CN113514945B

CN113514945B - 用于显微技术的方法与装置

Info

Publication number: CN113514945B
Application number: CN202110910336.1A
Authority: CN
Inventors: 爱德华多·沃马; 西蒙·乔纳森·思朋斯; 塞缪尔·罗丝·加兰·蓝阳; 本尼迪克特·约翰·斯图尔特-斯蒂尔
Original assignee: Genea IP Holdings Pty Ltd
Current assignee: Genea IP Holdings Pty Ltd
Priority date: 2015-03-13
Filing date: 2016-03-15
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2036-03-15
Also published as: AU2016232975B2; IL254325B1; AU2016232975C1; IL254325A0; AU2016232975A1; CA2978787A1; HK1246401A1; CN113514945A; US11385452B2; JP2018515802A; WO2016145476A1; IL254325B2; EP3268794A4; US20190064496A1; JP6793656B2; EP3268794A1; CA2978787C; CN107533217A

Abstract

本发明提供利用通过在延时测量间隔内同时地捕获生物样本的亮视野图像与暗视野图像的显微技术来评估生物样本的发育活力。

Description

用于显微技术的方法与装置

本申请是申请日为2016年3月15日、申请号为201680027834.9、名称为“用于显微技术的方法与装置”的发明申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及利用显微技术的临床试验与评估生物样本的领域。特别地，本发明涉及暗与亮视野显微技术在评估生物样本中的的使用。将会方便的是在下文中描述关于可以用于在胚胎发育过程中记录或观察胚胎的方法与装置的发明，但是应该理解的是本发明不仅限于此使用。

背景技术

应该理解的是在此说明书中的文献、装置、行为或知识的任何探讨均被纳入以说明本发明的背景。进一步地，贯穿本说明书的探讨是由于发明人的实施和/或通过发明人一定的相关技术问题的确定而产生的。此外，在此说明书中诸如文献、装置、行为或知识的材料的任何探讨被纳入以根据发明人的知识与经验说明本发明的上下文，并且相应地，任何此探讨都不应该认为是承认任何材料形成在本公开和在此的权利要求的优先权日或在此优先权日以前的现有技术基础或者在澳大利亚或者其它地方的相关技术中的公知常识。

简言之，如在维基百科的常见称谓中所见的，亮视野显微技术是全部光学显微镜照明技术中最简单的。透射样本照明，例如，白光从下面照明并且从上面观察，并且通过在样本的稠密区域中的透射光的一部分的吸收造成样本中的对比。亮视野显微技术可以视为用于照明光显微镜中的样本的技术范围中最简单的，并且其简单性使其成为流行技术。亮视野显微镜图像的典型表现是在亮背景上的暗样本，由此称为“亮视野”。

暗视野显微技术或“暗背景显微技术”，也如在维基百科下的该称谓中所见的，描述了在光与电子显微技术中的，从图像排除了不散射光束的显微技术方法。由此，在标本周围的视野或者换句话说在没有标本以使光束扩散处的视野，通常地是暗的。

图1是提供如现有技术中通常理解的亮视野与暗视野显微技术的部分之间的示意性比较的图表。在图1中强调了在亮视野光学布置与暗视野光学布置之间的样本照明(通过点划阴影示出)中的区别。在左手侧分解视图中的暗视野利用通过布置在聚光器002下面的“蜘蛛光阑”示出的暗视野光阑001。光阑001阻挡光束的中心以形成中空光锥003。此光不直接进入物镜004。只有通过样本散射并且进入物镜的光被视为暗视野中的图像。相比之下，图1的右手侧分解视图示出了实体光锥005，其照明并且在亮视野中进入物镜004。

通常地，亮视野显微技术可适用于观察活体或染色细胞，这需要要求极少准备的简单设置。然而，生物样本通常具有低对比，几乎没有天然着色，因此通常地需要将样本染色并且染色可能破坏或引入伪影。此外，分辨率可以限于大约0.2μm。在另一个方面，暗视野显微技术通常地可适用于观察活的、未染色样本。这也能够仅需要用于适当暗视野光学布置的简单设置，并且有利地提供与未染色组织的对比，从而能够观察到活体细胞。然而，可能需要强烈地照明组织，这可能损伤精细的样本。

另一个已知技术相差显微技术对于观察透明、未染色的活体细胞是最有用的。相差成像对亮视野光学器件提供了卓越的图像，并且在亮视野光学器件下不可见的细微细节在高对比下显示。然而，相差成像对于厚样本来说是不理想的，以此技术厚样本可能呈现扭曲产生“晕轮效应”或“相态伪影”，这可能在样本的外周周围呈现扭曲的细节。

暗视野显微技术具有优点。在此方面，暗视野显微技术对于观察未染色、透明且吸收很少光或不吸收光的物体来说是理想的。因此，这些标本通常具有与它们周围环境相似的折射率，使得难以用其它照明技术区分它们。暗视野成像可以用于研究海洋生物，诸如藻类和浮游生物、硅藻、昆虫、纤维、毛发、酵母和原生动物以及一些矿物质与晶状体、薄聚合物与一些陶瓷。暗视野成像还可以用于活菌以及涂片细胞与组织的实验中。它是在检查外部细节，诸如轮廓、边缘、颗粒边界与表面缺陷而非内部结构中更加有用的技术。暗视野显微技术通常因为诸如相差与DIC(鉴别干涉对比)的更现代的观察技术而不被考虑，更现代的观察技术提供了更准确、更高对比的图像，并且可以用于观察更多数量的标本。然而，如上面指出的，这些技术具有它们自身的弊端，诸如例如如上所述的扭曲。目前，暗视野显微镜重获其一定程度的流行性并且当与诸如荧光的其它照明技术结合时，扩大了其在一定区域中可能的使用。

