JP5483789B2 - 眼障害を治療及び診断するための新規な薬物及び方法 - Google Patents
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Description
本発明は、一般的に、眼障害の治療及び診断に関する。より具体的には、本発明はサブ−免疫グロブリン抗原結合分子を用いる眼障害の治療方法及び診断方法に関する。
発明の背景
本発明者らは、Fv免疫グロブリン断片、ミニボディ等のサブ−免疫グロブリン抗原結合分子が、角膜に浸入し、副作用の著しく低減した眼障害の有効な治療及び/又は診断を提供できることを発見した。
眼の一部と、該状態を示す標的抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子とを接触させる工程、及び
該抗原結合分子と該標的抗原を含む複合体の存在を検出する工程、
を含む方法が提供される。
1.定義
他に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に通常理解されているものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は等価の任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用できるが、好ましい方法及び材料が記述される。本発明のために、下記の用語が以下に定義される。
本発明は、サブ−免疫グロブリン抗原結合分子が眼に局所的に適用された場合相当のレベルまで角膜に浸入できるという予期せぬ発見に由来する。この発見に基づき、本発明者らは、このような分子の眼への浸入が非経口投与及び眼周囲注射を含む代替経路によっても達成できると考える。
本発明は眼障害の治療又は診断で使用するための組成物にも及び、該組成物は該障害と関連のある標的抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子を担体と共に含む。
本発明のさらなる特徴は、眼障害を治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、該障害と関連のある標的抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子の有効量を投与する工程を含む方法である。
本発明は、眼状態を診断する方法であって、該状態を示す抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子と眼の一部を接触させる工程、及び該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子と該抗原を含む複合体の存在を検出する工程を含む方法にも及ぶ。
(i)該抗原結合分子への該標識の直接的な付着;
(ii)該抗原結合分子への該標識の間接的な付着、即ち、他の検定試薬に該標識を付着させた後、該試薬を該抗原結合分子に結合させる;
(iii)該抗原結合分子の後の反応生産物への付着。
該標識は、色素原、触媒、酵素、蛍光色素、化学発光分子、ユーロピウム(Eu34)などのランタニドイオン、放射性同位元素、及び直接的可視標識を含む群から選択されうる。
実施例1
scFv抗体断片及び二価ミニ抗体の眼内侵入
scFv抗体断片及び二価ミニ抗体の工学及び発現
該抗体工学用の出発材料はOX38であった。これはラットのCD4抗原に対して特異的に結合する全長の抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統であった。該scFv抗体断片のための工学工程は、クレーバーら(1997, J Immunol Methods 201(1):35-55)及びプリュックツンら(大腸菌における抗体の生産:PCRから発酵まで、マックカフェリー・ジェイ、フーゲンブーム・エイチ、チスウェル・ディ編、抗体工学:実践的アプローチ、オックスフォード:オックスフォードユニバーシティープレス、1996年:203−252(ハーメス・ビイ編、実践的アプローチシリーズ))により記載されている技法通りに行った。要するに、mRNAを増殖中のハイブリドーマ細胞系統から抽出し、該mRNAをcDNAに逆転写した。該抗体の軽鎖及び重鎖の可変部についての遺伝情報は、クレーバーら(上掲)及びプリュックツンら(上掲)によって記載されているように、伸長されたプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により個別に増幅した。両鎖のDNA生産物は共にスプライシングしpAK100ベクターに挿入した。該ベクターは大腸菌JM83(エイ・プリュックツンから贈与された)を形質転換するために使用した。scFv断片を大腸菌中で発現し培養上清から回収した。これらの断片は、ラットCD4抗原の供給源としてラットの胸腺細胞を用いてフローサイトメーターでそれらの結合活性について試験した。
scFv又はミニ抗体を発現させるため、上記ベクターを用いて大腸菌HB2151又は大腸菌BL21を形質転換した。細菌培養物は、非常に良いブロス複合培地を用いてプリュックツンら(上掲)により記載されているものと類似した20L容のベンチトップ型発酵槽中で培養した。培養物は、25℃で、20の光学密度(OD600nm)で、0.1mMのIPTG(イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド)の添加によりタンパク質の発現を誘導した。3から4時間の発現の後、培養物をベックマンJ21遠心分離機(4000×g、4℃で25分間)で回収し、細菌ペレットは即座に処理するか又は−70℃で保存した。
