JP5559447B2

JP5559447B2 - カロテノイドエステル

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Publication number: JP5559447B2
Application number: JP2001274146A
Authority: JP
Inventors: ヨーゼフ・シールレ; ヴェルナー・ジモン; ヴォルフガング・シュタインベルク
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2000-09-11
Filing date: 2001-09-10
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2021-09-10
Also published as: US6896895B2; NO20014381D0; CN1197846C; NO20014381L; EP1186245A2; US20020114867A1; KR100810357B1; JP2002330705A; TWI271156B; CN1346824A; EP1186245A3; BR0103940A; AU780958B2; EP1186245B1; AU6880101A; CA2357055A1; KR20020020849A; MXPA01009114A

Description

本発明は、食品及び飼料産業における着色に有用である、一部は新規であるカロテノイドエステルに関する。

カロテノイドが、植物界及び動物界で豊富に見られ、場合によっては合成手段によって製造されている天然色素であることは周知である。さらなるカロテノイドが合成的に製造することができるが、自然界に見られるとは思われない。多くの重要なカロテノイドが、食品及び飼料産業で色素として、たとえば、特にエチルβ−アポ−８′−カロテノエート（CAROPHYLL（登録商標）Yellow）、アスタキサンチン（CAROPHYLL（登録商標）Pink）及びカンタキサンチン（CAROPHYLL（登録商標）Red）の場合、卵黄、家禽、魚及び甲殻類を着色するために使用されている。このために、動物の外皮、たとえば家禽の皮、脚及びくちばしならびに魚及び甲殻類の皮、うろこ及び殻、場合によっては家禽の皮下脂肪ならびに魚及び甲殻類の肉であろうと、動物性生産物、たとえば卵（卵黄）であろうと、強められ、より美的に受け入れられる色の視覚的印象を与えるため、動物の餌にカロテノイド色素が添加される。着色の増強は、多くの要因の中でも、当該カロテノイドの特定の光吸収性共役二重結合系、カロテノイド富化された餌の消費後の動物体内へのカロテノイドの吸収されやすさ（沈着速度）ならびに標的動物の身体組織又は生産物中のカロテノイド又は代謝産物の濃度に依存する。しかし、選択されたカロテノイドの構造の知識から、この応用分野で色素としてどれほど効果的に作用するかを予測することはできない。関与するさらなる要因は、動物飼料において、そのような飼料がさらされる通常条件下で貯蔵されたとき、たとえば大気酸化、光、温度及び湿気に対するカロテノイドの安定性である。

発明が解決しようとする課題

家禽に関しては、消費される運命のトリの外皮及び卵黄について、許容しうるレベル及び品質の着色が望まれる。消費者が深い色（特に濃い黄金色）の付いた卵黄を好むため、たとえば卵黄の色を強める物質の使用が一般に推奨される。品質の評価において見かけはまさに重要な要因である。世界の多くの場所では、たとえばブロイラ及び観賞用のトリは、その外皮、特に皮、脚及びくちばしならびにブロイラの場合には皮下脂肪が特定の着色規準を満たすならば、より美的に受け入れられる。低繊維、高エネルギー食品の使用を伴い、十分に着色された家禽及び卵黄の生産を困難にする現代の集約的家禽飼育方法では、草の消費を減らすことを考慮すると、今日、補充的な着色の必要性は優勢である。

特に各種サケ・マス類の魚肉及び外皮ならびに甲殻類、たとえばカニ、ロブスター及びエビの肉及び外皮の着色もまた、食用生産物を消費者にとってより魅力的にする観点で、魚及び甲殻類にカロテノイドに富む餌調製物を与えることによって達成されることは周知である。

そのうえ、栄養価の高い生産物、たとえば乳製品、たとえばバター及びチーズならびに化粧品、たとえば口紅は、当該製造工程の適当な段階でカロテノイドを配合することによって着色できることが公知である。

課題を解決するための手段

今、以下に指定する特定のカロテノイドエステルが、上記で示した用途で、色素として、そのような目的にこれまで使用されてきたカロテノイドエステル、特にエチルβ−アポ−８′−カロテノエートよりも驚くほど効果的であることがわかった。したがって、本発明は、家禽の卵黄、外皮及び／又は皮下脂肪ならびに魚及び甲殻類の肉及び／又は外皮を、１種以上のカロテノイドエステルをそのような家禽、魚又は甲殻類の餌に含めることによって着色する方法であって、該カロテノイドエステルが、一般式

（式中、Ｒは、メチル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルケニル又はＣ₅〜Ｃ₈シクロアルキルを表す）
で示されるものであることを特徴とする方法を提供する。