尽管暗视野显微镜检测可能导致美丽且惊艳的图像，但是此技术还伴随多个弊端。首先，暗视野图像倾向于变差、扭曲与不准确。由此，不足够薄或其密度沿载玻片而不同的标本，可能似乎贯穿图像具有伪影。载玻片的准备与质量能够极大地影响暗视野图像的对比与准确性，因此重要的是特别地小心载玻片、载物台、鼻部与光源免受诸如灰尘的小颗粒的影响，因为小颗粒将作为图像的一部分呈现的。类似地，如果需要在聚光器和/或载玻片上使用油或水，就几乎不能避免全部气泡。这些液泡将致使图像变差、发光以及扭曲并且甚至降低标本的对比与细节。暗视野还需要强烈光量以工作，并且这与其仅依赖于散射光线的事实关联，可能造成发光与扭曲。暗视野可能由此不是用于获取标本的准确测量的可靠工具。最后，当采用与使用暗视野显微镜时，可能产生多个问题。例如，光量与光的强度聚光器与光阑的位置、尺寸与布置需要被修正以避免任何像差。然而，暗视野具有多种应用并且是非常好的观察工具，特别地是当与其它技术结合使用时。然而，当将此技术用作实验研究的一部分时，需要对可能不期望的伪影的限制与认识进行考虑。

关于记录或观察生物标本，更特别地，关于在形态学/发育过程期间的胚胎，光学波长显微技术适用于此用途，但是亮视野成像或暗视野成像各自通常需要包括光学布置的单独系统设置。照明方法大体上要求是彼此独立且隔离的。暗视野显微技术要求在标本后面的区域不被照明，但是观察需要透过标本/物体的光。对于亮视野观察来说，光直接显示在标本后面并且直射光束聚焦在标本/物体上。可以通过圆锥/环形光束形成暗视野照明，光束在通过定位在到标本床相对于光源的另一侧上的显微镜观察的标本/物体处相交。

Auxogyn公司提供了用于生物样本的一种已知的显微技术系统。Auxogyn公司成功地提供了在被观察/记录的标本附近没有障碍的清楚成像。然而，Auxogyn公司系统的缺点在于它是大的单元，其对于市场上可获得其它可互换标准件的设计是不可定制的，Auxogyn公司系统的成本与其它定制设计件相比非常高。此外，当提供了胚胎的干净与清楚的成像的Auxogyn公司系统可以获得良好的清晰图像时，在使用定制培养皿变型的构造中，针对给定的培养皿设计具有全部井的不充足照明。图9是叠加在作为本申请的作为独立访问样本培养模块的商业上可获得的样本模块上的Auxogyn系统的说明。图12是将Auxogyn公司系统叠加在申请人的模块上的相似的说明，申请人的模块具有允许用于被覆盖在此说明中的光学器件的封套以便与对Auxogyn公司系统明显尺寸过大的形状因素对比。图12中的图像示出了在申请人已知装置上的要求位置中的Auxogyn公司的模块。如可以看到的，其非常大并且可能需要显著的修改，包括对整体模块产品的外观的修改以适合Auxogyn公司设计。如通过图9和图12显而易见地，Auxogyn公司系统不适于当前的仪器仪表。

通过背景，如呈现在边缘的两侧上的阴影可以看到的，在图10中成像的样本井不是照明井。因此甚至没有跨越全部井的照明。考虑这是通过在培养皿内的培养井周围的塑料环的高度形成的。这是示例性的当前使用的培养皿。此图像是培养皿内的井内的微井。

图11中的图像示出了没有阴影的光线好的井。

通常来说，根据胚胎评估，Auxogyn公司的非侵入性早期胚胎生活力评估测试(Eeva^TM)可以通过为IVF临床与患者提供关于胚胎生活力的客观信息改进体外受精(IVF)结果。当用于传统胚胎评估技术时，Eeva^TM系统可以为IVF临床以及它们的患者提供提高诊疗成功的可能性。由于具有更大的成功几率，其可能通过使单个胚胎移植用于大量患者而减少多胎。Eeva^TM系统的转用软件对科学、临床验证的细胞分裂时间参数自动地分析胚胎发育。通过针对各胚胎发育前景的Eeva^TM系统的量化数据，IVF临床能够优化用于它们的经历IVF手术的患者的治疗路径。

Auxogyn公司的Eeva^TM系统设计为适配到日常IVF实验室工作流系统中。Eeva^TM培养皿包括微井，其使Eeva^TM能够跟踪各胚胎的单独发育并且允许胚胎在组织培养技术下生长。暗视野Eeva^TM显微镜适于大部分标准IVF培养器，并且在没有胚胎学家介入或过多光暴露到胚胎的情况下提供了自动暗视野图像捕捉与细胞分裂跟踪。Eeva^TM显微镜屏适配在培养器的外侧上，并且允许胚胎学家在不打开培养器或不干扰胚胎的情况下控制各Eeva^TM患者会话并且观察最新图像。Eeva^TM对科学、临床验证细胞分裂时间参数自动地分析胚胎发育，并且预测各胚胎到第2天的未来生活力。来自Eeva^TM的量化客观数据，结合标准形态学分级，可以使IVF临床能够作出关于胚胎选择与最佳患者治疗路径的更好的精明决定。利用Eeva^TM站可以容易地检查用于各Eeva^TM患者会话的图像与视频。此外，在Eeva^TM系统中提供的可下载报告与视频可以当咨询患者时来协助并且改善整体患者体验。

对于一般参照来说，在通过PeterKovacs创作的RB&E文章中说明了胚胎选择中的延时监控的作用，其通过引用的方式纳入本文并且此文章内容的一部分在这里复制如下。

当前使用多种延时系统。最广泛使用技术中的两个，PrimoVision(Vitrolife^TM)与Embryoscope(Fertilitech^TM)系统，两者都使用亮视野技术，然而上述的EEVA^TM(早期胚胎的生活力评估，Auxogyn)系统，使用暗视野技术。全部系统包括数字倒置显微镜，其以5-20分钟延时间隔拍摄胚胎的图像，其中这些时间间隔被本领域中的技术人员很好地理解为通常地显微镜观察的领域中常用的时间期间。此图像通过定制图像获取技术处理并且然后显示在计算机屏幕上。以预设或选择间隔获取的图像然后连接到短片，其然后可以被倒回并且快进以用于详细分析。