正しく折りたたまれ且つ機能的なscFv又はミニ抗体を得るために、該細菌ペレットを、1グラムのペレットにつき2mLの抽出緩衝液を用いて50mMのホウ酸ナトリウム(NaBo)、0.15MのNaCl、pH8.0に再懸濁し、細菌をマントン−ガウリン・フロースルーホモジナイザーでの超音波処理により破砕した。溶菌液は4℃で30分間13,000xgで遠心分離した後、該scFv又はミニ抗体を含む上清を0.2μmのフィルターに通し、そして1%のトリトンX−100、1%のトゥィーン−20及び20mMのイミダゾールで補足した。清澄化された溶菌液をニッケル−ニトリロトリ酢酸(Ni−NTA)樹脂(キアーゲン社、キアイクスプレッショニスト、キアーゲン、ドイツ、1999年)で充填したIMACカラムにかけた。このカラムを20カラム容量(CV)の平衡緩衝液(50mMのNaBo、1%のトリトンX−100、1%のトゥィーン−20、20mMのイミダゾール、pH8.0)及び5CVの50mMのNaBo、20mMのイミダゾール、pH8.0で洗浄した。結合タンパク質は20〜500mMのイミダゾ−ルの直線勾配を用い10CV以上でカラムから溶出した。タンパク質を含む画分をプールし、Q−セファロース−HP陰イオン交換カラムにかけ、20mMのヘペス緩衝液(N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジン−N′−[4−ブタンスルフォン酸])pH8.0で平衡化した。非結合タンパク質を3CVの平衡緩衝液で洗浄した後、結合タンパク質を0〜1MのNaClの直線勾配を用い7CV以上の20mMのヘペス、pH8.0中に溶出した。精製されたscFv又はミニ抗体を含む画分をプールし、滅菌濾過しそして4℃で2×150容量の20mMのヘペス、pH8.0、0.15mMのNaClに対して透析した。試料は精製工程間で採取しSDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を用いて分析した。好ましい実施態様においては、この精製分子は、その半減期を延長するためにチャップマンら(1999, Nature Biotechnology 17: 780-783)の手法を用いてモノメトキシ−ポリエチレングリコール(PEG)で化学的に修飾される。
抗原結合についてのscFv断片に関する全ての試験は、ラットの胸腺細胞を基にフローサイトメトリーにより実施した。胸腺細胞の懸濁液を、採取したばかりのラットの胸腺組織を基にして標準的な実施要綱により調製した。50μLのRPMI培養液に懸濁された胸腺細胞(5x105)を検定チューブごとに使用した。高感受性フローサイトメトリー検定は、scFv(50μLの試料)、抗ポリHisマウス抗体(50μL、200倍に希釈、シグマ社)、ビオチン化ヤギ抗マウス抗体(50μL、50倍に希釈、ベクター社)及びストレプトアビジンR−フィコエリスリン複合体(50μL、50倍に希釈、シグマ社)について30分間のインキュベーション工程を用いて4℃で実施した。細胞はインキュベーションの間に30容量のPBS−アジドで洗浄した。検定は50μLの固定液(PBS、0.5%のホルムアルデヒド)を添加することにより固定し、フローサイトメーターで読み取った。
角膜組織
scFv、ミニ抗体及び全長のIgG抗体の浸透は、実験の2〜5時間前に地方の食肉処理場で食用に屠殺された正常な8〜14月齢のブタの眼で試験した。移殖の臨床用途に適さなかったヒトの眼1個を地方のアイバンクから入手し、摘出後2時間以内に使用した。他の実験上の理由で医学及び獣医学研究所(アデレード、南オーストラリア)の動物小屋で飼育され屠殺されたネコから得た四つの角膜を摘出の3時間以内に使用した。
角膜潅流チャンバー
ネコ及びブタの角膜を通過するscFvのインビトロの浸透を角膜潅流チャンバーで研究した(図2)。該潅流チャンバーは、本体、クランピングスリーブ(clamping sleeve)及び固定リングの三つの部分から構成される。全ての部分がポリカーボネートから作製される(生物医学工学センターで製造された、フリンダース・メディカル・セントレ、アデレード)。該クランプの後側部を形成する該本体の「肩」は、ヒト、ブタ及びネコなどの異なる種から得られる角膜の元々の湾曲を支持するため30°曲げられている。載せられた角膜と共に受容側上のチャンバーを形成する中心腔は直径12mmで深さ3mmである。本体には潅流の流入及び流出のためのチャンネルもある。上皮側から本体へ角膜を留める該クランピングスリーブは、ねじれのない垂直移動を指示するためそして組立て中に起こりうる角膜へのせん断応力及び角膜の縁の損傷を防ぐために二つのステンレス製のガイドピンを有する。該クランピングスリーブは、涙液排水を模倣して適用された目薬を吸収し得る流体チャネルをも含む。その表面上にある角膜及びクランピングスリーブは固定リングにより本体のチャンバーに押しつけられており、該リングは非常に精確な固定力の調整ができる細い糸(1mmのピッチ)を有する。一度、該角膜を適切に載せると、全チャンバーは暖水が水浴から循環している熱交換ブロックに連結される。
組織の生存能力は、角膜の厚さを携帯型厚度計(BVIポケット厚度計、B.V.インターナショナル、63100クラーモント−フェランド、フランス)で測定することにより全実験中30分ごとに機械的に評価した。各実験の初めに、該角膜を一時間潅流し、次の30分間で3以上の個別の測定により角膜の厚さの基線値を確立した。次の実験中に基線値から10%以上の厚さの増加があれば、上皮の機能障害とみなされ、この角膜は廃棄された。
無傷の結膜組織をもつヒト又はブタの眼全体を、ウエル中で角膜が下方に向くように置くためにテフロンの表面に造形されたくぼみを備えるテフロンブロック上に配置した(図3)。このウエルは100μLのscFv又はミニ抗体で部分的に満たされていた。角膜を除く他の組織が該薬物と接触しないよう注意を払った。全眼は湿潤チャンバーを形成するように伏せたプラスチックの容器で覆い、この実験設定全体を35〜37℃の温度に該眼を保つよう水浴上に配置した。インキュベーション期間の最後に、全眼球をBSSで数回洗浄し、ティッシュペーパーで乾燥し、そして再度洗浄した。前眼房液の試料は、角膜から前眼房へ通り抜ける27Gの注射針を用いて回収した。浸透したscFv及びミニ抗体の濃度は、潅流チャンバー実験設定の場合と同様にFACS検定で評価した。
