼ活性を容易に測定することが可能である。ＣｏＡを加えて持続的に発光させることによって改変されたルシフェラーゼ反応により、遺伝的に改変された細胞または組織中のルシフェラーゼ発現を定量するための非常に高感度で迅速なアッセイがもたらされる。

デュアル・レポーターは、実験精度を改善するために一般的に使用される。用語「デュアル・レポーター」は、１つの系の中で２つの別個のレポーター酵素を同時に発現および測定することを指す。遺伝子のレポーター実験では、現時点でデュアル・レポーター・アッセイが有効な例としては、２つの異なるレポーター遺伝子を同時に発現するように遺伝子操作した個々の細胞または細胞集団（培養物中に分散した細胞、分離組織、または動物全体など）が挙げられる。最も多いのは、１つのレポーター遺伝子の活性が特定の実験条件の影響を表し、第２のレポーター遺伝子の活性が内部対照を提供して、該内部対照によってすべての実験値群を正規化することが可能なものである。内部対照の活性に対して実験レポーターの活性を正規化することによって、細胞の生存能力またはトランスフェクション効率の違いにより引き起こされる実験の変動が最小限になる。ピペッティング容量、細胞溶解の効率、およびアッセイ効率の違いなどその他の変動要因は、効率良く排除することが可能である。したがって、デュアル・レポーター・アッセイにより、本質とは無関係な影響を減少させることによって、実験データにより信頼性の高い解釈を与えることが可能となることが多い。

遺伝子のレポーター実験では、現時点でデュアル・レポーター・アッセイが有効な例としては、２つの異なるレポーター遺伝子を同時に発現するように遺伝子操作した個々の細胞または細胞集団（培養物中に分散した細胞、分離組織、または動物全体など）が挙げられる。最も多いのは、１つのレポーター遺伝子の活性が特定の実験条件の影響を表し、第２のレポーター遺伝子の活性が内部対照を提供して、該内部対照によってすべての実験値群を正規化することが可能なものである。

酵素のデュアル・レポーター技術が有効な可能性のある無細胞の再構築系は、実験用および対照のレポーター酵素をコードする独立の遺伝物質を、同時に翻訳して、または転写と翻訳とを連結させて得られた細胞溶解物である。１つのサンプル中から実験値と対照値の両方を二重報告（デュアル・レポート）するために、イムノ・アッセイを同様に設計することが可能である。

現在、ホタル・ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ならびに分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）およびウテロフェリン（Ｕｆ；酸性ホスファターゼ）などの、様々なホスファターゼをコードする遺伝子が組み合わされて、遺伝子活性の共同レポーターとして使用されている。以下の参照文献には、これらの様々なレポーター遺伝子が遺伝子活性を二重報告するために組合せ形式で使用される代表例が提供されている：ｌｕｃおよびＧＵＳ（レッキー、エフ（Leckie, F.）ら、１９９４年）；ｌｕｃおよびＣＡＴならびにｌｕｃおよびｌａｃＺ（ジェイン、ブイ、ケイ（Jain, V.K.）およびマグラス、アイ、ティー（Magrath, I.T. ）、１９９２年）；ＣＡＴおよびｌａｃＺ（フラナガン、ダブリュー、エム（Flanagan, W.M.）他、１９９１年）；ＳＥＡＰおよびＵｆ（コンデプジ（Kondepudi ）ら、１９９４年）。プロメガのＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポーターアッセイシステムならびにプロメガのｐＧＬ３ルシフェラーゼ・レポーター・ベクター（米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ・コーポレイションから入手可能）、ならびにその全容を本願明細書に援用する、特許文献５および特許文献６（譲受人：プロメガ・コーポレイション）も参照のこと。
米国特許出願第０９／８１３，２７９号明細書 米国特許出願第１０／６６５，３１４号明細書 米国仮出願第６０／３５３，１５８号明細書 米国特許第５，２８３，１７９号明細書 米国特許第５，７４４，３２０号明細書 米国特許第５，６７０，３５６号明細書 ブロンシュタイン（Bronstein ）ら、１９９４年、アナリティカル・バイオケミストリー誌（Anal. Biochem.）、第２１９巻、ｐ．７３‐８２

ＡＴＰなどの生成物または生物特異的事象、例えばカスパーゼまたはＰ−４５０活性の阻害または活性化の発生を、酵素アッセイまたは単独／デュアル・レポーター・アッセイのいずれかの形式で検出する目的で、ルシフェラーゼをサンプルと組み合わせる場合、高スループットの薬剤スクリーニングに使用される化学ライブラリー中の１つまたは複数の化合物が、ルシフェラーゼと悪い方向に相互作用し、したがってアッセイに干渉する可能性がある。例えば、カスパーゼ・アッセイでは、カスパーゼのみを阻害する化合物は発光の減少をもたらし、ルシフェラーゼ活性のみを阻害する化合物（やはり発光を減少させる）と容易には区別されないと思われる。特に高スループット・スクリーニング手法において使用する場合、化合物による干渉に関して改善された耐性を備えたルシフェラーゼ・アッセイが必要とされている。

本発明は、特に化合物ライブラリーの高スループット・スクリーニングにおいて、１つまたは複数の化合物による干渉に関して高い耐性を有する、改良されたルシフェラーゼ・アッセイ用の方法、組成物およびキットを提供する。本発明の組成物は、ルシフェラーゼおよび耐性増大物質を含んでなり、耐性増大物質はスクリーニング・アッセイ中にルシフェラーゼを阻害あるいはルシフェラーゼと相互作用する１つまたは複数の化合物による干渉からルシフェラーゼ活性を実質的に保護する。特にサンプルが細胞溶解物またはＡＴＰａｓｅ活性を有する酵素混合物を含む場合は、任意選択でＡＴＰａｓｅ阻害剤を使用することが可能である。耐性増大物質は、界面活性剤であることが好ましい。本発明の改良型組成物は、サンプル中の精製酵素、酵素混合物、細胞溶解物または抽出物、および／または組織ホモジェネートに対する１つまたは複数の化合物の影響を決定するためにアッセイ試薬の構成成分としてルシフェラーゼを使用する任意のアッセイにおいて有用である。例えば、改良型組成物は、サンプル中に含まれるキナーゼ酵素活性、プロテアーゼ活性、Ｐ−４５０酵素活性、およびＡＴＰを使用または生成する酵素の活性に対する、１つまたは複数の化合物の影響を決定するための方法に使用することが可能である。

本発明は、ルシフェラーゼ・アッセイにおいて、化合物の干渉に対するルシフェラーゼ酵素活性の耐性を増大させるための方法を提供する。１実施形態では、本発明の方法は、化合物の干渉からルシフェラーゼ活性を実質的に保護するのに充分な量の耐性増大物質と、ルシフェラーゼ酵素を接触させることを含む。

本発明は、非発光酵素の活性に対する化合物の影響を決定する方法であって、（ａ）化合物および発光分子を提供する工程であって、前記発光分子が前記非発光酵素の基質でありかつルシフェラーゼ酵素の基質前駆体であることを特徴とする工程と、（ｂ）化合物と非発光酵素を接触させて、第１の反応混合物を生成する工程と、（ｃ）第１の反応混合物と、ルシフェラーゼ、発光分子および耐性増大物質を含む試薬組成物とを接触させて、第２の反応混合物を生成する工程であって、前記耐性増大物質が、化合物の干渉からルシフェラーゼの活性を少なくとも実質的に保護するのに有効な量存在することを特徴とする工程と、（ｄ）第２の反応混合物中の発光を検出する工程と、（ｅ）第２の反応混合物と対照反応混合物の発光を測定し比較することによって、化合物と非発光酵素との相互作用の結果生じる非発光酵素活性に対する化合物の影響について（該影響が存在する場合には）決定する工程とを含む方法も提供する。本発明の１実施形態では、これらの工程を順次実施する。本発明の他の実施形態では、工程（ｂ）と（ｃ）を同時に行う。

さらに、本発明は、非発光酵素活性に対する化合物の影響を決定する方法であって、（ａ）化合物および発光分子を提供する工程であって、前記発光分子が前記非発光酵素の基質でありかつルシフェラーゼ酵素の基質前駆体であることを特徴とする工程と、（ｂ）化合物と非発光酵素を接触させて、第１の反応混合物を生成する工程と、（ｃ）第１の反応混合物と発光分子を接触させて、第２の反応混合物を生成する工程と、（ｄ）第２の反応混合物と、ルシフェラーゼおよび耐性増大物質を含む試薬組成物とを接触させて、第３の反応混合物を生成する工程であって、前記耐性増大物質が、化合物の干渉からルシフェラーゼの活性を少なくとも実質的に保護するのに有効な量存在することを特徴とする工程と、（ｅ）第３の反応混合物中の発光を検出する工程と、（ｆ）第３の反応混合物と対照反応混合物の発光を測定し比較することによって、化合物と非発光酵素との相互作用の結果生じる非発光酵素活性に対する化合物の影響について（該影響が存在する場合には）決定する工程とを含む方法を提供する。本発明の１実施形態では、これらの工程を順次実施する。本発明の他の実施形態では、工程（ｂ）と（ｃ）、または工程（ｃ）と（ｄ）、または工程（ｂ）〜（ｄ）を同時に行う。

さらに、本発明は、非発光酵素活性に対する化合物の影響を決定する方法であって、（ａ）試験用の化合物と、発光分子、非発光酵素、ルシフェラーゼ、および耐性増大物質を含む試薬組成物とを提供する工程であって、前記発光分子が非発光酵素の基質でありかつルシフェラーゼ酵素の基質前駆体であることと、前記耐性増大物質は、化合物の干渉からルシフェラーゼの活性を少なくとも実質的に保護するのに有効な量存在することとを特徴とする工程と、（ｂ）最終反応混合物中の発光を検出する工程と、（ｃ）最終反応混合物と対照反応混合物の発光を測定し比較することによって、化合物と非発光酵素との相互作用の結果生じる非発光酵素活性に対する化合物の影響について（該影響が存在する場合には）決定する工程とを含む方法を提供する。

さらに、本発明は、非発光酵素活性に対する化合物の影響を決定する方法であって、（ａ）発光分子および試験用の化合物を提供する工程であって、前記発光分子が非発光酵素の基質でありかつルシフェラーゼの基質前駆体であることを特徴とする工程と、（ｂ）化合物、発光分子、および非発光酵素を接触させて、第１の反応混合物を生成する工程と、（ｃ）第１の反応混合物と、ルシフェラーゼを含む試薬組成物、および耐性増大物質とを接触させて、第２の反応混合物を生成する工程であって、前記耐性増大物質が、化合物の干渉からルシフェラーゼの活性を少なくとも実質的に保護するのに有効な量存在することを特徴とする工程と、（ｄ）第２の反応混合物中の発光を検出する工程と、および（ｅ）第２の反応混合物と対照反応混合物の発光を測定し比較することによって、化合物と非発光酵素との相互作用の結果生じる非発光酵素活性に対する化合物の影響を（該影響が存在する場合には）決定する工程とを含む方法を提供する。本発明の１実施形態では、これらの工程を順次実施する。本発明の他の実施形態では、工程（ｂ）と（ｃ）を同時に行う。

本発明は、非発光酵素活性に対する化合物の影響を決定する方法であって、（ａ）試験用の化合物、非発光酵素の基質、非発光酵素、およびＡＴＰまたはＡＤＰを提供する工程と、（ｂ）化合物、基質、ＡＴＰまたはＡＤＰ、および非発光酵素を接触させて、第１の反応混合物を生成する工程と、（ｃ）第１の反応混合物と、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、および耐性増大物質を含む試薬組成物とを接触させて、第２の反応混合物を生成する工程であって、前記耐性増大物質が、化合物の干渉からルシフェラーゼの活性を少なくとも実質的に保護するのに有効な量存在することを特徴とする工程と、（ｄ）第２の反応混合物中の発光を検出する工程と、（ｅ）第２の反応混合物と対照反応混合物の発光を測定し比較することによって、化合物と非発光酵素との相互作用の結果生じる非発光酵素活性に対する化合物の影響を（該影響が存在する場合には）決定する工程とを含む方法も提供する。本発明の１実施形態では、これらの工程を順次実施する。本発明の他の実施形態では、工程（ｂ）と（ｃ）を同時に行う。

本発明は、サンプル中のＡＴＰ生成酵素の活性に対する化合物の影響を決定する方法であって、（ａ）ＡＤＰおよび試験用の化合物を提供する工程と、（ｂ）化合物、ＡＤＰおよびサンプルを接触させて第１の反応混合物を生成する工程と、（ｃ）第１の反応混合物と、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、および耐性増大物質を含む試薬組成物とを接触させて、第２の反応混合物を生成する工程であって、前記耐性増大物質が、化合物の干渉からルシフェラーゼの活性を少なくとも実質的に保護するのに有効な量存在することを特徴とする工程と、（ｄ）第２の反応混合物中の発光を検出する工程と、（ｅ）第２の反応混合物と対照反応混合物の発光を測定し比較することによって、化合物とＡＴＰ生成酵素の相互作用の結果生じるＡＴＰ生成酵素活性に対する化合物の影響を（該影響が存在する場合には）決定する工程とを含む方法をさらに提供する。本発明の１実施形態では、これらの工程を順次実施する。本発明の他の実施形態では、工程（ｂ）と（ｃ）を同時に行う。

本発明は、サンプル中のＡＴＰ生成酵素の活性に対する化合物の影響を決定する方法であって、（ａ）試験用の化合物を提供し、該化合物と、ＡＤＰ、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、および耐性増大物質を含む試薬組成物とを接触させる工程であって、前記耐性増大物質が、化合物の干渉からルシフェラーゼの活性を少なくとも実質的に保護するのに有効な量存在することを特徴とする工程と、（ｂ）第２の反応混合物中の発光を検出する工程と、（ｃ）第２の反応混合物と対照反応混合物の発光を測定し比較することによって、化合物とＡＴＰ生成酵素の相互作用の結果生じるＡＴＰ生成酵素活性に対する化合物の影響を（該影響が存在する場合には）決定することを含む方法をさらに提供する。

特定の実施形態では、本発明の耐性増大物質は界面活性剤、例えばカチオン性、アニオン性、非イオン性、または両性イオン性界面活性剤を含むことが可能である。他の実施形態では、耐性増大物質は、非界面活性剤、例えばポリエチレングリコール、ポリビニルピリジン、クラウンエーテル、およびシクロデキストリンを含むことが可能である。さらに他の実施形態では、界面活性剤はＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）、Ｂｒｉｊ３５（登録商標）、Ｂｒｉｊ５８（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＮ１０１（登録商標）、ＣＨＡＰＳ（登録商標）、Ｃｈａｐｓｏ（登録商標）、Ｂｉｇｃｈａｐ（登録商標）、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６４（登録商標）、Ｒｈｏｄａｓｕｒｆ８７０（登録商標）、ＣｈｅｍａｌＬＡ−９（登録商標）、Ｓｕｌｆｏｎｙｌ４６５（登録商標）、デオキシコレート、ＣＴＡＢ、ＰｉｅｒｃｅＣ０８（登録商標）、またはＰｉｅｒｃｅＣ１０（登録商標）界面活性剤を含むことが可能である。

他の実施形態では、本発明の方法は、発光と酵素の濃度または活性とを関連付ける工程をさらに含む。
１実施形態では、酵素活性はサンプル中に含まれる。１態様では、サンプルは精製された酵素、部分的に精製された酵素、粗精製の酵素または酵素の混合物でもよく、細胞溶解物、組織ホモジェネート、または細胞内分画でもよい。