EEVA^TM系统利用暗视野照明，这允许更准确地观察胚叶细胞膜；由此，可以准确地监控分化，但是此方法提供的关于细胞内形态的信息极少并且对于用于跟踪具有渐增数量的细胞的超过2天的胚胎能力受限。自动系统可能混淆大片段与胚叶细胞，这可能由此影响其选择准确性。下面的表格1提供了这些系统的比较。

表1

用于亮视野与暗视野观察的一些示例性已知用途如下。

暗视野照明器通常地用于反射表面上以在背景与特定特征(对于OCR检测)或与诸如刮擦与包装撕裂的缺陷之间形成鲜明对比。利用光形成暗区域可能听起来像是奇怪想法，但是将光成角度投射到物体表面将致使它偏离照相机，除非表面变化致使光偏转到透镜中。相应地，如果没有表面像差，那么通过视觉系统不会看到任何东西。

AdcancedIllumination公司给它们的RL5064模型提供了“组合式”亮视野/暗视野照明器。此装置具有在可以独立地使用亮视野与暗视野的紧凑壳体中的亮视野与暗视野照明的双重功能性。然而，使活细胞成像中的问题是显而易见的。在此方面中，染色的(即，死的)细胞可以“吸收”光，引物除了活体细胞的大量物体很大程度上上是透明的，基本上不吸收光并且散射相对地少。相应地，如上面指出的，暗视野图像可以类似于荧光图像看起来是自发光的。此设计不使用透镜来将来自LED的光控制或聚焦到标本。这要求此装置非常接近标本，这在复杂系统中是不方便的。

应该指出的是，如上所述的用于胚胎评估的目的的开发用于胚胎的延时成像的全部系统，当前都仅依赖于亮视野或暗视野的一个或另一个成像系统。在胚胎评估中的亮视野的进展有许多，并且由此全部已知的、当前的胚胎形态学描述与质量等级系统依赖于亮视野图像的使用。其是并且一直都是在倒置或立体显微镜下进行胚胎评估的最通常的方法。它还允许(在一定程度上)观察细胞内结构以及细胞内组织(例如内细胞团以及滋养外胚层的外观，以及细胞破裂的程度与类型)。

当提到观察胚胎的形态学与发育活力时，具有用于形态学系统的多个理想的属性。这些包括下面内容：

1.利用亮视野与暗视野显微技术照明方法以利用可以从两种技术的相应数据集获得的组合信息。尽管使用暗视野照明允许更大的对比度，但是亮视野照明是用于生物标本的检查的行业标准，其提供了用于探测边缘并且突出胚胎的算法的更加更准确的信息。

2.经济与临床标准可能要求具体地定制的显微技术系统以将照明聚焦在特定性控制与可重复位置处。

3.从商业观点，低成本照明解决方案是非常理想的。

4.此外，非常理想的是显微技术系统优选地在没有复杂的部件的情况下适用于暗视野与亮视野显微技术。

5.尽管对于暗视野与亮视野照明各自可能需要两个特定的光源，但是高度追求将两个单独光源结合在单个部件中，同时保持彼此隔离。

6.空间限制是不可避免的，因此解决空间限制的解决方案也是非常理想的。

7.提供定制皿或生物样本囊几何结构的照明。

8.光的波长对胚胎是安全的。

9.考虑到用于生物样本的显微技术系统的属性，可能需要使显微镜透镜结构的热管理与另外必要的潮湿环境接触。

发明内容

这里描述的实施方式的目的是克服或缓解了上面指出的相关技术系统中的缺点中的至少一个或者至少提供了对相关技术系统的有用的替代。

在一个方面中，本发明提供了利用显微技术评估生物样本的发育活力的方法，此方法包括步骤：

在延时测量间隔内同时捕获生物样本的亮视野图像与暗视野图像。

优选地，同时捕获亮视野与暗视野图像的所述步骤包括以下步骤：

选择性地启动暗视野光源或亮视野光源；

通过复合亮视野与暗视野透镜系统相应地照明暗视野光路径或亮视野光路径；

相应地捕获定位在所述复合透镜系统的焦点处的生物标本的暗视野照明或亮视野照明的延时图像，其中，所述焦点对于所述暗视野光路径与所述亮视野光路径是共同的。

优选地，暗视野光源与所述亮视野光源彼此隔离。优选地，暗视野光路径与亮视野光路径彼此隔离。

优选地，此隔离是光隔离、电隔离、热隔离中的一个或组合：

优选地，选择性地启动暗视野光源或亮视野光源的步骤包括通过软件控制器、电子开关控制器以及机械开关控制器中的一个或组合独立地控制光源。

优选地，这里的方法还包括步骤：

生成数据组，此数据组包括来自多次延时测量的捕获的亮视野图像与暗视野图像的组合；以及

选择性地显示来自数据组的捕获的图像中的一个或组合以用于分析。

在优选实施方式中，延时测量间隔大约是5分钟。

在另一个方面中，本发明提供了用于生物样本的选择性亮视野或暗视野照明的光路径引导件，包括：

合成透镜系统，其具有第一透镜，以用于聚焦来自亮视野光源的亮视野照明，以形成亮视野光路径；以及第二非球面透镜布置，其与亮视野光路径同心地布置，以用于聚焦来自暗视野光源的暗视野照明，并且用于能够同时地捕获生物样本的亮视野图像与暗视野图像。