scFv及びミニ抗体の精製
ニッケル−NTA精製カラムから得られた溶出液は、OX38scFvについては52%の純度で0.5mg/mLのタンパク質濃度を、そしてOX38ミニ抗体については21%の純度で0.74mg/mLのタンパク質濃度をそれぞれ有した。Q−Sepharose(商標)陰イオン交換カラムでの次の精製により、98%の純度で3.98mg/mLの最終濃度のscFv及び75%の純度で1.83mg/mLの濃度のミニ抗体を得た。ニッケルカラム及び次のイオン交換カラムの二工程精製計画により、内毒素のレベルがわずか1.08内毒素単位(EU)/mgのscFv及び36EU/mgのミニ抗体という臨床グレードの純度を得た。
ラットのCD4抗原へのscFvの結合は、ラットの胸腺細胞を用いてフローサイトメトリー検定で試験した。全長のモノクローナル抗体であるOX38を用いたフローサイトメトリー検定で示されるように、全胸腺細胞の95%以上がその表面上にCD4抗原を発現した。OX38はラットのCD4に特異的に結合する。このCHRI−r4−Fv1・scFvは同一の様式で全ての胸腺細胞に結合した。CHRI−r4−Fv1・scFvの試料の最大蛍光強度はOX38で見られた該強度の約三分の二であった。しかしながら、希釈系列での該蛍光強度は、OX38抗体及びCHRI−r4−Fv1・scFvにおいて同一様式で低下した。このことは、両者が類似の結合特性を持つことを示している(図4)。
角膜間質を通るscFvの浸透は、該角膜潅流チャンバーを用いる最初の一連の実験で試験した。該角膜上皮はこの実験前に除去した。図5に示すように、このscFvはブタの角膜間質を首尾よく透通しその特異的な抗原結合活性を保持していた。供与側上でのscFvの最初の一滴と受容チャンバー側上での明確な結合活性の検出との間に4時間の間隔があった。
66.8kDaの分子サイズをもち角膜間質を通るOX38ミニ抗体の浸透を、該潅流チャンバー内での一価scFv断片と同じ方法で試験した。負の対照として使用された全長のOX38IgG抗体の浸透は、14時間の全実験期間の間検出できなかった。対照的に、OX38ミニ抗体の結合は3時間後に陽性となり、フローサイトメーター検定が8時間以降の試料で飽和に達するまで更に指数的に増加した(図11)。
本研究は、遺伝子工学的組換え抗体断片が目薬として局所的に投与された後に該角膜に首尾よく浸透して眼の内側に到達できたことを証明する。さらに、これらの断片は十分な抗原結合活性を保持し、抗体に基づく眼の治療介入及び診断介入の可能性を提供する。同時に、本研究は、以前の多数の人たち(ベルハーゲンら、1990, Invest Ophthalmol Vis Sci 31(8): 1519-25;オススキーら、1993 ,Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 231(2): 122-8)と同様に天然に生じる全長の抗体が該角膜を浸透せず又は治療に有用な程には少なくとも浸透しないことを示し、そして該角膜を通って浸透できる最大分子サイズの遮断がしばしば引用されるが再現されない研究(モーリス・ディ、ミシマ・エス、眼の薬物速度論、スプリンガー−ベルラグ、ベルリン、1984年、シアーズ・エム編、眼の薬理学)で見出される500kDaよりはるかに小さいことを明らかにした。
実験動物モデル
動物
6〜16週齢の雌雄のフィッシャー344、DA、ルイスとウィスター−フルスの同系交配のラット及びポートンの異系交配のラットを南オーストラリアのフリンダーズ大学(アデレード、オーストラリア)内で飼育する。ラットは21℃及び50%の湿度で12時間の明期と12時間の暗期の周期で飼われ、随意に水と乾燥飼料(ニュー・ジョイント・ストック、リドレー・アグリプロダクツ、ムレー・ブリッジ、南オーストラリア、オーストラリア)を与えられる。成体の雌雄のBALB/cマウス又はOLAマウスは21℃及び50%の湿度で12時間の明期と12時間の暗期の周期で飼育され、水と乾燥飼料(ニュー・ジョイント・ストック、リドレー・アグリプロダクツ、ムレー・ブリッジ、オーストラリア)を与えられる。全ての手順及び安楽死は吸入による全身麻酔(ハロセイン;ゼネカ社、マックレスフィールド、英国)の下で実施される。実験プロトコルはナショナル・ヘルス・アンド・メディカル・リサーチ・カウンシル・オブ・オーストラリアの「研究における動物使用のガイドライン」に従って開発された。該プロトコルは承認のため南オーストラリアのフリンダーズ大学の動物福祉委員会に常に提出する。
ラットは、ローゼンバームら(1980, Nature 286:611-613)の方法に従って、100マイクログラムの標準食塩水に溶解した200マイクログラムの大腸菌055:B55リポ多糖類(シグマ・ケミカル社)を片方の後足に注射される。炎症は注射12時間後に明白となり24時間で最大となり48時間までに消散する。動物は検診され24時間で細隙灯で評点される。本発明者らはこのモデルについて広範な経験を有する(スミスら、1998, Invest Ophthalmol Vis Sci 39:658-661; Immunol Cell Biol 76: 497-512)。