他の実施形態では、本発明の方法における非発光酵素は、プロテアーゼであってよい。１態様では、プロテアーゼは、例えばトリプシン、トリプシナーゼ、またはカスパーゼであってよい。他の態様では、カスパーゼは、カスパーゼ−３、カスパーゼ７、カスパーゼ８、またはカスパーゼ−９を含むことが可能である。他の態様では、発光基質は、プロテアーゼの基質でありかつルシフェラーゼの基質前駆体である任意の覆面基質（masked substrate）、例えばアミノ修飾されたアミノルシフェリン、あるいはそのカルボキシル保護誘導体などを含むことが可能である。

さらに他の実施形態では、非発光酵素はチトクロムＰ−４５０酵素であってよく、発光基質はＤ−ルシフェリン誘導体であってよく、耐性増大物質はＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）界面活性剤、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−９（登録商標）界面活性剤であってよい。

さらに他の実施形態では、非発光酵素はキナーゼであってよく、界面活性剤はＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、またはＣＨＡＰＳ（登録商標）界面活性剤であってよい。

他の実施形態では、本発明の方法において化合物と酵素を第１の所定時間接触させてから、基質およびＡＴＰまたはＡＤＰと接触させることが可能である。１態様では、基質およびＡＴＰまたはＡＤＰを、順次または同時に加える。

さらに他の実施形態では、ＡＴＰ生成酵素はキナーゼまたはホスファターゼであってよく、耐性増大物質はＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、またはＣＨＡＰＳ（登録商標）界面活性剤を含む。

本発明は、生細胞を含まないアッセイ・サンプル中のキナーゼ酵素の活性に対する化合物の影響を決定する方法であって、（ａ）試験用の化合物、キナーゼ基質、キナーゼ酵素、およびＡＴＰまたはＡＤＰを提供する工程と、（ｂ）化合物、基質、ＡＴＰまたはＡＤＰ、およびキナーゼ酵素を接触させて、第１の反応混合物を生成する工程と、（ｃ）第１の反応混合物と、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよび耐性増大物質を含む試薬組成物とを接触させて、第２の反応混合物を生成する工程であって、前記耐性増大物質が、化合物の干渉からルシフェラーゼの活性を実質的に保護するのに有効な量存在することを特徴とする工程と、（ｄ）第２の反応混合物中の発光を検出する工程と、（ｅ）検出した発光を、化合物を含まない、あるいは異なる濃度の化合物を含む同様の反応混合物の発光と比較することによって、キナーゼ酵素活性に対する化合物の影響を（該影響が存在する場合には）決定することを含む方法をさらに提供する。

特定の実施形態では、キナーゼ酵素はプロテインキナーゼである。
１実施形態では、耐性増大物質はＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、またはＣｈａｐｓ（登録商標）界面活性剤を含む。

他の実施形態では、化合物とキナーゼ酵素を第１の所定時間接触させてから、基質およびＡＴＰまたはＡＤＰと接触させる。
他の実施形態では、基質およびＡＴＰまたはＡＤＰを、順次または同時に加える。

さらに他の実施形態では、これらの工程を順次実施する。
さらに他の実施形態では、工程（ｂ）と（ｃ）を同時に行う。
本発明はキットも提供し、該キットは、例えば（ａ）試験化合物による干渉からルシフェラーゼ活性を実質的に保護するための耐性増大物質、（ｂ）任意選択のルシフェラーゼ酵素、（ｃ）任意選択のバッファー試薬、および（ｄ）キットを使用するための説明書を備える。１実施形態では、本発明のキットはＡＴＰおよびマグネシウムイオンをさらに備える。他の実施形態では、本発明のキットは、ルシフェリン、細胞溶解物質、および／またはＡＴＰ抽出物質をさらに備える。

本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下の詳細な説明に照らしてみると明らかになるであろう。

（発明の詳細な説明）
Ａ．定義
別途定義しない限り、すべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。別途示さない限り、引用したすべての特許文献および刊行物は、その全容が本願明細書に援用される。

デメレック（Demerec ）ら（１９６６年）が推奨する遺伝学に関する命名法を本明細書に適用する。遺伝子（および関連核酸）とそれらがコードするタンパク質とを区別するために、遺伝子に関する略語はイタリック体（または下線付き）の文字で示し、一方タンパク質に関する略語は大文字で始め、イタリック体では示さない。したがって、ｌｕｃまたはＬＵＣは、ルシフェラーゼ・ポリペプチドまたはＬｕｃをコードする、ルシフェラーゼ・ヌクレオチド配列を指す。

「単離」または「精製」ルシフェラーゼとは、ルシフェラーゼが天然の状態にある環境の構成要素から、同定かつ分離および／または回収されたルシフェラーゼを意味する。
本明細書で使用する用語「ルシフェラーゼ」は、発光反応を触媒する１つまたは複数のオキシゲナーゼを指す。したがって、ルシフェラーゼとは、生物発光を生み出す反応を触媒する酵素または発光タンパク質を指す。本発明のルシフェラーゼは、組換え体でも天然に存在するルシフェラーゼでもよいし、あるいはその変異体または突然変異体、例えば突然変異誘発によって生成された、熱安定性など天然に存在するタンパク質とは異なる１つまたは複数の性質を有する変異体であってよい。天然に存在するルシフェラーゼの非限定的な例には、海洋節足動物の間で見られるルシフェラーゼ、ホタル・ルシフェラーゼ、コメツキムシ・ルシフェラーゼ、および鉄道虫（railroad worm ）ルシフェラーゼがある。ルシフェラーゼ発光タンパク質の１つの非限定的な例は、エクオリン発光タンパク質である。

本明細書で使用する用語「サンプル」は、その広義の意味で使用され、純粋な酵素、部分的に精製された酵素、もしくは粗精製の酵素、または酵素の混合物、細胞溶解物、細胞内分画、あるいは組織ホモジェネートを含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用する用語「検出」は、試験化合物のサンプルに対する影響を定量的あるいは定性的に決定することを指す。
「アミノ酸配列の同一性の割合（％）」は、２つの配列が最適にアラインされているとき、重複する領域内において一方の配列中のアミノ酸残基のうち第２の配列中のアミノ酸残基と（に対して）同一であるものの割合として定義される。アミノ酸の同一性の割合を決定するためには、配列を局部的にアラインし、必要な場合はギャップを導入して配列同一性の最高の割合を得る。配列同一性を計算するとき、保存的置換は数えない。配列同一性を決定するためのアミノ酸配列アラインメント手法は当業者にはよく知られている。ＢＬＡＳＴソフトウェア（米国メリーランド州ベテスダ所在の米国国立生命工学情報センター（National Center for Biotechnology Information ）から入手可能）などの、公的に利用可能なコンピュータ・ソフトウェアを使用して、ペプチド配列のアラインすることが可能である。当業者は、２つのアミノ酸配列の最適なアラインメントを得るのに必要とされる任意のアルゴリズムおよびパラメータを含めて、アラインメントを測定するための適切なアルゴリズムおよびパラメータを決定することが可能である。

アミノ酸配列がアラインされると、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列が所与のアミノ酸配列Ｂと（に対して）同一である割合（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと（に対して）ある割合のアミノ酸配列の同一性を有する、または含む所与のアミノ酸配列Ａの、アミノ酸配列の同一性の割合と表すこともできる）は、以下のように計算することが可能である：
アミノ酸配列の同一性（％）＝（Ｘ／Ｙ）・１００
（式中、Ｘは、配列アラインメント用のプログラムまたはアルゴリズムによって、最適にアラインされたＡとＢにおいて同一として一致するものとして記録されたアミノ酸残基の数であり、Ｙはアラインされたアミノ酸部位の総数である）。

Ｂ．方法、組成物およびキット
本発明の１実施形態では、本発明は、ルシフェラーゼ、化合物の干渉に関する耐性を改良するための耐性増大物質、および／または１以上の任意選択のＡＴＰａｓｅ阻害剤を含んでなる性質を有する組成物を提供する。耐性増大物質は、スクリーニング中の１つまたは複数の試験化合物による干渉に対するルシフェラーゼ・アッセイの耐性を改善する、界面活性剤または金属イオン封鎖剤など１つまたは複数の物質を含む。一部の耐性増大物質、例えば界面活性剤は、抗酵素分解剤として、あるいはＡＴＰａｓｅ阻害剤として作用することも可能である。耐性増大物質はＡＴＰａｓｅ阻害剤として作用しないが、ＡＴＰａｓｅ阻害が望ましい場合、特に細胞溶解物を有するサンプルを使用する場合、１つまたは複数のＡＴＰａｓｅ阻害剤を含めてもよい。本発明は、これらの新規の組成物を使用して、単一工程または多工程プロトコルとして測定される、サンプル中の生成物または生物特異的事象の発生を検出する方法をさらに提供する。好ましくは、本発明の組成物とサンプルとの組合せから生じる発光は長い持続時間を有する、すなわち、組成物をサンプルと組合せた直後の発光に対して減少は約５０％未満である。本発明の方法は、ルシフェラーゼを用いてサンプルに対する化合物の影響または生物特異的事象の発生を検出する時間および労力を大幅に縮小する。

一般に、本発明の方法は、ルシフェラーゼ（以下に記載する配列番号１〜４で例示されるがこれらに限定されない）、耐性増大物質、および／または１以上の任意選択のＡＴＰａｓｅ阻害剤（耐性増大物質がＡＴＰａｓｅ阻害活性を有さない場合）を含む組成物（「試薬組成物」）をサンプルに加えること、ならびに発光を検出することを含み、該試薬組成物の活性によりルシフェラーゼ阻害剤に対する耐性が高まっている（すなわち、該試薬組成物は、耐性増大成分が含まれない試薬組成物より少なくとも１０％、発光シグナルが阻害されるのを保護することが可能である）ことを特徴とする。耐性増大物質は、少なくとも３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％またはそれを超えて、発光シグナルを保護することが好ましい。試薬組成物は、１つまたは複数の任意選択のＡＴＰａｓｅ阻害剤を含む溶液を凍結乾燥ルシフェラーゼに加えることによって、使用前に混合することが可能である。

前述のように、本発明は、長時間の発光を生み出す環境において実施することが可能である。安定性の消失は、活性の不可逆的な消失として定義される。本発明の試薬組成物は時間と共に安定性を失い、活性消失の量は、個々のルシフェラーゼ、耐性増大物質、任意選択のＡＴＰａｓｅ阻害剤、および存在する場合は使用する酵素安定化剤に応じて変わる。場合によっては、耐性増大物質が酵素を安定化させる能力を有し、別個の酵素安定化剤の代わりに使用することも可能である。試薬組成物の安定性は、約２０℃〜約３７℃の温度範囲で実証可能であることが好ましい。本発明の方法は、任意の量のＡＴＰを含むサンプルと共に使用することが可能であるが、非飽和量のＡＴＰ（すなわち、発光がＡＴＰの濃度と直線的に比例する範囲のＡＴＰ）を含むサンプルを、ＡＴＰレベルを検出するために設計されたアッセイにおいて使用することが好ましい。プロルシフェリン誘導体を使用するチトクロムＰ−４５０アッセイまたはプロテアーゼ・アッセイなどの、ルシフェリンのレベルを測定するアッセイに関しては、飽和レベルのＡＴＰを使用することが望ましい。なぜなら、ＡＴＰではなくルシフェリンのレベルが測定されるからである。

ルシフェラーゼ反応により生じる発光は、一般的には照度計を用いて検出されるが、他の検出手段を使用することも可能である。バックグラウンドのレベルを超える光が存在することによって、サンプル中にＡＴＰが存在することが示される。バックグラウンドのレベルの発光は、一般にサンプルが入っているのと同じ媒体中で、ただしサンプルの不在下で測定される。適切な対照反応は、当業者により容易に設計される。本発明の組成物および方法において使用される、好ましいルシフェラーゼは、安定したシグナルを生成する。すなわち好ましいルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ反応において長時間の発光（ルシフェラーゼ反応開始時の発光に対し、１時間当たりの発光の消失が５０％未満として定義される）を生み出す。本発明の好ましいルシフェラーゼは、１つのサンプルを長時間にわたって複数回分析すること、または多くのサンプルを長時間にわたって分析することを可能にするが、ここで長時間とは、ルシフェラーゼを試薬組成物と組み合わせた１時間後、より好ましくは２時間後、および最も好ましくは４時間あるいはそれ以上後である。場合によっては、本発明の組成物および方法において使用されるルシフェラーゼは、高い熱安定性を有する。

放射された光の量を定量することによって、サンプル中のＡＴＰの量も定量され、したがって、光を使用して生細胞を定量することが可能である。例えば、試験サンプルから放射された光の量を、対照サンプルから放射された光の量と比較すると、または既知量のＡＴＰおよび同じルシフェラーゼ、基質、ならびに反応条件（すなわち、温度、ｐＨなど）を使用して決定された標準曲線と比較すると、定量的なＡＴＰ値が得られる。定量にはバックグラウンド値を差し引くことが含まれることは当然である。サンプル中に存在するＡＴＰの絶対量を知る必要はなく、１サンプルから放射された発光を他のサンプルから放射された発光と比較する場合、例えば試験化合物の存在下または不在下のサンプルを比較する場合、定性的なＡＴＰ値が得られる。多くのこのような実験は、当業者であれば容易に設計可能である。

ＡＴＰａｓｅ阻害剤の例には、界面活性剤、好ましくは帯電基を有する界面活性剤、例えばカチオン性界面活性剤［例えば、ＤＴＡＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）、ＣＴＡＢ（セチルメチルアンモニウム）およびＢＤＤＡＢｒ（ベンジルジメチルドデシルアンモニウムブロミド）］、アニオン性界面活性剤（例えば、ＳＤＳおよびデオキシコレート）、および両性イオン性界面活性剤（例えば、スルホベタイン３−１０）］などがある。本発明の方法を容易にするために、ルシフェリンなどのルシフェラーゼの基質を試薬組成物中に含めることが可能である。試薬組成物の他の実施形態は、経時的にサンプル中のＡＴＰレベルが増大するのを妨げる化合物をさらに含むことが可能である。サンプル中のＡＴＰレベルの増大を妨げる化合物には、ＮａＦ、バナジウム酸（塩）およびパラ−ニトロフェニルリン酸がある。試薬組成物のさらに他の実施形態は、バッファーおよびマグネシウムをさらに含む。当業者であれば承知していることであるが、マンガンおよびカルシウムなどの他のカチオンがマグネシウムの適切な代替となりうる。

反応組成物は、任意選択の酵素安定化剤を含むことも可能である。酵素安定化剤は、分解からルシフェラーゼを安定させる任意の化合物であってよい。適切な酵素安定化剤には、タンパク質（ウシ血清アルブミンまたはゼラチンなど）、または界面活性剤（好ましくは非イオン性界面活性剤、最も好ましくはＴＨＥＳＩＴ）がある。

さらに本発明は、小分子（有機分子および無機分子、ならびに合成分子および天然に存在する分子を含む）の、無細胞酵素アッセイに対する影響を測定するのに有用であり、したがって、該小分子が薬剤として機能しうるかどうかを評価し得る。本発明は、小分子または化合物の無細胞酵素に対する影響を決定する方法に関する。当業者であれば、そのような、本発明が役に立つ多くの他のアッセイを開発することが可能である。

