JP5460086B2 - 培養細胞照明装置、及び培養細胞照明方法 - Google Patents

Description

本発明は、培養細胞照明装置、及び培養細胞照明方法に関し、より詳しくは、培養細胞の画像を取得する画像取得装置と得られた画像を解析する画像解析手段を備えた培養細胞測定装置において、３次元的に形成された培養細胞の立体的な情報を効果的に抽出し、得られた輝度分布などの情報から培養細胞の特徴量を定量測定するのに有用な培養細胞照明装置、及び培養細胞照明方法に関する。

従来、培養細胞などの生細胞の観察・測定を行うための装置が、例えば、次の非特許文献１、２、特許文献１に記載されている。

「顕微鏡フル活用術イラストレイテッド基礎から応用まで」P34-36 株式会社秀潤杜 IN Cell Analyzer1000カタログ GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社 特開平９−１９７２８９号公報

一般的な培養細胞、つまり生きた状態の細胞を観察、測定するには、蛍光色素などで細胞を染色することができない。しかし、無染色の生細胞は透明であるので、一般的な明視野観察では像を認識することが難しい。このため、無染色の生細胞に対しては、位相差光学系と、位相差光学系に適合させた照明系を用いて観察、測定する手法が一般的に用いられている。

図８は非特許文献１に記載の生細胞の観察装置である、位相差顕微鏡における位相差観察の一般的な原理を示す説明図である。
図８に示す位相差顕微鏡は、図示省略した光源と、位相差観察用コンデンサレンズ５１を備えた照明系と、位相差観察用対物レンズ５２を備えた観察系を有する。位相差観察用コンデンサレンズ５１は、リングスリット５１ａを備えている。位相差観察用対物レンズ５２は、位相版５２ａを備えている。

このように構成された位相差顕微鏡においては、光源からの照明光は、位相差観察用コンデンサレンズ５１内のリングスリット５１ａを通過して観察面６０を照明する。観察面６０を通過した光は、位相差観察用対物レンズ５２内の位相板５２ａ上に集光した後、位相差観察用対物レンズ５２の像面５３を照明する。

ここで、観察面６０に透明な無染色の標本６１が存在する場合、位相差観察用コンデンサレンズ５１内のリングスリット５１ａを通過した光が透明な標本６１に入射したときに回折が生じ、入射した光は、進行方向を変えずに透明な無染色の標本６１を透過する０次回折光と、進行方向を変えて透明な無染色の標本６１を透過する±１次回折光に分かれる。ここで、±１次回折光は進行方向が変わるため、位相板５２ａ上には集光しない。一方、０次回折光は、進行方向が変わらないため、位相板５２ａ上に集光する。また、これらの光は、位相差観察用対物レンズ５２の像面５３上で干渉する。このため、位相差観察用対物レンズ５２の像面５３上では、観察面６０における透明な標本６１が存在する箇所を通過した光と存在しない箇所を通過した光とでは光の明暗のコントラストが生じる。

ここで、位相板５２ａは、０次回折光と±１次回折光とが干渉したときの光の強度が最小、或いは最大になるように、０次回折光の位相を±１次回折光よりも進ませる、或いは遅らせる性質を有している。
例えば、０次回折光と±１次回折光とが干渉したときの光の強度が最小になるように０次回折光の位相を±１次回折光よりも進ませたときには、明るいバックグランドに対して標本像が暗く見える。一方、０次回折光と±１次回折光とが干渉したときの光の強度が最大になるように０次回折光の位相を±１次回折光よりも遅らせたときには、暗いバックグランドに対して標本像が明るく見える。
このため、透明な無染色の標本であってもバックグランドと明暗のコントラストをつけて観察できる。

そして、非特許文献２には、ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社製「IN Cell Analyzer」を用いて、コロニー状でない、厚さの薄い細胞を対象として、位相差画像を取得、画像解析することが記載されている。

しかし、非特許文献１、２に記載の装置では、観察系及び照明系に、位相差観察による適切な画像を得るために、位相板、リングスリットなどの複雑な光学素子を組み合わせて、精密に制御する必要があり、部材が複雑化するとともに調整操作が煩雑化する。また、非特許文献２に記載の装置では、焦点面として平面的に広がった物体を対象としているため、培養皿の上に撒かれたフィーダー細胞の上に形成されたコロニーなどの３次元的な構造を観察、測定する場合には、フィーダー細胞がノイズとなって検出されて画像の品質が低下し、コロニーの解析精度が低下してしまう。このため、コロニーに関する所望の特徴量を精度よく抽出するためには、画像解析をするためのソフトウェアにおいて、予めフィーダー細胞の画像情報を認識し、ノイズ分となるフィーダー細胞の画像情報を除去するための計算等をしなければならず、画像解析のための処理が複雑化するともに処理時間の増大を招くという欠点があった。