优选地，非球面透镜布置包括环形非球面透镜。

优选地，暗视野光路径与亮视野光路径彼此隔离。

优选地，光路径引导件还包括圆锥反射器，其与非球面透镜布置结合，使暗视野照明路径与亮视野照明路径隔离。

优选地，复合透镜系统的焦点对于暗视野光路径与亮视野光路径的焦点是共同的。

在另一个方面中，本发明提供了利用显微技术评估生物样本的发育能力的装置，包括：

复合光源布置，其包括亮视野光源与暗视野光源，其中，所述亮视野光源与所述暗视野光源彼此隔离；以及

如这里描述的光路径引导件。

优选地，此装置还包括定位在光路径引导件的复合透镜系统的焦点处的标本平台。

优选地此装置还包括：

切换设备，其用于选择性地启动所述暗视野光源或所述亮视野光源；

延时测量设备，其用于相应地捕获定位在复合透镜系统的焦点处的生物标本的暗视野照明或亮视野照明的延时测量间隔内的延时图像，其中所述焦点对于暗视野光路径与亮视野光路径是共同的。

在说明书公开和/或在所附权利要求中限定了其它方面与优选形式，其形成本发明的描述的一部分。

本发明源于这样的认识，尽管在现有技术中，试图利用亮视野显微镜与暗视野显微镜观察胚胎或更通常的生物样本发育具有缺陷，但是将暗视野与亮视野观察结合在一起可以允许获得更多信息，前提是暗视野能够探测良好形态胚胎中的重要与细微区别以改进胚胎选择，还允许软件算法，同时亮视野允许形态分析。

通过下文提出的详细描述，本发明的实施方式的进一步应用范围将变得显而易见。然而，应该理解的是详细的描述与特定实例，尽管指示本发明的优选实施方式，但仅通过描述方式提出，因为通过此详细描述这里公开的精神与范围内的多种改变与修改对于本技术领域中的这些技术人员来说将变得显而易见。

附图说明

通过参照下面实施方式的描述结合仅通过说明提供并且由此不限定这里的公开的附图，相关技术领域中的这些技术人员可以更好地理解本发明的优选实施方式以及其它实施方式的其它公开、目的、优点与方面，并且在附图中：

图1示出了根据现有技术系统的用于显微技术的亮视野与暗视野照明的比较；

图2是根据本发明的优选实施方式的示出了暗视野照明构造的显微技术系统的横截面视图；

图3是根据本发明的优选实施方式的示出了亮视野照明构造的显微技术系统的横截面视图；

图4是图2和图3的显微技术系统的系统部件的分解图；

图5是包括图4中示出的分解视图的部件的装配模块，并且是图2、图3和图4的实施方式的光学元件的原位视图，但是从与图4的角度大致相距180°的角度。

图6示出了根据本发明的优选实施方式的相应地通过图2和图3的显微技术系统获取的生物样本的培养皿的井5和井9的暗视野测试图像；

图7示出了根据本发明的优选实施方式的相应地通过图2和图3的显微技术系统获取的生物样本的培养皿的井5和井9的亮视野测试图像。

图8示出了根据本发明的实施方式的用于照明源的印刷电路组件(PCA)，该照明源包括用于选择性暗视野与亮视野照明的居中布置的LED。

图9示出了施加在当前培养器组件上的实例现有技术暗视野照明模块，识别该照明模块未适配在已知的培养器与培养仪器中。

图10示出了利用现有技术暗视野系统被照明的样本井，其提供了通过在边缘的两侧上的阴影突出的欠佳的图像质量。

图11是根据优选实施方式的利用暗视野照明捕获的图像，其提供了用于使用者检查的足够质量或自动算法以协助评估胚胎生活力。

图12示出在已知培养器与培养仪器上的要求位置中的暗视野现有技术显微技术模块。在暗视野照明源的中心中突出的是亮视野照明空间包络。

图13示出了具有替换密封选用件的根据本发明的另一个实施方式的显微镜光学布置并且示出了包括相似透镜与照明部件的装配过程。

具体实施方式

本发明的下面优选实施方式的描述提供了暗视野与亮视野照明中的一个或组合，以使具有用于容纳多个生物样本的样本井的培养皿中的胚胎/生物标本成像。

参照图2和图3，示出了用于胚胎的延时培养器中的组合式暗视野与亮视野照明器200。亮视野照明(在图3中最佳示出为BF)包括优选为LED的安装在PCA177上的光源175，(其中‘PCA’认为是印刷电路组件或PCBA印刷电路板组件)，光源直接地位于定位在培养皿166中的标本上方。此亮视野光束容纳在圆柱的形状中，以将光柱引导通过透镜115以聚集在标本上。

除了来自亮视野显微技术的改进的益处以外，暗视野显微技术在胚胎评估应用中的优点在于其能够探测诸如胚胎/细胞轮廓与边缘的外部细节，使得其很好地适于探测细胞数量和尺寸与胚胎尺寸。亮视野观察类型与暗视野观察类型它们两者自身都能够并且一直被单独地使用以评估胚胎发育潜力，但是结合它们并且允许发展和应用利用聚集的全部信息的算法，使得本发明的实施方式对于IVF临床来说是异常强大的工具。通过具体参照图2，为了暗视野照明，安装在PCA177上的光源180照射与亮视野光束平行、但不干涉或侵扰亮视野照明光路径的光。

如在前序中描述的Auxogyn公司系统模块可以用于特别地形成在用于本发明的优选显微镜检测系统内的亮视野照明。

根据优选实施方式，暗视野照明源180优选为在亮视野照明源LED175周围的两个同心环中的42个LED。在此LED的布置中每120度的三个2mm断裂允许包括用于支撑的结构肋部。在图2中最佳指示为DF的此光束包括在套环181的外侧上，用于亮视野照明。此光还通过略微锥形的反射镜170容纳，以将光引导通过环形非球面透镜组件169。这形成用于暗视野照明的环形光路径。透镜169形成聚焦在标本/物体上的锥形而且环形的光束。允许在缺少亮视野照明LED175的情况下形成暗视野，被驱动由此在没有亮视野照明的情况下在标本后面形成暗视野。

透镜115与169特别地选择为提供一致的聚焦平面，以在生物样本上提供用于各照明路径的焦点。相应地，透镜定位在组件中以将光路径引导到与标本/物体将定位的亮视野情形和暗视野情形一致的特定位置。