本発明の範囲では、「Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルキル」又は「Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルケニル」は、直鎖状及び分岐鎖状のアルキル及びアルケニル基、たとえばｎ−及びイソプロピル及びtert−ブチル又はビニル及び４−メチル−３−ペンテニルをそれぞれ包含する。「Ｃ₅〜Ｃ₈シクロアルキル」は、たとえば、シクロペンチル及びシクロヘキシルを含む。

上記式Ｉは、異性体形態、たとえば、異性体形態が具体的に示されないならば、光学活性及びシス／トランスもしくはＥ／Ｚ異性体ならびにそれらの混合物を包含する。Ｅ／Ｚ異性に関して、すべてのＥ異性体が一般に好ましい。

好ましい実施態様では、本発明の方法の場合だけでなく、これらのカロテノイドエステル（以下に定義し、記載する）の応用形態に関して、式Ｉのカロテノイドエステルは、以下のものからなる群より選択される。

メチルβ−アポ−８′−カロテノエート CAN:4273-73-8〔１〕
ｎ−プロピルβ−アポ−８′−カロテノエート〔２〕
ｎ−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート CAN:148216-79-9〔３〕
イソブチルβ−アポ−８′−カロテノエート CAN:148216-80-2〔４〕
sec−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート CAN:148216-81-3〔５〕
イソアミルβ−アポ−８′−カロテノエート CAN:148216-83-5〔６〕
２−メチル−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート〔７〕
２，２−ジメチルプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート〔８〕
２−エチル−１−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート〔９〕
ｎ−ヘキシルβ−アポ−８′−カロテノエート CAN:148216-84-6〔１０〕
２−メチル−１−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート〔１１〕
４−メチル−２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート〔１２〕
ｎ−ラウリルβ−アポ−８′−カロテノエート〔１３〕
ｎ−セチルβ−アポ−８′−カロテノエート〔１４〕
シクロペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート〔１５〕
シクロヘキシルβ−アポ−８′−カロテノエート CAN:148216-83-7〔１６〕
イソプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート〔１７〕
tert−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート〔１８〕
２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート〔１９〕

最も好ましい実施態様では、式Ｉのカロテノイドエステルは、ＲをＣ₃〜Ｃ₆アルキルとして有するもの、特に前記リストの最後３種のカロテノイドエステル、すなわち〔１７〕〜〔１９〕のカロテノイドエステルからなる群より選択される。

本発明はまた、家禽の卵黄、外皮及び／又は皮下脂肪ならびに魚及び甲殻類の肉および／または外皮の着色を目的とする、家禽、魚又は甲殻類のためのカロテノイドエステル富化された餌であって、カロテノイドエステルとして、好ましくは前記リストのカロテノイドエステル〔１〕〜〔１９〕、最も好ましくは〔１７〕〜〔１９〕から選択される、上記一般式Ｉの少なくとも１種のカロテノイドエステルを有効量で含むことを特徴とするカロテノイドエステル富化された餌を提供する。

本発明の方法及びカロテノイド富化された餌で使用することができるカロテノイドエステルの一部はそのもの公知であり、これら（全部で７種）の公知のカロテノイドエステルは、それぞれのＣＡＮ（Chemical Abstract Number）によって上記リストで指定されている。

しかし、これら公知のカロテノイドエステルに関する現在の技術水準は、それらを、先に示した用途で、たとえば卵黄の色を強めるための色素として使用できることをいかなるふうにも示していない。

本発明のカロテノイドエステル（請求項に係わる）、すなわち〔２〕、〔７〕〜〔９〕、〔１１〕〜〔１５〕及び〔１７〕〜〔１９〕のカロテノイドエステルを含む、式Ｉの新規なカロテノイドエステルは、類似した構造の公知のカロテノイドエステル、たとえばエチルβ−アポ−８′−カロテノエートを製造する方法〔たとえば、Helv. Chim. Acta 42, 862 ff.(1959), ibid. 49, 369ff.(1966), Pure Appl. Chem. 14, 245ff. (1967)、スイス国特許第３８２，１４８号及び米国特許第３，１１３，９６１号を参照〕と同様な方法により、適当な出発原料から製造することができる。したがって、式Ｉのカロテノイドエステルは、たとえば、ａ）所望のアルコール成分及び塩基の存在におけるエチルβ−アポ−８′−カロテノエートのエステル交換反応（J. March, Advanced Organic Chemistry, 3^rd Ed; Wiley Interscience, 1985, p. 351）、ｂ）塩基の存在における、β−アポ−１２′−カロテナールと（３−アルコキシカルボニル−２−ブテニル）−トリフェニルホスホニウムクロリドとのウイッティヒ反応（W. Guexらの米国特許第３，１１３，９６１号；Cadogan, Organophoshorus Reagents in Organic Synthesis, Academic Press, New York, 1979）又はｃ）β−アポ−８′−カロテン酸及びトリフルオロ酢酸から製造される混合無水物（R. C. Parish et al., J. Org. Chem. 30, 927(1965)）から得ることができる。

