JP5586598B2

JP5586598B2 - 安定化剤、および１種類以上の弱毒生フラビウイルスを含むワクチン組成物

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Publication number: JP5586598B2
Application number: JP2011517028A
Authority: JP
Inventors: アラン・フランソン; オリヴィエ・ブラス; ピエール・ショウヴァン; アマンディーヌ・ルリュー
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2008-07-09
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2014-09-10
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Description

本発明は、１種類以上の弱毒生フラビウイルスを含むワクチン組成物用の安定化剤、この安定化剤で安定化されたバルクワクチン組成物、特にこのバルクワクチン組成物から調製された乾燥ワクチン組成物、および１種類以上の弱毒生フラビウイルスを安定化するための方法に関する。

フラビウイルスは、フラビウイルス科の一属のウイルスである。このグループは、デング（ＤＥＮ）ウイルス、黄熱（ＹＦ）ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎（ＪＥ）ウイルスおよびウエストナイル（ＷＮ）ウイルスを含む。これらのウイルスのうちいくつかは不安定である。

本発明において、用語「フラビウイルス」とは、哺乳動物を含む動物に対して病原性であるフラビウイルス科のいずれかのウイルス、特にヒトに対して病原性であるフラビウイルスを意味することを意図したものである。例として以下のフラビウイルスを挙げることができるがこれらに限定されるものではない：デング（ＤＥＮ）ウイルス血清型１、２、３および４、日本脳炎（ＪＥ）ウイルス、黄熱（ＹＦ）ウイルスおよびウエストナイル（ＷＮ）ウイルス。

用語「生」は、その慣用的な意味で用いられ、生ウイルスとは、不活化されていないウイルス、すなわち、許容細胞上で複製することができるウイルスのことである。

弱毒生フラビウイルスとは、動物またはヒトにおいて対応する野生型によって引き起こされる疾患を誘発せず、特異的な免疫応答を誘発することができるフラビウイルスのことである。

本発明の安定化剤と一緒に使用され得る弱毒生フラビウイルスの例としては、ＪＥＶ株ＳＡ−１４−１４−２、特許文献１に記載されているＹＦ株、特許文献２に記載されているデングウイルス株、特にＶＤＶ１株、特許文献３に記載されている株、特にＶＤＶ２株；例えば特許文献４、５、６、７、８、９および１０に記載されているような株、ならびに特許文献１１に記載されている株ＤＥＮ−１１６００７／ＰＤＫ１３（「ＬＡＶ１」とも称される）、ＤＥＮ−２１６６８１／ＰＤＫ５３（「ＬＡＶ２」とも称される）およびＬＡＶ４のような弱毒ウイルス株が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

ＶＤＶ１株は、野生型ＤＥＮ−１株１６００７をＰＤＫ細胞上で１１回継代し（ＤＥＮ−１１６００７／ＰＤＫ１１）、３２℃にてＶｅｒｏ細胞上で増幅させ、そのＲＮＡを精製し、Ｖｅｒｏ細胞にトランスフェクトすることにより得られた株である。ＶＤＶ−１株は、ワクチン株ＤＥＮ−１１６００７／ＰＤＫ１３（ＰＤＫ−初代イヌ腎細胞上で１３継代）と比べて１４の付加変異を有する。ＶＤＶ−１株の完全な配列および調製方法および特徴付けは、特許文献２に記載されている。この株は、この教示に基づいて容易に再現することができる。

ＶＤＶ−２株は、野生型ＤＥＮ−２株１６６８１をＰＤＫ細胞上で５０回継代し（ＤＥＮ−２１６６８１／ＰＤＫ５０）、プラーク精製し、そのＲＮＡを抽出し、精製した後にＶｅｒｏ細胞にトランスフェクトすることにより得られた株である。ＶＤＶ−２株は、次に、プラーク精製し、Ｖｅｒｏ細胞上で増幅させることにより得られる。ＶＤＶ−２株は、ワクチン株ＤＥＮ−２１６６８１／ＰＤＫ５３（ＰＤＫ細胞上で５３回継代）と比べて１０の付加変異を有する。ＶＤＶ−２株の完全な配列および作成方法および特徴付けは特許文献３に記載されている。この株は、この教示に基づいて再現することができる。

本発明の安定化剤と一緒に使用され得る弱毒生フラビウイルスとしては、特許文献１２に記載されているキメラウイルス、およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^TMのようなキメラウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。「ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^TM」または「ＶＹＤ」は、プレメンブランおよびエンベロープタンパク質をコードする配列が別のフラビウイルスの株、例えばデング（ＤＥＮ）ウイルス、日本脳炎（ＪＥ）ウイルスまたはウエストナイル（ＷＮ）ウイルスの株の対応する配列と置き換えられたＹＦウイルスの骨格を含むキメラ黄熱（ＹＦ）ウイルスのことである。これらの「ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^TM」の構成は、特許文献１３および１４に詳細に記載されている（これらの作成方法の正確な記載は出典明示により本明細書に記載されたものとする）。本発明に使用され得る弱毒生キメラフラビウイルスの概説は、非特許文献１に記載されている。