また、特許文献１には、標本に対し、結像光学系の光軸に対して異なる少なくとも２つの斜め方向から切替えて照明する斜光照明手段を有し、斜光照明手段によるそれぞれの照明光から得られた画像を一枚に合成してコントラストの良い無染色画像を得る顕微鏡が記載されている。

しかし、特許文献１に記載の装置では、一枚の細胞画像を得るのに複数の方向から時系列的に照明、撮像し、なおかつ画像合成をする手段が必要となるため、装置構成の複雑化と、撮像に要する時間の増大化を招く。また、特許文献１の記載には、従来、培養皿の上に形成されたフィーダー細胞上に形成された３次元的なコロニーなどを観察するような場合にフィーダー細胞のノイズが発生する問題についての着目が全くない。

本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、簡易な光学構成で、且つ迅速に、３次元的に形成された培養細胞の立体的な情報を定量性よく抽出することが可能な培養細胞照明装置、及び培養細胞照明方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するため、本発明による培養細胞照明装置は、透明な無染色の培養細胞に対する透過照明を介して培養細胞の画像を取得する画像取得装置と前記画像取得装置を介して得られた画像に対して所定の解析処理を行う画像解析手段を備えた培養細胞測定装置において、３次元的に形成された培養細胞を照明するために用いる培養細胞照明装置であって、前記画像取得装置による画像取得位置の面に対して垂直な方向から外れた位置に配置されていて、前記画像取得装置による画像取得位置に配置された、培養皿上の３次元的に形成された培養細胞に対し、該培養細胞面との出射光軸のなす角度が３０度〜４５度の範囲内の所定角度となるように調整及び制御されて、一つの斜めの方向から散乱光を照明する光源を有することを特徴としている。

また、本発明の培養細胞照明装置においては、前記光源が、白色光源であるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明装置においては、前記画像取得装置が、顕微鏡撮像光学系と、固体撮像素子よりなるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明装置においては、前記３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞が、フィーダー細胞上に形成されたコロニーであるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明装置においては、前記コロニーを生じるサンプルが、細菌、植物、及び動物由来の細胞又は組織であるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明装置においては、前記光源がＬＥＤであるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明装置においては、前記光源の出射側に、散乱光の分布を最適化するための光学素子を備えるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明装置においては、前記画像解析手段が、前記画像取得装置を介して得られた画像から、所望の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞を認識し、その特徴量を解析する画像解析ソフトウェアを有するのが好ましい。

また、本発明による培養細胞照明方法は、透明な無染色の培養細胞に対する透過照明を介して培養細胞の画像を取得する画像取得装置と前記画像取得装置を介して得られた画像に対して所定の解析処理を行う画像解析手段を備えた培養細胞測定装置において、３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞を照明するために用いる培養細胞照明方法であって、前記画像取得装置による画像取得位置に配置された、培養皿上の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞に対し、前記画像取得装置による画像取得位置の面に対して垂直な方向から外れた位置に配置された、散乱光を出射する光源を用いて前記培養細胞面との出射光軸のなす角度が３０度〜４５度の範囲内の所定角度となるように調整及び制御して、一つの斜めの方向から照明することを特徴としている。

また、本発明の培養細胞照明方法においては、前記画像取得装置による画像取得位置に配置された、培養皿上の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞に対し、前記光源による散乱光を照明する角度を調整するのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明方法においては、前記光源として、白色光の散乱光を出射する光源を用いるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明方法においては、前記画像取得装置が、顕微鏡撮像光学系と、固体撮像素子よりなるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明方法においては、前記３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞が、フィーダー細胞上に形成されたコロニーであるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明方法においては、前記コロニーを生じるサンプルが、細菌、植物、及び動物由来の細胞又は組織であるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明方法においては、前記光源として、ＬＥＤを用いるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明方法においては、前記光源の出射側に、散乱光の分布を最適化するための光学素子を備えるのが好ましい。

また、本発明の培養細胞照明方法においては、前記画像解析手段として、前記画像取得装置を介して得られた画像から、所望の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞を認識し、その特徴量を解析する画像解析ソフトウェアを備えるのが好ましい。

本発明によれば、簡易な光学構成で、且つ迅速に、３次元的に形成された培養細胞の立体的な情報を定量性よく抽出することが可能な培養細胞照明装置、及び培養細胞照明方法が得られる。