本発明の方法を実現するためには、カロテノイドエステルは、適宜、家禽、魚又は甲殻類の餌を介して適用される。強い着色を担うカロテノイドエステルは、当該動物によって自然に摂取される。その餌はまた、それら自体が家禽の卵黄、外皮及び／又は皮下脂肪ならびに魚及び甲殻類の肉及び／又は外皮の通常の着色に寄与する他の天然及び／又は人工の（合成によって製造した）カロテノイド（たとえば、ＥＰ６３０，５７８Ｂ１及びＥＰ７１８，２８４Ｂ１で提供されるもの）を含むこともできる。餌に加えられる式Ｉのカロテノイドエステルの含量は、一般に、カロテノイドエステル富化された餌の総重量に基づき、０．１ppm〜１５０ppm（mg/kg又は０．００００１〜０．０１５重量％）の範囲である。家禽の餌では、特に産卵前のメスニワトリ及びブロイラの場合、添加されるカロテノイドエステルの含量は、好ましくは、０．２５ppm〜８０ppmの範囲であり、魚又は甲殻類の餌の場合、この含量は、好ましくは２．５ppm〜１５０ppmの範囲である。

本発明の家禽、魚又は甲殻類の餌の成分は、他の点では従来のものであり、餌は、物理的な添加混合、ペレット化、押し出し、マイクロカプセル化、吹き付けなどを含む従来方法によって製造することができる。これにより、製造工程のどこかの段階で、式Ｉのカロテノイドエステル１種以上が配合される。家禽の餌の従来の成分は、たとえば、小麦、とうもろこし、大麦、もろこし、オーツ麦、米及び又は大豆粉餌を、普通は適宜すりつぶした又は砕いた形態で、大きな割合（いずれの場合でも少なくとも約１０重量％で）で含む。さらなる少量の成分（約５重量％まで、又は場合によっては、１重量％未満）は、たとえば、魚、肉及び／又は骨粉餌、小麦もみがら、わら、イースト、加水分解脂肪、タロー、ラード、石灰石、塩、メチオニンプレミックス、ミネラルプレミックス、ビタミンプレミックス及び／又は固化防止剤を含む。いかなる家禽餌をも、式Ｉによって示される少なくとも１種のカロテノイドエステルによって富化して、本発明の家禽餌を得ることができる。本発明の典型的な魚又は甲殻類の餌は、添加されるカロテノイドエステルは別として、主要なタンパク質供給源としての魚粉餌、小麦及び骨粉餌、大豆粉餌、小麦粉、ボイルしたデンプン、イースト、魚油、大豆油、大豆レシチン、メチオニン、ビタミン類及びミネラルを含む。そのような餌のタンパク質、脂質及び炭水化物含量は、それぞれ約４０〜５０重量％、１４〜４０重量％及び約１０重量％である。

カロテノイドエステルならびに場合によっては家禽、魚又は甲殻類の餌に配合されるさらなるカロテノイドは、ビードレット（beadlet）（典型的なビードレットの組成についてはＥＰ６３０，５７８Ｂ１及びＥＰ７１８，２８４Ｂ１を参照）の形態でいわゆるプレミックス（W. Steinberg, M. A. Grashorn, A.-M. Klunter, J. Schierle, "Comparative pigmentation efficiency of two products containing either apo-ester or targets extracts in egg yolks and liquid eggs", Arch. Geflugelk. 64(4), 180-187（2000））に混入することができ、それを逆に餌に加える。本発明のさらなる態様を表すビードレットそのものは、好都合には、カロテノイドエステルは別として、ゼラチンと炭水化物とのデンプンコートされたマトリックス及び１種以上の酸化防止剤、たとえばエトキシキン及び／又はアスコルビルパルミテートを含む。

ビードレットは一般に、式Ｉの少なくとも１種のカロテノイドエステル、好ましくは上記リストのカロテノイドエステル〔１〕〜〔１９〕、最も好ましくは〔１７〕〜〔１９〕の少なくとも１種を活性成分として１〜２０重量％含み、プレミックスは一般に、活性成分を０．００１〜１５重量％含む。

