【発明の詳細な説明】
インターロイキン-10を用いた眼の炎症性状態の処置
発明の分野
本発明は、眼の炎症性状態、特に１型単純ヘルペスウイルス(HSV-1)により誘
導される支質角膜炎を処置するためのインターロイキン-10(IL-10)の使用に関す
る。
発明の背景
眼の炎症性疾患は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫感染により、そして
自己免疫により起こり得る(例えば、American Academy of Opthalmologyにより
公開されたFocal Points(1992)を参照のこと)。眼の炎症の一般的な合併症とし
ては、角膜瘢痕および角膜穿孔、緑内障、角膜および網膜の新血管形成、網膜瘢
痕および網膜剥離、白内障、視神経損傷、ならびに眼窩および眼瞼組織の瘢痕が
挙げられる(例えば、Wakefield，D.およびLloyd，A.，Cytokine 4:1，1992を参
照のこと)。透明で無血管である角膜のような組織における炎症を最小にするこ
とは重要である。なぜなら、白血球および血管の浸潤は重篤な視覚喪失を導き得
、そして炎症が生じた場合、角膜移植による修復では予後が非常に不良であるか
らである。眼の炎症性状態の１つの特に損傷性であるものは、１型単純ヘルペス
ウイルス(HSV-1)またはあまり一般的ではないが２型HSVにより誘導される支質角
膜炎である。HSVに起因する角膜の炎症は、特に重篤であり、そして処置された
場合でさえ何年間も持続し得る。通常の後遺症は角膜の血管新生および瘢痕であ
る。視力を回復するための角膜移植は、拒絶の割合の増加およびHSV感染の再発
のために失敗する割合が高い。(Barney N．P.およびFoster，C．S.，Cornea 13:
232，1994を参照のこと)。壊死性支質角膜炎の診断は臨床的所見によりなされ、
そしてウイルスの単離および血清学により確認され得る。一方、免疫投薬された
(immune medicated)支質角膜炎の診断は、臨床的所見、血清学、およびあるいは
組織形態学的研究によりなされる(Liesegang，T.J．Mayo Clin．Proc．63:1092
，19
88; Wilhelmus，K.R.ら、Ophthalmology 101:1883，1994; Barronら、Ophthalmo
logy 101:1871，1994を参照のこと)。現在、HSVで誘導された支質の疾患は、抗
ウイルス保護（cover）（通常トリフルリジンまたはアシクロビル）されたコル
チコステロイドの局所適用により処置される(例えば、Wilhelmus，K.R.ら、Opht
halmology，101:1883，1994を参照のこと)。しかし、コルチコステロイド療法は
長引くかもしれず、そしてあるいは疾患を悪化させるだけでなく、ウイルス複製
、白内障、緑内障、角膜溶解、二次感染、およびコルチコステロイド依存症の増
大ような他の影響をも導入し得る(Liesegang，T.J.，Mayo Clin．Proc．63:1092
，1988を参照のこと)。従って、ヘルペス性支質角膜炎のような眼の炎症性状態
を処置するためのより有効な方法を開発する多大な必要性が残存する。
発明の要旨
本発明は、哺乳動物における眼の炎症性状態を処置するための方法を提供する
ことにより前述の必要性を満たす。この方法は、治療的有効量のインターロイキ
ン-10をこの哺乳動物の眼の領域に投与する工程を包含する。眼の炎症の処置の
ための薬学的組成物（局所用溶液を含む）もまた提供される。用語「眼の領域」
は、角膜、強膜、脈絡膜、毛様体、虹彩、網膜、結膜、眼窩組織、眼瞼、鼻涙排
出器官、および視神経を含む眼の構成要素をいう。インターロイキン-10は、感
染しているウイルスの眼からのクリアランスを損なわずに炎症を低減する利点を
有する。
図面の簡単な説明
本発明は、添付の図面を参照することにより、より容易に理解され得る：
図1Aおよび1Bは、角膜ウイルス接種によりHSVを予め感染させたマウスのHSV-1
抗原に対する局所遅延型過敏症（DTH）応答に及ぼす局所的IL-10の効果を示すグ
ラフである。図1Aにおいて、組換えマウスインターロイキン-10（rmIL-10）（28
ng）をウイルス抗原投与抗原とともに耳に接種した(１×)。12時間後に２回目の
IL-10接種（55ng）を行った(２×)。図1Bにおいて、IL-10を、DTH試験部位にウ
イルス抗原と同時に接種する前、および抗原の抗原投与の12時間後に、抗IL-10
モノクローナル抗体またはコントロールIgGとともに予めインキュベートし、そ
して活性であるが抗体で中和されていないIL-10の存在下で低減した。耳の腫脹
を抗原の抗原投与の24時間後に測定した。ナイーブマウスにおける耳の腫脹応答
は、13±3×10-4インチであった。１群あたり３から４匹のマウスであった。
図２は、ヘルペス性支質角膜炎の進行に及ぼすrmIL-10の効果を示すグラフで
あり、生体顕微鏡により判断された角膜の混濁化の減少を実証する。マウス（１
群あたり８匹）に、１μlのIL-10の角膜内注射（１回の注射あたり5ng）を、HSV
-1(RE)角膜注射の時間の４時間前ならびに２日後および５日後に再び行った。さ
らに、110ngのIL-10を、ウイルス接種時およびその３日後に再び腹腔内に投与し
た。コントロールにIL-10の代わりに生理的食塩水を与えた。（*）は、処置群が
コントロール群と有意に（p＜0.05）異なることを示す。
図3Aおよび3Bは、HSV-1接種の28日後に除去した角膜の顕微鏡写真である。２
回の独立した実験で、一群あたり４個の角膜を試験した。生理的食塩水で処置し
たマウス（図3A）およびrmIL-10処置したマウス（図3B）からの角膜の断面は、
炎症、瘢痕、および新血管形成において顕著な差異を示した。Ｈ＆Ｅ染色。元の
拡大率は、図3Aについては×200であり、図3Bについては×100である。
図4Aおよび4Bは、全身DTH感作に対するrmIL-10の効果を示すグラフである。HS
V-1の角膜接種により感染されたマウスを、上記の図２の説明に記載のようにIL-
10で処置したか、または生理的食塩水を与えた(コントロール)。DTH試験を感染
後６日目に行い、そして耳の腫脹を24時間後に測定し、そしてIL-10処置マウス
における耳の腫脹が、生理的食塩水で処置したコントロールと統計学的に異なら
