JP6793656B2 - 顕微鏡検査のための方法および装置 - Google Patents

Description

[0001]本発明は、顕微鏡検査を使用した、生体試料の臨床試験および評価の分野に関する。特に、本発明は、生体試料を評価する際の明暗視野顕微鏡検査の使用に関する。胚の発達期間中に胚を記録し、または観察するために使用され得る方法およびデバイスに関して本発明を以下で説明することは、好都合であろう。しかしながら、本発明は、その使用のみに限定されないことが認識されるべきである。

[0002]この明細書における文書、デバイス、動作または知識のいかなる考察も、本発明の文脈を解説するために含まれていることが認識されるべきである。さらに、この明細書の全体にわたる考察は、発明者による実現および／または発明者による一定の関連技術の問題の識別に起因して、生じるものである。さらに、この明細書における文書、デバイス、動作または知識などの資料の考察は、本発明の文脈を発明者の知識および経験の観点から解説するために含まれており、したがって、そのようないかなる考察も、オーストラリアまたは他所において、本明細書における開示および特許請求の範囲の優先日以前に、当該資料のいずれかが従来技術の基礎または関連技術における共通の一般知識の一部を形成するという自認としてみなされるべきではない。

[0003]簡単に言えば、Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ^１の一般的な参照において見出されるように、明視野顕微鏡検査は、あらゆる光学顕微鏡検査の照明技法のうちで最も単純なものである。試料照明が送られ、例えば、白色光は、下から照明され、上から観察され、試料におけるコントラストは、試料の密な領域における透過光の一部の吸収によって引き起こされる。明視野顕微鏡検査は、光学顕微鏡において試料の照明のために使用される一連の技法のうちで最も単純なものであると考えられ得、その単純さが、明視野顕微鏡検査を普及した技法にしている。明視野顕微鏡検査画像の典型的な外観は、明るい背景上の暗い試料であり、そのため、「明視野」という名前である。

[0004]暗視野顕微鏡検査、または「暗い背景の顕微鏡検査（ｄａｒｋ ｇｒｏｕｎｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」は、やはりＷｉｋｉｐｅｄｉａ^２のその参照において見出されるように、光学顕微鏡検査と電子顕微鏡検査との両方における顕微鏡検査方法を説明しており、これらは、画像から非散乱ビームを除外する。その結果、試験片の周りの視野、または、言い換えれば、ビームを散乱させる試験片が存在しない場所は、全体に暗い。

[0005]図１は、従来技術^３において一般に理解されるような、明視野顕微鏡検査の構成要素と暗視野顕微鏡検査の構成要素との間の概略的な比較を与える図である。明視野光学配置と暗視野光学配置との間の試料の照明の差（点状の影によって示されている）が、図１において強調されている。左側の分解組立図内の暗視野は、集光装置００２の下に配置される「スパイダーストップ」によって示される暗視野ストップ００１を利用する。ストップ００１は、光のビームの中心を遮断して、光の中空円錐００３を生み出す。この光は、対物レンズ００４に直接入射しない。試料によって散乱され、対物レンズに入射する光のみが、暗視野における画像として見られる。対照的に、図１の右側の分解組立図は、光の中実円錐００５を示しており、これは、明視野において、対物レンズ００４を照射して対物レンズ００４に入射する。

[0006]従来、明視野顕微鏡検査は、生細胞または染色細胞を見るために適用可能であり、これは、ほとんど準備を必要とせずに、単純なセットアップを伴う。しかしながら、生体試料は、自然色素が少ないため低いコントラストであることが多く、そのため、試料は、通常は染色される必要があり、染色は、アーチアファクトを破壊し、または導入することがある。さらに、解像度は、約０．２μｍに制限され得る。他方で、暗視野顕微鏡検査は、通常は、生きている非染色試料を見るために適用可能である。これも、適当な暗視野光学配置のために単純なセットアップのみを必要とし得、有利には、生細胞が観察され得るように、非染色組織にコントラストを提供する。しかしながら、組織は、強く照明される必要があることがあり、これは、繊細な試料を損傷することがある。

[0007]位相差顕微鏡検査の別の知られている技法は、透明で、非染色の生細胞を観察するのに最も役立つ。位相差イメージングは、明視野光学系に対して優れた画像を提供し、明視野光学系の下では目に見えない細部が高コントラストで現れる。しかしながら、位相差イメージングは、「ハロー効果」または「位相アーチアファクト」を生み出し得るこの技法により歪んだように見え得る厚い試料に対しては理想的ではなく、これらの効果は、試料の境界の周りの詳細を歪めて、存在が露わになることがある。