本発明はさらに、本発明の要素を集めてキットとする。このようなキットは、サンプル中の化合物の影響または生物学的事象の発生を決定するため、例えば、化合物の酵素に対する影響を決定するために設計される。２つ以上の目的を実現することが可能であるように、キットが多機能性であってもよい。１実施形態では、キットは１つの容器中に凍結乾燥ルシフェラーゼを含み、別の容器には、１以上の耐性増大物質、および／または１以上のＡＴＰａｓｅ阻害剤を含んだ再構成用バッファーを含む。耐性増大物質および／またはＡＴＰａｓｅ阻害剤は、すでに開示した物質および界面活性剤、例えばＤＴＡＢ、ＢＤＤＡＢｒ、ＳＤＳ、デオキシコレート、またはスルホベタイン３−１０、あるいはこれらの組合せから選択することが可能である。

本発明のキットによって、ルシフェラーゼ基質、例えばルシフェリン、セレンテラジン、またはこれらの機能的誘導体などを供給することも可能である。本発明のキットによって、マグネシウム、あるいはマンガンまたはカルシウムなどの他のカチオンを供給することも可能である。例えばサンプル中のＡＴＰを定量するために使用するキットの実施形態においては、既知濃度のＡＴＰを用いる対照実験の使用を容易にするために、ＡＴＰの入った容器を当該キット内に供給することも可能である。キットによって、サンプル中のＡＴＰの量が時間と共に増大するのを妨げる化合物（例えばＮａＦ）を供給することも可能である。キットによって、ＡＴＰａｓｅ阻害剤（例えば、ＴＣＡ、ＤＭＳＡ、ＣＴＡＢ、エタノールなど）を供給することも可能である。キットによって、バッファーを供給することも可能である。キットによって、酵素安定化剤、例えばＢＳＡまたはゼラチンまたはＴＨＥＳＩＴを供給することも可能である。

本発明のキットは、組み合わせると試薬組成物が得られるいくつかの構成要素を含むことが可能であり、該試薬組成物は（ｉ）該試薬組成物をサンプルと組み合わせた時に発光によって検出され、該試薬組成物を構築した直後（すなわち、ルシフェラーゼを含む構成要素を、耐性増大物質および任意選択のＡＴＰａｓｅ阻害剤を含む構成要素と組み合わせた０〜１０分後）に対して少なくとも約３０％の（好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の）活性を少なくとも約１時間（好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは４時間）維持し、かつ（ｉｉ）サンプル内在性のＡＴＰａｓｅ活性を、ＡＴＰａｓｅ阻害剤の不在下でのサンプルのＡＴＰａｓｅ活性と比較して、少なくとも約２５％または少なくとも約３０％（好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、あるいはこの中の任意の増分）低下させる。

ＡＴＰａｓｅ阻害剤を含む構成要素は２つ以上のＡＴＰａｓｅ阻害剤を含むことが可能であり、これらの阻害剤は、その組合せ効果によって、ＡＴＰａｓｅ阻害剤の不在下でのサンプルのＡＴＰａｓｅ活性と比較して、サンプル内在性のＡＴＰａｓｅ活性を、少なくとも約２５％または少なくとも約３０％（好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、あるいはこの中の任意の増分）低下させるような濃度で試薬組成物中に存在し、このとき試薬組成物が与えられる。

好ましくは、キットは緩衝界面活性剤溶液を含む容器を備え、前記緩衝界面活性剤溶液はｐＨが約ｐＨ６．０〜約ｐＨ９．０の範囲にある。本発明の１実施形態では、前記緩衝界面活性剤溶液は、試薬組成物中における濃度が約０．０５％〜約２％（ｗ／ｖ）の範囲であるＤＴＡＢを含み、任意選択で、試薬組成物中における濃度が約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲であるＮａＦを含み、任意選択で、試薬組成物中における濃度が約１％〜約５％の範囲であるＴＨＥＳＩＴ、すなわち耐性増大非イオン性界面活性剤物質を含む。キットは、凍結乾燥ルシフェラーゼ、好ましくは配列番号１、２、３、または４、最も好ましくは配列番号２または４の配列を有するルシフェラーゼを含む別の容器をさらに備える。好ましくは、ルシフェラーゼは、緩衝界面活性剤溶液と組み合わせて試薬組成物を作製すると濃度が１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは８０μｇ／ｍｌ以上である。凍結乾燥ルシフェラーゼを含む容器は、凍結乾燥ルシフェリンをさらに含むことが好ましい。本発明のキットは、任意選択で、ＡＴＰを測定する目的でキットを使用するための教示書をさらに含む。

好ましい実施形態では、本発明は、１つまたは複数の試験化合物の存在下におけるサンプル中の酵素（例えばキナーゼ）活性を決定するために発光測定前に必要とされる操作を減らして単一工程とする。本発明の単一工程のＡＴＰアッセイでは、酵素、基質、耐性増大物質、およびＡＴＰａｓｅ阻害剤などの、ＡＴＰ依存性酵素（例えばルシフェラーゼ）の必要な構成要素のすべてが試薬組成物中に含まれ、１度にサンプルに加えられる。いくつかの実施形態では、試薬組成物の１構成要素として酵素安定化剤が含まれる。

本発明の他の実施形態では、サンプル中のルシフェリンのレベルを検出し定量することによって、好ましくは高スループット・スクリーニング形式で、酵素、例えばプロテアーゼの活性に対する１つまたは複数の化合物の影響を決定するための方法、組成物およびキットが提供される。該方法は、ルシフェラーゼ酵素、化合物の干渉に関する耐性を改善するための耐性増大物質、およびルシフェラーゼの基質前駆体であるプロテアーゼ基質、例えばアミノ修飾されたアミノルシフェリン、あるいはそのカルボキシル保護誘導体などを含む組成物（「試薬組成物」）をサンプルに加える工程と、ルシフェラーゼにより基質由来のアミノルシフェリンを発光化合物に変換することによってサンプル中に生じた発光を、検出する工程とを含む。これらの覆面ルシフェラーゼ基質はプロテアーゼによって切断されて覆面が外される。例えば、アミノ修飾されたアミノルシフェリン、またはその誘導体は、アミノルシフェリンのアミノ基にプロテアーゼ基質が共有結合しており、プロテアーゼはこの共有結合またはペプチド結合においてその基質を切断し、ルシフェラーゼの基質であるアミノルシフェリンを放出することが可能である。その全容を本願明細書に援用する、「プロテアーゼの生物発光アッセイ（Bioluminescent protease assay ）」という表題の２００２年２月１日に出願された米国特許出願第６０／３５３，１５８号（譲受人：プロメガ・コーポレイション（Promega Corp. ））は、プロテアーゼ活性を決定するためのルシフェラーゼ・アッセイおよび有用なプロテアーゼ基質を記載している。

本発明の１態様では、１つまたは複数の化合物の存在下におけるプロテアーゼ活性、例えばカスパーゼ、トリプシンまたはトリプターゼの活性を決定するための感度のよい発光法が提供される。例えば本発明により、１つまたは複数の化合物の存在下における１つまたは複数のカスパーゼの活性を決定するための発光アッセイ法が提供される。該方法は、１つまたは複数のカスパーゼを有する疑いのあるサンプルと、甲虫ルシフェラーゼおよびアミノ修飾された甲虫アミノルシフェリンまたはそのカルボキシル保護誘導体、ならびに耐性増大物質を含む混合物とを接触させる工程を含み、前記アミノルシフェリンまたはその誘導体のアミノ基が、同アミノルシフェリンとのペプチド結合を介してカスパーゼの基質またはそのカルボキシル保護誘導体と共有結合するように修飾されていることを特徴とする。基質中に認識部位を有するカスパーゼがサンプルに含まれていれば、該基質とアミノルシフェリンを連結するペプチド結合部位においてその基質は切断され、混合物中にルシフェラーゼの基質であるアミノルシフェリンが生成する。次いで発光を検出する。本発明の方法は、発光とプロテアーゼ濃度またはプロテアーゼ活性とを関連付ける工程をさらに含むが、すなわち、発光の増大は、プロテアーゼの濃度または活性の増大と関連がある。本明細書で定義するように、基準的な基質の「機能的同等物」という用語は、基準的な基質の配列に対して１つまたは複数のアミノ酸置換を有する基質であり、その機能的に同等な基質は、基準的な基質とほぼ同じ効率で、同じプロテアーゼによって認識され切断される。好ましくは、２００２年２月１日に出願された米国特許出願第６０／３５３，１５８号に記載の発光基質を使用する方法に関しては、プロテアーゼ・アッセイの感度の増大は、少なくとも１つの基質分子またはその機能的同等物と共有結合した蛍光物質を含む複合体を使用する類似のアッセイの感度より、少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５、６、７、８、９、または１０倍、あるいはそれを超えて、例えば少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、５００、または１０００倍以上高い。したがって、本発明の方法は、サンプル中の５ｕＵ未満、あるいはそれ未満、例えば１ｕＵ未満、０．５ｕＵ未満または０．２ｕＵ未満のカスパーゼを検出することが可能である。本明細書で使用される場合、検出限界とは、バックグラウンド・ノイズよりも３ＳＤ（ＳＤ：標準偏差）だけ高いことを意味する（「ノイズ」とは、バックグラウンド値の１ＳＤであり、バックグラウンドとはカスパーゼを含まない対照である）。

アミノルシフェリンまたはローダミン−１１０のいずれかと結合させたカスパーゼ３および７の基質を使用して、アミノルシフェリン系基質の検出限界は精製カスパーゼ０．２〜０．５ｕＵであり、ローダミン−１１０系基質の検出限界は１０ｕＵであることが見出された。アミノルシフェリン系基質を用いたカスパーゼ発現細胞の検出限界は、１時間当たり細胞１５個であり、一方ローダミン−１１０系基質の検出限界は、１時間当たり細胞１５０個であることも見出された。本発明の方法は、精製された酵素、部分的に精製された酵素、あるいは粗精製の酵素調製物を含むサンプルと共に使用することが可能である。

本発明は、アスパラギン酸を含む基質を特異的に切断するプロテアーゼの活性を検出するための発光アッセイ法も提供する。この方法は、１つまたは複数のアスパラギン酸特異的プロテアーゼを有し、かつ１つまたは複数の化合物を含むサンプルと、ルシフェラーゼ、耐性増大物質、およびアミノ修飾されたアミノルシフェリンまたはそのカルボキシル保護誘導体を含む混合物とを接触させる工程を含み、アミノルシフェリンまたはその誘導体のアミノ基が、該アミノルシフェリンまたはそのカルボキシル保護誘導体とのペプチド結合を介して基質と共有結合するように修飾されていることを特徴とする。アスパラギン酸を認識部位とするプロテアーゼは、アスパラギン酸を含む基質とアミノルシフェリンとを連結するペプチド結合部位において基質を切断し、混合物中にアミノルシフェリン、すなわちルシフェラーゼの基質を生成する。次いでサンプル中の発光を検出する。アスパラギン酸を含む基質を特異的に切断する好ましいプロテアーゼには、カスパーゼ、例えばカスパーゼ１〜１４のいずれか１つがあるが、これらに限定はされない。好ましい基質はＸ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｄ（式中Ｘ_１はＹ、Ｄ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｗ、またはＰであり；Ｘ_２はＶまたはＥであり；かつＸ_３は任意のアミノ酸である）を含んでなり、例えばＤＥＶＤ、ＷＥＨＤ、ＶＤＶＡＤ、ＬＥＨＤ、ＶＥＩＤ、ＶＥＶＤ、ＶＥＨＤ、ＩＥＴＤ、ＡＥＶＤ、ＬＥＸＤ、ＶＥＸＤ、ＩＥＨＤ、またはＰＥＨＤを含む基質である。

本発明は、１つまたは複数の化合物の存在下におけるトリプシン活性またはトリプターゼ活性を決定するための発光アッセイ法も提供する。この方法は、トリプシンまたはトリプターゼおよび１つまたは複数の試験化合物を有するサンプルと、ルシフェラーゼおよびアミノ修飾されたアミノルシフェリンまたはそのカルボキシル保護誘導体、ならびに耐性増大物質を含む混合物とを接触させる工程を含み、アミノルシフェリンまたはその誘導体のアミノ基が、該アミノルシフェリンまたはそのカルボキシル保護誘導体とのペプチド結合を介してトリプシンまたはトリプターゼの基質と共有結合するように修飾されていることを特徴とする。次いで発光を検出する。発光アッセイは、少なくとも１つの基質分子またはその機能的同等物と共有結合した蛍光物質を含む複合体を用いる相応のアッセイよりも感度が高いことが好ましい。トリプシンに関しては、アルギニンおよびリシンが機能的に同等な基質である。なぜならトリプシンは、ほぼ同じ効率でこれらの残基の後のペプチド結合を切断するからである。トリプシンまたはトリプターゼ用の本発明の発光基質を使用する方法を用いると、アッセイの感度の増大は、少なくとも１つの基質分子またはその機能的同等物と共有結合した蛍光物質を含む複合体を使用するアッセイの感度より、少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５、６、７、８、９、または１０倍、あるいはそれを超えて、例えば少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０または１００倍以上高い。トリプシンの基質を使用して、リシル−アミノルシフェリン基質の検出限界が３．０ｐｇであり、一方アルギニン_２−ローダミン−１１０系基質の検出限界は１２〜３０ｐｇであることが見出された。したがって、アミノ修飾されたアミノルシフェリン基質を使用するトリプシン・アッセイは、２つの機能的に同等なトリプシン基質と共有結合したローダミン−１１０を含む複合体を用いる相応のアッセイより、少なくとも４倍感度がよい。

１つまたは複数の試験化合物の存在下でアルギニンまたはリシンを含む基質を特異的に切断するプロテアーゼの活性を決定するための発光アッセイ法をさらに提供する。この方法は、アルギニンまたはリシンを含む基質に特異的な１つまたは複数のプロテアーゼ、および１つまたは複数の試験化合物を有するサンプルと、ルシフェラーゼ、耐性増大物質、ならびにアルギニンまたはリシンを含む基質とペプチド結合によって共有結合したアミノ修飾されたアミノルシフェリンまたはそのカルボキシル保護誘導体を含む混合物とを接触させる工程を含む。次いでサンプル中の発光を検出する。このアッセイは、該基質または該基質の機能的同等物と共有結合した蛍光物質を含む複合体を用いる相応のアッセイよりも感度が高いことが好ましい。トリプターゼは、アナフィラキシー反応およびアレルギー性鼻炎などのアレルギー反応を含めた炎症状態と関係がある活性化肥満細胞から放出され、かつ便中のトリプシンはのう胞性線維症の指標である可能性があるので、本発明の方法は、抗炎症療法に役立つ可能性がある試験化合物をスクリーニングするのに非常に有用である。

本発明の方法において有用なキットも想定される。このようなキットは、本発明のアミノ修飾されたアミノルシフェリンまたはカルボキシル保護誘導体、およびそれらを使用するための教示書、ルシフェラーゼ、耐性増大物質、さらに任意選択で発光反応用のバッファーも含むことが可能である。