本発明の実施例１にかかる培養細胞照明装置を備えた培養細胞測定装置の全体構成を示す概念図である。 図１に示した実施例１の培養細胞照明装置を備えた培養細胞測定装置で撮像した画像の写真である。 比較例１の培養細胞照明装置を備えた培養細胞測定装置で撮像した画像の写真である。 図２に示した画像を、画像解析ソフトウェアとして、本発明者が開発した所定の細胞画像認識ソフトウェアを介して、所定の解析パラメータを用いてコロニーを自動認識させたときの実際の画像を示す写真である。 図３に示した画像を、画像解析ソフトウェアとして、本発明者が開発した所定の細胞画像認識ソフトウェアを介して、所定の解析パラメータを用いてコロニーを自動認識させたときの実際の画像を示す写真である。 図２に示した画像からコロニーを正確に認識するために必要な画像解析処理手順の一例を示すフローチャートである。 図３に示した画像からコロニーを正確に認識するために必要な画像解析処理手順の一例を示すフローチャートである。 非特許文献１に記載の生細胞の観察装置である、位相差顕微鏡における位相差観察の一般的な原理を示す説明図である。

実施形態の説明に先立ち、本発明の作用効果について説明する。
本発明の培養細胞照明装置は、透明な無染色の培養細胞に対する透過照明を介して培養細胞の画像を取得する画像取得装置と前記画像取得装置を介して得られた画像に対して所定の解析処理を行う画像解析手段を備えた培養細胞測定装置において、３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞を照明するために用いる培養細胞照明装置であって、画像取得装置による画像取得位置の面に対して垂直な方向から外れた位置に配置されていて、画像取得装置による画像取得位置に配置された、培養皿上の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞に対し、培養細胞面との出射光軸のなす角度が３０度〜４５度の範囲内の所定角度となるように調整及び制御されて、一つの斜めの方向から散乱光を照明する光源を有する。

本発明者は、上述した課題を解決すべく鋭意研究した結果、画像取得装置による画像取得位置の面に対して垂直な方向から外れた位置に配置された光源を用いて、培養細胞面との出射光軸のなす角度が３０度〜４５度の範囲内の所定角度となるように調整及び制御して、一つの斜めの方向から散乱光を培養皿上の３次元的に形成された培養細胞に照明すると、３次元的に展開した構造体の立体的な情報を定量性よく抽出することが可能であることを見出した。
本発明によれば、簡易な光学構成で、且つ迅速に、バックグランドからのノイズの影響
を受けにくい培養細胞の画像が得られ、所望の特徴量を抽出、計算することができる。

次に、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
図１は本発明の実施例１にかかる培養細胞照明装置を備えた培養細胞測定装置の全体構成を示す概念図である。
図１の培養細胞測定装置は、画像取得装置と、画像解析手段と、実施例１の培養細胞照明装置を備えている。
画像取得装置は、対物レンズ５と結像レンズ６とを有する顕微鏡撮像光学系と、ＣＣＤやＣＭＯＳなどの固体撮像素子７とを組み合わせて構成されている。対物レンズ５は、不図示の電動制御機構により、焦点合わせのために上下動可能になっている。結像レンズ６は、培養皿１上の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞３の透過像を固体撮像素子７の撮像面に結像させる。そして、画像取得装置は、測定位置に配置された、培養皿１上の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞３の画像を取得する。
画像解析手段は、パーソナルコンピュータ１２の中央演算処理装置及びそれにインストールされた画像解析ソフトウェアを有して構成されており、画像取得装置を介して得られた画像に対して所定の解析処理を行う。

実施例１の培養細胞照明装置は、光源８と、照明角度可変機構９を有している。
光源８は、３Ｗの白色ＬＥＤで構成され、画像取得装置による画像取得位置（即ち、培養細胞測定装置における測定位置）の面に対して垂直な方向から外れた位置に配置されていて、画像取得装置による画像取得位置に配置された、培養皿１上の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞３に対し、培養細胞面との出射光軸のなす角度が３０度〜４５度の範囲内の所定角度をなすように、一つの斜めの方向から散乱光を照明するように、照明角度可変機構９に取り付けられている。また、光源８は、コントローラ１０から電源供給を受け、その照明輝度を変化させたり、点滅させることができる。照明角度可変機構９は、コントローラ１０からの指示により、光源８が、画像取得装置による画像取得位置に配置された、培養皿１の上の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞３に対し、散乱光を照明する照明角度を任意の角度に制御可能に構成されている。また、この照明角度の制御は、パーソナルコンピュータ１２の中央演算処理装置にインストールされている撮像ソフトウェアを介して、操作者がコロニーの照明状態をモニター１３で確認しながら、３０度〜４５度の範囲の任意の角度に設定することができるようになっている。本発明者の実験では、画像取得装置による画像取得位置に配置された、培養皿１の上の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞３に対し、３０度程度の角度で散乱光を照明したときに、コロニーとフィーダー細胞とのコントラストが明瞭となる画像が得られることが判った。