ないことを実証した。１群あたり３匹から４匹のマウスであった。図4Aおよび4B
は２回の独立した実験を示す。
図５は、眼におけるHSV-1力価に対するrmIL-10の効果を示すグラフである。角
膜がHSV-1で感染されたマウスを、上記の図２の説明に記載のようにIL-10で処置
したか、または生理的食塩水を与えた。所定の日に各群の４匹の動物を屠殺し、
そして個々の眼を切除し、そして感染性ウイルス含量について滴定し、その結果
、IL-10で処置した眼のウイルスカ価がコントロール動物に比較して漸時減少し
たことが実証された。（●）IL-10処置；（○）コントロール。
図６は、HSV-1で感染された角膜でのサイトカイン合成に対するrmIL-10の効果
を示すグラフである。角膜がHSV-1で感染されたマウスを、上記の図２の説明に
記載のようにIL-10で処置したか、または生理的食塩水を与えた。感染の10日後
に、角膜を切除し、そしてIL-1α、IL-2、およびIL-6についての酵素連結免疫吸
着アッセイにより個々に評価した。角膜は、宿主IL-2およびIL-6の選択的ダウン
レギュレーションを示したが、IL-1αについては示さなかった。
図7Aおよび7Bは、切除されたマウス角膜ボタンによるIL-6およびIL-1αの自発
的合成に対するrmIL-10の効果を示すグラフである。正常な角膜をBALB/cマウス
から除去し、そして３つの角膜のプールの各々を所定のIL-10の量の存在下また
は非存在下でインキュベートした。図7Aでは、インキュベーションの12時間後に
上清中のIL-6レベルをアッセイした。図7Bでは、インキュベーションの４時間後
に角膜ボタン溶解物をIL-1αについてモニターした。宿主角膜IL-6は有意に阻害
されたのに対し、宿主角膜IL-1αは低減されなかった。（*）は、Studentのｔ検
定により評価した場合のコントロールに対する有意な減少（p＜0.05）を示す。
上記の図の各々は、元々Tumpeyら、J．Immunol．153:2258(1994)に公開された
。ヒトにおけるHSKのIL-10インヒビターについてのさらなる証拠が２つのさらな
る出版物により例証される。Boorsteinら(Ophthalmology; 101:1529-1535(1994)
)による「ヒトヘルペス性支質角膜炎におけるHLA-DR発現のインターロイキン-10
阻害」では、ヒト支質角膜炎におけるHLA-DR抗原の発現の著しい減少が、罹患し
たヒト角膜を100単位/mlの用量の組換えヒトIL-10(rhIL-10)とともにインキュベ
ーションした後に観察された。Boorsteinら(Invest．Ophthalmol Vis Sci，36(4
):S147，1995)による「ヒトHSKにおけるインターロイキン-８および単球走化性
タンパク質１分泌のインターロイキン-10調節」と題された第二の研究により、r
hIL-10が、100単位/mlの用量で用いた場合に、HSV-1支質角膜炎で感染されたヒ
ト角膜においてIL-８（80％阻害）およびMCP-1（50％阻害）白血球走化性の強力
なインヒビターであることが示された。
発明の詳細な説明
本明細書中で引用された全ての参考文献は、本明細書中でその全体が参考とし
て援用される。
本明細書において使用する「インターロイキン10」または「IL-10」は、(a)米
国特許第5,231,012号において開示される成熟（例えば、分泌リーダ-配列を欠い
ている）IL-10のアミノ酸配列を有し；そして(b)天然IL-10と共通の生物学的活
性を有するタンパク質であると定義される。本発明の目的のために、グリコシル
化された（例えば、CHO細胞のような真核生物細胞において産生された）IL-10お
よびグリコシル化されていない（例えば、化学的に合成されたか、またはE.coli
において産生された）IL-10の両方は等価であり、そして交換可能に使用され得
る。ムテインおよび他のアナログ（Epstein-Barrウイルスタンパク質BCRF1(ウイ
ルス性IL-10)を含む）もまた含まれ、これはIL-10の生物学的活性を保持してい
る。
本発明における使用のために適切なIL-10は、このタンパク質を分泌する活性
化された細胞で馴化された培養培地から得られ、そして標準的な方法によって精
製され得る。さらに、IL-10またはその活性フラグメントは、当該分野において
公知の標準的な技術を使用して化学的に合成され得る。Merrifield，Science 23
3:341（1986）およびAthertonら、Solid Phase Peptide Synthesis，A Practica
l Approach，1989，I.R.L．Press，Oxfordを参照のこと。米国特許第5,231,012
号もまた参照のこと。
好ましくは、タンパク質またはポリペプチドは、IL-10ポリペプチドをコード
する単離された核酸を使用して、組換え技術により得られる。分子生物学の一般
的方法は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Co
ld Spring Harbor，New York、第２版、1989、およびAusubelら（編）Current P
rotocols in Molecular Biology，Green/Woley，New York（1987および定期的な
補遺）により記載されている。適切な配列は、標準的な技術を使用して、ゲノム
ライブラリーまたはcDNAライブラリーのいずれかから得られ得る。ポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）技術が使用され得る。例えば、PCR Protocols: A Guide to Met
hods and Applications，1990，Innisら（編），Academic Press，New Yorkを参
照のこと。
適切な細胞から抽出された核酸からライブラリーが構築される。例えば、IL-1
0を作製するための組換え法を開示する米国特許第5,231,012号を参照のこと。例
えば、有用な遺伝子配列が種々の配列データベース(例えば、核酸についてはGen
BankおよびBMPL、ならびにタンパク質についてはPIRおよびSwiss-Prot、c/o Int
elligenetics，Mountain View，California、またはthe Genetics Computer Gro