かくして、デング血清型１株（ＤＥＮ−１）のｐｒＭおよびＥ配列を含有するキメラＹＦウイルスは、ＣＹＤ−１またはＣＹＤＤＥＮ１と称される。ＤＥＮ−２株のｐｒＭおよびＥ配列を含有するキメラＹＦウイルスは、ＣＹＤ−２またはＣＹＤＤＥＮ２と称される。ＤＥＮ−３株のｐｒＭおよびＥ配列を含有するキメラＹＦウイルスは、ＣＹＤ−３またはＣＹＤＤＥＮ３と称される。ＤＥＮ−４株のｐｒＭおよびＥ配列を含有ｒ．キメラＹＦウイルスは、ＣＹＤ−４またはＣＹＤＤＥＮ４と称される。デングキメラウイルスは、例えば、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^TMＤＥＮ−１、特にＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−１ウイルス、またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^TMＤＥＮ−２、特にＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−２ウイルス、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^TMＤＥＮ−３、特にＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−３ウイルス、またはＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ^TMＤＥＮ−４、特にＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−４ウイルスであり得る。例示されているキメラは、ＤＥＮ１ＰＵＯ３５９（ＴＶＰ１１４０）株、ＤＥＮ２ＰＵＯ２１８株、ＤＥＮ２ＰａＨ８８１／８８株およびＤＥＮ４１２２８（ＴＶＰ９８０）株由来のｐｒＭおよびＥ配列を使用することによって得られた。

好ましくは、キメラＹＦウイルスは、弱毒黄熱株ＹＦ１７Ｄ（非特許文献２）の骨格を含むものである（ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−１ウイルス、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−２ウイルス、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−３ウイルス、ＹＦ１７Ｄ／ＤＥＮ−４ウイルス）。使用され得るＹＦ１７Ｄ株の例としては、ＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦＶａｘ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｓｗｉｆｗａｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ；Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｍａｒｃｙｌ’Ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ；ＡＲＩＬＶＡＸ^TM、Ｃｈｉｒｏｎ，Ｓｐｅｋｅ，Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，ＵＫ；ＦＬＡＶＩＭＵＮ（登録商標）、ＢｅｒｎａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ＹＦ１７Ｄ−２０４Ｆｒａｎｃｅ（Ｘ１５０６７、Ｘ１５０６２）；ＹＦ１７Ｄ−２０４，２３４ＵＳ（非特許文献３）、または他の関連株ＹＦ１７ＤＤ（ジェンバンク受入番号Ｕ１７０６６）、ＹＦ１７Ｄ−２１３（ジェンバンク受入番号Ｕ１７０６７）およびGallerらの非特許文献４に記載されているＹＦ１７ＤＤ株が挙げられる。このキメラの構築のために、ヒトに使用され得る他の弱毒黄熱ウイルス株を使用することもできる。これらの同黄熱株は、そのままで、黄熱に対する免疫化に関して使用され得る組成物の調製のための本発明の安定化剤と一緒に使用され得る。

ベクターが、例えば特許文献１５および１６に記載されているようなデングウイルスであるキメラもまた、本発明の安定化剤と一緒使用され得る。

キメラウイルスの異なる実施態様は、特許文献１７、１８、１９、２０、２１にも記載されており、これらのウイルスもまた、本発明の安定化剤と一緒に使用され得る。

さらにまた、挿入された異種配列が特許文献２２に記載されているような配列である上記キメラウイルスもまた本発明に使用され得る。

キメラウイルスは、上記定義の弱毒生ウイルスの特徴を示すという特殊性を有する。したがって、１種類以上のフラビウイルスのエンベロープタンパク質または１つ以上のエンベロープタンパク質の１つ以上のエピトープを発現し、エンベロープタンパク質またはエピトープが由来する株またはこれらの株のうち少なくとも１つを中和する抗体を含む特異的免疫応答を誘発するキメラウイルスを本発明に使用することができる。

本発明において、用語「バルクワクチン組成物」とは、精製または非精製の一価または多価混合後の抗体生産の最終段階から得られた組成物を意味することを意図したものである。

本発明において、用語「乾燥ワクチン組成物」とは、残留物水分量が３％以下の組成物を意味することを意図したものであり、水性溶液による再構成が容易であってワクチンとして使用することができるかまたは乾燥微粒子形態でそのまま使用することができる。

用語「スプレー凍結乾燥」とは、低温貯蔵環境下で流体をスプレーし、次いで、得られた凍結乾燥粒子を凍結乾燥させることを意味すると解される。

用語「泡沫乾燥」とは、濃縮溶液の、水の蒸発によるガラス状泡沫体の形態での乾燥を意味すると解される。

用語「冷凍泡沫乾燥」とは、ガラス転移温度および最大崩壊温度以下の温度での、予備冷凍溶液の、氷の昇華によるガラス状泡沫体の形態での乾燥を意味すると解される。

フラビウイルスの水性組成物は、５℃以上の温度で長期間の良好なウイルス安定性が可能ではない。例えば、ＹＦ−ＤＥＮ（黄熱−デング）キメラのバルク水性組成物は、３７℃で１日貯蔵した後に液体中での安定化が４ｌｏｇ以上喪失する。ここで、この熱不安定性は、低温流通体系下での輸送が困難な亜熱帯のＹＦ流行国では深刻な問題である。