[0008]暗視野顕微鏡検査には利点がある。この点において、暗視野顕微鏡は、非染色で、透明であり、光をほとんどまたは全く吸収しない物体を見るために理想的である。その結果、これらの試験片は、それらの周囲と同様の屈折率を有することが多く、他の照明技法により試験片を識別することを困難にする。暗視野イメージングは、藻類およびプランクトンなどの海洋生物、珪藻類、昆虫、繊維、髪、酵母および原虫類、ならびに、いくつかの鉱物および結晶、薄いポリマーおよびいくつかのセラミックを調べるために使用され得る。暗視野イメージングは、載せられた細胞および組織だけでなく、生きているバクテリアの研究においても使用され得る。それは、内部構造よりも、外部詳細、例えば、輪郭、エッジ、結晶粒界および表面欠陥などを検査する際に、より役立つ技法である。暗視野顕微鏡検査は、より最新の観察技法、例えば、位相コントラストおよびＤＩＣ（微分干渉コントラスト：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｒａｓｔ）などにより退けられることが多く、より最新の観察技法は、より正確で、より高いコントラストの画像を提供し、より多くの数の試験片を観察するために使用され得る。しかしながら、上記の通り、これらの技法は、例えば、上述されたような歪みなどの、それらの技法自体の欠点を有する。最近では、暗視野顕微鏡検査は、その人気をある程度回復しており、他の照明技法、例えば、蛍光などと組み合わされた場合に、一定の分野において、その考え得る採用の幅を広げている。

[0009]暗視野顕微鏡は、美しく、素晴らしい画像をもたらすことができる一方で、この技法は、複数の欠点も伴う。第１に、暗視野画像は、劣化し、歪み、および不正確になる傾向がある。したがって、十分に薄くない試験片、またはその密度がスライドにわたって異なる試験片は、画像全体にわたってアーチアファクトを有するように見えることがある。スライドの準備および品質は、暗視野像のコントラストおよび精度に大きく影響することがあり、したがって、スライド、ステージ、ノーズおよび光源に、塵などの小粒子がないように、特別な注意を払うことが重要である。なぜならば、小粒子は、画像の一部として現れるからである。同様に、集光装置および／またはスライド上で油または水を使用する必要がある場合に、気泡を全て回避することは、ほとんど不可能である。これらの液体泡は、画像劣化、フレアおよび歪みを引き起こし、試験片のコントラストおよび細部をさらに低下させるであろう。暗視野は、作業するためにかなりの量の光も必要とし、このことと、暗視野がもっぱら散乱光線に依存するという事実とが結合すると、グレアおよび歪みを引き起こすことがある。したがって、暗視野は、試験片の正確な測定を得るための信頼できるツールではないことがある。最後に、暗視野顕微鏡を適応し、使用する場合には、多くの問題が生じることがある。例えば、集光装置およびストップの光の量および強さ、位置、サイズならびに配置は、収差を回避するために正確である必要がある。それでもなお、暗視野は、特に他の技法と共に使用される場合、多くの用途を有し、非常に優れた観察ツールである。しかしながら、この技法を調査研究の一部として使用する場合には、考え得る望ましくないアーチアファクトの制限および知識を考慮に入れる必要がある。

[0010]生体試料、より詳細には、モフォロジー／発達中の胚の記録または観察に関して、光学波長顕微鏡検査は、この使用に適しているが、光学配置を含む別個のシステムのセットアップが、明視野イメージングまたは暗視野イメージングの各々に通常は必要とされる。照明方法は、独立し、互いから分離されることを一般に必要とされる。暗視野顕微鏡検査は、試験片の後ろの領域が照明されないことを必要とするが、見るためには、試験片／物体を通って示される光が必要とされる。明視野観察の場合、光は、試験片の真後ろに示され、直接的な光線が、試験片／物体上に焦点を合わせられる。暗視野照明は、円錐形／リング状の光線により生成されてもよく、この光線は、光源に対して試料ベッドの反対側に配置された顕微鏡を通して見られる試験片／物体において交差する。