up，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，Wisconsin)中
に見出され得る。
ヒトIL-10をコードする配列を含むクローンが、受託番号第68191号、および同
第68192号の下にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、Rockville,
Marylandに寄託されている。IL-10をコードする配列を含む他のクローンの同定
は、発現ベクターが用いられる場合、コードされるタンパク質の核酸ハイブリダ
イゼーションまたは免疫学的検出のいずれかにより行われる。米国特許第5,231,
012号に開示される寄託された配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブが特に
有用である。オリゴヌクレオチドプローブ配列はまた、他の種の関連する遺伝子
の保存された領域から調製され得る。あるいは、IL-10のアミノ酸配列に基づく
縮重プローブが用いられ得る。
標準的な方法が、大量のポリペプチドを発現する形質転換された原核生物細胞
株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株、または昆虫細胞株を産生するために用いられ
得る。発現およびクローニングの両方に適した例示的なE.coli株として、W3110(
ATCC Bi，27325)、X1776(ATCC No．31244)、X2282、およびRR1(ATCC Mp/31343)
が挙げられる。例示的な哺乳動物細胞株として、COS-7細胞、マウスＬ細胞、お
よびCHP細胞が挙げられる。Sambrook(1989)（前出）およびAusubelら、(1987)補
遺（前出）を参照のこと。
種々の発現ベクターがIL-10をコードするDNAを発現するために用いられ得る。
原核生物細胞または真核生物細胞における組換えタンパク質の発現に用いられる
従来のベクターが用いられ得る。好ましいベクターとして、Okayamaら、Mol．Ce
ll．Biol．3:280(1983);およびTakebeら、Mol．Cell．Blol．8:466(1988)により
記載されるpcDベクターが挙げられる。他のSV40に基づく哺乳動物発現ベクター
として、Kaufmanら、Mol．Cell．Biol．2:1304(1982)および米国特許第4,675,28
5号に開示されるベクターが挙げられる。これらのSV-40に基づくベクターは、CO
S-7サル細胞（ATCC No．CRL 1651）、ならびにマウスＬ細胞のような他の哺乳動
物細胞において特に有用である。Pouwelsら、（1989および補遺）Cloning Vecto
rs: A Laboratory Manual，Elsevier，New Yorkをまた参照のこと。
IL-10は、形質転換されたかまたはトランスフェクトされた酵母細胞、昆虫細
胞、または哺乳動物細胞の分泌された産物のような可溶性形態で産生され得る。
次いで、ペプチドは当該分野で公知の標準的な手順により精製され得る。例えば
、精製工程は、硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーなどを含み得る。Methods in
Enzymology Purification Principles and Practices(Spring-Verlag，New Yor
k，1982)を参照のこと。
あるいは、IL-10は、凝集体または封入体のような不溶性形態で産生され得る
。このような形態のIL-10は、当該分野で周知の標準的な手順により精製される
。精製工程の例は、破壊された宿主細胞から封入体を遠心分離により分離する工
程、次いでこの封入体をカオトロピック剤および還元剤で可溶化し、その結果ペ
プチドが生物学的に活性なコンホメーションをとる工程を含む。これらの手順の
詳細については、例えば、Winklerら、Biochemistry 25:4041(1986)，Winklerら
、Bio/Technology 3:9923(1985)；Kothsら、および米国特許第4,569,790号を参
照のこと。
宿主細胞をトランスフェクトするために使用されるヌクレオチド配列は、種々
の所望の特性を有するIL-10またはそのフラグメントを作製するために、標準的
技術を用いて改変され得る。このように改変されたIL-10は、一次的レベルで（
例えば、アミノ酸の挿入、置換、欠失および融合により）天然に生じる配列から
変化し得る。これらの改変は、最終的な改変されたタンパク質鎖を生成するため
に、多数の組み合わせで使用され得る。
アミノ酸配列変異体は、種々の考えられている目的（血清半減期を増加させる
こと、精製または調製を容易にすること、治療的効力を改善すること、および治
療的使用の間の副作用の重篤度または発生を少なくすることを含む）を有して調
製され得る。アミノ酸配列変異体は、通常は事前に決定された天然において見出
されない変異体であるが、他は翻訳後変異体（例えば、グリコシル化変異体また
はポリエチレングリコール（PEG）に結合されたタンパク質など）であり得る。
このような変異体は、それらがIL-10の生物学的活性を保持している限り本発明
において使用され得る。
ポリペプチドをコードする配列の改変は、部位特異的変異誘発のような種々の
技術により容易に達成され得る(Gillmanら、Gene 8:81(1987))。ほとんどの改変
が、所望の特性についての適切なアッセイにおける日常的なスクリーニングによ
り評価される。例えば、米国特許第5,231,012号はIL-10活性を測定するために適
切な多くのインビトロアッセイを記載する。
好ましくは、ヒトIL-10がヒトの処置のために使用されるが、ウイルス性IL-10
またはいくつかの他の哺乳動物種由来のIL-10が代わりに使用され得る。最も好
ましくは、使用されるIL-10は、組換えヒトIL-10である。ヒトおよびマウスIL-1
0の調製は、米国特許第5,231,012号に記載されている。Epstein-Barrウイルス由
来のウイルス性IL-10（BCRFIタンパク質）のクローン化および発現は、Mooreら
（Science 248:1230，1990）に開示されている。（国際特許出願第WO 91/09127
号および米国特許第5,368,854号もまた参照のこと。）