１９７０年代から１９８０年代にかけて、凍結乾燥黄熱ワクチンは深刻な熱安定性問題（貯蔵：＋５℃で６ヶ月）を示した。安定化剤を含まないこれらの凍結乾燥ワクチンは、それらが２０℃以上の温度にさらされると非常に急速に劣化する。凍結乾燥黄熱ワクチン組成物の安定化の改良するための努力が行われた（３７℃で７日間での喪失、非安定化ワクチン：０.８７ｌｏｇ、安定化ワクチン：０.２４ｌｏｇ）。キメラＹＦ−ＤＥＮ（黄熱−デング）ワクチンに使用した黄熱のために開発された安定化剤（非特許文献５）は、無効であることが判明した（３７℃で７日間での喪失：血清型１について２.１ｌｏｇ；血清型２について１.３ｌｏｇ；血清型３について１.４ｌｏｇ；血清型４について１.９ｌｏｇ）。最近では、A.A. Adebayoら（非特許文献６）が凍結乾燥１７Ｄ黄熱ワクチンのための安定化剤を提案し、３７℃で２８日間の貯蔵の後に５０％の有効な生１７Ｄウイルスの喪失（０.３ｌｏｇ）を示した。また、ごく最近では、増量剤としての糖と組み合わせた安定化剤としてのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および弱毒生フラビウイルスを含有する凍結乾燥組成物のためのバッファーが特許文献２３にて提案された。

米国特許第６５８９５２２号国際公開第２００６／１３４４３３号国際公開第２００６／１３４４４３号国際公開第０２／６６６２１号国際公開第００／５７９０４号国際公開第００／５７９０８号国際公開第００／５７９０９号国際公開第００／５７９１０号国際公開第０２／０９５０７５号国際公開第０２／１０２８２８号欧州特許出願公開第１１５９９６８号国際公開第９３／０６２１４号国際公開第９８／３７９１１号国際公開第０３／１０１３９７号国際公開第９６／４０９３３号国際公開第０１／６０８４７号国際公開第０２／１０２８２８号国際公開第０３／１０３５７１号国際公開第０２／０７２８３５号国際公開第２００４／０４５５２９号国際公開第２００５／０８２０２０号国際公開第０３／１０２１６６号国際公開第２００８／０５７５５０号

C.-J. Lai and T.P. Monath in "Advances in Virus Research", (2003) vol. 61, pages 469 to 509 Theiler M, and Smith HH (1937) J Exp. Med 65, p 767-786 Rice et al., 1985, Science, 229:726 733 1998, Vaccines 16(9/10):1024-1028 M. Barme and C. Bronnert, J. Biol. Standardization, 1984, 12, p. 435 Biologicals (1998) 26, 309-316

本発明は、フラビウイルスワクチン組成物、特にキメラフラビウイルスワクチン、特にＹＦ−ＤＥＮ（黄熱−デング）キメラの安定化の問題を解決することができる。

したがって、本発明は、１種類以上の弱毒生フラビウイルスを含むワクチン組成物のための安定化剤であって、動物起源のタンパク質を含まず、二価の陽イオンを有する塩を添加しない水性溶液中に
バッファー、
ソルビトール２.５％〜６.５％
シュークロース２.５％〜１３％、
トレハロース０〜７.５％および／または他の二糖もしくは三糖０〜７.５％、
尿素０.２％〜０.５％、
アルギニン（Ａｒｇ）、シスチン（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）およびセリン（Ｓｅｒ）を含むアミノ酸混合物０.８％〜２.５％
を含む安定化剤に関する。

（原文に記載なし）

本発明の安定化剤は、ＴＲＩＳ（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン）（例えば５〜１０ｍＭの濃度）、ＨＥＰＥＳ（２−(４−(２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジニル)エタンスルホン酸）（例えば７.５〜２０ｍＭの濃度）およびリン酸カリウムおよび／またはリン酸ナトリウムからなる群から選択される１種類以上のバッファーを含有することができる。

さらに詳しくは、本発明の安定化剤は、
ソルビトール３.８％（ｗ／ｖ）、
シュークロース７.５％（ｗ／ｖ）、
トレハロース５.５％（ｗ／ｖ）、
尿素０.２５％（ｗ／ｖ）、および
アミノ酸混合物１.５％（ｗ／ｖ）
を含む。