実験的メラニン誘導性ブトウ膜炎(EMIU)は急性前部ブドウ膜炎の確固たる関連モデルである(スミスら、1998, Immunol. Cell. Biol. 76:497-512;スミスら、1999, Clin. Exp. Immunol. 115:64-71)。眼のメラニンは、ブリュックヒュイゼら(1984, Curr Eye Res 3:1405-1412)により記述されたプロトコルに従ってウシの脈絡膜から抽出され、乾燥重量として定量される。EMIUは、百日咳毒素コアジュバントと共に、ハンターのアジュバント中で乳化された250μgの精製されたウシの脈絡膜メラニンで免疫化することにより、フィッシャー344ラットで誘導する(ブリュックヒュイゼと同僚、1984、上掲;1995, Ocul Immunol Inflamm 3: 149-155; 1996, Jpn J Ophthalmol 40: 459-468)。具体的には、ラットには、滅菌済みでパイロジェン・フリーの0.9%標準食塩水とフンターの TitreMax (商標)アジュバント(シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国)との1:1乳濁液中の125マイクログラムのウシの眼のメラニンを60マイクロリットルの総容量で右後足に注射することにより投与する。その直後に、該ラットは、総容量40マイクロリットルの標準食塩水中の1マイクログラムの百日咳毒素(シグマ・ケミカル社)と混合した同量のメラニンで腹膜腔内注射される。ブドウ膜炎は一般的に二側性であり注射後10〜20日で明白となり2〜3週後に消散し動物の20%に再発する。
動物は毎日細隙灯で検診しブトウ膜炎の発症及び経過を同定する。重篤度は、水溶性の細胞及び発赤、フィブリンの存在、癒着、瞳孔の反応性、虹彩の充血及び蓄膿が全て評点されるよく実証された系に従って記録する。使用する尺度は以下の通りである。
炎症なし: 正常な外観、
軽病: 前部ブドウ膜の腫脹は無いが明白な浸潤、前房若しくは後房における細胞浸出物は±、
中度の病気:軽症又は中度の前部ブドウ膜の腫脹及び浸潤、前房及び後房における中皮の細胞浸出物、
重病: 重度の前部ブドウ膜の腫脹及び浸潤、硝子炎を伴う前房及び後房における大きな細胞浸出物。
動物は麻酔ハロセインの過剰投与により殺し、これらの眼をさらなる工程のため即座に取り出す。
本発明者らは、広範に使用されている同系交配ラットの眼科角膜移植モデル(ウィリアムズとコースター、1985, Invest Ophthalmol Vis Sci 26:23-30;ウィリアムズら、小動物の角膜移植。小動物の実験的移殖モデル、エムケイ・グリーン、ティーイー・マンデル、チュア,スウィッツアーランド編:ハワード・アカディミック・パブリッシャーズ、1995年、5章、107〜132頁)を発展させた最初の者となった。同系交配のフィッシャー344ラット(F344;主要組織適合遺伝子複合体(MHC)ハプロタイプRTv )及び同系交配のウィスター−フルス・ラット(WF;MHCハロタイプRTu )を角膜移植用に用いる。成体のF344ラットは、成体のF344ラット(同種同系移殖片)又は成体のWFラット(同種異系移殖片)のいずれかからの角膜移植片の受容動物である。移植片は性差にまたがって実施されないが、同種異系移殖片はMHCのクラスI及びクラスII及び少数の抗原障壁にまたがって実施される。
BALB/cマウスの角膜を針を用いて乱切し、106 pfuのHSV−1(臨床的単離物)を含む4μLを局所的に適用する(トーマスら、1998, J Immunol 160:3965-70)。病気は3週間の期間にわたって間質性角膜炎に進行する。臨床的評点システムを細隙灯で病気を追跡するために使用する。0は透明な角膜、1は軽度のかすみ、2は中度の不透明又は傷、3は重度の不透明化だが虹彩の縁は見える、4は虹彩が見えない、5は間質性角膜炎の壊死。よく特徴付けられたNIH/OLAマウス(ハルランド社)の再発性HSV角膜炎モデルも用いられる(レイコックら、1991, Invest Ophthalmol Vis Sci 32: 2741-2746)。一つの角膜が乱切され上記のように接種される。同時に、HSVに対する抗体(ケミコン社、テメキュラ、カリフォルニア州)を含むプールされたヒトの血清0.5mLを腹膜腔内に投与すると感染の急性期の間損傷から眼を保護する。次いで、潜伏期を確立するため該マウスを5週間放置する。ウイルスの再活性化はUVBトランスイルミネーター(FS40ウェスティングハウスランプ)を用いて行う。麻酔されたマウスは該眼だけが照射されるように遮蔽される。55秒間にわたる248mJ/cm2 の線量はHSVの再活性化に最適である。
アカントアメーバ角膜炎は、本発明者らの研究室で開発されたモデル(バデノックら、1990, Arch Ophthalmol 108: 107-112)に従って、異系交配ラットの角膜にアカントアメーバ及びコリネバクテリウム・エスピイを接種することにより誘導される。成体の雌のポートンラットに麻酔をかける。縁から約1mmの角膜周辺に、メス刃を用い、2mmの部分厚で切開した。手術用顕微鏡の下で、31ゲージの針を固定した微量注射器を用いて、106 個のコリネバクテリウム・ゼロシスと混合した104 個のアカントアメーバ・キャステラニイ(>90%栄養型、>90%生存能)1μL容積を接種する。この針を該傷を通して中心の角膜薄膜内に挿入する。全ての動物は接種後毎日観察される。アカントアメーバ角膜炎は全動物で発症し、5日目に白血球の浸潤が見え、7日目までに化膿性角膜炎が十分に確立される。
実験群は10匹の動物を含む。移殖片の生存及び病気の発症率のデータを、つなぎ線について補正されたマン−ウィットニーU試験を用いて分析する。明確なデータ(例えば、病気の重篤度の評点)を二元フィッシャーの直接確立検定を用いて分析する。