本発明の他の実施形態では、１つまたは複数の試験化合物の存在下でＰ−４５０活性を測定するための方法が提供される。１つまたは複数のＰ−４５０酵素および１つまたは複数の試験化合物を含む反応混合物を調製し、所定の時間インキュベートする。その後、この混合物を発光分子と接触させ、所定の時間インキュベートする。チトクロムＰ−４５０は、第１の反応において発光分子を代謝して生物発光酵素の基質とする。次いで反応混合物を、ルシフェラーゼおよび耐性増大物質と接触させる。次いで生物発光酵素は、第２の発光反応において基質に作用する。アッセイ混合物から生じた発光の量を対照混合物と比較して測定することによって、チトクロムＰ−４５０活性が間接的に決定される。対照には、Ｐ４５０酵素を水またはＰ−４５０バッファーに置き換えるか、組換えＰ−４５０膜調製物をＰ−４５０酵素が含まれない類似の調製物に置き換えるか、ＮＡＤＰＨを除去するか、またはルシフェリン基質を加える前にＰ−４５０酵素を熱変性させることが必要であろう。所定の時間インキュベーションした後に、あるいは反応開始時から連続的に、発光を測定することが可能である。その全容を本願明細書に援用する、「チトクロムＰ−４５０活性を測定するための発光を用いる方法ならびにプローブ（Luminescence-based methods and probes for measuring cytochrome P-450 activity ）」という表題の、２００３年９月１９日に出願された米国特許出願第１０／６６５，３１４号（譲受人：プロメガ・コーポレイション（Promega Corp. ））、およびその開示のその全容を本願明細書に援用する、２００３年９月１９日に出願された米国特許出願第１０／６６５，３１４号には、Ｐ−４５０活性および有用な発光基質を決定するためのルシフェラーゼ・アッセイが記載されている。

Ｐ−４５０活性は、Ｐ４５０基質またはＰ４５０基質／生物発光酵素の基質前駆体である発光分子、例えば甲虫ルシフェリンまたはルシフェリン誘導体などを使用して、決定することが可能である。本明細書で使用する用語「ルシフェリン誘導体」は、Ｄ−ルシフェリンの実質的な構造を有するある種の発光性の分子または化合物であって、恐らく１つまたは複数のチトクロムＰ４５０酵素の基質でありかつルシフェラーゼの基質前駆体であると思われるものを指す。チトクロムＰ４５０の存在下で、該化合物はルシフェラーゼの基質であるルシフェリンへと代謝される。予めＰ４５０により代謝されない場合、該化合物の一部は、ルシフェリンを伴う反応を阻害する能力を有することから示されるように、ルシフェラーゼと結合する可能性はあるが、該化合物が光生成反応における基質として代謝回転されることはない。いかなる作用理論によっても縛られずに、これらの化合物はルシフェラーゼの競合阻害剤である可能性が最も高いと考えられる。有用なＤ−ルシフェリン誘導体は、全容が本願明細書に援用される２００３年９月１９日に出願された米国特許出願第１０／６６５，３１４号明細書中に開示されている。

本発明の他の実施形態では、チトクロムＰ４５０酵素の活性を測定するための方法が提供される。Ｐ４５０基質でありかつ生物発光酵素の基質前駆体である発光分子を、１つまたは複数のチトクロムＰ４５０酵素および生物発光酵素と、同時あるいは段階的に、所定の時間接触させることが可能である。Ｐ４５０の存在下では、第１の反応において発光分子が生物発光酵素の基質へと代謝される。次いで生物発光酵素が第２の発光反応において基質に作用する。反応混合物から生じた発光の量を対照（例えばＰ４５０酵素を含まないもの）と比較して測定することによって、チトクロムＰ４５０活性を決定することが可能である。Ｐ４５０反応が起きるためには、一般にＰ４５０リダクターゼ、ＮＡＤＰＨおよびＭｇ^＋２が反応系中に存在する。同様に、一般にホタル・ルシフェラーゼの活性にはＡＴＰおよびＭｇ^＋２の存在が必要とされるが、ウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性には必要とされない。任意の適切な濃度の発光分子を、反応混合物中に使用すればよい。本発明を実施する際に、発光分子の濃度は一般に約１０ｎＭ〜１ｍＭの範囲、好ましくは特定のＰ４５０アイソフォームによる基質用量に対する応答の直線範囲内、最も好ましくはその特定の基質／Ｐ４５０アイソフォーム反応のＫｍ、または同反応のＶｍａｘである。

天然のセレンテラジンおよびセレンテラジン誘導体（セレンテラジンと総称する）である発光分子を使用して、Ｐ４５０活性を測定することも可能である。セレンテラジンは、広く様々な生物発光タンパク質、特に海洋生物ルシフェラーゼによる作用を受けると発光することが知られている。海洋生物ルシフェラーゼの例には、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、エクオリン、ガウシア属（Gaussia ）のルシフェラーゼ、発光エビ（Oplophorus）ルシフェラーゼ、およびウミホタル（Cypridina ）ルシフェラーゼがある。有用なセレンテラジンは、その開示のその全容を本願明細書に援用する、２００１年１１月２日に出願された米国特許出願第１０／０５３，４８２号に開示されているがこれらに限定はされない。セレンテラジンは、米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ・コーポレイション、および米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブス・インコーポレイティッドから入手可能である。セレンテラジンは、例えばシモムラ（Shimomura ）他、バイオケミカル・ジャーナル誌（Biochem. J. ）第２６１巻，ｐ．９１３〜２０、１９８９年；イノウエ（Inouye）他、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ誌（Biochem. Biophys. Res. Comm.）第２３３巻、ｐ．３４９〜５３、１９９７年；およびテラニシ（Teranishi ）他、アナリティカル・バイオケミストリー誌（Anal. Biochem.）第２４９巻：ｐ．３７〜４３、１９９７年に記載されているように合成することも可能である。

これらのセレンテラジンに対し、Ｐ４５０は２つのうち一方の方法で作用する。１つの反応経路では、発光分子はＰ４５０基質でありかつ生物発光酵素の基質前駆体であり、特徴的なセレンテラジンの化学発光（生物発光酵素、例えばウミシイタケ型ルシフェラーゼ不在下での発光）は示さない。第１の反応における発光分子のＰ４５０による代謝の結果、ウミシイタケ・ルシフェラーゼの基質が生成する。次いで第２の発光反応において該基質にウミシイタケ・ルシフェラーゼが作用する。次いでＰ４５０活性が、反応混合物の発光を対照反応混合物と比較して測定することによって確認される。第２の反応経路では、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体は化学発光を示し、かつウミシイタケ型ルシフェラーゼの基質である。このような発光分子がＰ４５０により代謝される結果、化学発光およびウミシイタケ型ルシフェラーゼによる活性が消失する。いずれの型の反応経路においても、Ｐ４５０単独の作用による化学発光の変化によって直接的に、あるいはウミシイタケ型ルシフェラーゼ由来の生物発光の変化によって間接的に、Ｐ４５０活性を検出することが可能である。有用なセレンテラジンは、その開示の全容を本願明細書に援用する、２００１年１１月２日に出願された米国特許出願第１０／０５３，４８２号、ならびにその開示の全容を本願明細書に援用する、２００３年９月１９日に出願された米国特許出願第１０／６６５，３１４号に開示されているが、それらに限定はされない。

本発明の他の態様では、１つまたは複数の試験化合物の存在下でＰ−４５０活性を決定するための方法が提供される。この方法に従い、１つまたは複数のＰ−４５０酵素、１つまたは複数の試験化合物、および発光分子を含む反応混合物を調製し、所定の時間インキュベートする。次いで反応混合物を所定の時間インキュベートする。Ｐ−４５０酵素は発光分子を代謝して生物発光酵素の基質へと転換する。その後、第２の反応混合物を、所定の時間ルシフェラーゼおよび耐性増大物質と接触させる。ルシフェラーゼ酵素は、第２の発光反応において基質に作用する。次いで、反応混合物から生じた発光の量を対照（例えばＰ４５０酵素を含まないもの）と比較して測定することによって、チトクロムＰ４５０活性を間接的に決定する。試験化合物がチトクロムＰ−４５０の代わりに、あるいはチトクロムＰ−４５０以外に、ルシフェラーゼと直接相互作用する場合、耐性を増大させる構成要素によって、チトクロムＰ４５０活性のさらに正確な定量が可能となる。

本発明のさらに他の実施形態では、好ましくは高スループット・スクリーニング形式で、ＡＴＰ生成酵素の活性に対する１つまたは複数の化合物の影響を測定するための、方法、組成物およびキットが提供される。この方法は、ＡＤＰ、ＡＴＰ生成酵素、および化合物を含むサンプルに、ルシフェラーゼ酵素、化合物の干渉に関する耐性を改善するための耐性増大物質、および場合によってはＡＴＰａｓｅ阻害剤を含む組成物（「試薬組成物」）を加える工程と、ルシフェラーゼにより基質（ルシフェリン）を発光化合物に変換することによってサンプル中に生じた発光を検出する工程とを含む。代表的なＡＴＰ生成酵素には、ホスホグリセリン酸キナーゼまたはホスホピルビン酸キナーゼがあるが、これらに限定はされない。その全容を本願明細書に援用する、２００１年５月２２日に発行された米国特許第６，２３５，４８０号（譲受人：プロメガ・コーポレイション）を参照すると、ＡＴＰ生成酵素の活性を決定するためのルシフェラーゼ・アッセイが記載されている。本発明の試薬組成物は、化合物の干渉に関する耐性を改善するための耐性増大物質、および／または１つまたは複数の任意選択のＡＴＰａｓｅ阻害剤（好ましくは界面活性剤）、および非内在性のＡＴＰ依存性酵素を含み、この組成物は、該酵素をＡＴＰａｓｅ阻害剤と組み合わせた直後（０〜１０分後）のその活性と比較して、少なくとも約３０％の酵素活性を少なくとも約１時間、好ましくは少なくとも約２時間、より好ましくは少なくとも約４時間維持することが可能であり、１つまたは複数のＡＴＰａｓｅ阻害剤が、サンプル内在性のＡＴＰａｓｅ活性を、ＡＴＰａｓｅ阻害剤の不在下におけるサンプル内在性のＡＴＰａｓｅ活性と比較して、少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、あるいはこの中の任意の増分だけ、全体的に低下させるのに充分な濃度で組成物中に存在することを特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、非内在性のＡＴＰ依存性酵素は、ルシフェラーゼである。

好ましい実施形態では、本発明の試薬組成物の構成要素は、使用直前に混合される２つの部分：（１）ルシフェラーゼを含む部分、および（２）１つまたは複数の化合物からの干渉に対するルシフェラーゼの耐性を改善するための耐性増大物質、および１つまたは複数の任意選択のＡＴＰａｓｅ阻害剤を含む部分、として供給することが可能である。耐性増大物質がＡＴＰａｓｅ阻害活性を有していてもよく、したがって、別個のＡＴＰａｓｅ阻害剤の代わりに使用することが可能である。細胞溶解サンプルの場合ＡＴＰａｓｅ阻害剤が存在することが望ましい。ルシフェラーゼ要素はルシフェリンをさらに含むことが可能であり、凍結乾燥されていることが好ましい。ルシフェラーゼ要素は、凍結乾燥用の賦形剤、タンパク質（ルシフェラーゼ）安定化剤、マグネシウム（または他のカチオン）、およびマグネシウム・キレート剤（または他のカチオン・キレート剤）を任意選択で含む。ＡＴＰａｓｅ阻害剤要素は、バッファー、２価カチオン金属キレート剤、マグネシウム（または他のカチオン）、消泡剤、抗ＡＴＰ生成酵素剤（例えばＮａＦ）、酵素安定化剤（例えばＴＨＥＳＩＴ）、およびサンプル中に存在するＡＴＰの量を安定化させるＡＴＰａｓｅ阻害剤（および場合によってはキナーゼ阻害剤）が存在する場合に細胞内ＡＴＰを長時間検出および定量するための信頼性のある有効な方法をもたらす物質をさらに含むことが可能である。

Ｃ．ルシフェラーゼ
その触媒生成物が光を含むルシフェラーゼ酵素は、高い感度、検出可能な生成物を提供し、ＡＴＰまたは他の分子（ルシフェリンまたはルシフェリン誘導体など）の容易な測定を可能にする。しかしながら、任意の発光生成酵素を、本発明の方法および組成物において使用することが可能である。

その最も基本的なレベルにおいて、ルシフェラーゼは発光を生成する能力により定義される。より詳細には、ルシフェラーゼとは、基質であるルシフェリンの酸化を触媒することによってオキシルシフェリンおよび光子を生成する酵素である。

今日までに、５分類のルシフェラーゼが同定されている（ジョーンズ（Jones ）他、１９９９年；トムソン（Thomson ）他、１９９７年）。これらの中で、一般的なホタル（ホタル科（Lampyridae））のルシフェラーゼなどの、甲虫ルシフェラーゼは、固有の進化起源を有する、異なる分類を形成する（マッケルロイ（McElroy ）他、１９６９年；ホワイト（White ）他、１９６９年；ホワイト他、１９７５年）。甲虫ルシフェラーゼは、文献中ではホタル・ルシフェラーゼと呼ばれることが多い；しかしながら、ホタル・ルシフェラーゼは実際には、甲虫ルシフェラーゼ類の亜群である。甲虫ルシフェラーゼは、甲虫のランタン自体から、あるいは当分野でよく知られているタンパク質発現系から、精製することが可能である（バルドウィン（Baldwin ）およびグリーン（Green ）、２０００年；ベニー（Beny）およびドリボ（Dolivo）、１９７６年、ブランチニ（Branchini ）他、１９８０年；フィリポバ（Filippova ）他、１９８９年）。

甲虫ルシフェラーゼ、特に北アメリカ産ホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ由来のホタル・ルシフェラーゼは、当分野でよく知られている。Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｙ）は、その遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質としての計算によれば、６１ｋＤａの約５５０アミノ酸からなる。ホタル・ルシフェラーゼの他の例は、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａのホタル・ルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｅ２；５４５アミノ酸、ＧｅｎＢａｎｋ２１９０５３４、（イェー（Ye）他、１９９７年））である。ＬｕｃＰｐｅ２に由来する突然変異ルシフェラーゼ（例えばＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８（７８−ＯＢ１Ｏとしても知られている）、配列番号１；ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０（９０−１Ｂ５としても知られている）、配列番号２、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３（１３３−１Ｂ２としても知られている）、配列番号３、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６（１４６−１Ｈ２としても知られている）、配列番号４）を、本発明の方法において使用することが可能である。さらに、本明細書で述べる制約に見合う任意のルシフェラーゼを、本発明の組成物、方法およびキットにおいて使用することが可能である。ＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３、およびＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６を作製する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０９２５に開示されている。

いくつかの実施形態では、単離および／または精製されたルシフェラーゼを本発明において使用することが可能である。ルシフェラーゼの天然における環境から混入する要素は、ルシフェラーゼの診断上または治療上の用途を一般に妨害すると思われる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性物質が挙げられる。純度を確かめるための１つの技法は、クーマシーブルーまたは銀染色を使用して、非還元または還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を施すことである。単離ルシフェラーゼには、組換え細胞内に存在する状態（ｉｎ ｓｉｔｕ）のルシフェラーゼが含まれる。なぜなら、ルシフェラーゼの天然における環境のうち少なくとも１つの要素が存在しないからである。ルシフェラーゼを生成する生物試料から、あるいは所望のルシフェラーゼをコードする外来ポリヌクレオチド（例えば、７８−ＯＢ１０、９０−１Ｂ５、１３３−１Ｂ２、または１４６−１Ｈ２をコードするヌクレオチド；それぞれ配列番号５〜８）を発現する細胞から、ルシフェラーゼを単離することが可能である。このような技法は、当業者にはよく知られている。