本発明はさらに、家禽の卵黄、外皮及び／又は皮下脂肪ならびに魚及び甲殻類の肉及び／又は外皮を着色するための、これら式Ｉのカロテノイドエステル１種以上の使用を提供する。この使用は、好ましくは、産卵前の卵黄を着色する又はブロイラを着色することを含む。

以下の例によって本発明を説明する。
例１
アルゴン雰囲気下、（３−イソプロポキシカルボニル−２−ブテニル）−トリフェニルホスホニウムクロリド５．２６g、β−アポ−１２′−カロテナール４g及びメタノール８０mlを２００mlフラスコ中（不活性条件）で混合した。その後、メタノール中ナトリウムメチレートの３０％溶液２．２３mlを、不活性条件下２５℃で攪拌しながら３０分以内に混合物に滴下した。反応混合物を５０℃でさらに４時間攪拌したのち、水８２ml及び酢酸０．３４mlを加えた。その後、混合物を環流温度で１６時間攪拌した。次に、混合物を０℃に冷却し、得られた結晶質の沈殿物をろ過によって収集し、１２mlのイソプロパノール２部及び水４０mlで洗浄した。

生成物である粗イソプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート（約９g）を水７mlを含むアセトン１４０mlから再結晶させて、赤褐色の結晶３．６gを得た。イソプロピルβ−アポ−８′−カロテノエートの収率は７６％であった（ＨＰＬＣによるカロテノイドエステルの総含有率約９７％）。

この例は、ウィティッヒ反応による本発明の化合物（化合物〔１７〕）の製造を例示する。

例２
アルゴン雰囲気下、７５０mlフラスコ中、エチルβ−アポ−８′−カロテノエート３０．５６g及び２−ペンタノール１４４．５mlを塩化メチレン２５０mlに溶解し、メタノール中ナトリウムメチレートの３０％溶液４．７９mlを加えた（不活性条件）。反応混合物を加熱し、還流温度で攪拌した。得られたエタノールを、塩化メチレンとの共沸混合物として留去した。留出物を新鮮な塩化メチレンによって置き換えた。３時間後、反応はほぼ完了し、酢酸１．６４mlでの中和ののち、塩化メチレンを、６５℃の蒸気温度までの蒸留により、メタノールによって置き換えた。得られた結晶懸濁液をろ過し、収集した濃赤色の結晶質沈殿物をメタノール及び水で洗浄した。乾燥させたのち、粗２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート３０．２６gを９０．７％の収率で得た（ＨＰＬＣによるカロテノイドエステルの総含有率約９７％）。

この例は、エステル交換反応法による本発明の化合物（化合物〔１９〕）の製造を例示する。

例３
アルゴン雰囲気下、エチルβ−アポ−８′−カロテノエート４７．０１g、テトラヒドロフラン２８２ml、エタノール１７９ml及び水酸化カリウム４１．２６gならびに水５３４mlを反応フラスコ中で混合した（不活性条件）。混合物を還流下で加熱し、３時間攪拌した。その間、すべての固形成分が溶解した。

２５℃に冷まし、塩酸４３４．５ml（水中１０％）を加えたのち、得られた懸濁液を減圧下でろ別した。次に、収集した結晶質沈殿物を水３００mlで洗浄し、減圧下、６０℃で乾燥させた。β−アポ−８′−カロテン酸４６．９１gを赤紫色の結晶として得た。

こうして得た粗β−アポ−８′−カロテン酸、トルエン４４０ml及びトリフルオロ酢酸無水物５５．６mlを混合し、アルゴン雰囲気下で６０℃に加熱して明澄な溶液を得た。tert−ブタノール１８８mlを１０分以内に滴下し、その後、溶液を１０％苛性ソーダ１２０gで注意深く中和した。水相を分離したのち、有機相を１５０mlの水３部で洗浄し、減圧下、乾燥状態まで濃縮した。油状の残渣をアセトン５０mlに溶解し、アルゴン雰囲気下で攪拌しながらメタノール２００mlを加えた。得られた結晶懸濁液を環流下で２時間加熱した。２５℃に冷まし、ろ過し、メタノール１５０mlで洗浄し、減圧下に乾燥させたのち、粗tert−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート３６．７gを７３．６％の収率で得た（ＨＰＬＣによるカロテノイドエステルの総含有率約８２．９％）。

この例は、混合無水物法による本発明の化合物（化合物〔１８〕）の製造を例示する。

例４
カロテノイドエステル含有ビードレット組成
成分重量％
カロテノイドエステル１１．５
エトキシキン２．２
アスコルビルパルミテート１．１
ゼラチン、 Bloom 140 ３１．０
デキストリンイエロー１３．２
スクロース（結晶質）１３．２
コーンスターチ２７．８