手術用顕微鏡に連結されたワイルド・ヒールブルグ・フォトオートマットMPS45カメラを用いて、麻酔をかけた動物の角膜の写真撮影を実施する(ラット、マウスについて)。免疫組織化学は、PLPで固定された組織の凍結切断切片について、免疫ペルオキシダーゼ技法を用いて実施する。即ちラット及びマウスの白血球に対するモノクローナル抗体及び角膜の白血球浸潤物の組成を正確に同定させる他の細胞表面マーカーに対する広範囲のモノクローナル抗体を用いる。組織病理学的相関関係はホルマリン固定され、パラフィン包埋された全眼のH&E切片について行う。フローサイトメトリーは標準的な単色間接的免疫蛍光法及び高感度法を用いて実施する。
抗ラットB7−1(CD80:3H5;IgG1)及び抗B7−2(CD86:24F;IgG1)のハイブリドーマはエイチ・ヤギタ博士(順天堂大学、東京、日本)から恵与された。抗CD28ハイブリドーマ(JJ319;IgG1)はティ・フニグ博士(インスティチュート・フォ・ヴァイロロジー・アンド・イミュノロジー、ヴルツブルグ大学、ドイツ)から恵与された。抗−ポリ−ヒスチジン抗体(HIS−1;マウス;IgG2a)はシグマ・ケミカル社(セントルイス、ミズーリ州、米国)から購入した。FITC結合ヤギ抗−マウス免疫グロブリンはシレナス・ラボラトリーズ(メルボルン、VIC)から購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン及びビオチン化ヤギ抗−マウス免疫グロブリンはDAKOコーポレーション(カルピンテリア、カリフォルニア州、米国)から購入した。
全身投与は、担体として加えられた1%の牛胎児血清(FCS)とともに緩衝化生理食塩水中の抗体を腹膜腔内(ip)注射することにより実施され得る。注射の計画は実験に応じて決定する。局所投与は、1%のFCS及び一つ以上の浸透増強剤で補足され且つ眼科用バランスド・ソルト・ソリューション中の抗体を直接角膜に適用することにより実施され得る。
モノクローナル抗体を腹水として作製するために、標準的な方法に従ってプリスタン処理した個々のBALB/cマウス群にハイブリドーマ細胞を腹膜腔内投与する。腹水は該マウスを安楽死させた後に無菌的に回収する。得られる腹水は1%v/vの牛胎児血清を含み且つ滅菌済みでパイロジェン・フリーのPBSで希釈する。
ラット又はマウスの細胞表面抗原の免疫組織化学的同定に使用されるマウスのモノクローナル抗体は、定常期のハイブリドーマから得られる無希釈の上清として生産される。ハイブリドーマX63(特異性は未知、IgG1イソ型の負の対照)、OX−1(抗−CD45[白血球に共通の抗原 ]、IgG1イソ型)、OX−35及びOX−38(抗CD4、それぞれIgG1及びIgG2aイソ型)、OX−8(抗CD8、IgG1イソ型)、NDS61(抗CD25[インターロイキン−2受容体(IL−2R)]、IgG1イソ型)、R73(抗T細胞受容体(TCR)、IgG1イソ型)、OX−26(抗CD71[トランスフェリン受容体]、IgG2aイソ型)、OX−42(抗CD11b/CD18[C3b受容体]、IgG2aイソ型)、ED−1(抗ラット単球、マクロファージ及び樹状細胞の細胞質抗原、IgG1イソ型)並びにOX−6(抗MHC単形態クラスII決定基、IgG1イソ型)はヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズから入手し、ハイブリドーマSAL5(抗サルモネラ抗原、IgG2aイソ型の負の対照)はエル・アシュマン博士(アデレード大学、アデレード、オーストラリア)から恵与された。種々のマウスの表面マーカー(マウスのCD4(GK1.5)、CD8(TIB150)、CD11b/c(TIB213、HB8466)及びIL−2受容体(PC61))に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは両方とも、フリンダーズ大学のピイ・マカルドル博士とピイエイチ・ハート博士から恵与された。
ラット又はマウスの安楽死の後、眼は毛様体輪の後部に穴をあけ、2%重量/容量(w/v)パラホルムアルデヒド−0.075Mリシン−0.0375M燐酸ナトリウム−0.01M過ヨウ素酸ナトリウムに4℃で4時間浸漬することにより前固定し、ダルベッコのA燐酸緩衝化生理食塩水(PBS)中に7%と15%w/vのショ糖の逐次変化で脱水し、OCT化合物(マイルス、エルクハート、インディアナ州、米国)中に包埋し、そして液体窒素中ですばやく凍結した。眼の横断面を5〜8ミクロンの厚さで低温装置により切断した。切片はダルベッコA燐酸緩衝化生理食塩水(PBS)中10%v/vの正常なブタの血清(カモンウェルス・シーラム・ラボラトリーズ、メルボルン、オーストラリア)と室温で10分間インキュベートした後、該第一抗体と18時間インキュベートした。この時点及びその後に、該切片を0.2%w/vのゼラチンを含むPBSで洗浄した。これらを、1%v/vの正常なラットの血清を含むPBSで1:500の割合に希釈されたビオチン化親和性で単離されたヤギ抗マウス免疫グロブリン(DAKOコーポレーション、カルピンテリア、カリフォルニア州、米国)と30分間インキュベートし、洗浄した後、PBSで1:1000の割合に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(DAKOコーポレーション〉と共にさらに30分間インキュベートした。切片を洗浄し、40mMのアジ化ナトリウム、20mMの3,3′−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド、9mMのイミダゾ−ル、及び0.07%v/vの過酸化水素(シグマ・ケミカル社)を加えたpH7.6の9mMトリス−塩酸緩衝液中で5分間呈色させた。抗体の反応性及び特異性は、免疫組織化学で使用する前に適切なラット又はマウスの標的細胞(正常細胞及び/又はトランスフェクタント)上で、及び眼で使用する前に眼以外の組織の固定切片上で、フローサイトメトリーにより確認した。
摘出した眼を、10%の緩衝ホルマリン中で最低24時間固定し、100%エタノールにより脱水し、さらにクロロホルム中で18時間固定し、そしてパラフィンワックスに包埋する。組織横断面を5ミクロンの厚さに切断しヘマトキシリンとエオシンで染色する。