IL-10に言及する場合、その活性なフラグメント、アナログ、およびホモログ
も含まれる。IL-10の活性なフラグメント、アナログ、およびホモログは、１つ
以上の種々の特徴的なIL-10活性を有するタンパク質、ポリペプチド、またはペ
プチドを含む。これらのタンパク質様物質のいずれもが、グリコシル化または脱
グリコシル化され得る。IL-10活性の例は、IL-2、リンホトキシン、IL-3、また
はGM-CSFのレベルの阻害または実質的な低減を含む。IL-10活性はまた、活性化
されたマクロファージ（例えば、IL-L、IL-6、およびTNF-α）によるサイトカイ
ン産生の阻害を含む。
IL-10活性を決定するための手順およびアッセイの例については、米国特許第5
,231,012号を参照のこと。この特許はまた、IL-10活性を有するタンパク質、な
らびに組換え技術および合成技術を含む、このようなタンパク質の産生を提供す
る。
ポリペプチドIL-10を含む薬学的組成物を調製するために、このポリペプチド
を、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と混合する。これらのキャリアま
たは賦形剤は、好ましくは不活性である。薬学的キャリアは、患者へのポリペプ
チドの送達に適切な、任意の適合性無毒性物質であり得る。このような薬学的組
成物の調製は、当該分野で公知である；例えば、Remington's Pharmaceutical S
ciences，and U.S．Pharmacopeia: National Formulary，Mack Publishing Comp
any，Easton，PA(1984)；Avisら（編）（1993）Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications
: Dekker，New York: およびLiebermanら（編）（1990
）Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker，New Yorkを参照の
こと。特に、眼用調製物は、従来の点眼剤もしくは軟膏を用い得るか、または浸
透を高めるための保存剤（例えば、塩化ベンジルコニウムもしくはエチレンジア
ミン四酢酸（EDTA））の使用；薬物の接触時間を長期化するためのヒアルロン酸
を含む粘膜付着性ポリマー；ならびに薬物送達粒子としてのマイクロパーティク
ル／ナノパーティクルおよびリポソームを用い得る。特に適用可能なのは、角膜
をタンパク質および小ペプチドに対して透過性にする、タンパク質吸収促進剤（
アゾン（azone）、セトリミド、サイトカラシンＢ、EDTA、タウロコラート、お
よびタウロデオキシコラートを包含するが、これらに限定されない）であり得る
。（例えば、Aldrich Catalogue Handbook of Fine Chemicals，1994-95年版，M
ilwaulee，Wisconsinを参照のこと）。
眼用調製物に関する一般的な参考文献については、例えば、Lee，Pharm.Int.
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眼の炎症を局所的に処置することが望ましい。これは、IL-10の局所投与の形
態をとり得る。IL-10が局所的に投与される場合、IL-10は、点眼剤、軟膏、およ
び先に列挙したビヒクルを用い得る他の処方物の形態であり得る。これらの種々
のビヒクルにおけるIL-10の濃度は、上皮関門が無傷である場合は、１％浸透が
生じ得る条件（例えば、炎症）下での１μg/mlから、角膜に対する最大許容局所
ポリペプチド用量である2.5mg/ml（KrishnamoorathyおよびMitra，1993，Ocular
Delivery of Peptides and Proteins; Ophthalmic Drug Delivery Systems(A.K
.Mitra編)，Marcel Dekker，New York，455頁以降参照）まで変化し得る。従っ
て、１滴あたり１μg/mlから2.5mg/ml、より好ましくは10μg/mlから0.25mg/ml
までの範囲にわたり得る濃度で、１時間あたり１滴から２日毎に１滴の範囲にわ
たって、より好ましくは１日あたり１滴から１日あたり４滴の範囲の割合で、１
滴が眼に投与され得る。IL-10の半減期は涙液膜においては短いかもしれないの
で、１日に１回よりも頻繁に薬物を与えることが必要であるかもしれない。これ
は、特定の患者の状態に基づいて、臨床医により決定され得る。点眼処方物は、
上記ビヒクルについての参考文献において示されるように調製され得る。
IL-10は、眼周辺に投与され得る。眼周辺処方物は、静脈内注射、皮下注射、
および／または筋肉内注射において既に用いられたビヒクルを用いることにより
調製され得る。このような処方物の調製は、当該分野で周知である。例えば、Gi
lmanら（編）（1990）Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of T
herapeutics，第９版，Pergamon Press; およびRemington's Pharmaceutical Sc
i
ences，第17版(1992)，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.を参照のこと。眼
周辺投与のための投薬量は、注射されたビヒクルからの生物利用性および種々の
ビヒクルにおいて調製されたIL-10の半減期に依存して、好ましくは１日あたり
約５μg〜約５mg、より好ましくは１日あたり約50μg〜約0.5mgである。
IL-10はまた、結膜下（sc）または角膜内に投与され得る。IL-10は、感染５日
後に処置を開始して、毎日0.5μgの用量で７日間のscで与えた場合、マウスにお
ける眼の炎症を軽減させるのに有効である。結膜下処方物または角膜内処方物は
、局所投薬のために用いられるビヒクル、または静脈内送達、筋肉内送達、もし
くは皮下送達のために用いられるビヒクルを用い得る。従って、ヒトにおける結
膜下投与に好ましい用量範囲は、１日あたり約５μg〜約５mg、より好ましくは
約50μg〜約0.5mgである。角膜内投与の場合、好ましい投薬量は、静脈内系のた
めの処方物を用いて約0.5μg〜約0.5mg、より好ましくは約５μg〜約50μgであ