例５
概要
卵黄、ブロイラ死骸の背部の皮及びブロイラの脚で、目視評定（Roche Colour Fan）を伴う反射比色法によって着色効能を評価した。卵黄及びブロイラの背部の皮で、エチルβ−アポ−８′−カロテノエート（対照）及び他のカロテノイドエステルの沈着を測定した。加えて、血漿及び腹部脂肪中のカロテノイドレベルを計測した。

動物試験「産卵メスニワトリ」のための材料及び方法
卵黄着色試験に使用される標準実験設計にしたがって、Roche Research Center for Animal Nutrition（ＣＲＮＡ、F-68305 Village-Neuf, France）で試験を実施した。毎年２月、新たなメスの群で着色試験を開始した。試験開始時、産卵前のメスニワトリ（１９２羽、タイプ「ＩＳＡブラウン」）の齢は次のとおりであった。
Ｈ−１９／９８５１週
Ｈ−２５／９８５９週
Ｈ−１２／９９３６週
Ｈ−１８／９９６０週
Ｈ−０５／００２３週

試験の前に、メスニワトリには、低カロテノイド基本食（ＣＲＮＡで製造）を、カロテノイド補充なしで少なくとも２８日間与えた。基本食の組成の詳細を表１に示す。試験中、３週間、対照グループには、餌１kgあたり総キサントフィル２mg未満の低カロテノイド基本食を与え、他のメスには、適切な色素を補充されたこの食事を与えた。食事は、どろどろにした形で自由に与えた。水道水を自由に与えた。補充のない対照処置の他に、以下の処置を試験した（表７〜９を参照）。

動物試験「ブロイラ」のための材料及び方法
Couvir de la Bohardiere, F-49290 Saint Laurent de la PlaineからのタイプRoss 308（試験ＭＣ−２４／９８及びＭＣ−０２／９９）及びRoss 508（試験ＭＣ−１１／９９、ＭＣ−１６／９９、ＭＣ−２４／９９及びＭＣ−０３／００）のニワトリを使用して試験を実施した。性別によって分けた１日齢のブロイラニワトリを、体重により、１０羽ずつの実験グループに分け、おがくずをまき散らした囲いの中で飼育した。２２日目（試験ＭＣ−２４／９８、ＭＣ−０２／９９及びＭＣ−１１／９９）又は１５日目（試験ＭＣ−１６／９９、ＭＣ−２４／９９及びＭＣ−０３／００）まで、ニワトリには、１kgあたり総キサントフィル２mg未満の低カロテノイド基本成長食（組成は表２に示す）を与えた。その後３週間の試験期間中、適切な色素で栄養補充された基本食を与えた。餌は、第一週目には、ほぐしたペレットとして与え、その後はペレットとして与えた。餌及び水へのアクセスには制限を加えなかった。所与の処置は、オスニワトリの１グループ及びメスニワトリの１グループを含むものであった。各グループのニワトリを、２２日目（試験ＭＣ−２４／９８、ＭＣ−０２／９９及びＭＣ−１１／９９）又は１５日目（試験ＭＣ−１６／９９、ＭＣ−２４／９９及びＭＣ−０３／００）及び４３日目に計量した。４２日目に、各グループから５羽を無作為に選び出し、標識を付けた。頸動脈から血液サンプルを採取した。実験の最後（４４日目）に、市販の畜殺装置（Freyburger, Dannemarie, France）でニワトリを処分した。翌日、標識付きニワトリの皮膚（死骸の背部）及び脚の色を反射比色計（Minolta CR200装置、CIE-Labシステム）によって計測した。背部の皮膚及び腹部脂肪のサンプルを採取し、実験グループごとに溜め、カロテノイド濃度を測定した。餌、血漿、皮膚及び腹部脂肪中のカロテノイドの濃度を、表１及び２の後に記載する標準手法によって測定した。

着色効力を計測する方法
Steinbergら〔Arch, Geflugelk 64(4), 180-187(2000)〕によって記載されたようにして卵黄の色を評価した。卵黄は、卵白から手作業で分けた。卵３〜６個から分離した卵黄を合わせ、計量し、色が均一になるまでガラス棒で攪拌した。Roche Yolk Colour Fan（ＲＹＣＦ、１９９３年版）を使用して色相を目視的に評定した。溜めておいた卵黄のアリコートをガラスキュベットに移して、厚さ約２cmの層にし、Dr. Lange Xeno Color LS 100スペクトル比色計により、拡散Ｄ６５照射及び８°の視角で計測した。