透镜115和169是低成本的。在此方面，暗视野非球面透镜组件169的中心需要改变以在中心具有大约14mm直径的孔，以用于亮视野照明的安装。透镜而非多倍透镜的低成本透镜构造和数量允许更小且更便宜的部件，以形成相同的照明。

暗视野与亮视野照明围绕相同轴线同心地形成，同时两个单独光束路径彼此隔离。可选地，光源沿着如图2和图3中所示的两个不同路径行进。通过物理隔离，来自暗视野区域的光不能达到亮视野区域。LED光源是独立的并且能够单独地控制。光路径的构造是彼此同心的。软件能够在不通过显微镜组件改变焦点的情况下从暗视野切换到亮视野。

两个光源定位在相同的PCA上并且优选地通过使用垫圈彼此隔离。通常地，由于两个部件(PCB与机加工套环)的机加工表面不是完全地平坦，并且使它们完全地平坦不是成本有效的，因此通过使用垫圈使光源隔离。从而作为软泡沫材料的垫圈可以布置在其间，以填充两个部分之间的间隙。

能够实现两个光路径中的此隔离的另一种方式是用粘结剂装或者填充电子组件，这通常地用于腐蚀保护与冲击保护。粘结剂/填充剂将形成光与空气密封，尽管其可能不一定易于可逆，并且可能是永久改变，此外不允许两个部件相互移除。

另选地，只要材料不允许光在独立聚焦组件之间透射，就可以将不同材料用于两个部件之间的垫圈。

在这些优选实施方式中，隔离方式还应该不允许空气在组件之间转移。

还能够通过将LED布置在两个单独PCB或PCA上实现两个光源的分离，这将允许暗视野PCA定位为使得光容纳在套环内，并且此套环在其上具有盖并且仅具有用于一些线通过的小的空间以使电可到LED。

还可以使用O形环替代抵靠PCB被向下夹紧的垫圈(因为O形环可能太硬，通常不被使用)。O形环被按压在PCB上，并且阻挡暗视野光路径到亮视野光路径之间的源渗出光，这需要保持黑暗以便暗视野工作。单个PCA允许通过使两种光源安装到相同的PCB(印刷电路板)使部件成本降低。如图4中最佳示出的，可以通过使用由中间支撑件3布置与压紧的垫圈在一个部件上获得亮视野光源与暗视野光源两者的隔离，以使亮视野光源与暗视野光源隔离。有利地，这提供了允许使用具有多个光源的单个PCA的简单部件。

透镜构造的空间限制要求透镜到标本床/皿的紧密布置。非球面透镜组件的使用移除了对于多个透镜的需要，以使光聚焦到适当的焦点。使用彼此在PCB上同心、由此在相同轴线上的LED，使得设计的包装显著地小于用于具有遵循附加轴线的光路径的暗视野照明的反射表面。

显微镜光路径的工作直径大约是14mm，并且在它的任一侧上的1mm内使照明变差。这用于限定非球面透镜对于由于标本皿的几何形状产生的图像的清晰性来说是关键的。圆锥光源能够足够窄或宽以照明皿中的全部井。这通过圆锥光束的尺寸与形状、反射镜的形状是可改变或可选择的，反射镜是机加工部件并且能够将光引导到非球面透镜组件中。在测试过程中，圆锥反射镜的几种形状被测试以形成现在使用的基本几何形状。发现最有效的内部尺寸是大约14mm的直径并且外径大约是24mm。仅通过结构肋部断开此直径，这允许亮视野透镜保持在适当位置中。三个肋部以120分离定位并且大约是2mm厚。通过较小的厚度与结构肋部的减小，这允许暗视野照明的更加均匀的光锥。

已经发现，与其它波长相比，特定波长对标本不那么有害。在此方面，LED波长越接近625nm，照明对标本的损伤越小。由此选择的LED尽可能地接近625nm。

需要透镜的热管理。由于连接到室，室是与在GERI专利中描述的相同的室，此照明模块拧入到它的室的壁中，然后利用O形环密封。此O形环密封用于密封室的湿气以免泄露，以保持用于胚胎的适当湿度范围，其局部还具有温度，跨越透镜的温度与湿度差可以在透镜上形成冷凝，当光穿过时这将形成衍射，由此区分光路径。在图2和图3的横截面中可以看到室的一部分。白色空间就在培养皿166上方。湿度存在变化，由此PCA需要密封以免受室的湿度。通过使用几个O形环179来形成此密封。为保持对透镜的温度的控制而不形成透镜的冷凝，我们不通过使用加热元件主动地控制透镜的温度，但是我们特别地选择将允许温度穿过它们以提供温度的逐渐改变而不是急剧差异的材料。温差跨越透镜，周围的安装部件材料选择为在透镜周围提供良好的热传送以保持局部地限定的温度变化。

执行测试以通过亮视野照明与暗视野照明来模拟皿中的标本/胚胎的照明。通过使用朝向非球面透镜组件的原型反射引导件来测试在皿上的反射式样的几个概念。光源的“引导”允许聚焦在培养皿上的锥形光的几何形状的变化。几个原型的迭代允许照明跨越培养皿中的全部井是均匀的。在优选实施方式的发展中，追求清晰度或阴影以及利用早期采用的部件，例如通过用于证明构思的测试中反射镜171的迭代，允许选择非球面透镜组件169以及中心孔的适当直径。在非球面透镜组件几何形状内，最佳适配非球面透镜选择为现成部件，并且然后在其中部中加工孔以形成亮视野光路径。这当前地被标记为BF，并且用作用于阻挡光的路径以允许暗视野测量。在附图中示出了一些测试图像，其中图6相应地示出了样本培养皿的井5和井9的暗视野图像，并且图7示出了相应地在测试下的相同培养皿的井5和9的亮视野图像。