甲虫ルシフェラーゼの天然に存在する基質は、ホタル・ルシフェリン、すなわち多環複素環式有機酸のＤ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−Δ^２−チアゾリン−４−カルボン酸（ルシフェリン）である。ルシフェリンは天然から（例えばホタルから）単離してもよいし、合成してもよい。合成ルシフェリンは、天然に存在するルシフェリンと同じ構造を有していてもよいし、同様に機能する限りは誘導体化してもよい（ボーイ（Bowie ）他、１９７３年、ブランチニ（Branchini ）、２０００年；クライグ（Craig ）他、１９９１年；ミスカ（Miska ）およびゲイガー（Geiger）、１９８７年；ヤン（Yang）およびトマソン（Thomnason ）、１９９３年）。ルシフェリンの誘導体の例には、Ｄ−ルシフェリンメチルエステル、Ｄ−ルシフェリル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｄ−ルシフェリル−Ｌ−Ｎα−アルギニン、Ｄ−ルシフェリン−ＯサルフェートおよびＤ−ルシフェリン−Ｏ−ホスフェート（ミスカおよびゲイガー、１９８７年）、サンプル中の構成成分により加水分解またはエステラーゼ作用を受けてルシフェリンになる、ルシフェラーゼのエステル（クライグ他、１９９１年；ヤンおよびトマソン、１９９３年）がある。有用なルシフェリン類似体の他の例には、それぞれ緑色および赤色の光スペクトルで光を発する、ナフチル−およびキノリルルシフェリンがある（ブランチニ（Branchini ）他、１９８９年）。ルシフェリンの商業的供給元は複数存在する（例えば、米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ・コーポレイション、米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブス）。

甲虫ルシフェラーゼに触媒される発光反応（ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応）には、ホタル・ルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウム、および分子状酸素が関与する。最初の反応では、ホタル・ルシフェリンとＡＴＰが反応して、無機ピロリン酸が除かれたルシフェリルアデニレートを形成する。ルシフェリルアデニレートは、ルシフェラーゼの触媒部位と強く結合したままの状態である。この形態の酵素が分子状酸素に曝されると、酵素に結合しているルシフェリルアデニレートが酸化されて、電気的に励起された状態のオキシルシフェリンが生成する。励起状態の酸化ルシフェリンは、基底状態に戻るときに光を放出する。

この反応におけるＡＴＰの機能は、ＡＴＰ類似体（例えばｄＡＴＰ）によって行うことが可能であると企図される。他のイオン（例えばＭｎ^２＋またはＣａ^２＋）が、マグネシウムイオンの代わりとして働くことが可能であることも企図される。さらに、酸素はこの反応の反応物であるので、反応は嫌気的条件下で実施するべきではない。しかしながら、本発明を実施する際に、空気中に存在する酸素を越えて酸素を与えることは一般に必要ではない。反応溶液中に充分な酸素が存在すれば、反応を密閉容器中で行うことが可能である。

大部分のルシフェラーゼ−ルシフェリン反応は、短命の閃光を生じる。しかしながら、本発明の方法で使用することが可能ないくつかのルシフェラーゼ、例えばＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６およびＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０ルシフェラーゼは、本発明の条件下において、試薬組成物をサンプルと組み合わせた後に、１時間当たりの発光の損失が５０％未満の、「グロー型」の発光シグナルを生成する。

本発明の試薬組成物中で使用する場合に発光を生み出す能力を保持し、かつ試薬組成物が本発明の安定性要件を満たすのを妨げない、任意のルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異体、ルシフェラーゼ断片、または変異ルシフェラーゼ断片を、本発明において使用することが可能である。

完全長のルシフェラーゼ変異体は、天然の配列を有する完全長ルシフェラーゼ配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％のアミノ酸配列同一性、および最も好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有し、発光を生み出す能力を保持するであろう。通常、変異ルシフェラーゼ断片は、少なくとも約５０アミノ酸長であり、少なくとも約６０アミノ酸長であることが多く、少なくとも約７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または５５０アミノ酸長以上であることがさらに多く、発光を生み出す能力を保持している。ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ断片、ルシフェラーゼ変異体または変異ルシフェラーゼ断片を、ルシフェラーゼではない他のアミノ酸配列と融合させ、かつ本発明における機能を維持させることも可能である。

本発明の組成物および方法において使用する、完全長ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ断片、ルシフェラーゼ変異体、および変異ルシフェラーゼ酵素の断片は、天然の供給源から精製してもよいし、いくつかの技法、すなわち（１）化学合成、（２）ルシフェラーゼの酵素（プロテアーゼ）による消化、および（３）組換えＤＮＡ法などによって調製してもよい。化学合成法は、プロテアーゼを使用して特定の部位を切断する方法と同様に、当分野ではよく知られている。ルシフェラーゼタンパク質のセグメントを生成するために、ルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ変異体のセグメントを作製し、次いで大腸菌などの宿主生物体中で発現させることが可能である。エンドヌクレアーゼ消化またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法によって、当業者は、特定の断片を無制限に供給させることが可能である。ルシフェラーゼ断片は、少なくとも１つの生物学的活性、および触媒活性を天然のルシフェラーゼと共有することが好ましいが、活性のレベルは天然のルシフェラーゼの活性レベルと異なっていてもよい。

任意の種類のアミノ酸置換、挿入もしくは欠失、またはこれらの組合せを使用して、変異体ルシフェラーゼを生成することが可能である。しかしながら、保存的アミノ酸置換（同類アミノ酸置換）を有するルシフェラーゼが活性を保持している可能性がより高い。有用な保存的置換を、表Ａ「好ましい置換」中に示す。ある分類のアミノ酸が同じ分類の他のアミノ酸と置換される保存型の置換は、その置換がルシフェラーゼ活性を害さない場合、本発明の範囲内に入る。

（１）ポリペプチド骨格の構造、例えばβ−シート構造もしくはαらせん構造など、（２）電荷または（３）疎水性、あるいは（４）標的部位の側鎖の嵩、に影響を与える非保存的置換は、ルシフェラーゼ機能を変化させる可能性がある。残基は、表Ｂに示す共通の側鎖の性質に基づいて、いくつかの群に分けられる。非保存的置換は、これらの群の１つのメンバーを他の群のメンバーと交換することを伴う。

変異体ルシフェラーゼ遺伝子または遺伝子断片は、オリゴヌクレオチドを仲介した（部位指定）突然変異誘発法、アラニン・スキャニング、およびＰＣＲ突然変異誘発法などの、当分野で知られている方法を使用して作製することが可能である。部位指定突然変異誘発（カーター（Carter）、１９８６年；ゾラー（Zoller）およびスミス（Smith ）、１９８７年）、カセット突然変異誘発、制限酵素部位選択突然変異誘発（ウェルズ（Wells ）他、１９８５年）、または他の知られている技法をクローニングされたＤＮＡに使用して、ルシフェラーゼ変異体ＤＮＡを生成することが可能である（アウスベル（Ausubel ）他、１９８７年；サムブルック（Sambrook）１９８９年）。

１．選択したルシフェラーゼ
基質を酸化する際に光子を放出する任意のルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ断片、またはそれらの変異体を、本発明で使用することが可能である。熱安定性、化学的安定性、およびシグナル安定性などの、他の望ましい特徴も企図される。さらに、ルシフェラーゼを他のアミノ酸配列と融合させることが可能であり、かつ本発明における機能性を保つようにすることも可能である。このような酵素はｉｎ ｖｉｔｒｏで合成してもよいし、あるいは他の生物から単離してもよい。

天然に存在するルシフェラーゼは、例えば細菌、単細胞緑藻、腔腸動物、甲虫（Ｐ．ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ以外）、魚類、および他の生物において見出すことが可能である。化学的には、すべてのルシフェラーゼが、分子状酸素と様々なルシフェリンとの発エルゴン反応を伴い、その結果光子を生成する（ハスティングス（Hastings）、１９９６年；ハスティングス（Hastings）およびウィルソン（Wilson）、１９７６年；ウィルソン（Wilson）およびハスティングス（Hastings）、１９９８年、ウッド（Wood）他、１９８９年）。

甲虫由来のルシフェラーゼ以外のルシフェラーゼを使用するには、酸化の際に化学的かつ電気的に不安定な中間体または検出可能な酵素生成物を生成する、適切なルシフェリン分子が必要である。他の基質、および検出可能な酵素生成物を生成する他のＡＴＰ依存性酵素を使用することも可能である。検出可能な生成物には、光子、放射標識生成物、不溶性もしくは可溶性の色原体、または肉眼もしくは装置を使用することによって検出することが可能なその他の生成物がある。

いくつかの実施形態では、本発明のルシフェラーゼは、ＡＴＰ依存的で光子を放出する触媒活性を有する。他の実施形態では、本発明のルシフェラーゼは、ＡＴＰａｓｅ阻害剤の存在下において、同じ反応条件下でのＰ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｙ）の化学的安定性のレベルと比較して高い化学的安定性を有する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法において使用するルシフェラーゼは安定したシグナルを生成する。すなわち該ルシフェラーゼはルシフェラーゼ反応において長時間の発光を生成し、長時間の発光とはルシフェラーゼ反応開始時の発光に対して、１時間当たりの発光の消失が５０％未満であるとして定義される。さらに他の実施形態では、本発明のルシフェラーゼによって、ルシフェラーゼ反応が開始された１時間後、より好ましくは２時間後、最も好ましくは４時間以上後に、経時的に１サンプルを多数回分析すること、または経時的に多くのサンプルを分析することが可能になる。場合によっては、本発明の組成物および方法において使用するルシフェラーゼは、熱安定性を高めたものである。ルシフェラーゼに一例は、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６（配列番号４）である。本発明において有用な酵素の他の例には、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８（配列番号１）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０（配列番号２）、およびＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３（配列番号３）があるが、これらに限定はされない。

ルシフェラーゼＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８（配列番号１）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０（配列番号２）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３（配列番号３）およびＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６（配列番号４）は、Ｐ．ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａの突然変異体（Ｔ２４９Ｍ）から作製した。このタンパク質をコードする核酸配列に反復（recursive ）突然変異誘発を含む突然変異誘発法を施してから、熱安定性、シグナル安定性、および基質結合性に関してスクリーニングしたが、これはウッド（Wood）およびホール（Hall）（国際公開公報第９９１４３３６号、１９９９年）に全容が記載されている。

２．化学的に安定なルシフェラーゼ
本明細書で使用する「化学的に安定なルシフェラーゼ」とは、一般にＡＴＰａｓｅを阻害し、ＬｕｃＰｐｙなどの化学的に安定でないルシフェラーゼの機能を害する化合物の存在下または条件下において、活性を維持するルシフェラーゼと定義する。同定した上記のルシフェラーゼＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８（配列番号１）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０（配列番号２）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３（配列番号３）およびＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６（配列番号４）は、ＡＴＰａｓｅ阻害剤に対して高い化学的安定性を有することが、本明細書に記載されている。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明のルシフェラーゼは、サンプル内在性のＡＴＰａｓｅ活性を全体で少なくとも約２５％（好ましくは少なくとも約３０％、さらにより好ましくは少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、あるいはこの中の任意の増分）低下させるのに充分な量のＡＴＰａｓｅ阻害剤、好ましくは界面活性剤、例えばカチオン性界面活性剤（好ましくはＤＴＡＢまたはＢＤＤＡＢｒ）、アニオン性界面活性剤（好ましくはデオキシコレートまたはＳＤＳ）、または両性イオン性界面活性剤（好ましくはスルホベタイン３−１０）、あるいはこれらの組合せと接触させた後に、少なくとも約１時間（好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも４時間）、発光によって測定される酵素活性を、ＡＴＰａｓｅ阻害剤の不在下でのサンプルのＡＴＰａｓｅ活性と比較して少なくとも約３０％（好ましくは少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％）維持するルシフェラーゼを含む。

酵素の化学的安定性は、酵素活性の経時的な低下率によって示すことも可能である。例えば、ＡＴＰａｓｅ阻害剤とルシフェラーゼを混合することによって試薬組成物を作製した直後（０〜１０分後）と、その後いくつかの時点で、試薬組成物の等分試料をサンプルに加え、その直後に相対光度単位（ｒｌｕ）の測定値を得る。これらの測定値をグラフ化して、経時的に試薬組成物の酵素活性の低下の傾向を決定することが可能である。

化学的に安定なルシフェラーゼ（例えばＰｐｅ２ｍ７８、Ｐｐｅ２ｍ９０、Ｐｐｅ２ｍ１３３、およびＰｐｅ２ｍ１４６）は、複数の界面活性剤の溶液中でも活性を保持している。具体的には、０．０１％、好ましくは０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、最も好ましくは０．２５％のＣＨＡＰＳ（３−（［３−コルアミドプロピル］ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート）を、少なくとも０．０１％、好ましくは０．０５％、０．１％、０．２％、および最も好ましくは０．３％または１．０％のＢＤＤＡＢｒ、タウロコール酸またはタウロリトコール酸、またはＤＴＡＢとともに含む溶液、あるいは０．０１％、好ましくは０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、最も好ましくは１．０％のタウロコール酸またはタウロリトコール酸を、少なくとも０．０１％、好ましくは０．０５％、０．１％、０．２％、および最も好ましくは０．３％または１．０％のＢＤＤＡＢｒ、ＤＴＡＢ、またはＣＨＡＰＳとともに含む溶液である。その他の複数の界面活性剤溶液であって、該溶液中でＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３およびＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６が活性を保持する溶液には、０．０１％、好ましくは０．０５％、最も好ましくは０．１％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００を、少なくとも０．０１％、好ましくは０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％、最も好ましくは１．０％のＢＤＤＡＢｒ、ＤＴＡＢ、またはＣＨＡＰＳとともに含む溶液、あるいは０．０１％、好ましくは０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、最も好ましくは１．０％のタウロコール酸またはタウロリトコール酸を、少なくとも０．０１％、好ましくは０．０５％、０．１％、０．２％および最も好ましくは０．３または１．０％のＢＤＤＡＢｒ、ＤＴＡＢ、またはＣＨＡＰＳとともに含む溶液；あるいは０．０５％、１．０％、２．０％、４．０％、好ましくは２％のポリエチレングリコール４００ドデシルエーテル（ＴＨＥＳＩＴ）を、少なくとも０．０５％、好ましくは０．１％、０．２％および最も好ましくは０．３％または１．０％のＢＤＤＡＢｒ、ＤＴＡＢ、またはＣＨＡＰＳとともに含む溶液がある。

３．熱に安定なルシフェラーゼ
いくつかの実施形態では、発光を生成する熱に安定なルシフェラーゼ、または検出可能なシグナルを生成するその他の熱に安定なＡＴＰ依存性酵素を本発明の方法に使用すること、特にＡＴＰ検出の直前に熱処理するサンプル中で使用することが可能である。熱に安定なポリペプチドは、他のタンパク質を失活または変性させる温度において活性状態を維持する。ＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３およびＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６酵素は、天然に見られるルシフェラーゼ、または天然から単離したポリヌクレオチドにコードされたルシフェラーゼと比較して、高い熱安定性を示す。

Ｄ．キット
本発明をキットとして供給するとき、組成物の異なる構成要素を別個の容器中にパッケージし、使用前に混合することが可能である。本発明の異なる構成要素が、これらのパーツのサブセットを構成してもよく、本発明の適用を容易にする、あるいは保存寿命を延ばす任意の方法で組み合わせることが可能である。

以下の項は、キットの構成要素のいくつかの例を提供することを目的とする。当業者は、本発明のキット中に与えられる実際の構成要素が、どの特定のアッセイを実施するかに応じて変わることを理解しているであろう。

１．ルシフェラーゼ−ルシフェリン構成要素
ＡＴＰ依存性反応を触媒し発光を生成するすべてのルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異体、ルシフェラーゼ断片および変異体ルシフェラーゼ断片について、本発明における使用が企図される。いくつかの実施形態ではルシフェリンが排除され、例えば、ユーザが彼／彼女の選択でルシフェリンを供給することが可能であり、あるいはルシフェリンを別途提供することも可能である。提供されるルシフェリンの種類は様々でよいが、提供されるルシフェラーゼの種類に適した基質でなければならない。