る。IL-10の半減期はインビボでは短い（マウスにおいて2.5時間と評価される）
ので、薬物を１日に１回よりも頻繁に与える必要があるかもしれない。これは、
特定の患者の状態に基づいて臨床医により決定され得る。
IL-10はまた、種々の破壊的眼内炎症性疾患の処置のための前眼房薬物送達お
よび硝子体内薬物送達を含む、眼房内薬物送達に有用であり得る。眼内処方物は
、静脈内投与のために既に用いられたビヒクル（例えば、Remington's Pharmace
utical Sciences，17版(1992)，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.を参照の
こと）、またはリポソーム、マイクロスフェア、もしくはイオン導入法によるIL
-10送達（例えば、SchulmanおよびPeyman，1993，Intracameral，Intravitreal
，and Retinal Drug Delivery: Ophtalmic Drug Delivery Systems(A.K.Mitra編
)Marcel Dekker，New York，383頁以降参照を参照のこと）を用いることにより
調製され得る。
IL-10はまた、レシピエント宿主への生組織同種移植片の手術的配置の前の、
眼の領域への生組織同種移植片（角膜同種移植片を含むがこれに限定されない）
の処理のために有用であり得る。採取された同種移植片のIL-10処理は、0.001μ
g/ml〜0.1mg/ml、より好ましくは0.1μg/ml〜10μg/mlの範囲にわたる用量を必
要とする。
本明細書中で用いる場合、用語「治療的有効量」は、眼の炎症の症状または徴
候を回復させるに充分な量を意味する。臨床的なヘルペス性支質角膜炎は、角膜
水腫、角膜の濁り、新生血管形成、前眼房炎症、および角膜沈降物により特徴付
けられる。従って、回復は、これらの１つ以上の臨床的徴候の軽減により認識さ
れる。
処置され得る代表的な哺乳動物は、イヌおよびネコのような愛玩動物（compan
ion animal）、ならびにヒトを含む霊長類を包含する。好ましくは、処置の標的
動物種に由来するIL-10が用いられる。特定の患者のための有効量は、処置され
るべき状態、患者の全体的な健康、投与の方法、経路、および用量、ならびに副
作用の重篤度のような要因に依存して変化し得る。適切な用量の決定は、当該分
野で公知のパラメーターを使用することにより、臨床医により行われる。一般に
、用量は、最適用量よりいくらか少ない量で開始され、その後、所望の効果また
は最適の効果が達成されるまで、用量はわずかな増分ずつ増大する。（一般に、
The Merck Manual §269「薬物動態学および薬物投与」を参照のこと）。
適切な環境において、複数の投薬法が組み合わせて投与され得る。例えば、IL
-10は、１つ以上のさらなる治療的活性剤の治療的有効量と組み合わせて投与さ
れ得る。さらなる薬剤は、抗感染剤（例えば、トリフルリジンもしくはアシクロ
ビル）またはステロイド性（例えば、酢酸プレドニゾロンもしくはフルオロメト
ロン）または非ステロイド性の抗炎症剤（例えば、オクフェン（ocfen）、イン
ドビン（indovin）、もしくはシクロスポリン）であり得る。
本発明の広範な範囲は、以下の実施例を参照にすると最も良く理解される。実
施例は、本発明を特定の実施態様に限定することを意図していない。
実施例
以下の実施例では、このサイトカインが支質疾患の進行を抑制し得るか否かを
決定するためにIL-10を試験した。２つの研究が、エキソビボで100単位/mlで組
換えヒトIL-10を用いて、ヘルペス性支質角膜炎に罹患したヒト角膜におけるHLA
-DR抗原発現のIL-10抑制（Boorsteinら，Ophthalmology 1994; 101: 1529-1535
）および白血球ケモカイン産生（Boorsteinら，Invest.Ophthalmol Vis Sci，3
6(4): S147;1995）を実証した。これらの両方の文献（Boorsteinら，Ophthalmol
ogy；101: 1529-1535 1994およびBoorsteinら，Invest.Ophthalmol Vis Sci,36(
4): S147;1995）は、明白に、その全体が本明細書中に参考として援用される。
さらに、大規模な動物試験において、rmIL-10を、局所的HSV-1角膜接種の時点
に対して４時間前ならびに再度＋２日目および＋５日目にマウスの角膜内に接種
した。さらに、マウスは、ウイルス投与の時点および再度感染３日後に、IL-10i
.p.を受けた。感染４週間後に、失明病の発生率は、生理的食塩水で処置したコ
ントロールにおいて95％であったが、IL-10処置した動物においてはほんの36％
であった。組織学的試験は、コントロール角膜においては大規模な細胞浸潤を示
したが、IL-10処置した眼の角膜においては示さなかった。感染10日後の角膜に
おける炎症誘発性サイトカインレベルの検査は、コントロールにおいて見出され
るのよりも、IL-2の存在は10倍低く、そしてIL-6は約50倍低かったことを明らか
にした。IL-1αレベルは低減しなかった。用いたIL-10処置プロトコルは、ウイ
ルス抗原に対する全身性の細胞性免疫応答または体液性免疫応答を抑制せず、か
つ眼からのHSV-1クリアランスの速度は、コントロールにおいて見出される速度
と異ならなかった。インビトロでの試験は、切り出された正常な角膜によるIL-6
の自発産生が、低用量のIL-10で＞95％阻害されたことを明らかにした。IL-1α
合成は、阻害されなかった。集合的に、これらの結果は、IL-10処置が、1)角膜
細胞により産生される特定のサイトカインの産生を抑制し得ること、および2)眼
からの感染性ウイルスのクリアランスを損なわずに、眼の炎症を最小化し得るこ
とを示す。
材料および方法
ウイルス感染−感染を開始するために、公知の支質角膜炎インデューサーであ
るHSV-1 RE株（Lauschら，Curr．Eye Res．8: 499，1989）を用いた。ウイルス
ストックを増殖させ、そして以前に記載されたように、Vero細胞で滴定した（La
uschら，Curr．Eye Res．8: 499，1989）。４週齢雌性BALB/cマウス（Charles R
iver Breeding Laboratories，Wilmington，MA）を、i.p.注射した0.2mlのリン