末梢T細胞の部分集合を尾の血液調製物のフローサイトメトリーにより監視した。試料は、該第一抗体の注射の直前並びに疾患誘導の7日、14日及び28日後にラットから採取した。1mL以下の末梢血をリチウムヘパリン被覆したチューブ内に採取し、100IU/mLのペニシリン、100マイクログラム/mLの硫酸ストレプトマイシン、2mMのグルタミン及び10%v/vの牛胎児血清を含むヘペス緩衝化RPMI1640培地(ICNバイオメディカル社、オーロラ、オハイオ州、米国)で5mLまで希釈した。リンパ球は、Lymphoprep (商標)(ニコムド・ファーマ・アズ、オスロ、ノルウェイ)の比重を1.09に調整するために、40mMのメグルミンジアトリゾエート(アンジオグラフィン、シェーリング・エイジイ・ベルリン、ドイツ)を使用した以外は、製造業者の記載通りにリンフォプレップを用いて単離した。回収した細胞を1x107細胞/mLでPBS−0.02Mアジ化ナトリウム(PBS−アジド)中に懸濁し、そしてリンパ球懸濁液のこの50マイクロリットルに50マイクロリットルのモノクローナル抗体を添加した。この混合物を30分間氷上でインキュベートした後、PBS−アジドで洗浄し、4℃で5分間400×gで遠心分離した。そのペレットを25マイクロリットルの正常なラットの血清及びPBS−アジドで50倍に希釈した50マイクロリットルのFITC結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(シレナス・ラボラトリーズ、メルボルン、オーストラリア)に再懸濁した。氷上で30分間インキュベートした後、連続して二回洗浄した。この細胞ペレットを、PBS中に10mMのグルコース、5%v/vのホルムアルデヒド及び5mMのアジ化ナトリウムを含む50mLの固定液に再懸濁した。抗体結合は標準的な蛍光フィルターセット( FACScan(商標)、ベクトン・ディッキンソン、マウンテン・ビュー、カリフォルニア州、米国)を用いてフローサイトメトリーにより測定した。
内毒素のレベルは、製造業者の説明書に従ってマルチ−テスト・リムラス・アメーボサイト・ライセート・アッセイ(ウィッタッカー・バイオプロダクツ、ウォーカーズビレ、ミズーリ州、米国)(感度=0.125EU/mL)により測定した。
試薬中の全タンパク質量は、製造業者の説明書に従って市販のタンパク質評価キット(シグマ・ダイアグノティックス、セントルイス、ミズーリ州、米国)を用いて改変ラウリー法により測定した。吸光度は750nmで測定した。
単核細胞画分は、リンフォプレップ(ニコメド・ファーマ、オスロ、ノルウェイ)上での密度遠心分離により単離した。2万個の生きた応答者である脾細胞を、96穴の丸底マイクロタイタープレート内の最終容量250μLの全RPMI培地(20%v/vFCS、100IU/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mML−グルタミン、5x10-5M2−メルカプトエタノール)中、2x105のマイトマイシンC(250ng/ml、37℃、30分間、協和発酵工業株式会社、協和、日本)で不活性化された刺激物質とインキュベートした。モノクローナル抗体試薬又は断片を添加し、培養物を5%COの湿潤大気中で37℃で6日間インキュベートした。細胞増殖を測定するため、1μCiのトリチウム化チミジン(アマシャム、バッキンガムシャー、英国)を合計18時間該培養物に添加した。採取後、しみ込ませたグラスファイバー紙をマスク内に置き、20μLのシンチレーション液を各ウェルに添加した。紙を Topcount (商標)カウンター中で算定した。全ての培養は三連で実施した。
インビトロにおける工学抗体断片の評価
インビトロにおける一価又は二価の抗体の機能的活性を、親の全長モノクローナル抗体及び関連のない対照のscFvと比較する。断片は単独で及び組合わせて試験されうる。scFvが「タグ」配列のポリ−Hisを含む場合、フローサイトメトリー及び免疫組織化学での検出は該タグに対するモノクローナル抗体(HIS−1、シグマ社)の使用により達成できる。しかしながら、他の同定用タグが同様に使用できることは理解されよう。工学構築物の適切な特異性を確認するため、結合を、未固定の正常なラット細胞又はトランスフェクタントについてのフローサイトメトリーにより、及び/又は固定されたトランスフェクタント、ラット又はマウスの正常細胞、分裂促進因子で刺激されたラットの脾細胞、HSVに感染したHep−2細胞及びMRC−5線維芽細胞、若しくは培養したアカントアメーバ細胞の細胞遠心分離調製物についての免疫組織化学により、評価する。適切ならば活性はフローサイトメトリーにより滴定する。組織の結合は、PLP固定され低温装置で5〜8μmに切断された正常なラットの眼、リンパ節、脾臓、腎臓、心臓及び肝臓の切片について免疫ペルオキシダーゼ染色により評価する。尾の静脈から採取された末梢血についてのフローサイトメトリーは、断片がインビボscFv投与で循環細胞に結合したか否かを決定するために使用される。scFv親和性のオン/オフ率は精製された抗原を固相として用いて光学バイオセンサー( BIAcore(商標))で試験される。
scFvによるEMIUの調節
本発明者らは全長の抗CD4(CD8ではない)モノクローナル抗体がEMIUにおける新たな病気の発症を遮断し、病気の再発を遮断しうることを既に示したので(スミスら、1999, Clin. Exp. Immunol. 115: 64-71)、本発明者らは、まず、抗CD4・scFvを試験する。次いで、抗ICAM−1・scFvが試験される。対照は、病気の誘導、病気の誘導と負の対照のscFv、及び病気の誘導と全長のモノクローナル抗体以外の治療を受けない群を含む。全身投与のために、ラットには、病気誘導の3日前、0日並びに3、5、7、9、及び11日後に、1mg/mL未満のscFvタンパク質(1mL容量)を腹膜腔内に注射し、細隙灯試験によりブドウ膜炎の発症率及び重篤度を測定した。適切な治療用量を決定するための実験を実施する必要がある。予備実験において、総タンパク質量1mg/mLの抗CD4・scFvを全身投与することにより試験動物の30%以上でEMIUが防止された(表1参照)。