１実施形態では、キットは無水調製物としてルシフェラーゼを供給する。ルシフェラーゼの無水調製物は、真空下で水を除去して凍結乾燥してもよいし、結晶化してもよいし、氷結乾燥してもよいし、あるいはルシフェラーゼを失活させずに水を除去する任意の他の方法で調製可能である。血清アルブミンまたはＰｒｉｏｎｅｘ（Ｒ）などの、調製物に嵩を与えルシフェラーゼを安定化させる賦形剤も含まれてよい。他の実施形態では、グリセロールまたはその中でルシフェラーゼが安定な他の溶媒を含む水性組成物に、ルシフェラーゼを懸濁させることが可能である。当業者は、本発明の組成物および方法において適切に機能する様々な構成成分の量を容易に決定することが可能である。

２．耐性増大物質
発光アッセイによって、生物学的または生物化学的プロセスと光の出力との間の相関関係が与えられる。化合物による干渉は、相関関係をある程度妨害したり変化させたりする可能性がある。本発明の「耐性増大物質」は、ルシフェラーゼのアッセイ系における干渉化合物の影響を最小限に、干渉化合物のない系に対して少なくとも約１０％、好ましくは約３０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、および最も好ましくは約１００％にすることによって、ルシフェラーゼ活性を実質的に保護することが可能であり、アッセイを相関関係に近づける。これらの耐性増大物質には、界面活性剤（例えばカチオン性、アニオン性、非イオン性、および／または両性イオン性）、および非界面活性剤があるが、これらに限定されない。非界面活性剤の耐性増大物質の例には、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、およびシクロデキストリンがあるが、これらに限定されない。個々のルシフェラーゼ・アッセイに適した、個々の耐性増大物質の選択および使用量は、既知のルシフェラーゼ阻害剤を含むルシフェラーゼ・アッセイにおいて様々な濃度の物質を滴定すること、およびこのようなアッセイから得た発光を、耐性増大物質を使用しないかあるいは少量使用する第２のアッセイと比較することを含めた、いくつかの方法によって決定することが可能である。任意の適切な一般的ルシフェラーゼ阻害剤を、耐性増大物質を同定しスクリーニングするための、標準阻害剤として使用することが可能である。以下の例は、いくつかの耐性増大物質をスクリーニングし、該物質をスクリーニングするための標準として周知の一般的なルシフェラーゼ阻害剤であるイソリクイリチゲニン（isoliquirtigenin）を使用するための代表的手法を提示する。

本発明を実施する際に、１つまたは複数の耐性増大物質をルシフェラーゼ・アッセイに使用して、酵素または細胞活性に対する１つまたは複数の化合物の影響を決定することが可能である。試薬中に存在する耐性増大物質の量は、スクリーニング中、１つまたは複数の化合物による干渉からルシフェラーゼの活性を少なくとも実質的に保護するために有効であるような量である。スクリーニング中、特に高スループット・スクリーニング中、１つまたは複数の化合物に対するルシフェラーゼの耐性を増大させるように機能する限りは、任意の適切なカチオン性、アニオン性、両性イオン性、または非イオン性界面活性剤を本発明において使用することが可能である。例えば、界面活性剤の適切な例には、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（非イオン性）；Ｂｒｉｊ３５（非イオン性）；Ｂｒｉｊ５８（非イオン性）；ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（非イオン性）；ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５（非イオン性）；ＴｒｉｔｏｎＮ１０１（非イオン性）；Ｃｈａｐｓ（両性イオン性）；Ｃｈａｐｓｏ（両性イオン性）；Ｂｉｇｃｈａｐ（非イオン性）；Ｔｈｅｓｉｔ（非イオン性）；ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６４（非イオン性）；Ｒｈｏｄａｓｕｒｆ８７０；ＣｈｅｍａｌＬＡ−９；Ｓｕｌｆｏｎｙｌ４６５；デオキシコレート（アニオン性）；およびＣＴＡＢ（カチオン性）；ＰｉｅｒｃｅＣＯ８；ＰｉｅｒｃｅＣ１０；およびＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−９（登録商標）があるが、これらに限定はされない。１つまたは複数の試験化合物の存在下における酵素活性を決定するための、ルシフェラーゼ・アッセイに関しては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｐ−４５０およびキナーゼ活性用）、Ｔｈｅｓｉｔ（キナーゼ用）、ＣＨＡＰＳ（キナーゼ活性用）が好ましい。

３．ＡＴＰａｓｅ阻害剤構成要素
サンプルのＡＴＰ濃度を測定するときに特に有用な１実施形態では、本発明のキットは、他の機能的要素、例えばバッファー、消泡剤、酵素安定化剤などを任意選択で含む溶液中に、１つまたは複数のＡＴＰａｓｅ阻害剤を含む要素からなる。この要素は、作業溶液として、あるいは濃縮物として、供給することが可能である。ＡＴＰａｓｅ阻害剤要素（例えばＣＴＡＢ）を単独でパッケージ化することも可能である。ＡＴＰａｓｅ阻害剤は、本明細書で前に記載したＡＴＰａｓｅ阻害剤のいずれであってもよい。この要素は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を害する可能性がある金属イオンをキレート化する物質（例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）、マグネシウム（硫酸塩または塩化物などの塩として供給されることが好ましい；あるいは他の機能的に同等なカチオン）、消泡剤、およびＡＴＰ生成酵素の阻害剤（例えばＮａＦ）を、さらに含むことが可能である。作業溶液のｐＨを維持するバッファー、例えばクエン酸もしくはＭＥＳ（例えばナトリウムまたは遊離酸もしくは遊離塩基などの塩として供給することが可能である）、または任意の他の適切なバッファーを使用することが可能である。キットの目的に応じて、教示書、ならびに標準または対照の役割を果たしうる物質もキットに含めることが可能である。

本発明の１態様は、ＡＴＰａｓｅ阻害剤、好ましくはＡＴＰａｓｅを阻害する界面活性剤、より好ましくは帯電基を含む界面活性剤、例えばカチオン性界面活性剤（好ましくはＤＴＡＢまたはＢＤＤＡＢｒ）、アニオン性界面活性剤（好ましくはデオキシコレートまたはＳＤＳ）、または両性イオン性界面活性剤（好ましくはスルホベタイン３−１０）である。このような阻害剤は、ルシフェラーゼがルシフェラーゼ−ルシフェリン反応のためにサンプル中のＡＴＰを利用することが可能になる前に、サンプル内在性のＡＴＰａｓｅによってＡＴＰがアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）とアデノシン１リン酸（ＡＭＰ）とに処理されてしまうのを妨げる。ＡＴＰａｓｅ阻害剤は、直接的または間接的にＡＴＰａｓｅを失活させることが可能である。ＡＴＰａｓｅ阻害剤は、ＡＴＰａｓｅの活性部位のいずれかに結合することによって基質の結合を妨げることや、変性作用を有する界面活性剤などによってＡＴＰａｓｅを変性させることが可能であり、あるいはＡＴＰａｓｅをその基質から選択的に隔離することが可能である。

本発明の１実施形態は、ＡＴＰａｓｅ阻害剤として作用するＤＴＡＢまたはＢＤＤＡＢｒ界面活性剤などのカチオン性界面活性剤を使用する。しかしながら、他のカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤（例えばＳＤＳおよびデオキシコレート）および両性イオン性界面活性剤（例えばスルホベタイン３−１０）などの、他のＡＴＰａｓｅ阻害剤も企図される。

ＤＴＡＢまたはＢＤＤＡＢｒに関しては、試薬組成物中の濃度は、試薬組成物中に約０．０２％〜約５．０％の範囲、より好ましくは約０．０５％、さらにより好ましくは約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％および１．５％、ならびに最も好ましくは約１．０％の最終濃度であることが好ましい。

試薬組成物中に含めるための他の非カチオン性界面活性剤ＡＴＰａｓｅ阻害剤が企図される；その要件は、ＤＴＡＢなどの阻害剤が試薬組成物中に存在するとき、サンプル内在性のＡＴＰａｓｅ活性を少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および最も好ましくは約１００％阻害し、このとき前記試薬組成物が、該試薬組成物をサンプルと組み合わせた後に発光によって測定すると、ルシフェラーゼをＡＴＰａｓｅ阻害剤と組み合わせた直後の試薬組成物の活性と比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および最も好ましくは約１００％の活性を少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも２時間保つことが可能であることである。ＡＴＰａｓｅ阻害剤として機能する適切な非カチオン性界面活性剤と考えられるものには、アニオン性界面活性剤（好ましくはＳＤＳおよびデオキシコレート）、両性イオン性界面活性剤（好ましくはスルホベタイン３−１０）がある。個々のＡＴＰａｓｅ阻害剤の濃度は、使用する阻害剤、およびある程度は分析するサンプルに応じて変わるであろう。当業者は、試薬組成物中に含めるＡＴＰａｓｅ阻害剤の適切な濃度を測定するための方法を熟知しており；例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ由来のシグナルを経時的に調べ、様々な濃度の候補ＡＴＰａｓｅ阻害剤を有するサンプルと、既知のＡＴＰａｓｅ阻害剤を全く含まないサンプルとを比較すればよい。

本発明の方法において機能的な最も好ましい濃度、あるいは濃度範囲ですら、異なる界面活性剤に応じて変わるであろうことは、充分に予想される。例えば、本発明の方法において機能的なＳＤＳ濃度は、約０．００２％である。本発明で使用する界面活性剤に関する機能的な濃度の範囲は、本明細書で開示する方法を使用して、当業者により容易に測定することが可能である。

いくつかのＡＴＰａｓｅ阻害剤は、本発明において有用なある濃度において、水溶液に不溶であるか、あるいは溶解度が低い可能性があるも考えられる。これらの化合物を、本発明の組成物および方法において使用するために、有機溶液（例えば、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミド）中に最初に溶かしてから試薬組成物中で希釈することが可能である。

４．ＡＴＰ生成酵素の阻害剤
一部のサンプル中には、キナーゼなどの酵素が活性を有し、ＡＴＰの連続的な生成が可能である場合がある。ＡＴＰ濃度は特定の時点で測定されるので、このような酵素活性が調べられていない状態である場合、ＡＴＰ濃度が過大評価されることになる。このようなＡＴＰ生成活性（ＡＴＰ生成終了時に分析することが望ましい）に対抗するために、ＡＴＰ生成の阻害剤を使用することが可能である。ＡＴＰ生成終了時に分析するときは、キナーゼ反応の不活化が有利である可能性がある。何故なら不活化によって、より安定した発光シグナルが確実になるからである。個々の阻害剤の作用は完全には理解されていないかもしれないが、それらの有用性が排除されるものではない。有用な化合物の例にはＮａＦがあり、ＮａＦは少なくとも１ｍＭ、好ましくは２ｍＭ〜１００ｍＭ、あるいはこの中の任意の増分の濃度で有用であり、２ｍＭが最も好ましい。しかしながら、阻害剤がルシフェラーゼに対して本発明の有用性から外れるような悪影響を与えない場合は、任意のこのような阻害剤を使用することが可能である。当業者は、阻害剤が新規であろうとよく知られていようと、このような阻害剤の適切な濃度の測定の仕方を知っているであろう。ＡＴＰ生成酵素の他の阻害剤には、バナジン酸、パラニトロフェニルホスフェートおよびジクロロ酢酸（キークル（Kiechle ）他、１９８０年）があるが、これらに限定はされない。

５．バッファー
作業溶液の適切なｐＨを保ち、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を害さない任意のバッファーが企図される。好ましいｐＨ範囲は、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ９．０、より好ましくは約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０である。Ｐ−４５０活性を測定するためには、ルシフェラーゼ・アッセイは約ｐＨ８．４で行われる。ＭＥＳおよびクエン酸バッファー以外に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ホウ酸、および当業者に知られている任意の他のバッファーなどの、他のバッファーが適切である可能性がある。適切なバッファーの選択は、ｐＨ緩衝能力および、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応との相互作用に依存する。

６．消泡剤
消泡剤は、特に発光を定量する用途において、泡が生物発光の検出に干渉するのを防ぐために望ましい。ＭＡＺＵ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの物質は、有機系またはシリコーン系であってよい。消泡剤の選択は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に干渉せずに泡を除去する能力に依存する。

７．カチオン
必要であれば、例えば甲虫のルシフェラーゼ−ルシフェリン反応では、カチオンが含まれてもよいが、該反応はＡＴＰだけでなく、マグネシウムイオンにも依存する。このような例においてルシフェラーゼ活性を確実にするために、マグネシウムを外から供給することが可能である。硫酸マグネシウム以外に、塩化マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、臭化マグネシウム、炭酸マグネシウムなどの、他のマグネシウム塩が企図される。いずれの場合も、マグネシウム錯体が解離して、Ｍｇ^２＋イオンをルシフェラーゼが利用できるようになるとともに、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応には干渉しないはずである。当業者は、他のカチオンが、マグネシウムの代わりに機能的でありうることを理解している。他のカチオンには、カルシウムおよびマンガンがある。

いくつかの適用例では、内在性マグネシウムは充分であるはずであり、このような場合は外部からのマグネシウムは不要であると思われる。
８．安定化剤
非イオン性界面活性剤および低濃度の両性イオン性界面活性剤の作用に対して耐性がある一方で（シンプソン（Simpson ）およびハモンド（Hammond ）、１９９１年）、天然のホタル・ルシフェラーゼは、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウム）、ＤＴＡＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）、および塩化メチルベンゼトニウムなどの、カチオン性界面活性剤によって失活する（シンプソンおよびハモンド、１９９１年）。高いルシフェラーゼの安定性が望ましい場合、安定化剤をキット中に与えることが可能である。

安定化剤は、分解からルシフェラーゼを安定させる、任意の化合物であってよい。適切な安定化剤には、タンパク質（ウシ血清アルブミンまたはゼラチンなど）または界面活性剤（好ましくは非イオン性界面活性剤、最も好ましくはＴＨＥＳＩＴ）がある。

９．他の物質
キット中に含めることが可能な他の物質には、ルシフェラーゼ反応から生じる発光の時間を増大することが知られている物質、例えばコエンザイムＡ（ＣｏＡ）や、ジチオトレイトールおよびβメルカプトエタノールなどのチオール試薬（ウッド（Wood）の米国特許第５，２８３，１７９号、１９９４年；ウッド（Wood）、米国特許第５，６５０，２８９号、１９９７年）、シグナルを延長させるためのＥＤＴＡなどの金属イオン・キレート剤、およびプロテアーゼ阻害剤（シェムラー（Schemrer）、米国特許第５，６１８，６８２号、１９９７年；シャイラー（Scheirer）、米国特許第５，８６６，３４８号、１９９９年）または高濃度の塩（バンルーン（Van Lune）およびトレアービール（Trer Wiel ）、国際公開公報第００／１８９５３号、２０００年）などがある。

１０．他のキット要素
キットは、細胞の生存能、細胞毒性、細胞増殖、またはＡＴＰ濃度の測定などの、特定の試験の実施を容易にするための試薬を別の容器中に含むことも可能である。例えば、標準曲線を決定するため、または内部対照として使用するために、ＡＴＰを提供することが可能である。さらに、ルシフェリンの標準曲線を決定できるように、ルシフェリンを供給することが可能である。キットは、膜、フィルターまたはスワブなどサンプル収集用の要素を供給することが可能である。