本発明はまた、１種類以上の弱毒生フラビウイルスおよび本発明の上記安定化剤を含む安定化バルク水性ワクチン組成物に関する。

本発明の組成物は、弱毒生デング（ＤＥＮ）ウイルスおよび／または弱毒生ウエストナイル（ＷＮ）ウイルス病ウイルスおよび／または弱毒生日本脳炎（ＪＥ）ウイルスの１種類以上の血清型を含むことができる。

本発明のバリエーションは、１種類以上の弱毒生キメラフラビウイルス、例えばキメラＹＦ−ＤＥＮ（黄熱−デング）ウイルス、キメラＹＦ−ＷＮ（黄熱−ウエストナイルウイルス）ウイルスおよび／またはキメラＹＦ−ＪＥ（黄熱−日本脳炎）ウイルスの１種類以上の血清型を含む。

本発明はまた、１種類以上の弱毒生フラビウイルスを安定化する方法に関する。弱毒生フラビウイルスの生成における最終段階（例えば、Ｖｅｒｏ細胞上での培養、感染およびウイルス培養、次いで、１つ以上の工程における精製）で、弱毒生フラビウイルスを含む精製または非精製の濃縮または非濃縮ウイルス収集物を安定化剤の添加により希釈して、本発明の安定化剤の最終濃度を得、本発明の安定化バルク水性ワクチン組成物を得る。多価組成物は、複数の精製または非精製の濃縮または非濃縮安定化ウイルス収集物を混合することによって得られる。

本発明の安定化方法は、また、泡沫乾燥、スプレー乾燥または冷凍泡沫乾燥からなる群から選択される方法による水性組成物の乾燥、例えば、凍結乾燥法またはスプレー凍結乾燥法による水性組成物の乾燥を含むことができる。凍結乾燥法またはスプレー凍結乾燥法を選択することにより、本発明の安定化方法は、第１段階で均一な粒子またはビーズの形態で水性溶液を凍結させ、第２段階で凍結均一粒子またはビーズを乾燥させて安定化乾燥生成物を均一粒子またはビーズの形態で得ることにより変更することができる。ビーズの生成は、好ましくは、滅菌条件下で行うことができる。均一粒子またはビーズ（またはより具体的にはマイクロビーズ）は、本発明の水性組成物の液滴を、非常に冷たいガス（蒸発した液体窒素）中に滴下することによるかまたは低温貯蔵液（例えば液体窒素）中に直接滴下することにより凍結させることによって得られる。水性溶液または液体からの凍結均一粒子または凍結ビーズの調製は、Priceら（米国特許第３６５５５８３８号）、Adamsら（米国特許第４２１１０１５号）、A.A. Fawzyら（米国特許第５３０７６４０号）、R.O. Williams IIIら（米国特許第６８６２８９０号）、P.F. Herbertら（国際公開第９６／３６３１７号）およびP.-R. Nyssenら（米国特許第６９０３０６５号）に記載されている。液滴の凍結は、例えば、本発明の安定化バルク水性ワクチン組成物を顆粒にして非常に狭い粒度分布を有する直径１００μｍ〜１５００μｍの範囲の較正液滴を生成することで行うこともできる。これらの液滴は、液体窒素の直接注入／噴霧によって、または、窒素、ＣＯ₂もしくは空気のような非常に冷たいガスを向流的に流すことによって、冷凍媒体により低温に維持されている低温貯蔵チャンバー中を落下する。これらの液滴は落下の間に凍結して、較正凍結粒子を形成する。

層流噴流破砕技術としても知られている造粒は、生体触媒および生細胞固定化の分野で通常用いられている液体の較正液滴を得るための周知技術である（Hulst et al., 1985. A new technique for the production of immobilized biocatalyst and large quantities. Biotechnol. Bioeng. 27, 870-876；Gotoh et al., 1993. Mass production of biocatalyst-entrapping alginate gel particles by a forced oscillation method. Chem. Eng. Commun. 120, 73-84.；Seifert and Philips, 1997. Production of small, monodispersed alginate beads for cell immobilization. Biotechnol. Prog. 13, 562-568）。Lord Rayleighは、初めて、ニュートン流体について、ノズルから噴出するキャピラリー噴流の不安定さを分析し、モデルを提案し、文献に記載した（Rayleigh L, 1978. On the stability of jets. Proc. London Math. Soc. 10, 4-13）。Weber（Weber C, 1931. Zum Zerfall eines Fluessigkeitsstrahles. Z. Angew. Math. Mech. 11, 136-154）は、粘性の効果を含む分析を拡張した。最速成長妨害および噴流破砕に最適な波長は

［式中、λ_optは、噴流破砕に最適な波長であり、ｄ_jは、噴流の直径であり、ηは、流体の粘度であり、ρは、流体の密度であり、σは、流体の表面張力である］
によって示される。形成された液滴の直径ｄは、