通过使用特定的光方向以及在定制皿上的现有障碍物周围聚焦至标本来提供定制皿几何形状的照明。使用特定透镜以形成光束几何形状以照明培养皿上的全部标本。有利地，这已经依照皿几何形状被具体地定制以实现最好的照明结果。示例性地用于优选实施方式中的定制培养皿几何形状是在申请人的公开国际(PCT)专利说明书No.WO2014/131091中公开的。在本发明的优选实施方式中有用的另一个培养皿是在申请人的公开国际(PCT)专利说明书No.WO2014/106286中公开的。通过使用如在WO2014/131091中公开的培养皿几何形状，需要使用照明装置以照明在培养皿上的一个井内的全部微井。如前面所描述的，Auxogyn公司照明模块不能清楚地照明培养皿上的井中的全部微井。暗视野照明的特定几何形状用于照明皿上的全部微井。

返回到图2，示出了本发明的实施方式的横截面视图，并且此横截面视图指出了用于暗视野照明的构造。在图2中示出的箭头以粗略估计代表光束的路径。PCA177具有附接到板的LED。通过在PCA177的板上的LED产生的光被引导通过暗视野扩散器172，其将光扩散为比源自多个暗视野源LED的独立斑点更加均匀。光束然后被引导通过圆锥外部170，其将光引导到非球面环形透镜组件169的表面中。这然后将光聚焦在培养皿166上。

图3示出了与图2相同的本发明的的实施方式的横截面视图，使得图3的箭头在此情形中描述了亮视野照明的光路径。在亮视野情形中，PCA177具有居中地安装的单个LED，其引导用于亮视野照明的光直接地在包括标本的培养皿与井上方。光出现并且通过抵靠PCA夹紧的光绝缘件178容纳在中间圆柱体内。光被引导通过亮视野扩散器173，其扩散以形成光的单一传播。光束现在容纳在套环内并且被引导通过将光聚焦在培养皿166上的双重凸面透镜115。

图4示出了如图2和图3中所示的优选实施方式的光学系统的组件的分解视图。在图4的分解视图中，PCA177示出了在圆形构造中的42个暗视野源LED180，每120度具有与中间支撑件3上的支撑肋对准的大约2mm的三个间隙。本领域中的技术人员应该理解的是，暗视野源LED180或实际上亮视野源LED/多个亮视野源LED175的布置可以以其它形式构造，但是仍提供了根据本发明的实施方式的适用于暗视野照明的照明。

在相同PCA板177上具有亮视野与暗视野照明光源(相应地175和180)的优选实施方式的圆柱形的同心设计可以与非球面透镜组件169结合使用，以提供适当地变窄并且聚焦在标本床上的环形光束以用于两种类型照明。这允许适配在非常小的限定空间内、同时在培养皿上提供标本的清晰照明的紧凑设计。通过选择两个透镜布置调节到皿的定制距离，以提供将光聚焦到标本床。透镜的定位位置对于照明标本来说是重要的。要求定位位置与标本的距离和透镜的规定焦距的距离相同，从而光照射标本。焦距是与光聚焦的透镜的距离。定位位置是规定精确位置，或其中透镜定位在其上的壁架的位置的另一种方式。该优点在于低成本透镜是可获得的，并且适于允许照明标本。在此方面中，在容纳两种光(亮视野与暗视野)源的优选实施方式中，通过PCA177提供了低成本照明解决方案。此外，透镜优选地由丙烯酸制成以降低成本。紧凑装配减小了要求的透镜的尺寸以及此外用于使光聚焦的透镜的数量。如此有利地，亮视野与暗视野光源两者都在相同的PCA上以减少部分数量与成本。

独立光源可以通过软件控制为允许在亮视野照明与暗视野照明方法之间切换。有利地，不需要移动机械部件。此外，不需要滤光器或阻挡部件以移动到适当位置中。

优选实施方式的同心透镜与照明源布置允许系统包装在限定区域的空间中。同心照明源要求独立地控制亮视野与暗视野照明，以便允许独立的捕获、观察或检查暗视野或亮视野图像。在优选的实施方式中，使用独立的电子与可编程软件控制可以用于独立地选择各光源。通过将照明源与透镜结合到相同的覆盖区中，不需要机械移动来选择与观察亮视野或暗视野图像。

在优选实施方式中，图3中的照明组件包装在大约26mm的竖直高度中。本领域中的技术人员应该理解的是，包括焦距、目标标本位置、以及需要照明的面积、透镜选择和设计的整体设计要素，可以改变以减小或增加组件的尺寸。在优选实施方式中，部件可以具体地设计与选择为照明与匹配全部仪器组件、显微镜、照相机与胚胎皿的具体细节。主要的组合的几何上同心的照明源、透镜部件、控制PCA与软件可以改变以适合在此优选实施方式以外的宽范围的应用。

在优选实施方式中并且参照图8，单个中心发光二极管(LED)175用作用于亮视野图像捕获、观察或检查的照明源。亮视野LED175被引导到亮视野扩散器173中并且通过双凸透镜115。LED180阵列居中地位于中心LED周围，其用于产生用于暗视野图像捕获、观察或检查的照明。LED180的外环用于形成均匀光环，其在优选实施方式中穿过扩散器172并且到环形非球形透镜组件169中。

延时图像捕获能够以与传统延时测量相同的方式、通过优选实施方式的复合暗视野与亮视野显微镜透镜组件进行执行，但是选择性切换的附加益处能够在一方面样本的暗视野照明和另一方面暗视野照明之间切换，而无需将样本移动到替换的光学布置，或者具有延时以将光学组件重新布置以用于替换的照明区域。

此外，亮视野与暗视野观察两者实际上精确地同时实现(在数秒内)并且持续地记录的事实，允许考虑人类胚胎的快速发育属性的高级算法的发展，当在重要时刻时能够在几分钟内发生显著改变(例如，原核膜破裂)。