酸緩衝化生理的食塩水中の1.0mgのペントバルビダールナトリウムで麻酔した。
右眼を、２mm角膜トレフィンを３回ねじることによりわずかに乱切した。次いで
、１〜５×104プラーク形成単位のウイルスを含む２μl容量を角膜表面に滴下し
、そして眼瞼を用いてマッサージした。眼を解剖生体顕微鏡で毎週検査した。角
膜の混濁を、別に記載のように、０〜＋５のスケールで等級付けした（Metcalf
ら，Curr.Eye Res．6: 173，1987）；０のスコアは清澄な角膜を示し、一方、＋
５のスコアは、重篤な壊死性支質角膜炎を示す。読み取り者は与えられた処置を
知らないで、眼をコード化した様式で検査した。データを、Mann-Whitney U検定
（Snedecor，G.W.およびCochran，W.G.，Statistical Methods，第６版，Iowa S
tate University Press，Arnes，Iowa，1967; 130-131頁）を用いることにより
評価した。
試薬-マウス組換えIL-10（rm-IL-10）を、DNAX Research Institute，Palo Al
to，CAから得た。IL-10調製物のエンドトキシン含量は、＜0.1ng/μgであった。
このサイトカインの生物学的活性は、マウスMC/9細胞（Mooreら，Science 248:1
230(1990)）において測定した場合に、７U/μlであった。IL-10の濃度を、ELISA
キットを（Endogen Inc．Boston，MA）用いて決定した。ラット抗マウスIL-10モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマJESS-2A5.11を、アメリカンタイプ
カルチャーコレクション（ATCC; Rockville，MD）から得た。モノクローナル抗
体を中和するモノクローナルラット抗マウスIL-10をまた、Genzyme Corporation
（Cambridge，MA）から購入した。
角膜内注射−角膜内注射を、以前に記載されたように行なった（Hendricksら
，Invest．Ophthalmol.Vis.Sci.32: 366，1991）。簡略には、30ゲージの使い捨
て針を用いて角膜上皮壁に穿刺した。次いで、Hamiltonディスペンサー（Hamilt
on，Reno，NV）に取り付けた30cmで32ゲージのステンレススチール針を支質内に
刺し、そして１μlのrmIL-10または生理的食塩水を角膜の中央に注射した。
遅延型過敏症（DTH）アッセイ−眼球感染させたマウスにおけるDTH応答性を、
耳腫脹アッセイを用いることにより決定した。試験Ag、HSV-1（RE）を、無血清R
PMI 1640培地中に希釈した。次いで、ウイルス調製物を、UV照射に10分間曝した
。これにより、感染性が106プラーク形成単位／10μlから102プラーク形成単位
／10
μl未満に低減した。DTH応答性について試験するために、10μlのウイルス抗原
を、50μl Hamiltonシリンジおよび30ゲージの針を用いて感染６日後にマウスの
右耳の背側に接種した。左耳（コントロール）は、１％ウシ新生仔血清を有する
RPMI 1640の10μlを受けた。耳の腫脹を、Mitutoyo 7326マイクロメーター（Sch
lessinger Tools，New York，NY）を用いて24時間後に測定した。結果を、右（
抗原）耳の腫脹−左（コントロール）耳の腫脹として、10-4インチの単位で示す
。IL-10がDTH応答を抑制したか否かを決定するために、右の検査耳は、28ngのIL
-10を含有する５μlと混合した５μlのUV-HSV-1（RE）を、耳の抗原投与の直前
に受けた。コントロールは、IL-10の代わりに生理的食塩水を受けた。いくつか
の検査において、IL-10（110ng）を、モノクローナルラット抗マウスIL-10中和A
b（10μg/ml最終濃度）またはコントロールIgGとともに、耳の接種前に氷上で30
分間インキュベートした。データをStudentのｔ検定を用いることにより評価し
た。
感染性HSV-1についての眼球組織のアッセイ−角膜内のHSV-1複製に対するマウ
スIL-10処置の効果を試験するために、個々の全眼を切り出し、そして抗生物質
を有するDMEM培地中の２％FBSの600μlに配置した。調製物を−70℃で凍結し、
解凍し、そしてTen Broechホモジナイザー（Belico，Vineland，NH）中でホモジ
ナイズした。ホモジネートを凍結し、再度解凍し、そしてSonic 300 Dismembrat
or（Artek Systems Corporation，Farmingdale，NY）で15秒間超音波処理した。
次いで、上清を、48時間プラークアッセイにおいてVero細胞単層上で感染性ウイ
ルスについて滴定した。
サイトカインの定量−インビボでのIL-6、IL-2、およびIL-1α産生へのIL-10
の効果を試験するために、角膜を、IL-10処置および生理的食塩水コントロールH
SV-1感染マウスから感染10日後に取り出した。角膜を、顕微解剖トレフィン（Ro
boz Surgical Instrument Co.，Rockville，MD）を用いて２mmに切り取り、そし
てFungi-Bact抗生物質溶液を有する無血清RPMI 1640の600μl中に個々に配置し
た。サンプルを、アッセイするまで−70℃にて保存した。サンプルを解凍し、30
秒間超音波処理し、そして150×ｇで10分間の遠心分離により明澄化した。明澄
化した細胞溶解物を、ELISAキットを使用して、IL-1，IL-2、およびIL-6につい
てアッセイした。IL-6（アッセイ感度15pg/ml）キットおよびIL-2（アッセイ感
度３pg/ml）キットを、Endogen，Inc.から購入した。IL-1αキット（アッセイ感
度15pg/ml）を、Genzymeから購入した。
切り出された正常角膜による自発サイトカイン合成を、以前に記載されたよう
に決定した（Staatsら，J.Immunol．151: 277，1993）。簡略には、角膜ボタン
を未処置マウスから切り出し、そして２mmに切り取った。組織調製物には、顕微
鏡検査により判断したところ、肢血管系は無かった。各サンプルは、Fungi-Bact
抗生物質溶液を有するRPMI 1640（Life Technologies，Inc.,Gaithersburg，MD