によって算出することができる。

所望の結果を達成するために流体に施す回数ｆは、

によって噴流速度（したがって、流体の流速）ｕ_jおよび波長と関係づけられる。

したがって、最適条件は、既知のプロセスパラメーターおよび流体特性から算出することができる。しかしながら、均一液滴を形成するための回数および噴流速度は、ノズルの直径、流体の流動学および表面張力に依存してさまざまである（Meesters G., 1992. Mechanisms of droplet formation. Delft University Press, Delft, NL）。好適な操作回数はまた、液滴形成の安定性の視覚的評価によって実験的に決定することもできる。標準的な造粒装置は、液滴形成を観察するための光学ストロボスコープを装備している。所定の生成物および所定の操作条件について、このストロボスコープの光を用いて安定で穏やかな液滴鎖が観察されるまで、手動により回数を調節することができる。さらにまた、無菌造粒用にマルチノズルシステムが開発された（Brandenberger H. et al.1998. A new multinozzle encapsulation/immobilization system to produce uniform beads of alginates. J. Biotechnol. 63, 73-80）。結論として、操作回数は、利用可能な道具および生成物の知識に依存して理論的かつ実験的に決定することができる。

造粒プロセスは、粘稠性液体に適している。現在の供給者による最大許容粘度は、約３００ｍＰａ.ｓである。プロセス管およびノズル中の温度は、液滴形成前の溶媒結晶化を回避するように制御される必要がある。製剤化の技術分野における当業者は、賦形剤間の結果として起こる相互作用を考慮して、非制御結晶化および所定の限度を超える粘度を回避するように生成物中の様々な賦形剤濃度を調整する。

本発明の安定化バルク水性ワクチン組成物は、非常に狭い粒度分布を有する直径１００μｍ〜１５００μｍの範囲の較正液滴を生じるように造粒され得る。これらの液滴は、液体窒素の直接注入／噴霧によって、または、窒素、ＣＯ₂もしくは空気のような非常に冷たいガスを向流的に流すことによって、低温に維持されている低温貯蔵チャンバー中を落下する。これらの液滴は落下の間に凍結して、較正凍結粒子を形成する。液滴の凍結（すなわち、ペレットを固化する氷晶形成）のための最低落下高は、超冷却を制限することによって最低限にすることができる。超冷却は、液体窒素フォグもしくは液滴との接触（チャンバー内での液体窒素の直接注入）または微視的氷晶との接触（冷チャンバー内での水または過熱蒸気の直接噴霧）による液滴中でのシーディング氷核形成によって軽減することができる。

超音波噴霧化（Sindayihebura D., Dobre M., Bolle L., 1997 - Experimental study of thin liquid film ultrasonic atomization. ExHFT'97, Bruxelles）のような較正液滴を得るための他の技術、そして、次いで、食品工業から知られているように米国特許第５,０３６,６７３号に記載されているような特定の冷凍ドラムによって較正凍結粒子を得るための他の技術が当該技術分野で知られている。

次いで、均一粒子またはビーズ（マイクロビーズ）の形態で凍結した水性溶液を凍結乾燥させる。層流シーリング下で、該マイクロビーズをトレー上に分布させる。行われた工程を以下に記載する。
・凍結乾燥器の棚を−５０℃に前冷却する。
・トレー識別のためにトレーにラベルを貼る。
・約１時間凍結乾燥器の棚上で取扱道具およびトレーを−５０℃に冷却する。

次いで、凍結マイクロビーズを容器からトレーに移す。次いで、ビーズが均一に分布するようにトレーを撹拌する。次いで、トレーの上に分布したビーズ凍結乾燥させる。このプロセスから得られた安定化乾燥生成物のこれらの均一粒子またはビーズ（マイクロビーズ）は、約１００μｍ〜１５００μｍの直径、特に約５００μｍ〜１０００μｍの直径を有する。

凍結均一粒子またはビーズの形態で溶液の凍結を行い、次いで、乾燥させて均一粒子またはビーズ（マイクロビーズ）の形態の乾燥生成物を得るための方法および装置は、例えば、W.L. Porterら（米国特許第３１６２０１９号）、K.M. Goverら（米国特許第３４３１６５５号）、G.J. Malecki（米国特許第３３１３０３２号）、K.D. Heckら（ドイツ国特許出願公開第２６５９５４６号）、A.T.M. Wilderbeek（欧州特許出願公開第０７９９６１３号）およびD. Gehrmannら（米国特許出願公開第２００８／００６０２１３号）に記載されている。

本発明は、また、本発明の安定化バルク組成物を乾燥させることによって得られる乾燥ワクチン組成物に関する。この乾燥ワクチン組成物は、組成物が均一粒子またはビーズの形態で存在することを特徴とすることができる。この均一粒子またはビーズの形態の乾燥ワクチン組成物は、種々の弱毒生および／またはキメラ弱毒生フラビウイルスの混合物を含有する。この均一粒子またはビーズの形態の乾燥ワクチン組成物は、各粒子または各ビーズが単一のタイプの弱毒生および／またはキメラ弱毒生フラビウイルスを含有することを特徴とすることができる。

本発明はまた、均一粒子またはビーズ（マイクロビーズ）の形態であってもなくてもよい本発明の安定化バルク組成物を乾燥させることによって得られる乾燥ワクチン組成物を水性溶液で再構成する工程を含む、ワクチンの調製方法に関する。