scFvによる角膜同種異系移植片拒絶の調節
WFからF344への同種異系移殖における角膜移植拒絶の予防においてCD4、CD54、IL−2R、CD28、CD80及びCD86に対するscFvの有効性が試験される。補助的刺激分子(co-stimulatory molecule)のCD80及びCD86に対して、scFvの混液が使用される。対照には、無治療のラット、関連する特異性をもたないscFvによる治療、抗CD8・scFvによる治療、及び全長の抗体による治療を受けるラットが含まれる。少数の同種同系移殖が毒性又は他の副作用を確認するために実施される。全長の抗体に関して有効であることが知られている実験計画を用いて全身投与を試験する。移殖の3日前、当日、3、5、及び7日後にラットに腹膜腔内注射する。インビボでの効果に必要な工学断片量の見積りは、scFv活性の滴定とともに、同様な効果に必要な全長の抗体量に基づいて予備実験で確立する。次いで、拒絶開始を防止する能力(移殖の日から28日間毎日該移殖片に直接適用する)及び進行中の拒絶反応を治療する能力(角膜の血管が移植片−宿主接合部を最初に交差した第一日目から又は前部節の炎症の兆候が観察された日から、どちらが最初に起ころうと5日間毎日直接適用する)について、scFvを局所的に試験する。移植後特定の時点で幾匹かの動物を屠殺し、組織学用及び免疫組織化学用に眼を摘出し任意の細胞浸潤物の組成を決定する。
抗体断片によるヘルペス性角膜炎の診断及び治療
間質のヘルペス性角膜炎に対する治療薬としてのscFvの可能性を調べるために、病気の壊死モデル及び再発性モデルの両方を用いる。マウスに、目薬としてscFv(抗−CD4、CD8、CD11b/c、IL−2R又はHSVgpD抗原)又は関係のある特異性をもたないscFvを、毎日1滴ずつ四回、局所適用する。追加の対照群には、0.5%の眼科用燐酸プレドニソロンン及び3%のアシクロビル眼科用軟膏(ゾビラックス、グラクソ−ウェルカム)を局所的に毎日四回与える。壊死病の動物は接種後14日から21日まで治療し、再発病の動物は再活性化後2日から4日まで治療する。scFvの全身投与も調査する。有効性は細隙灯で臨床的に測定し、終点の免疫組織化学及び組織学により白血球の湿潤物の組成を決定する。診断目的で、HSVgpDに対するscFvをフルオレセインに結合する。フルオレセインは局所的な眼科用調製物で既に使用されている蛍光色素で、細隙灯で青の光源を用いて容易に視覚化できる。蛍光色素で標識化されたscFvを目薬として感染した角膜に投与した後、本発明者らは、直接的試験によりそして青色フィルターを備えた細隙灯の写真撮影によりインサイチュで角膜内におけるウイルス抗原の存在を検出することを試みる。壊死するHSV角膜炎モデルにおいて、scFvによる迅速診断の可能性が接種後三週間目に調べられる。再発性の角膜炎モデルにおいて、再活性化後3日目に目薬を与える。直接的試験の結果は組織病理学及びウイルス培養の結果と相関する。
抗体断片によるアカントアメーバ角膜炎の診断及び治療
栄養型及び嚢の両方の表面上に存在することが知られている40kDaのタンパク質に対する蛍光色素標識されたscFv及び二量化断片が作製される。適切なIgGハイブリドーマをATCCから入手する。ポートン・ラットに、アカントアメーバ・キャステラニ・ネフを接種し、その4、7又は10日後にscFvの目薬を与える。この段階で、これらの角膜は、それぞれ、大半が栄養型、栄養型と嚢、又は大半が嚢である。毎日、種々の濃度の該結合scFvを含む目薬を与え、細隙灯を用いて眼を調べ写真を撮影する。その後、動物を屠殺し組織学用に眼を処理する。これによって病理学と細隙灯の観察とを相関づけることができる。断片の潜在的な治療用途を調べるため、感染したラットに接種6日後から10日後にかけて毎時間非結合二量体断片を用いて局所的に治療する。他のラットには、対照の断片のみ、又はアメーバ角膜炎の現在の第一選択の治療であるプロパミジンとポリヘキサメチレンビグアニドの組合わせを与える。治療効果は臨床評点、組織病理学、及びホモジナイズされた角膜の限界希釈による生存アメーバの定量により評価される。
Claims (42)
- 眼障害と関連のある標的抗原と免疫的に相互作用し、角膜を通して前眼房へ浸透する、免疫グロブリンのFcを含まない免疫グロブリン断片またはミニボディ、眼または角膜上皮中への前記免疫グロブリン断片またはミニボディの浸透を改良するための浸透増強剤、および担体を含む、眼障害を治療または診断するための局所組成物。
- 眼中の標的抗原と免疫的に相互作用し、角膜を通して前眼房へ浸透する、免疫グロブリンのFcを含まない免疫グロブリン断片またはミニボディ、眼または角膜上皮中への前記免疫グロブリン断片またはミニボディの浸透を改良するための浸透増強剤、および製薬的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む、眼の局所投与用に製剤化された眼用医薬組成物。
- 免疫グロブリン断片が、合成されたFv断片、合成され安定化されたFv断片、または一本鎖Fv断片を含む、請求項1または2記載の組成物。
- 標的抗原が、MHC分子、補助的刺激分子、接着分子、受容体関連分子、サイトカイン受容体及びウイルス表面抗原から成る群より選択される、請求項1〜3のいずれか1項記載の組成物。
- 補助的刺激分子がCD80、CD86及びCD152から成る群より選択される、請求項4記載の組成物。