三刺激式Minolta CR-300クロマメータを使用して、拡散Ｄ６５照射及び０°の視角でブロイラの皮及び脚の色を計測した。皮の色は、乾燥したブロイラ死骸の背面の異なる３点で読み、３点計測の平均値を記録し、脚の色は、指先の間のふくらみの一カ所の計測によって記録した。

色データは、ｈ^*（色相）及びＣ^*（クロマ）を含むＣＩＥＬ^*ａ^*ｂ^*値として表した。処置及び試験ごとの表記した値は、四つの卵黄プール又は十羽のブロイラの背部の皮及び脚（オス５羽及びメス５羽）の色計測値の平均を表す。

ＨＰＬＣ分析
Schierleらの方法（J. Shierle, N. Faccin, V. Riegert, Analytical Methods for Vitamins and Carotenoids in Feed, Revised Supplement: Determination of Stabilized Apocarotenoic Ester and Canthaxanthin in Premixes and Feeds, Roche Publication no. 50771(1995)、F. Hoffmann-La Roche Ltd., CH-4070 Baselより市販）にしたがって、餌中の種々のカロテノイドエステルの含量を測定した。偏差として、ノーマル相ＨＰＬＣの移動相には、ｎ−ヘキサン中７％ではなく０．５％のアセトンを含めて、カロテノイドエステルのＥ／Ｚ異性体の分離を改善した。ｎ−ヘキサン中、各規準物質の熱異性化溶液のクロマトグラフィーにより、ピークを種々のカロテノイドエステルのすべてのＥ及びＺ異性体に対応させた。ＨＰＬＣ系は、エチルβ−アポ−８′−カロテノエートのすべてのＥ異性体で較正した。種々の誘導体の応答係数を、それぞれの分子量を考慮に入れながら、エチルβ−アポ−８′−カロテノエートの応答係数から演繹した。Ｚ異性体画分の含量は、すべてのＥ異性体の応答に基づき、低い方のＺ異性体の比吸収率の１．４の補正係数の使用によって計算した。

また、餌内分析のためのＨＰＬＣ系を使用して、卵黄、ブロイラ組織及びブロイラ血漿中のカロテノイドエステルの定量したが、抽出手順はマトリックスごとに異なっていた。

血漿抽出の場合、十分に混合した血漿サンプル１．０gを、脱イオン水１．０ml及びエタノール４．０mlとともに１０ml試験管に導入し、内容物をVortexシェーカで混合した。ｎ−ヘキサン４．０mlを加えたのち、試験管をガラスストッパでシールし、水平振とう装置で５分間振とうした。混合物を約２５００gで５分間遠心分離して、相の分離を高めた。上有機相のアリコートをオートサンプラによってＨＰＬＣに注入した。

卵黄の抽出のために、溜めて均一化しておいた卵黄１０gを、分散器具（Polytron）を使用して脱イオン水１０mlと混合した。希釈卵黄１．０gを脱イオン水１．０ml及びエタノール２．０mlとともに１０ml試験管に導入し、内容物をVortexシェーカで混合した。ｎ−ヘキサン４．０mlを加えたのち、血漿に関して記載したようにして混合物をさらに処理した。卵黄脂質がｎ−ヘキサン相を４．０mlから４．３mlに拡張させ、これをカロテノイドエステル含量の計算で考慮した。

５羽のオス又はメスの死骸からのブロイラ背部の皮又は腹部脂肪を溜め、Retsch Grindomix GM200を使用して均一化した。組織ペースト１．０gを硫酸マグネシウムヒドレート１．０gと混合し、分散器具（Polytron）によって８．０mlのアセトン３部で残らず抽出した。合わせた抽出物をろ過し、５０℃の窒素流下で蒸発させた。油状の残渣を、０．５％アセトンを含むｎ−ヘキサンとでメスフラスコ中１０mlまで溶解した。溶液を振とうし、ＨＰＬＣ装置に注入した。

ブロイラの血漿、皮及び脂肪中の色素
エチルβ−アポ−８′−カロテノエートの当量としてのイソプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート（化合物〔１７〕）の濃度は、対照（市販品Carophyll Yellow（登録商標）：エチルβ−アポ−８′−カロテノエート、いわゆるアポエステル）との比較で、血漿中で１２９％、皮中で１３４％及び脂肪中で８８％であった。tert−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート（化合物〔１８〕）の匹敵する値は、それぞれ１０３％、１８９％及び１１３％であり、２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート（化合物〔１９〕）の匹敵する値は、それぞれ８８％、１３４％及び８５％であった（表３）。他１２種の試験したカロテノイドエステル（表４）と比較して、化合物〔１７〕、〔１８〕及び〔１９〕の濃度は、エチルβ−アポ−８′−カロテノエートの当量であると測定され、少なくとも皮中では実質的により高かった。