本発明はまた、本発明の乾燥ワクチン組成物が入っている第１容器およびワクチンを再構成するための水性溶液が入っている第２容器を含むフラビウイルスワクチンキットに関する。このキットは、第１容器には種々のワクチン組成物の混合物が入っており、各粒子または各ビーズが単一のタイプの弱毒生および／またはキメラ弱毒生フラビウイルスを含有することを特徴とすることができる。

実施例１：安定化キメラ黄熱−デングバルク水性ワクチン組成物の調製
特定の安定化賦形剤濃度が得られるようにキメラＹＦ−ＤＥＮ、血清型１、２、３または４（ＣＹＤ−１、−２、−３または−４）を安定化剤と混合することによって一価組成物を調製した。多価組成物は、複数の一価組成物を混合することによって得られる。

本発明の安定化剤を用いて各造粒一価ワクチン組成物を安定化し、濾過し、ホモジナイズし、アリコート化し、次いで、ガラス転移温度以下の温度にて凍結水性形態で貯蔵した。

各一価ワクチン組成物を撹拌して解凍し、二価、三価および四価のワクチン組成物を目的の最終濃度で調製するために最終混合物に加えるべき各ワクチン組成物の体積を下記計算式により決定した：

ＢＦＰは、バルク最終生成物または一価もしくは多価ワクチン組成物を示す。

算出した各水性ワクチン組成物の目的体積を採取し、残った一価ワクチン組成物を再冷凍した。目的の最終濃度および目的の体積になるように一価ワクチン組成物を本発明の安定化剤と混合した。該混合物を５℃で２０分間撹拌してホモジナイズし、濾過滅菌した後、該混合物を冷凍または乾燥させた。該混合物は、放置の間、５℃であった。
選択された目的の濃度（ｌｏｇ／ｍｌ）で最終組成物を得るように、キメラ黄熱−デング（ＶＹＤ）ウイルスのバルクワクチン組成物の１つ、２つ、３つまたは４つを本発明の安定化剤と混合した後、これらの一価、二価、三価および四価のバルク混合物を冷凍または乾燥させることによってワクチン組成物を調製した。濃度は、各一価ワクチン組成物間で等しいかまたは選択された目的によって異なることができる。

実施例２：安定化キメラ黄熱−デングバルク凍結乾燥ワクチン組成物の調製
実施例１の記載に従って、水性の一価、二価、三価または四価ワクチン組成物を得た。この撹拌した５℃の混合物をバイアル１つにつき０.３ｍｌずつ可能な再現性のある方法で工業用凍結乾燥器の充填に必要な時間で分配した。次いで、棚を５℃に前冷却した凍結乾燥器中のラベルで識別されたトレー上に該バイアルを置いた。最終目的力価の該水性ワクチン組成物を含むバイアルを、以下に記載する凍結乾燥サイクルに従って凍結乾燥させた。このバイアルを−５０℃に冷凍した。目的の温度が達成させると、各バイアルに含まれる冷凍ワクチン組成物を、第１昇華段階の間、５０マイクロバールの圧力下にて棚温度−２８℃で１６.５時間昇華させた。次いで、凍結乾燥器中にて真空下または部分窒素圧下にてシェルフプレッシャーによって凍結乾燥バイアルに栓をした。該バイアルを取り出し、圧着し、標識し、次いで、５℃で貯蔵した。

実施例３：実施例１および２に準じた凍結乾燥安定化キメラ黄熱−デングバルク四価ワクチン組成物の安定性
安定化水性キメラ黄熱−デングバルク四価ワクチン組成物を６ｌｏｇ／ｍｌの目的濃度の本発明の安定化剤で安定化させた後、０.３ｍｌずつ分配したバイアルを凍結乾燥させた。安定化四価ワクチン組成物の賦形剤の配合割合を下記表１に示す：

各凍結乾燥物質を再水和化した後、０.４％ＮａＣｌ溶液で滴定した。平均力価を得るために、３〜６つのバイアルを滴定した。

２つの滴定技術を使用した。ＣＣＩＤ５０技術は、デングウイルス懸濁液の段階希釈に基づいており、各希釈生成物を、Ｖｅｒｏ細胞を入れた９６ウェルプレートのウェル中に分配する。７日間培養した後、Ｖｅｒｏ細胞を固定し、各血清型に特異的なモノクローナル抗体を使用した後にデングウイルスが存在する場合には染色する。試料の希釈と関連のある陽性ウェルの数に従って感染力価を算出する。最小二乗法によってＣＣＩＤ５０を算出し、力価をｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍｌとして表す。

μＰＦＵ技術は、ＣＣＩＤ５０技術と同じ原理に基づいている。しかしながら、細胞変性効果の個々のカウンティングによって力価が得られる。該分析は、画像解析によって行われる。滴定は、±０.３ｌｏｇに対して正確である。