- 接着分子が、CD11、CD18、CD54及びCD62Lから成る群より選択される、請求項4または5記載の組成物。
- 受容体関連分子が、CD3、CD4、CD8、CD28、CD40、CD40L及びCTLA4から成る群より選択される、請求項4〜6のいずれか1項記載の組成物。
- サイトカイン受容体が、インターロイキン2受容体、インターロイキン2受容体のサブユニット、及びインターフェロンγ受容体から成る群より選択される、請求項4〜7のいずれか1項記載の組成物。
- ウイルス表面抗原がヘルペスウイルス表面抗原を含む、請求項4〜8のいずれか1項記載の組成物。
- ヘルペスウイルス表面抗原がgD2又はgB2である、請求項9記載の組成物。
- 免疫グロブリン断片がその半減期を延長するために修飾されている、請求項1〜10のいずれか1項記載の組成物。
- 免疫グロブリン断片がポリエチレングリコールで化学的に修飾されている、請求項11記載の組成物。
- 透増強剤が、カプリン酸、DMSO、ジヒドロサイトカラシンB、ジギトニン、界面活性剤及びそれらの任意の組合せから成る群より選択される、請求項1〜12のいずれか1項記載の組成物。
- イオン導入法用に製剤化された、請求項1〜13のいずれか1項記載の組成物。
- 目薬またはコラーゲン・シールドの形態で製剤化された、請求項1〜14のいずれか1項記載の組成物。
- 眼障害が、角膜移植拒絶反応、ブドウ膜炎、炎症性または感染性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選ばれる、請求項1〜15のいずれか1項記載の組成物。
- 炎症性または感染性疾患がウイルス性、細菌性若しくはクラミジア性結膜炎若しくは角膜炎、眼腫瘍、新生血管形成増殖病、新生血管形成黄斑症、リュウマチ性角膜融解疾患からなる群より選ばれる、請求項16記載の組成物。
- 自己免疫疾患が眼類天疱瘡である、請求項16記載の組成物。
- 免疫グロブリン断片が前記分子に結合した検出可能な標識を有する、請求項1〜18のいずれか1項記載の組成物。
- 標識が蛍光色素を含む、請求項19記載の組成物。
- 蛍光色素がフルオレセインである、請求項20記載の組成物。
- 眼障害と関連のある標的抗原と免疫的に相互作用し、角膜を通して前眼房へ浸透する、免疫グロブリンのFcを含まない免疫グロブリン断片またはミニボディの、該眼障害の治療用の医薬の調製のための使用であって、前記免疫グロブリン断片またはミニボディが局所投与用に眼または角膜上皮中への前記免疫グロブリン断片またはミニボディの浸透を改良するための浸透増強剤と共に製剤化されている、前記使用。
- 眼障害の指標となる標的抗原と免疫的に相互作用し、角膜を通して前眼房へ浸透する、免疫グロブリンのFcを含まない免疫グロブリン断片またはミニボディの、該眼障害の診断用の医薬の調製のための使用であって、前記免疫グロブリン断片またはミニボディが局所投与用に眼または角膜上皮中への前記免疫グロブリン断片またはミニボディの浸透を改良するための浸透増強剤と共に製剤化されている、前記使用。
- 免疫グロブリン断片が、合成されたFv断片、合成され安定化されたFv断片、一本鎖Fv断片を含む、請求項22または23記載の使用。
- 標的抗原が、MHC分子、補助的刺激分子、接着分子、受容体関連分子、サイトカイン受容体及びウイルス表面抗原から成る群より選択される、請求項22〜24のいずれか1項記載の使用。
- 補助的刺激分子がCD80、CD86及びCD152から成る群より選択される、請求項25記載の使用。
- 接着分子が、CD11、CD18、CD54及びCD62Lから成る群より選択される、請求項25または26記載の使用。
- 受容体関連分子が、CD3、CD4、CD8、CD28、CD40、CD40L及びCTLA4から成る群より選択される、請求項25〜27のいずれか1項記載の使用。
- サイトカイン受容体が、インターロイキン2受容体、インターロイキン2受容体のサブユニット、及びインターフェロンγ受容体から成る群より選択される、請求項25〜28のいずれか1項記載の使用。
- ウイルス表面抗原がヘルペスウイルス表面抗原を含む、請求項25〜29のいずれか1項記載の使用。
- ヘルペスウイルス表面抗原がgD2又はgB2である、請求項30記載の使用。
- 免疫グロブリン断片がその半減期を延長するために修飾されている、請求項22〜31のずれか1項記載の使用。
- 免疫グロブリン断片がポリエチレングリコールで化学的に修飾されている、請求項32記載の使用。
- 浸透増強剤が、カプリン酸、DMSO、ジヒドロサイトカラシンB、ジギトニン、界面活性剤及びそれらの任意の組合せから成る群より選択される、請求項22〜33のいずれか1項記載の使用。
- 医薬がイオン導入法用に製剤化される、請求項22〜34のいずれか1項記載の使用。
- 医薬が目薬またはコラーゲン・シールドの形態である、請求項22〜35のいずれか1項記載の使用。
- 免疫グロブリン断片が前記分子に結合した検出可能な標識を有する、請求項23〜36のいずれか1項記載の使用。
- 標識が蛍光色素を含む、請求項37記載の使用。
- 蛍光色素がフルオレセインである、請求項38記載の使用。
- 眼障害が、角膜移植拒絶反応、ブドウ膜炎、炎症性または感染性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選ばれる、請求項22〜39のいずれか1項記載の使用。
- 炎症性または感染性疾患がウイルス性、細菌性若しくはクラミジア性結膜炎若しくは角膜炎、眼腫瘍、新生血管形成増殖病、新生血管形成黄斑症、リュウマチ性角膜融解疾患からなる群より選ばれる、請求項40記載の使用。
- 自己免疫疾患が眼類天疱瘡である、請求項40記載の使用。
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