反射比色計測
皮及び脚における反射比色計測の値によって皮中の色素濃度の増大値を確認した。クロマＣ^*ａ^*ｂ^*値が実質的に高まり、対照よりも化合物〔１７〕、〔１８〕及び〔１９〕の場合により強い色を示した。色相ｈ^*ａ^*ｂ^*は、有意に変化しなかった（表５）。測定されたクロマ値の増大を、畜殺されたブロイラの皮及び脚の目視分類によって確認した（表５）。他１２種の試験したカロテノイドエステルの色値（表６）は、対照の範囲内であった。

結論
試験したカロテノイドエステルのうち３種（化合物〔１７〕、〔１８〕及び〔１９〕）は、皮中の濃度ならびに皮及び胸中の色の強さ（クロマＣ^*ａ^*ｂ）の点で対照よりも有意に効果的であった。さらには、他１２種の試験したカロテノイドエステルは、対照に匹敵しうる品質を有していた。

卵黄中の色素
エチルβ−アポ−８′−カロテノエートの当量としての試験したカロテノイドエステルの、対照との比較における分析含量、沈着速度及びRoche Colour Fan Value（ＲＹＣＦ）を表７及び８に示す。化合物〔１７〕、〔１８〕及び〔１９〕の卵黄中の濃度は、対照の範囲内であった（表７）。沈着速度〔沈着速度の計算：Steinberg et al., Arch. Geflugelk. 64(4), 180-187(2000)〕は、いくつかの例外を除いて、対照に対応した（表７及び８）。

反射比色計測
カロテノイドエステルの値（色相ｈ^*ａ^*ｂ^*及びクロマＣ^*ａ^*ｂ^*）及びＲＹＣＦの値は、いくつかの例外を除き、対照値に対応した（表９及び１０）。

結論
化合物〔１７〕、〔１８〕及び〔１９〕ならびに他１２種の試験したカロテノイドエステルは、沈着速度及び卵黄中の色の強さ（クロマＣ^*ａ^*ｂ^*）の点で対照に匹敵しうる品質を有していた。

従って、本発明は以下の通りである。
（１）家禽の卵黄、外皮及び／又は皮下脂肪ならびに魚及び甲殻類の肉及び／又は外皮を、１種以上のカロテノイドエステルをそのような家禽、魚又は甲殻類の餌に含めることによって着色する方法であって、該カロテノイドエステルが、一般式

（式中、Ｒは、メチル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルケニル又はＣ₅〜Ｃ₈シクロアルキルを表す）
で示されるものであることを特徴とする方法。
（２）該カロテノイドエステルが、メチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−プロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、sec−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソアミルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−メチル−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、２，２−ジメチルプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−エチル−１−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ヘキシルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−メチル−１−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、４−メチル−２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ラウリルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−セチルβ−アポ−８′−カロテノエート、シクロペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、シクロヘキシルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、tert−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート及び２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエートからなる群より選択される、（１）記載の方法。
（３）餌中のカロテノイドエステルの含量が、カロテノイドエステル富化された餌の総重量に基づき、０．１ppm〜１５０ppmの範囲である、（１）又は（２）記載の方法。
（４）産卵メスニワトリの卵黄を着色する又はブロイラを着色するための、（１）〜（３）のいずれか１項記載の方法。
（５）家禽の卵黄、肉、外皮及び／又は皮下脂肪ならびに魚及び甲殻類の肉及び／又は外皮の着色を目的とする、家禽、魚又は甲殻類のためのカロテノイド富化された餌であって、カロテノイドとして、一般式

（式中、Ｒは、メチル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルケニル又はＣ₅〜Ｃ₈シクロアルキルを表す）
の１種以上のカロテノイドエステルを有効量で含むことを特徴とするカロテノイド富化された餌。
（６）該カロテノイドエステルが、メチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−プロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、sec−ブチルβ−アポ−８’−カロテノエート、イソアミルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−メチル−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、２，２−ジメチルプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−エチル−１−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ヘキシルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−メチル−１−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、４−メチル−２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ラウリルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−セチルβ−アポ−８′−カロテノエート、シクロペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、シクロヘキシルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、tert−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート及び２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエートからなる群より選択される、（５）記載のカロテノイド富化された餌。
（７）着色に使用されるカロテノイドエステルの含量が、カロテノイド富化された餌の総重量に基づき、０．１ppm〜１５０ppmの範囲である、（５）又は（６）記載のカロテノイド富化された餌。
（８）家禽に用いられる、（５）〜（７）のいずれか１項記載のカロテノイド富化された餌。
（９）家禽、魚又は甲殻類のためのプレミックス又は餌に配合するための、１種以上のカロテノイドを含むビードレットであって、カロテノイドとして、一般式