実施例４：実施例１および２に準じた糖によって異なる凍結乾燥安定化キメラ黄熱−デングバルク四価ワクチン組成物の安定性
シュークロース７.５％／トレハロース５.５％の混合物をシュークロース１３％に変更し、他の成分は変更しなかった。

実施例５：実施例１および２に準じた凍結乾燥安定化キメラ黄熱−デングバルク四価ワクチン組成物−ＨＥＰＥＳバッファー組成物の安定性
トリスバッファーをＨＥＰＥＳバッファー０.３６％に変更し、他の成分の配合割合は変更しなかった。

実施例６：凍結乾燥マイクロビーズの形態の四価バルクワクチン組成物の安定性
この研究は、実施例１の記載に従って生成し、凍結乾燥物質の形態（実施例２）または凍結乾燥マイクロビーズの形態で乾燥させた四価バルクワクチン組成物の安定性を比較した。図１に示された方法を用いて、凍結乾燥マイクロビーズを生成した。

較正ノズルの振動に基づく造粒技術によってバルク水性ワクチン組成物を較正液滴にした。次いで、これらの液滴を、液体窒素の直接注入またはこの非常に冷たいガス（＜−１１０℃）の向流的走査により−１１０℃以下に維持された低温貯蔵チャンバーの内部に落として冷凍する。このようにして得られた凍結較正ビーズを前冷却した金属トレー上に分布させた。次いで、これらのトレーを、凍結乾燥器の−５０℃に前冷却した棚上に置いて、凍結ビーズの温度が最大低温濃度でのそれらのガラス転移温度（−１０℃〜−４０℃であり得るＴｇ’）を超えないようにした。これにより、該ビーズの部分的な融着、凝集、またはある賦形剤の再結晶を回避することができた。生成物を凍結乾燥器中に置いてすぐに、従来技術によって定義されているように生成物の慣用的な凍結乾燥に関するように該装置を真空下において氷を昇華させた。この用途のために、以下の乾燥パラメーターを適用した：
−３５℃の棚温度および５０マイクロバールの圧力下で１０時間の第１乾燥。
２０℃の棚温度および５０マイクロバールの圧力下での３時間の第２乾燥。

図２は、この方法によって得られたビーズの粒度に関して示す。

分析できるように乾燥マイクロビーズをバルクで回収し、貯蔵した。貯蔵条件は、乾燥した脆弱な含水粉末の貯蔵に適したものであった。マイクロビーズを希釈剤で再水和化するとすぐに再構成が生じた。

生成物の残留含水量を、国際薬局方（４版）のMethods of Analysis: 2. Chemical methods: 2.8 Determination of water by the Karl Fischer methodによって定義されているカール−フィッシャー法によって測定した。得られた値は２％以下であった。

次いで、バイアル１つにつき１回用量が得られるように、得られたビーズを分配した。これらのバイアルを３７℃および４５℃で貯蔵して、この生成物の熱安定性を研究し、慣用の凍結乾燥によって乾燥させたものと比較した。ウイルスの活性をμＰＦＵ技術によってアッセイし、得られた結果を下記表８〜１０に示す。

４つの血清型の各々について、乾燥工程での喪失は、凍結乾燥（実施例２および３に記載）とマイクロビーズ法との間で等価であった（０.２および０.４ｌｏｇ１０ＰＦＵ／用量）。マイクロビーズ形態における乾燥形態は、３７℃で１ヶ月後の０.３ｌｏｇの差異（４５℃で１４日間の貯蔵後には強くなり、０.８ｌｏｇに達した）をもつ標準的な凍結乾燥形態よりも３７℃および４５℃で高い熱安定性を示した。

この安定性の差異が同一のワクチン組成物について観察されたことを考慮すれば、マイクロビーズ法の操作条件および特に急速冷凍相は、生キメラウイルスの安定性に対して有益な効果を及ぼす。

実施例７：実施例１および２に準じた凍結乾燥安定化キメラ黄熱−ウエストナイルバルクワクチン組成物の安定性
安定化水性キメラ黄熱−ウエストナイルバルクワクチン組成物を本発明の安定化剤で安定化した（実施例１および２に準じた）後、０.３ｍｌずつ分配したバイアルを凍結乾燥させた（実施例３に準じた）。安定化凍結乾燥ワクチン組成物の賦形剤の配合割合は、実施例３の表１に示されている。並行して、安定化水性キメラ黄熱−ウエストナイルバルクワクチン組成物を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する参照安定化剤で安定化した後、０.３ｍｌずつ分配した凍結乾燥させた。