なお、図１中、２は培養皿１の上に撒かれたフィーダー細胞である。４は電動ＸＹステージであり、培養皿１を載置し、コントローラ１０から電源供給及び動作指示を受けて動作する。１１はカメラコントローラで、固体撮像素子７とパーソナルコンピュータ１２とに接続され、パーソナルコンピュータ１２からの指示により撮像制御やパーソナルコンピュータ１２への撮像画像情報の転送を行う。

比較例１
比較例１の培養細胞測定装置は、画像取得装置が、図１に示した対物レンズ５の代わりに図８に示した位相差観察用対物レンズ５２と同様の対物レンズを備えている。また、培養細胞照明装置は、図８に示した位相差観察用コンデンサレンズ５１と同様のコンデンサレンズと図示省略した光源を備えて構成されている。

実験
培養皿１の上にフィーダー細胞２として繊維芽細胞（TIG7）を撒き、その上に培養細胞３として乳がん細胞（MCF7）を撒き、マトリジェルを添加して乳がん細胞（MCF7）が３次元的なコロニーを形成したサンプルを、図１に示した実施例１の培養細胞照明装置を備えた培養細胞測定装置、図８に示した位相差光学系を備えた比較例１の培養細胞照明装置を備えた培養細胞測定装置のそれぞれ用いて撮像した。次いで、撮像したそれぞれの画像から、画像解析ソフトウェアとして、本発明者が開発した所定の細胞画像認識ソフトウェアを介して、解析パラメータを同じにしてコロニーを自動認識させた。

図２は上記３次元的なコロニーを形成したサンプルを図１に示した実施例１の培養細胞照明装置を備えた培養細胞測定装置で撮像した画像の写真、図３は上記３次元的なコロニーを形成したサンプルを比較例１の培養細胞照明装置を備えた培養細胞測定装置で撮像した画像の写真である。図４、図５は、それぞれ図２、図３に示した画像を、画像解析ソフトウェアとして、本発明者が開発した所定の細胞画像認識ソフトウェアを介して、解析パラメータを同じにしてコロニーを自動認識させたときの実際の画像を示す写真である。

図１の実施例１の細胞培養照明装置を備えた培養細胞測定装置で撮像することによって得られた画像は、図２に示すように、フィーダー細胞であるバックグランドの輝度が非常に小さく、測定対象であるコロニーとバックグランドとの輝度差が明瞭になった。

これに対し、図８の位相差光学系を備えた比較例１の培養細胞照明装置を備えた培養細胞測定装置で撮像することによって得られた画像は、図３に示すように、全体が明るく、測定対象であるコロニーとバックグランドとの輝度差が明瞭ではなく、しかも、バックグランドにフィーダー細胞の構造が輝度差の明瞭な状態で筋状に映っており、これがノイズとなって全体的に不明瞭な画像となった。

そして、実施例１の細胞培養照明装置を備えた培養細胞測定装置で撮像した画像を、上記細胞画像認識ソフトウェアを介してコロニーを自動認識させた場合は、図４に示すように、画像の中心部分に存在するコロニーを正確に認識することができた。

これに対し、比較例１の細胞培養照明装置を備えた培養細胞測定装置で撮像した画像を、上記細胞画像認識ソフトウェアを介してコロニーを自動認識させた場合は、図５に示すように、画像の中心部分に存在するコロニーを正確に認識することができず、周囲のフィーダー細胞部分を誤認識した。

図６は実施例１の培養細胞照明装置を備えた培養細胞測定装置で撮像した図２の画像からコロニーを正確に認識するために必要な画像解析処理手順の一例を示すフローチャート、図７は比較例１の培養細胞照明装置を備えた培養細胞測定装置で撮像した図３の画像からコロニーを正確に認識するために必要な画像解析処理手順の一例を示すフローチャートである。