）の500μl中で、マウスIL-10の非存在下または存在下において37℃および５％
CO2でインキュベートされた３つの角膜ボタンからなった。12時間のインキュベ
ーション期間の後、上清をIL-6についてアッセイした。IL-1α検出のために、角
膜サンプルを６時間インキュベートした。次いで、角膜を、Sonic 300ディスメ
ンブレーターでの30秒間の超音波処置により破壊した。アッセイ前に、組織溶解
物を、150×gで10分間の遠心分離により明澄化した。
組織学的検査−感染した眼を、眼球摘出し、10％中性緩衝化ホルマリン（４％
中性緩衝化ホルムアルデヒド溶液に等しい）中で固定し、パラフィン中に包埋し
、そして複数の５ミクロン切片を調製した。切片をヘマトキシリン−エオシンで
染色し、樹脂中に取り付け、そして光学顕微鏡検査のためにカバーガラスをかぶ
せた。
結果
１.局所的に与えられたIL-10処置は、感作宿主におけるDTH応答性を抑制する
最初の検査を、rmIL-10処置が、局所的に誘導された免疫細胞媒介性炎症を抑
制し得るか否かを調査するために設計した。従って、HSV-1に感作したマウスに
おけるDTH応答性に対するこのサイトカインの効果を試験した。マウスを、乱切
した角膜への104プラーク形成単位のHSV-1（RE）の局所感染を通して免疫した。
６日後、動物は、DTH試験においてウイルス抗原に対して強力に応答した（図１
）。しかし、試験抗原でのrmIL-10の注射は、著しく低減した耳の腫脹をもたら
した（図1A）。サイトカインでの反復処置（すなわち、HSV-1抗原の抗原投与
の時点および再度12時間後）（55ng）は、抑制効果を増大させた。この抑制、特
に、HSV-1抗原に対するDTH応答へのIL-10の抑制は、耳の皮内接種の前に特定の
中和モノクローナル抗体とともにIL-10を予めインキュベートすることにより、
取り消され得る（図1B）。図1Aにおいて、IL-10（28ng）を、ウイルス抗原の抗
原投与とともに、耳内に注射した（１×）。２回目のIL-10注射（55ng）を、12
時間後に与えた（２×）。図1Bにおいて、IL-10を、DTH試験部位で接種される前
に、ウイルス抗原と同時に、および抗原の抗原投与の12時間後に、抗IL-10 mAB
またはコントロールのIgGで予めインキュベートした。耳の腫脹を、抗原の抗原
投与の24時間後に測定した。ナイーブマウスにおける耳の腫脹応答は、13±３×
10-4インチであった。１群あたり３〜４頭のマウスが存在した。
２．IL-10 処置は、HSV-1により誘導される支質角膜炎（HSK）の進行を抑制する
上記の結果は、予め感作された宿主に与えられたrmIL-10が、HSV-1抗原に対す
るＴ細胞媒介性炎症応答をダウンレギュレートし得ることを示した。従って、本
発明者らは、IL-10処置がまた、ヘルペス性支質角膜炎（感作されたＴ細胞によ
り少なくとも部分的に媒介されると考えられる疾患）（Metcalfら，Infect.Immu
n．26: 1164，1979）；（Russellら，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci．25: 938，19
84）;(Newellら，J．Virol．63: 769，1989);(Newellら，Reg．Immunol.2: 366,
1989);(Hendricksら，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci．31: 1929，1990)；（Doymaz
ら，Invest．Ophthalmol．Vis.Sci．33: 2165，1992）;(Niemialtowskiら，J.Im
munol．149: 3035，1992)の進行を抑制し得るかもしれないと想定した。感染時
から−１、＋１、＋４および＋７日目に角膜内に直接接種したrmIL-10は、ヘル
ペス性支質角膜炎の進行を遅延させたが、防止はしなかった。IL-10を全身的な
らびに局所的に与えた場合、支質角膜炎の著しい抑制が達成された。図２は、代
表的な検査結果を示す。平均角膜混濁スコアは、生理的食塩水で処置したコント
ロール群において見られたスコアと比較して、感染７日後を除く全ての時点で有
意に減少（p<0.05）した。
検査の終了時（28日目）に、眼を顕微鏡検査のために取り出した。図3Aは、代
表的なコントロール角膜からの切片を示す。これは、実験的なマウスヘルペス性
支質角膜炎の代表的な組織学的外観（Wangら，Curr.Eye Res．8: 37(1989)）を
示している。角膜は著しく腫大し、そして重篤な炎症性浸潤を含む。多数の血管
が支質内に存在し、そして角膜上皮の潰瘍形成が明白であった。図3Bは、rmIL-1
0処置により防御された感染角膜は腫脹せず、そして上皮の潰瘍形成を示さず、
極わずかな浸潤している炎症性細胞および低レベルの新生血管形成のみを有した
ことを示す。
IL-10の防御作用を、さらに２つの検査で確認した。集合的に、コントロール
の95％（20/21）が失明病を進行させたにもかかわらず、サイトカイン処置した
動物の36％（8/22）しか失明病を進行させなかったことが見出された。IL-10処
置は、眼瞼炎を予防しなかった。眼瞼炎は、マウスにおけるHSV-1角膜感染の後
に通常見られる（Lauschら，Intervirology 31: 159(1990)）。用いたウイルス
感染用量（１〜５×104プラーク形成単位）で、HSV-1 RE株は、ときどき、眼か
ら中枢神経系にまで蔓延し、そして致死的疾患を誘導する。IL-10レシピエント
において見られる脳炎の発生率（3/32、９％）は、コントロールにおいて見られ
る発生率（4/32、12.5％）と同様であった。従って、本発明者らの実験において
用いたサイトカイン投薬量は、中枢神経系の疾患に対する宿主の感受性を増大さ
せるようには見えなかった。
IL-10は、免疫応答の種々のエフェクター段階に対して複数の抑制効果（Ｔ細
胞増殖の阻害を含む）を有する。低減した角膜炎症が、ヘルペスウイルス抗原に
対して感作されたＴ細胞の生成における減少の結果であり得ることが可能であっ
た。IL-10が細胞媒介性免疫に対してどんな効果を有するかを評価するために、
サイトカイン処置したマウスおよびコントロールマウスにおいて、感染６日後に
DTH試験を行なった。図４のデータは、代表的な３つのこのような実験である。