ＰＦＵ技術を用いて力価を測定した。下記表は、キメラ黄熱−ウエストナイルウイルスの２つの安定化剤による安定性プロフィールを比較する。

Claims

１種類以上の弱毒生フラビウイルスを含むワクチン組成物用の安定化剤であって、動物起源のタンパク質を含まず、二価の陽イオンを有する塩を添加していない水性溶液中に
バッファー
ソルビトール２.５％〜６.５％、
シュークロース２.５％〜１３％
トレハロース０〜７.５％および／または他の二糖もしくは三糖０〜７.５％
尿素０.２〜０.５％、
アルギニン（Ａｒｇ）、シスチン（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）、アラニン（Ａｌａ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）およびセリン（Ｓｅｒ）を含むアミノ酸混合物０.８％〜２.５％
を含む安定化剤。
ＴＲＩＳ（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ（２−(４−(２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジニル)エタンスルホン酸）およびリン酸カリウムおよび／またはリン酸ナトリウムからなる群から選択される１種類以上のバッファーを含有する、請求項１記載の安定化剤。
ＴＲＩＳが５〜１０ｍＭの濃度で存在する、請求項２記載の安定化剤。
ＨＥＰＥＳが７.５〜２０ｍＭの濃度の濃度で存在する、請求項２記載の安定化剤。
ソルビトール３.８％（ｗ／ｖ）、
シュークロース７.５％（ｗ／ｖ）、
トレハロース５.５％（ｗ／ｖ）、
尿素０.２５％（ｗ／ｖ）、および
アミノ酸混合物１.５％（ｗ／ｖ）
を含む、請求項１〜４いずれか１項記載の安定化剤。
１種類以上の弱毒生フラビウイルスおよび請求項１〜５いずれか１項記載の安定化剤を含む、安定化バルク水性ワクチン組成物。
１種類以上の弱毒生デング（ＤＥＮ）ウイルス血清型を含む、請求項６記載の組成物。
弱毒生黄熱（ＹＦ）ウイルスを含む、請求項６または７記載の組成物。
弱毒生ウエストナイル（ＷＮ）ウイルス病ウイルスを含む、請求項６または８記載のワクチン組成物。
弱毒生日本脳炎（ＪＥ）ウイルスを含む、請求項６〜９いずれか１項記載のワクチン組成物。
１種類以上のキメラ弱毒生フラビウイルスを含む、請求項６〜１０いずれか１項記載のワクチン組成物。
キメラＹＦ−ＤＥＮ（黄熱−デング）ウイルスの１種類以上の血清型を含む、請求項１１記載のワクチン組成物。
キメラＹＦ−ＷＮ（黄熱−ウエストナイルウイルス）ウイルスを含む、請求項１１または１２記載のワクチン組成物。
キメラＹＦ−ＪＥ（黄熱−日本脳炎）ウイルスを含む、請求項１１〜１３いずれか１項記載のワクチン組成物。
ＣＹＤ−１、ＣＹＤ−２、ＣＹＤ−３およびＣＹＤ−４を含む四価の組成物である、請求項６記載のワクチン組成物。
１種類以上の弱毒生フラビウイルスを安定化させる方法であって、請求項１〜５記載の安定化成分の最終濃度を得るように安定化剤を添加することによって１種類以上の弱毒生フラビウイルスを含む精製濃縮ウイルス収集物を希釈して請求項６〜１５いずれか１項記載の組成物を得ることを含む、方法。
泡沫乾燥、スプレー乾燥または凍結泡沫乾燥からなる群から選択される方法によって水性組成物を乾燥させることを含む、請求項１６記載の安定化方法。
凍結乾燥法によって水性組成物を乾燥させることを含む、請求項１６記載の安定化方法。
スプレー凍結乾燥法によって水性組成物を乾燥させることを含む、請求項１６記載の安定化方法。
第１段階で水性溶液を均一粒子またはビーズの形態で凍結させ、第２段階でこの凍結均一粒子またはビーズを乾燥させて均一粒子またはビーズの形態の安定化乾燥生成物を得ることを特徴とする、請求項１８または１９記載の安定化方法。
安定化乾燥生成物の均一粒子またはビーズが１００μｍ〜１５００μｍの直径を有する、請求項２０記載の安定化方法。
安定化乾燥生成物の均一粒子またはビーズが５００μｍ〜１０００μｍの直径を有する、請求項２１記載の安定化方法。
請求項６〜１５いずれか１項記載の安定化バルク組成物を乾燥させることによって得られる乾燥ワクチン組成物。
均一粒子またはビーズの形態で存在する、請求項２３記載の乾燥ワクチン組成物。
各粒子または各ビーズが種々の弱毒生および／またはキメラ弱毒生フラビウイルスを含有する、請求項２４記載の乾燥ワクチン組成物。
各粒子または各ビーズが弱毒生および／またはキメラ弱毒生フラビウイルスを含有する、請求項２４記載の乾燥ワクチン組成物。
請求項６〜１５いずれか１項記載の安定化バルク組成物から調製される乾燥ワクチン組成物。
請求項２３〜２７いずれか１項記載の組成物を水性溶液で再構成する工程を含む、ワクチンの調製方法。
請求項２３〜２７いずれか１項記載の乾燥ワクチン組成物が入っている第１容器およびワクチンを再構成するための水性溶液が入っている第２容器を含むフラビウイルスワクチンキット。
第１容器に請求項２６記載の種々のワクチン組成物の混合物が入っている、請求項２９記載のキット。