図２に示したようにコロニーとバックグランドとの輝度差が明瞭な画像が得られれば、例えば、図６に示すように、後述する図７に示したローパスフィルター処理やバックグランドの輝度を低下させるための処理は不要となるので、画像解析ソフトウェアにおける処理を単純化して、処理時間を短縮することができる。
これに対し、図３に示したようにコロニーとバックグランドとの輝度差が不明瞭な画像からコロニーを正確に認識することができるようにするには、例えば、図７に示すように、フィーダー細胞によるノイズを除去するためのローパスフィルター処理（ステップＳ１）や、バックグランドの輝度を低下させるための処理（ステップＳ２）が必要となり、画像解析ソフトウェアによる処理の複雑化と処理時間の増大を招くことになる。

本発明の培養細胞照明装置及び培養細胞照明方法は、コロニーを形成する生細胞を観察、測定、解析することが求められる生物学、医療、医学の分野に有用である。

１ 培養皿
２ フィーダー細胞
３ ３次元的に形成された培養細胞
４ 電動ＸＹステージ
５ 対物レンズ
６ 結像レンズ
７ 固体撮像素子
８ 光源
９ 照明角度可変機構
１０ コントローラ
１１ カメラコントローラ
１２ パーソナルコンピュータ
１３ モニター

Claims (16)

1. 透明な無染色の培養細胞に対する透過照明を介して培養細胞の画像を取得する画像取得装置と前記画像取得装置を介して得られた画像に対して所定の解析処理を行う画像解析手段を備えた培養細胞測定装置において、３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞を照明するために用いる培養細胞照明装置であって、
   前記画像取得装置による画像取得位置の面に対して垂直な方向から外れた位置に配置されていて、前記画像取得装置による画像取得位置に配置された、培養皿上の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞に対し、該培養細胞面との出射光軸のなす角度が３０度〜４５度の範囲内の所定角度となるように調整及び制御されて、一つの斜めの方向から散乱光を照明する光源を有することを特徴とする培養細胞照明装置。
2. 前記光源が、白色光源であることを特徴とする請求項１に記載の培養細胞照明装置。
3. 前記画像取得装置が、顕微鏡撮像光学系と、固体撮像素子よりなることを特徴とする請求項１又は２に記載の培養細胞照明装置。
4. 前記３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞が、フィーダー細胞上に形成されたコロニーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の培養細胞照明装置。
5. 前記コロニーを生じるサンプルが、細菌、植物、及び動物由来の細胞又は組織であることを特徴とする請求項４に記載の培養細胞照明装置。
6. 前記光源がＬＥＤであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の培養細胞照明装置。
7. 前記光源の出射側に、散乱光の分布を最適化するための光学素子を備えたことを特徴とする請求項５に記載の培養細胞照明装置。
8. 前記画像解析手段が、前記画像取得装置を介して得られた画像から、所望の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞を認識し、その特徴量を解析する画像解析ソフトウェアを有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の培養細胞照明装置。
9. 透明な無染色の培養細胞に対する透過照明を介して培養細胞の画像を取得する画像取得装置と前記画像取得装置を介して得られた画像に対して所定の解析処理を行う画像解析手段を備えた培養細胞測定装置において、３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞を照明するために用いる培養細胞照明方法であって、
   前記画像取得装置による画像取得位置に配置された、培養皿上の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞に対し、前記画像取得装置による画像取得位置の面に対して垂直な方向から外れた位置に配置された、散乱光を出射する光源を用いて前記培養細胞面との出射光軸のなす角度が３０度〜４５度の範囲内の所定角度となるように調整及び制御して、一つの斜めの方向から照明することを特徴とする培養細胞照明方法。
10. 前記光源として、白色光の散乱光を出射する光源を用いることを特徴とする請求項９に記載の培養細胞照明方法。
11. 前記画像取得装置が、顕微鏡撮像光学系と、固体撮像素子よりなることを特徴とする請求項９又は１０に記載の培養細胞照明方法。
12. 前記３次元的に形成された培養細胞が、フィーダー細胞上に形成されたコロニーであることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の培養細胞照明方法。
13. 前記コロニーを生じるサンプルが、細菌、植物、及び動物由来の細胞又は組織であることを特徴とする請求項１２に記載の培養細胞照明方法。
14. 前記光源として、ＬＥＤを用いることを特徴とする請求項９〜１３のいずれかに記載の培養細胞照明方法。
15. 前記光源の出射側に、散乱光の分布を最適化するための光学素子を備えることを特徴とする請求項１３に記載の培養細胞照明方法。
16. 前記画像解析手段として、前記画像取得装置を介して得られた画像から、所望の３次元的に形成された透明な無染色の培養細胞を認識し、その特徴量を解析する画像解析ソフトウェアを備えることを特徴とする請求項９〜１５のいずれかに記載の培養細胞照明方法。