在优选方式中，延时使胚胎培养器包括以下有利特征：

·组合式暗视野/亮视野照明源

·组合透镜组件以及如上所述的非球面透镜的特定结构

·暗视野与亮视野源具有可以是软件、电子或机械中的一个的独立的控制

·分离光源以便不允许光的交叉污染的能力

·使电子件/光学件与室环境条件隔离的能力

·描述用于聚焦暗视野照明的特定圆锥设计

·具体地选择照明波长以减小对胚胎的损害

·用于暗视野照明的LED的环

·亮视野图像与暗视野图像两者的自动捕获

·用于检查在所述培养器软件平台上的亮视野与黑暗图像的能力

·相对于胚胎的照明件位置

·选择性地显示暗视野与亮视野图像，这允许在无需要求从环境受控室手动介入或移除胚胎的情况下在基本上相同时间点检查全部图像。DF/BF两者的捕获与显示允许使用者手动地检查两种图像以得到用于将要使用的胚胎的生活力的更好的结果。

·亮视野与暗视野两者的自动分析用于协助选择用于植入的最佳胚胎。

尽管已经联系其特定实施方式描述了本发明，应该理解的是能够对其进行进一步修改。在本发明的一般原理后面，本申请旨在覆盖本发明的任意变型使用或者调整，并且包括与如在本发明所属的本技术领域内的已知或惯例实践内并且如可以适用于上文中阐述的基本特征的本公开的这种偏离。

由于本发明可以在不偏离本发明的基本特征的精神的情况下以几种形式体现，因此应该理解的是，除非另外具体指明，否则上述实施方式不限制本发明，而是应该在如在所附权利要求中限定的本发明的精神与范围内广义地理解。描述的实施方式在所有方面都仅作为是描述性的，而不是限定性的。

多种修改与等效布置旨在包括在本发明与所附权利要求的精神与范围内。因此，特定实施方式将理解为是对多种方式的描述，其中可以实施本发明的原理。在下面的权利要求中，装置加功能限定用于覆盖如执行限定功能的结构并且不是结构等效物，而是等效结构。例如，尽管钉子与螺钉可能不是结构等效的，这是由于钉子利用圆柱形表面来将木质部分固定在一起，然而螺钉利用螺旋表面以将木质部分固定在一起，在紧固木质部分的情况中，钉子与螺钉是等效结构。

应该指出的是在这里使用术语“伺服器”、“安全伺服器”或者类似术语的地方，描述了可以用于通信系统中的通信装置，除非上下文另外要求，并且不应解释为将本发明限定到任何特定通信装置类型。由此，通信装置可以非限定地包括可以是安全的或可以是非安全的桥、路由器、网桥路由器(路由器)、开关、节点、或其它通信装置。

还应该指出的是流程图在这里用于展示本发明的多个方面，其不应解释为将本发明限定到任意特定逻辑流程或逻辑实施。可以在不改变整体结果或者另外地偏离本发明的真实范围的情况下，将描述的逻辑划分成不同的逻辑模块(例如，程序、模块、功能或子程序)。通常，可以在不改变整体结果或者另外地与本发明的真实范围偏离的情况下，增加、修改、省略、以不同顺序执行、或者利用不同的逻辑结构执行逻辑元素(例如，逻辑门、循环基元、条件逻辑和其他逻辑结构)。

本发明的多个实施方式可以以多种不同形式体现，包括用于处理器(例如，微处理器、微控制器、数字信号处理器、或者通用目的计算机，并且就此而言，任何商业处理器都可以用于实施本发明的实施方式作为单个处理器，系统中的串联或并联组处理器，并且同样地，商业处理器的实例包括但不限于Merced^TM,Pentium^TM,Pentium II^TM,Xeon^TM,Celeron^TM,Pentium Pro^TM,Efficeon^TM,Athlon^TM,AMD^TM等)的计算机程序逻辑，用于可编程逻辑装置的可编程逻辑(例如，区域可编程门阵列(FPGA)或其它PLD)、分立部件、集成回路(例如，应用特定集成回路(ASIC))、或者包括其任意组合的任意其它装置。在本发明的示例性实施方式中，显著地使用者与伺服器之间的全部通信都执行为一组的计算机程序指令，其转换成计算机可执行形式，本身存储在计算机可读取介质中，并且在操作系统的控制下通过微处理器执行。

执行这里描述的功能性的全部或部分的计算机程序逻辑可以以多种形式体现，包括源代码形式、计算机可执行形式以及多种中间形式(例如，通过汇编程序、编译器、连接器或定位器生成的形式)。源代码可以包括用于在多种操作系统或多种操作环境中以多种编程语言(例如，目标码、汇编语言、或诸如Fortran、C、C++、JAVA或HTML的高级语言。此外，存在可以用于执行本发明的实施方式的数百种可用计算机语言，其中更加常用的是Ada、Algol、APL、awk、Basic、C、C++、Conol、Delphi、Eiffel、Euphoria、Forth、Fortran、HTML、Icon、Java、Javascript、Lisp、Logo、Mathematica、MatLab、Miranda、Modula-2、Oberon、Pascal、Perl、PL/I、Prolog、Python、Rexx、SAS、Scheme、sed、Simula、Smalltalk、Snobol、SQL、VisualBasic、VisualC++、Linux和XML。)中任一种执行的一系列计算机编程指令。源代码可以限定与使用多种数据结构与通信信息。源代码可以是以计算机可执行形式(例如，经由注释器)，或者源代码可以转换(例如，经由翻译器、汇编器或编辑器)成计算机可执行形式。

计算机编程可以以任意形式(例如，源代码形式、计算机可执行形式或中间形式)永久地或暂时地固定在有形存储介质中，诸如半导体存储装置(例如，RAM、ROM、PROM、EEPROM或闪存可编程RAM)，磁性存储装置(例如，磁盘或硬盘)、光学存储装置(例如，CD-ROM或DVD-ROM)、PC卡(例如，PCMCIA卡)或其它存储装置。计算机编程可以以任意形式固定在信号中，该信号可利用多种通信技术中的任一种传送到计算机，通信技术包括但绝不限于模拟技术、数字技术、光学技术、无线技术(如蓝牙)、网络技术和网络互联技术。计算机编程可以以任意形式作为具有伴随印刷或电子文件(例如，收缩包围软件)的可移除存储介质分布，预加载计算机系统(例如，在系统ROM或硬盘上)，或者从伺服器或电子公告板分配到通信系统(例如互联网或万维网)上。