ウイルス感染の日から始めた防御的rmIL-10処置が、耳腫脹アッセイにおいて、H
SV-I抗原に対するDTH応答において活性なＴ細胞の生成を阻害しなかったことが
見出された。さらに、IL-10処置した宿主から感染４週間後に採取した血清のウ
イルス中和力価は、コントロールにおいて見出される力価と類似していた（デー
タは示さず）。従って、IL-10処置が、HSV-1抗原に対する細胞性または体液性の
免疫応答のいずれかの進行を抑制（または促進）したという証拠はない。
３．眼におけるウイルス複製に対するIL-10処置の効果
多くのサイトカインが、眼球組織において抗ウイルス効果を発揮することが示
されている（Chenら，Antiviral Res．22: 15，1993）。従って、HSV-1感染前に
開始されたrmIL-10処置が、角膜におけるウイルス複製を阻害することにより、
角膜炎症を直接的または間接的に低減させるかもしれない可能性を考慮した。こ
の仮定を試験するために、Il-10処置したマウスおよびコントロールマウスの眼
から回収した感染性ウイルスの量を経時的にモニターした。図５は、検査した各
時点で、処置した動物の眼におけるウイルス力価が、コントロール動物において
見られるウイルス力価に匹敵したことを示す。これらの結果は、IL-10処置が、
眼からのウイルスクリアランスを加速（または遅延）させなかったことを示した
。
４．角膜におけるIL-1α、IL-2、およびIL-6の合成に対するIL-10の効果
マウス角膜のHSV-1感染が、上昇したレベルのIL-6およびIL-1αにより特徴付
けられることが知られている（Staatsら，J.Immunol．151: 277，1993）。他の
研究者らは、IL-10が、Ｔ細胞（de Waalら，J.Immunol．150: 4754，1993）、多
形核白血球（Cassatellaら，J.Exp.Med.178: 2207，1993）、および単球／マク
ロファージ（Fiorentinoら，J.Immunol．147: 3815(1991); Bogdanら，J.Exp.Me
d．174: 1549(1991); de Waalら，J.Exp.Med．174: 1209(1991)）により産生さ
れる炎症誘発性サイトカインの合成を抑制し得ることを報告している。IL-10処
置がHSV-1角膜炎のサイトカインプロフィールを変化させるか否かを試験するた
めに、IL-10処置した動物およびコントロール動物から感染10日後に個々の角膜
を取り出し、そしてIL-1α、IL-2、およびIL-6についてELISAによりアッセイし
た。２つの実験からのデータは匹敵し、そしてプールした結果を図６に示す。処
置動物におけるIL-1αレベルは、コントロールにおいて見られたレベルと有意に
は異ならなかった（p<0.7）。しかし、IL-2およびIL-6のレベルは、IL-10処置さ
れた宿主において著しく低減（p<0.05）した。特に、10のうちのほんの１つの角
膜サンプルが検出可能なレベルのIL-2レベルを有し、そして10のうちの２のみが
IL-6について陽性であった。対照的に、70％のコントロールは、IL-2について
陽性であり、そしてその80％は高レベルのIL-6を有した。
５．切り出したマウス角膜ボタンによるIL-6およびIL-1αの自発合成に対するIL -10の効果
骨髄起源の白血球に結合しているIL-10は、サイトカイン合成の選択的阻害を
もたらすことが知られているので、IL-10もまた、内在角膜細胞によるサイトカ
イン産生を阻害し得ることが可能であった。この仮定は、試験するために受け入
れられた。なぜなら、切り出され、インビトロでインキュベートされた、正常角
膜ボタンが、自発的にIL-1αおよびIL-6を合成することが、以前に実証されたか
らである（Staatsら，J.Immunol．151: 277，1993）。従って、未感染ドナーか
ら切り出された角膜ボタンを、種々の濃度のrmIL-10の存在下または非存在下で
インビトロでインキュベートした。引き続いて、培地上清および角膜組織の溶解
物を得て、そしてそれぞれ、IL-6およびIL-1αについてアッセイした。図７にま
とめた３つの実験の結果は、1.5ng/mlの濃度でのIL-10が、Il-6合成を＞95％抑
制し得たことを示す。奇妙なことに、150ng/ml用量は抑制がより弱かった。この
理由は明らかでないが、３つ全ての検査において類似する用量応答パターンが観
察された。対照的に、IL-1αの合成は、1000倍用量の範囲を超えると、IL-10に
より阻害されなかった。
本発明の多くの改変および変更は、当業者には明らかである。本明細書中に記
載した特定の実施態様は単に例示のために提供したのみであり、そして本発明は
、それにより限定されると解釈されるべきではない。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 31/405 Ａ６１Ｋ 31/405
31/57 ６０１ 31/57 ６０１
45/00 45/00
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ
，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，
ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｌ
Ｒ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ
，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，
ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 トムペイ，トルレンス エム.
アメリカ合衆国 アラバマ 36608，モビ
ル，オールド シェル ロード 6451，ア
パートメント 1106
(72)発明者 オークス，ジョン イー.
アメリカ合衆国 アラバマ 36608，モビ
ル，パイン ニードル ドライブ 2100
(72)発明者 エルナー，スーザン ジー.
アメリカ合衆国 ミシガン 48103，アン
アーバー，モアヘッド ドライブ 1495
(72)発明者 ボールステイン，スティーブン エム.
アメリカ合衆国 ミシガン 48103，アン
アーバー，ハーバーウェイ 432