１１．容器類
キット中に含まれる試薬は、種々の要素の寿命が保たれ、容器の材料に吸着したり同材料によって変化したりしないように、任意の種類の容器中に供給することが可能である。例えば、密閉ガラスアンプルは、窒素などの中性の不活性ガス下でパッケージ化された凍結乾燥ルシフェラーゼまたはバッファーを含むことが可能である。アンプルは、ガラス、有機ポリマー（例えばポリカーボネート、ポリスチレンなど）、セラミック、金属、または試薬を収容するために一般に使用される任意の他の材料などの、任意の適切な材料から構成されていればよい。適切な容器の他の例には、アンプルと同様の耐性増大物質から製造することが可能な単純なボトル、およびアルミニウムまたは合金などの箔で内側が裏打ちされた包装材料などがある。スクリュー状の先端部を有するプラスチック製容器、またはゴム製ストッパーを有するガラス製容器も使用することが可能である。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどがある。容器が滅菌されたアクセス・ポートを有していてもよく、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどである。他の容器は、容易に除去可能な膜によって隔離された２つの区画を有し、膜を除去することによって成分を混合することが可能である。除去可能な膜は、ガラス製、プラスチック製、ゴム製などであってよい。

１２．教示書
キットに教示書を含めることも可能である。教示書は紙または他の素材の上に印刷されていてもよいし、かつ／あるいはフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの読み取り可能な電子媒体として供給することも可能である。詳細な教示は、キットと物理的に関連していなくてもよく；その代りに、キットの製造業者または流通業者が指定したインターネットのウェブ・サイトをユーザに対して示してもよいし、あるいは電子メールとして供給してもよい。好ましい実施形態では、教示書は、ルシフェラーゼと耐性増大物質を組み合わせてから試薬組成物をサンプルに加えること、または耐性増大物質と非発光反応を組み合わせてからルシフェラーゼをこの反応物に加えることをユーザに教示する。

Ｅ．試薬組成物の活性
発光を測定し、それによって試薬組成物の活性を決定するためには、試薬組成物をサンプルと組み合わせた後の目的の時点で、ルシフェラーゼ反応によって生じた相対光度単位（ＲＬＵ）値を測定すればよい。例えば、耐性増大物質を含む要素を、ルシフェラーゼを含む要素に加えることによって試薬組成物を作製した直後（０〜１０分後）に、既知濃度のＡＴＰ（キナーゼ活性を測定する場合）または基質（プロテアーゼまたはＰ−４５０活性を測定する場合）を試薬組成物と組み合わせたサンプルから生成する発光を測定することによって、ＲＬＵ値を得ることが可能である。この値は、その条件下における１００％の活性（非阻害状態）であるとみなされる。ルシフェラーゼを阻害することが知られている化合物（例えばイソリクイリチゲニン）とルシフェラーゼ反応を組み合わせた後に、発光の強度が低下する場合、耐性増大物質によって与えられる相対的な保護は、非阻害状態の発光に対する強度の相対的近似性と同等である。例えばイソリクイリチゲニンが、耐性増大物質の不在下で反応の発光を２００倍阻害するが、ある化合物の存在下では発光を１００倍しか阻害しない場合は、その化合物は耐性増大物質であり、５０％の相対的保護をもたらすということである。

本発明を実施する際には、ＡＴＰなどの生成物、あるいは酵素阻害または酵素活性などの生物特異的事象の発生を検出する目的で、試薬組成物を一般にサンプルと組み合わせる。典型的には、試薬組成物はルシフェラーゼと、ルシフェラーゼを阻害するかあるいはルシフェラーゼと相互作用する可能性がある１つまたは複数の化合物による干渉からルシフェラーゼ活性を保護するための耐性増大物質とを含む。通常は周囲の酸素で充分である。実施するアッセイの種類に応じて、任意選択の成分が試薬組成物中に含まれてよい。ＡＴＰの検出および／またはＡＴＰ検出の定量のためのアッセイ用には、試薬組成物に、ＡＴＰ依存性ルシフェラーゼ、耐性増大物質、（飽和濃度または準飽和濃度の）ルシフェリン、および２価カチオン（好ましくはＭｇ^＋２）を含む。バッファー、ならびにＡＴＰａｓｅおよび／または酵素安定化剤などの他の適切な補助的要素も存在してよい。

ルシフェリンの検出に基づくアッセイ用には、ＡＴＰ依存性またはＡＴＰ非依存性のルシフェラーゼが、一般的に使用される。したがって、１工程アッセイに関する本発明の１実施形態では、試薬組成物は、ＡＴＰ依存性ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼの基質前駆体、耐性増大物質、（飽和濃度または準飽和濃度の）ＡＴＰ、および２価カチオン（好ましくはＭｇ^＋２）を含む。２工程アッセイに関する本発明の他の実施形態では、試薬組成物はＡＴＰ依存性ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、および２価カチオンを含む。ルシフェラーゼの基質前駆体は試薬組成物とは別個にしておいて、試薬組成物を加える前にサンプルに加える。他の実施形態では、試薬組成物は、ＡＴＰ非依存性ルシフェラーゼおよび耐性増大物質、ならびにセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体などのルシフェラーゼ基質前駆体を含む。ＡＴＰ非依存性ルシフェラーゼに関しては、ＡＴＰは必要とされない。２工程アッセイに関する本発明の他の実施形態では、試薬はＡＴＰ非依存性ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、および２価カチオンを含む。ルシフェラーゼの基質前駆体は試薬組成物とは別個にしておいて、試薬組成物を加える前にサンプルに加える。バッファー、ならびにＡＴＰａｓｅ阻害剤および／または酵素安定化剤などの、他の適切な補助的要素も存在してよい。

Ｆ．ルシフェラーゼ反応の生成物の検出および定量
ルシフェラーゼ反応は、光の生成（「発光」）をもたらす。ユーザはサンプルの反応を肉眼によって簡単に調べて、光の生成を確認することが可能である。しかしながら、さらに感度の良い装置によって、微弱なシグナルを検出するだけでなく、光シグナルを定量することも可能である。光以外の生成物を、該生成物の性質に従って測定する反応も企図される。本発明は、発光シグナルをもたらす任意のアッセイに役立つ可能性がある。このような生成物に適した装置および方法は、当業者には明らかであろう。

光を検出するすべての場合において、照度計などの特別な装置で、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の光の生成を読み取ることが可能である。ルシフェラーゼ反応によって発せられる波長の光を検出することが可能な任意の装置を使用することが可能である。このような装置は１つずつサンプルを読み取るものでもよいし、あるいは高スループット・スクリーニングにおいて、マイクロウェル・プレート（ウェル数が６、２４、４８、９６、３８４、１５３６などのウェル形式）のウェル中に収容された多数のサンプルを読み取るものでもよい。発光を測定するために使用される装置が、本発明を限定しないことは明らかである。使用することが可能である他の装置には、シンチレーション・カウンター（ヌグエン（Nguyen）他、１９８８年）、または測光器などの、発光を感知するように発明または適合された装置がある（ピクシオロ（Picciolo）他、１９７７年）。写真用フィルムまたはＸ線フィルムを使用して発光を検出することも可能である。さらに、ユーザがサンプルを肉眼によって調べて、発光を定性的に評価することが可能である。

Ｇ．ルシフェラーゼ反応用の用途
本発明は、ＡＴＰまたはルシフェリンのレベルを効果的かつ正確に検出し定量するために使用する方法、組成物およびキットを対象とする。

本発明は、ルシフェラーゼ、および耐性増大物質を含む単一の組成物（試薬組成物）を加えること、次いで発光を検出することを含む。本発明の耐性増大物質を加えることによって、標的とする活性または要素（例えばＣＹＰ４５０、プロテアーゼ、キナーゼ、ＡＴＰレベル）に対して試験される化合物のルシフェラーゼに対する影響を最小限とし、その結果発光が標的とする活性または要素のレベルとより密接な相関関係となるようにすることができる。

１．生成物の検出
本発明の方法、組成物およびキットによって、サンプル中のＡＴＰ（またはルシフェラーゼ基質として機能しうるＡＴＰ類似体）および酵素活性（例えばキナーゼ、プロテアーゼ、またはチトクロムＰ−４５０活性）を、さらには１つまたは複数の試験化合物の存在下において、簡単に定性的または定量的に検出することが可能となる。好ましい実施形態において、本発明を使用してサンプル中で発光を生成させる簡単な定性実験では、耐性増大物質は干渉化合物の影響を最小限にし、発光が調査対象の生物学的または生化学的プロセスとより密接な相関関係となるようにする。ＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３またはＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６などのルシフェラーゼと、場合により１つまたは複数のＡＴＰａｓｅ阻害剤とを含む試薬組成物を使用して、発光を生成させる。さらに、試薬組成物は、１つまたは複数の以下の構成要素：凍結乾燥調製物から再構成可能であるルシフェリン（あるいは、適切なルシフェリン類似体基質）、ＡＴＰａｓｅ阻害剤、終点測定用のキナーゼなどのＡＴＰ生成酵素の阻害剤、２価カチオン（例えばマグネシウム）、酵素安定化剤、およびバッファーをさらに含むことが可能である。

サンプルは、例えばキナーゼ、プロテアーゼ、またはＰ４５０酵素活性などの、高スループット・スクリーニング手法において１つまたは複数の化合物に対する感受性を有しうる生物活性を含む疑いがある任意のサンプルでよい。サンプルには、１つまたは複数の酵素を含む溶液、細胞溶解物、飲料、および動物、植物、または無生物体の表面などの表面を拭いたスワブなどがある。サンプルの他の例には、既知ＡＴＰ濃度の組成物、または任意の生物（原核生物または真核生物）由来の細胞の溶解物がある。原核細胞の例には、大腸菌、緑膿菌（P. aeruginosa ）、枯草菌（B. subtilis ）、およびサルモネラ菌（S. typhimurium）がある。真核細胞は、植物、動物、真菌、昆虫など、またはこのような生物由来の培養細胞に由来するものであってよい。いくつかの例には、シロイヌナズナ（A.thaliana）およびブラシカ属（Brassica）、クラミドモナス属（Chlamydomonas ）、およびボルボックス属（Volvox）の生物（植物）、ヒト（H. sapiens）およびハツカネズミ属（Mus ）の生物（動物）、サッカロマイセス属（Saccharoymyces）の生物（特にセレビシエ（cerevisae ）およびポンベ（pombe ））およびニューロスポラ属（Neurospora）の生物（真菌）、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster ）および線虫（C. elegans）（昆虫）、任意の植物由来のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養したカルス細胞、任意の生物（例えばげっ歯類由来の臓器移植片など）由来のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）およびチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物の細胞系、およびｓｆ９細胞などの昆虫細胞系がある。これらの例は単に例として与えられるものであり、限定を意味するものではない。

細胞溶解物は、もはや組織化されて認識可能な完全な細胞構造となることのない細胞構成成分を含む。細胞溶解物は可溶性成分および不溶性成分を有する可能性があり、これらのいずれかを、該溶解物を使用する前に除去することも可能である。超音波処理、ダンス（Dounce）型ホモジナイザー、乳鉢と乳棒、凍結−解凍サイクルを使用する物理的破壊、または細胞の物理的完全性を破壊する任意の他の装置または処理、または両性イオン性および非イオン性界面活性剤、もしくは例えばＤＴＡＢまたはＣＴＡＢなどのカチオン性界面活性剤など、界面活性剤による溶解を含めた任意の手段によって、溶解物を調製することが可能である。細胞溶解物は、細胞をハーベストした時点のＡＴＰ濃度の完全性が保たれるように生成されることが好ましい。サンプル中のＡＴＰを正確に検出するために、細胞のＡＴＰを分解すると思われる酵素、またはＡＴＰを生成すると思われる酵素を阻害することが好ましい。このような阻害剤の不在下では、ＡＴＰ濃度が不正確に決定されるリスクが高い。ＤＴＡＢなどの阻害剤はＡＴＰａｓｅを不活性化し、一方ＮａＦなどの他の分子は、ＡＴＰ生成酵素の活性を不活性化する。まだ完全に理解されたわけではないが、ＮａＦが有効な種類の細胞（例えばリンパ球細胞）に関しては、ＮａＦはキナーゼを阻害するために作用している可能性があると仮定されている。

１つまたは複数の酵素を含む溶液は、精製酵素、未精製酵素、半精製酵素、可溶化した酵素、部分的に可溶化した酵素、または膜結合酵素を含むが、これらに限定はされない。
生成物または副生成物としてＡＴＰを有するキナーゼ活性などを有するＡＴＰ生成酵素の阻害剤は、試薬組成物中に組み入れてもよいし、あるいは後で試薬組成物の使用に組み入れるために別の容器中に入れておいてもよく、キナーゼ活性の終点測定が望ましい場合には後者を使用する。有効な阻害剤の一例はＮａＦである（ボスチック（Bostick ）他、１９８２年）。このような組成物は、少なくとも０．５ｍＭ、好ましくは少なくとも１ｍＭ、より好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｍＭ、あるいはこの中の任意の増分の濃度でＮａＦを含み、２ｍＭが最も好ましい。ＡＴＰ生成酵素の他の阻害剤には、バナジン酸、ＡＭＰ、ＤＡＰＰ（ボスチック他、１９８２年）およびジクロロ酢酸（キークル（Kiechle ）他、１９８０年）などの、他のキナーゼ阻害剤がある。

２．キナーゼ活性の検出および定量
本発明の組成物、方法、およびキットによって、ユーザは、発光量を定量することによって、サンプル中のキナーゼにより消費されたＡＴＰの量を検出し定量することにより、キナーゼ活性を検出し定量することが可能である。本発明を目的のサンプルおよび既知量のＡＴＰを含むサンプル（対照）に適用する。ＡＴＰ濃度未知のサンプルに本発明を適用することから生じたシグナルは、内部対照（既知量のＡＴＰをサンプルに加え、その後の発光を測定する）、またはＡＴＰ濃度既知のいくつかのサンプルの発光を測定してグラフにプロットすることにより作製した外部標準曲線によって生じたシグナルと関連付ける。このような方法は当業者に知られている。（モーヤー（Moyer ）およびヘンダーソン（Henderson ）、１９８３年；ロナー（Ronner）他、１９９９年；スタンリー（Stanley ）、１９８９年；ウッド（Wood）他、１９８９年）。

３．化合物の影響
本発明の組成物、方法、およびキットを適用して、化合物、例えば無機物、小分子、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ステロイド、汚染物質、発癌物質、または薬剤などの、サンプルと接触させたときの生物特異的事象に対する影響を測定することが可能である（アイギンガー（Aiginger）他、１９８０年；アンドレオッティ（Andreotti ）他、１９９５年；ブラッドベリー（Bradbury）他、２０００年；クリー（Cree）およびアンドレオッティ（Andreotti ）、１９９７年；クローチ（Crouch）他、１９９３年；カンガス（Kangas）他、１９８４年）。これらの化合物は化合物ライブラリーに分類整理されていてもよいし、あるいは単独で試験されてもよい。本発明のこのような適用例では、ＡＴＰ代謝または酵素機能に対するその影響が既知である対照化合物とサンプルとを接触させる対照例を利用する。ルシフェラーゼと化合物が一緒に存在して、化合物自体はルシフェラーゼ活性に直接影響を与えないことが確実なサンプルが対照例に含まれることも好ましい。