可以利用传统的手动方法设计，或者可以利用多种工具，诸如计算机辅助设计(CAD)、硬件描述语言(例如，VHDL或AHDL)、或PLD编程语言(例如，PALASM、ABEL或CUPL)电子地设计、捕获、模拟或记录执行这里描述的功能性的全部或部分的硬件逻辑(包括用于可编程逻辑装置的可编程逻辑)。硬件逻辑还可以并入到显示屏中以便执行本发明的实施方式，并且其可以是分段显示屏、模拟显示屏、数字显示屏、CRT、LED显示屏、等离子屏、液晶二极管屏等。

可编程逻辑可以永久地或者短暂地固定在有形存储介质中，诸如半导体存储装置(例如，RAM、ROM、PROM、EEPROM或闪存可编程RAM)、磁性存储装置(例如，软盘或硬盘)、光存储装置(例如，CD-ROM或DVD-ROM)、或者其它存储装置。可编程逻辑可以固定在信号中，此信号利用多种通信技术中的任一个可传送到计算机中，通信技术包括但是绝不限于，模拟技术、数字技术、光学技术、无线技术(例如，蓝牙)、网络技术以及网络互联技术。可编程逻辑电路可以作为具有伴随印刷或电子文件(例如，压缩打包软件)的可移除存储介质分布，预加载计算机系统(例如，在系统ROM或硬盘上)，或者从伺服器或电子公告板分配在通信系统(例如互联网或万维网)上。

当在本说明书中使用的术语“包括(comprises)/包括(comprising)”与“具有(includes)/具有(including)”被采取具体规定所述特征、整数、步骤或部件的存在，而不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、部件或其群组的存在或添加。由此，除非上下文清楚地另外要求，否则贯穿说明书与权力要求，术语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、具有(include)/具有(including)等应该以与排他性或穷尽性意义相对的涵盖性意义，也就是说，以“包括但不限于”的意义理解。

Claims

1.一种利用显微技术评估生物体外受精样本的发育活力的方法，此方法包括以下步骤：

从组合式暗视野与亮视野照明器选择性地启动亮视野光源和暗视野光源，所述暗视野光源围绕所述亮视野光源在同一印刷电路组件上同心地设置；

通过所述组合式暗视野与亮视野照明器的复合暗视野与亮视野透镜系统分别选择性地照明暗视野光路径和亮视野光路径，其中复合透镜系统包括所述暗视野光路径和亮视野光路径共有的焦点以便在此定位生物样本，并且其中所述复合透镜系统包括：第一透镜，用于聚焦来自所述亮视野光源的亮视野照明，以形成亮视野光路径；以及第二非球面透镜布置，其与亮视野光路径同心地布置，以便聚焦来自所述暗视野光源的暗视野照明，以形成暗视野光路径；

在延时测量间隔内选择性地捕获生物样本的亮视野与暗视野延时图像。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述暗视野光源与所述亮视野光源彼此隔离。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述暗视野光路径与所述亮视野光路径彼此隔离。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述隔离是下列中的一个或组合：

光隔离；

电隔离；

热隔离。

5.根据权利要求2至3中任一项所述的方法，其中，所述暗视野光源和所述亮视野光源位于通过一个或一组垫圈和粘结剂彼此隔离开。

6.根据权利要求1-3中任一项中所述的方法，其中，选择性地启动暗视野光源或亮视野光源的步骤包括通过软件控制器、电子开关控制器以及机械开关控制器中的一个或组合独立地控制光源。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法还包括步骤：

8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述延时测量间隔大约是5分钟。

9.一种评估生物体外受精样本的发育活力的显微镜装置，该显微镜装置包括：

组合式暗视野与亮视野照明器，其具有围绕亮视野光源在同一印刷电路组件上同心地设置的暗视野光源，其中所述暗视野光源和亮视野光源各自适于选择性启动；

复合暗视野与亮视野透镜系统，其适于通过组合式照明器分别选择性地照明暗视野光路径和亮视野光路径，其中复合透镜系统包括所述暗视野光路径和亮视野光路径共有的焦点，并进一步适于在共有焦点处定位生物体外受精样本，并且其中所述复合暗视野与亮视野透镜系统进一步包括：第一透镜，用于聚焦来自所述亮视野光源的亮视野照明，以形成亮视野光路径；以及第二非球面透镜布置，其与亮视野光路径同心地布置，以便聚焦来自所述暗视野光源的暗视野照明，以形成暗视野光路径，并允许选择性捕获生物样本的亮视野图像与暗视野图像。

10.根据权利要求9所述的装置，其中，所述非球面透镜布置包括环形非球面透镜。

11.根据权利要求9或10所述的装置，其中，所述暗视野光路径与所述亮视野光路径彼此隔离。

12.根据权利要求9或10所述的装置，进一步包括锥形反射件，所述锥形反射件与所述非球面透镜布置结合，使暗视野照明路径与亮视野照明路径隔离。

13.根据权利要求9所述的装置，其中，所述组合式暗视野与亮视野照明器的亮视野光源和暗视野光源形成复合光源，所述复合光源包括作为亮视野光源的至少一个LED以及作为暗视野光源的一系列LED，所述暗视野光源相对于所述亮视野光源同心地布置。

14.根据权利要求9-10中任一项所述的装置，进一步包括定位在所述复合透镜系统的焦点处的标本平台。

15.根据权利要求9-10中任一项所述的装置，进一步包括：

延时测量设备，其用于相应地捕获定位在复合透镜系统的焦点处的生物体外受精样本的暗视野照明和/或亮视野照明的延时测量间隔内的延时图像，其中所述焦点是所述暗视野光路径与亮视野光路径共有的。

16.一种适于培养生物体外受精样本的装置，所述装置包括：

处理设备，所述处理设备适于根据预定的指令组操作，

所述装置与所述指令组结合，适于执行如权利要求1至8中任一项所述的方法。