（式中、Ｒは、メチル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルケニル又はＣ₅〜Ｃ₈シクロアルキルを表す）
の１種以上のカロテノイドエステルを１〜２０重量％の量で含むことを特徴とするビードレット。
（１０）該カロテノイドエステルが、メチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−プロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、sec−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソアミルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−メチル−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、２，２−ジメチルプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−エチル−１−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ヘキシルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−メチル−１−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、４−メチル−２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ラウリルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−セチルβ−アポ−８′−カロテノエート、シクロペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、シクロヘキシルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、tert−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート及び２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエートからなる群より選択される、（９）記載のビードレット。
（１１）家禽、魚又は甲殻類のための餌に配合するための、１種以上のカロテノイドを含むプレミックスであって、カロテノイドとして、一般式

（式中、Ｒは、メチル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルケニル又はＣ₅〜Ｃ₈シクロアルキルを表す）
の１種以上のカロテノイドエステルを０．００１〜１５重量％の量で含むことを特徴とするプレミックス。
（１２）該カロテノイドエステルが、メチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−プロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、sec−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソアミルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−メチル−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、２，２−ジメチルプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−エチル−１−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ヘキシルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−メチル−１−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、４−メチル−２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ラウリルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−セチルβ−アポ−８′−カロテノエート、シクロペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、シクロヘキシルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、tert−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート及び２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエートからなる群より選択される、（１１）記載のプレミックス。
（１３）家禽の卵黄、外皮及び／又は皮下脂肪ならびに魚及び甲殻類の肉及び／又は外皮を着色するための、一般式

（式中、Ｒは、メチル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₁₆アルケニル又はＣ₅〜Ｃ₈シクロアルキルを表す）
の少なくとも１種のカロテノイドエステルの使用。
（１４）カロテノイドエステルｎ−プロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−メチル−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、２，２−ジメチルプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−エチル−１−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート、２−メチル−１−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、４−メチル−２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−ラウリルβ−アポ−８′−カロテノエート、ｎ−セチルβ−アポ−８′−カロテノエート、シクロペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート、イソプロピルβ−アポ−８′−カロテノエート、tert−ブチルβ−アポ−８′−カロテノエート又は２−ペンチルβ−アポ−８′−カロテノエート。

Claims

家禽の卵黄、外皮及び／又は皮下脂肪を、１種以上のカロテノイドエステルをそのような家禽の餌に含めることによって着色する方法であって、該カロテノイドエステルが、イソプロピルβ−アポ−８’−カロテノエート、tert−ブチルβ−アポ−８’−カロテノエート及び２−ペンチルβ−アポ−８’−カロテノエートから選ばれるものであることを特徴とする方法。
家禽の卵黄、肉、外皮及び／又は皮下脂肪の着色を目的とする、家禽のためのカロテノイド富化された餌であって、カロテノイドとして、イソプロピルβ−アポ−８’−カロテノエート、tert−ブチルβ−アポ−８’−カロテノエート及び２−ペンチルβ−アポ−８’−カロテノエートから選ばれる１種以上のカロテノイドエステルを有効量で含むことを特徴とするカロテノイド富化された餌。
家禽のためのプレミックス又は餌に配合するための、１種以上のカロテノイドを含むビードレットであって、カロテノイドとして、イソプロピルβ−アポ−８’−カロテノエート、tert−ブチルβ−アポ−８’−カロテノエート及び２−ペンチルβ−アポ−８’−カロテノエートから選ばれる１種以上のカロテノドエステルを１〜２０重量％の量で含むことを特徴とするビードレット。
家禽のための餌に配合するための、１種以上のカロテノイドを含むプレミックスであって、カロテノイドとして、イソプロピルβ−アポ−８’−カロテノエート、tert−ブチルβ−アポ−８’−カロテノエート及び２−ペンチルβ−アポ−８’−カロテノエートから選ばれる１種以上のカロテノイドエステルを０．００１〜１５重量％の量で含むことを特徴とするプレミックス。
イソプロピルβ−アポ−８’−カロテノエート、tert−ブチルβ−アポ−８’−カロテノエート及び２−ペンチルβ−アポ−８’−カロテノエートから選ばれるカロテノイドエステル。