以下の実施例は、限定ではなく本発明を例示することを目的とする。

［ルシフェラーゼ阻害剤に対する界面活性剤の耐性増大効果］
この実施例では、ルシフェラーゼ・レポーターを用いるアッセイを使用して、既知のＰ４５０酵素阻害剤がルシフェラーゼ阻害剤でもあるかどうか、およびいくつかの界面活性剤の耐性増大効果を使用して、このような潜在的なルシフェラーゼ阻害剤に対してルシフェラーゼを防御することが可能であるかどうかを評価した。細胞調節または酵素調節に関して研究中の化合物が、ルシフェラーゼを用いる細胞または酵素のレポーター・アッセイ系におけるルシフェラーゼ反応にも影響を与えるであろうという、若干の懸念が存在する。このことが真実であれば、例えば阻害剤のスクリーニング・アッセイについては、誤った「的中」が増大すると予想される。２つの潜在的なルシフェラーゼ阻害剤、エモジン（emodin）とチロホスチン（tyrphostin）ＡＧ４９４を、「薬理活性化合物ライブラリー（Library of Pharmaceutically Active Compounds）」（ＬＯＰＡＣ）スクリーニングから同定した。この２つの化合物は、ある種のチトクロムＰ４５０酵素の潜在的な阻害剤である。この実験の目的は、エモジンおよびチロホスチンＡＧ４９４がルシフェラーゼ反応の阻害剤でもあるかどうか決定することと、これらの化合物によって引き起こされたルシフェラーゼに対する何らかの阻害を界面活性剤の存在によって軽減することが可能であるどうかをさらに決定することであった。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェリンの存在下で、化合物の存在下または不在下、および２つの異なる濃度の５つの異なる界面活性剤の不在下または存在下でアッセイした。

最初に、３つのルシフェリン阻害剤の２×混合物を調製した。各混合物には、１００ｍＭのＫＰＯ_４、２０ｎＭのルシフェリン、０．１ｍｇ／ｍｌのコントロールＳｆ９ミクロゾーム膜（米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在のビーディー、ゲンテスト（BD Gentest）から入手可能；これらの膜は、Ｐ−４５０酵素が存在しない状態で目的のＰ４５０アッセイのアッセイ条件を模倣するために使用したが、これは、一般にＰ４５０がｓｆ９細胞のミクロゾーム膜で組換えにより発現されるからである）、±１０ｕＭのエモジンまたは１０ｕＭのチロホスチンＡＧ４９４を含めた。阻害剤を含まない対照混合物も調製した。

第２に、１１種類の２×ルシフェリン検出試薬を、ＵｌｔｒａＧｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ（１００マイクログラム／ｍｌ、プロメガ・コーポレイション（Promega Corp. ）から入手可能）、ＡＴＰ（４００μＭ）、および賦形剤（０．４％Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）（スイス国バーゼル所在のペンタファーム（Pentapharm））を含む凍結乾燥塊から、バッファー（２００ｍＭのトリシン、ｐＨ８．４、２０ｍＭのＭｇＳＯ_４）を使用して再構成した。最終的な２×反応混合物には、以下のうち１つが含まれるものとした：
１／界面活性剤なし
２／０．２％のＴＯＭＡＨ
３／２％のＴＯＭＡＨ
４／０．２％のＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ９
５／２％のＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ９
６／０．２％のＴｈｅｓｉｔ
７／２％のＴｈｅｓｉｔ
８／０．２％のＣＨＡＰＳ
９／２％のＣＨＡＰＳ
１０／０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００
１１／２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００
界面活性剤の最終濃度は、０％、０．１％または１％のいずれかとなる。最後に、５０マイクロリットルの各ルシフェリン阻害剤混合物を、５０マイクロリットルの各ルシフェリン検出試薬と３連で、白色の照度計用９６ウェル・プレート上で組み合わせ、混合し、ＢＭＧ Ｆｌｕｏｓｔａｒ（商標）照度計（ＢＭＧ社）で読み取った。これらの結果はＲＬＵおよび対照に対する割合（％）で表し、図１に示す。

図１は、ルシフェラーゼ阻害剤であるチロホスチンまたはエモジンの存在下での標準的なルシフェラーゼ系反応における、界面活性剤によるルシフェラーゼに対する阻害の軽減を示す。図１ａは、対照（界面活性剤なし）のＲＬＵ値を、０．１または１％のＴｏｍａｈ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（ＮＰ９）、Ｔｈｅｓｉｔ、ＣＨＡＰＳ、またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む反応混合物に対して、ｒｌｕ値の関数として比較するものである。図１ｂは、対照の、０．１または１％のＴｏｍａｈ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、Ｔｈｅｓｉｔ、ＣＨＡＰＳ、またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む反応混合物に対する相対的割合（％）を比較分析するものである。

［耐性増大物質を使用する、誤った的中例発生の最小化］
この実施例では、市販のライブラリーであるＬＯＰＡＣ（商標）ライブラリー（薬理活性化合物ライブラリー、米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマコーポレーション（Sigma Corp. ）から入手可能）のスクリーニングを実施し、薬剤化合物から受ける可能性のある阻害に対して、細胞系または無細胞系のルシフェラーゼ・アッセイにおけるルシフェラーゼ反応を保護する際の耐性増大物質の効果を決定した。ＬＯＰＡＣライブラリーは、その薬理活性が既知の６４０種の化合物を含む。このライブラリーは、開発中のスクリーニング・プロトコルを実証するために一般的に使用されている。

ＬＯＰＡＣの６４０種の化合物のスクリーニングから、１８９種の化合物が、３つ全てのチトクロムＰ４５０アイソフォーム（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｃ９）からの発光を、未処理対照より１０％を越えて阻害する化合物として同定された。これらはルシフェラーゼ阻害剤である可能性があると判断された。３つのＣＹＰ４５０反応のいずれか１つが見かけ上阻害されない場合は、ルシフェラーゼ検出系の阻害については除外され得る。１８９種の化合物に関して、結果の解釈として３つの可能性が存在した。１つめは、該化合物が真のＰ４５０阻害剤であること；２つめは、該化合物はルシフェラーゼを阻害しており、それらは誤った的中例であるということ；３つめは、該化合物がＣＹＰ４５０およびルシフェラーゼを阻害しているということである。これらの可能性を見極めるために、ルシフェリンの存在下、いずれのＰ４５０酵素も用いずに、該化合物をスクリーニングした。ある化合物が依然として的中となる場合、その化合物はルシフェラーゼを阻害している。

最初に、白色の照度計用９６ウェル・プレートの２連ウェルにおいて、実施例１に記載したのと同様に、１０ｕＭの各化合物、４０ｎＭのルシフェリン、および１００ｍＭのＫＰＯ_４を含む２×ルシフェリン−化合物混合物を５０マイクロリットル調製した。それぞれのプレートには、化合物を添加しない（媒体のみの）対照ウェルも２連で含めた。

第２に、実施例１に記載したのと同様に、それぞれの反応用に２×ルシフェリン検出試薬を３連で調製した。この２×試薬には、以下のものをさらに含む：
１／界面活性剤なし
２／０．２％のＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ９
３／２％のＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ９
最終的な界面活性剤濃度は、０．１％または１％界面活性剤となる。

最後に、５０マイクロリットルの各ルシフェリン−阻害剤混合物を、白色の照度計用９６ウェル・プレート上において、５０マイクロリットルのそれぞれのルシフェリン検出試薬と２連で組み合わせ、混合し、室温で１５分間放置し、次いでＢＭＧのＦｌｕｏｓｔａｒ（商標）照度計で読み取る。

化合物が対照の平均±３×標準偏差（ＳＤ）（９９％信頼区間）より高いか、あるいは低い場合、化合物は「的中」であるとみなされる。添付のグラフ（図２ａ〜２ｄ）では、菱形プロットはそれぞれ１つの化合物を表し、中央の線は対照（阻害剤なし）の平均を表し、中央の線の外側の２本の線は、対照の平均±３×ＳＤを表す。

いずれの界面活性剤も存在しない条件では、５つの化合物がルシフェラーゼの阻害剤として同定された。したがって、目的の酵素（チトクロムＰ４５０など）も含むスクリーニングでは、これらの物質は、「誤った」的中例として同定されると思われる。しかしながら０．１％Ｔｅｒｇｉｔｏｌの存在下では、誤った的中例は４つだけである。最後に、１％Ｔｅｒｇｉｔｏｌの存在下では、わずかに１つの的中例だけが残り、他の４例はもはやルシフェラーゼを阻害しないか、あるいはほとんど阻害しない。

図２ａ〜ｄに示す結果から、界面活性剤などの耐性増大物質の存在下で薬剤ライブラリーをスクリーニングすると有利であることが実証されている。なぜなら耐性増大物質は、誤った的中例の数を最小限にするのを手助けするからである。

［ホタルおよびウミシイタケのルシフェラーゼの阻害に対する界面活性剤および非界面活性剤の耐性増大効果］
この実験では、いくつかの耐性増大物質を、既知のルシフェラーゼ阻害剤であるイソリクイリチゲニン（ＩＬＴ）（１００μＭ、シグマ・ケミカル（Sigma Chemical））からルシフェラーゼを保護する能力に関して評価した。ＩＬＴをルシフェラーゼ反応に加え、耐性増大物質と見込まれる物質を、ルシフェラーゼを阻害から保護する能力に関して評価した。

基本的なホタル・ルシフェラーゼ反応混合物には、ｐＨ８．０の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（シグマ・ケミカル）、６．４ｍＭの硫酸マグネシウム（フィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientific ））、２０ｍＭのジチオスレイトール（シティ・ケミカル（City Chemical ））、０．６３ｍＭのコエンザイムＡ（ファルマシア・バイオケミカル（Pharmacia Biochemical ））、０．４ｍＭのＥＤＴＡ（シグマ・ケミカル）、４．０μＭのルシフェリン（プロメガ・バイオサイエンシズ（PromegaBiosciences ））、０．５６ｍＭのＡＴＰ（ファルマシア・バイオケミカル）、および１．３×１０^−６ｍｇ／ｍｌのホタル・ルシフェラーゼ（ＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）、プロメガ・コーポレイション）を含めた。

基本的なウミシイタケ・ルシフェラーゼ反応混合物には、ｐＨ７．４の１００ｍＭのリン酸カリウム・バッファー（シグマ・ケミカル）、５００ｍＭの塩化ナトリウム（フィッシャー・サイエンティフィック）、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（シグマ・ケミカル）、２００ｎＭのセレンテラジン（プロメガ・バイオサイエンシズ）、０．１％のゼラチン（シグマ・ケミカル）および０．１２ｎｍｏｌ／ｍｌのウミシイタケ・ルシフェラーゼ（ケミコン・ケミカルズ（ChemiCon Chemicals））を含めた。

ＩＬＴをジメチルスルホキシド（シグマ・ケミカル）に溶かして１００ｍＭとした。ＩＬＴを１：１０００に希釈し、保護物質を反応混合物に希釈してからルシフェラーゼを加えることによって反応を開始させた。

それぞれのサンプルの反応体積は１００μｌであった。ルシフェラーゼを反応混合物に加えて反応混合物を混合した直後に、ターナー・バイオシステムズ（Turner Biosystems ）のＶｅｒｉｔａｓ（商標）照度計においてサンプル当たり０．５秒間の発光を積分した。すべての測定は３連で行った。

それぞれの化合物によって与えられる相対的保護は、以下の式によって表されるように、保護物質の存在下で生じた発光と不在下で生じた発光との間の差を全体の阻害量で割って算出される：
（Ｌ１−Ｌ２）／（Ｌ３−Ｌ４）
（式中、Ｌ１は、阻害剤および耐性増大物質の存在下の発光を表し；Ｌ２は阻害剤存在下で耐性増大物質不在下の発光を表し；Ｌ３は阻害剤および耐性増大物質の不在下の発光を表し；かつＬ４は阻害剤存在下で耐性増大物質不在下の発光を表す）。

したがって耐性増大物質の不在下での相対的保護は０％であり、阻害剤の不在下での相対的保護は１００％である。阻害剤または耐性増大物質のいずれも不在の場合に発光を生成するために使用した反応混合物には、反応を比較すべき阻害剤を溶解するために使用した溶媒をさらに含めた。

上記のデータ中に見られるように、阻害剤からルシフェラーゼを保護する化合物は、容易に決定することが可能である。さらに、耐性増大物質の有効性は均一ではなく、また耐性増大物質の濃度は得られる保護のレベルに影響を与える。

ここでは本発明をある程度特定して記載し例示してきたが、当業者は、本発明の精神から逸脱することなく本明細書で開示してきた範囲内で作製可能な、変形、追加および省略を含めた様々な変更形態を理解するであろう。したがって、これらの変更形態も本発明に含まれ、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲に法律上一致し得る最大限広義の解釈によってのみ限定されると考えられる。

潜在的なルシフェラーゼ阻害剤であるチロホスチンＡＧ４９４またはエモジンの存在下での標準的なルシフェラーゼ反応における、界面活性剤によるルシフェラーゼ阻害の軽減を示す図。０．１％または１％のＴｏｍａｈ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、Ｔｈｅｓｉｔ、ＣＨＡＰＳ、またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む反応混合物に対して、対照（界面活性剤なし）のＲＬＵを相対光度単位の値の関数として比較する図。 潜在的なルシフェラーゼ阻害剤であるチロホスチンＡＧ４９４またはエモジンの存在下での標準的なルシフェラーゼ反応における、界面活性剤によるルシフェラーゼ阻害の軽減を示す図。０．１％または１％のＴｏｍａｈ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、Ｔｈｅｓｉｔ、ＣＨＡＰＳ、またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む反応混合物に対する、対照の相対的割合（％）を比較分析する図。 既知の薬剤ライブラリーを標準的なルシフェラーゼ反応を使用してスクリーニングする際の、界面活性剤Ｔｅｒｇｉｔｏｌによるルシフェラーゼ阻害の軽減を示す図。対照（界面活性剤なし）のＲＬＵと反応混合物とを比較する図。ライブラリー中の５つの薬剤化合物が、Ｔｅｒｇｉｔｏｌの不在下でルシフェラーゼ酵素を阻害することが見出された。 既知の薬剤ライブラリーを標準的なルシフェラーゼ反応を使用してスクリーニングする際の、界面活性剤Ｔｅｒｇｉｔｏｌによるルシフェラーゼ阻害の軽減を示す図。図２ａを再度示し、０．１％のＴｅｒｇｉｔｏｌの存在下におけるＲＬＵを比較する図。 既知の薬剤ライブラリーを標準的なルシフェラーゼ反応を使用してスクリーニングする際の、界面活性剤Ｔｅｒｇｉｔｏｌによるルシフェラーゼ阻害の軽減を示す図。図２ａを再度示し、１％のＴｅｒｇｉｔｏｌの存在下におけるＲＬＵを比較する図。 既知の薬剤ライブラリーを標準的なルシフェラーゼ反応を使用してスクリーニングする際の、界面活性剤Ｔｅｒｇｉｔｏｌによるルシフェラーゼ阻害の軽減を示す図。前記５つの薬剤阻害剤のうち４つに対するＴｅｒｇｉｔｏｌの劇的な影響を示す棒グラフ。

Claims (2)

1. 試験化合物をスクリーニングする無細胞環境下において試験化合物による阻害からルシフェラーゼ酵素活性を保護する方法であって、該方法は、
   （ａ）ルシフェラーゼ酵素を界面活性剤と接触させて第１の反応混合物を形成する工程と、
   （ｂ）試験化合物を含有する第２の反応混合物に前記第１の反応混合物を接触させる工程とを備え、
   前記第１の反応混合物中の界面活性剤は、前記試験化合物による阻害から前記ルシフェラーゼ酵素のルシフェラーゼ酵素活性を保護して、界面活性剤がないときと比べてその阻害の程度を少なくとも１０％抑えるのに十分な量であり、前記界面活性剤が、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、Ｃｈａｐｓ（登録商標）、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、デオキシコレート及びＣＴＡＢから選択されることを特徴とする方法。
2. 前記界面活性剤はＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９である、請求項１に記載の方法。

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