[0011]生体試料用の１つの知られている顕微鏡システムは、Ａｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．によって提供されている。Ａｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．のシステムは、観察される／記録される試料の近くに障害物なしで、鮮明なイメージングを提供することに成功している。しかしながら、Ａｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．のシステムには、そのシステムが大型のユニットであるという短所があり、その大型のユニットは、市場で入手可能な他のモジュラーユニットの設計に合わせてカスタマイズ可能ではなく、Ａｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．のシステムのコストは、他のカスタム設計されたユニットと比較してかなり高い。さらに、Ａｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．のシステムは、胚の鮮明ではっきりとしたイメージングを提供する良好で鮮明な画像を得ることができるが、カスタム培養皿のバリエーションを有する構成においては、所与の培養皿設計上で全てのウェルについて不適当な照明が存在し得る。図９は、本出願人の、独立してアクセス可能な試料培養モジュールである市販の試料モジュールの上に、Ａｕｘｏｇｙｎのシステムを重ねた図である。図１２は、Ａｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．のシステムの明らかな特大のフォームファクタとの比較のために、この図中にオーバーレイされた、光学系のための許容可能なエンベロープを備えた本出願人のモジュール上にＡｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．のシステムを重ねた同様の図である。図１２の画像は、本出願人の知られている機器上の所要位置にあるＡｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．のモジュールを示す。図から分かるように、それはかなり大きく、Ａｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．の設計に適合させるためには、モジュール製品全体の外観の変形を含む、著しい変形を必要としたであろう。図９および図１２から明らかなように、Ａｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．のシステムは、現行の計装に適合しない。

[0012]背景として、図１０において画像化されている試料ウェルは、エッジの両側に現れている影から分かるように、十分に照らされていない。したがって、全てのウェルにわたって均一な照明が存在しない。これは考慮される培養皿内の培養ウェルの周りのプラスチック製リングの高さによって引き起こされると考えられる。これは、現在使用されている培養皿の例示である。この画像は、培養皿内のウェル内のマイクロウェルである。

[0013]図１１の画像は、影のない、十分に照らされたウェルを示す。
[0014]胚評価の点から概して言えば、Ａｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．の非侵襲性の初期胚生存性評価（Ｅｅｖａ：Ｅａｒｌｙ Ｅｍｂｒｙｏ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（商標））試験は、体外受精（ＩＶＦ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の成果を、ＩＶＦクリニックおよび患者に胚生存性に関する客観的な情報を提供することによって改善し得る。従来の胚評価技法と共に使用すれば、Ｅｅｖａ（商標）システムは、ＩＶＦクリニックおよびそれらの患者に、臨床的効果を改善する見込みを与え得る。成功の機会がより増えれば、多数の患者に対する単一胚移植を可能にすることによって、多胎を減少させることが可能になり得る。Ｅｅｖａ（商標）システムが所有するソフトウェアは、科学的かつ臨床的に確認された細胞分裂タイミングパラメータに対する胚発達を自動的に分析する。各胚の発達の見込みに関するＥｅｖａ（商標）システムの定量的なデータを用いれば、ＩＶＦクリニックは、ＩＶＦ処置を受けている当該クリニックの患者に対する治療の道筋を最適化することができる。

[0015]Ａｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．のＥｅｖａ（商標）システムは、ルーチンＩＶＦ研究所ワークフローシステムに適合するように設計されている。Ｅｅｖａ（商標）培養皿は、Ｅｅｖａ（商標）が各胚の個々の発達を追跡し、胚がグループ培養技法下で成長することを可能にするマイクロウェルを含む。暗視野Ｅｅｖａ（商標）顕微鏡は、最も標準的なＩＶＦ培養器に適合し、胎生学者による介入または胚に対する過度な露光なしに、自動暗視野画像捕捉および細胞分裂追跡を提供する。Ｅｅｖａ（商標）顕微鏡画面は、培養器の外側に取り付けられ、胎生学者が、各Ｅｅｖａ（商標）患者セッションを制御し、培養器を開くことまたは胚に支障をきたすことなく、最新の画像を見ることを可能にする。Ｅｅｖａ（商標）は、科学的かつ臨床的に確証された細胞分裂タイミングパラメータに対する胚発達を自動的に分析し、２日目までに各胚の将来的な生存性を予測する。Ｅｅｖａ（商標）からの定量的で客観的なデータは、標準的なモフォロジー評価（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｇｒａｄｉｎｇ）と共に、ＩＶＦクリニックが胚選択および最適な患者治療経路に関して、情報に基づくより良い決定を行うことを可能にし得る。Ｅｅｖａ（商標）ステーションを使用すれば、各Ｅｅｖａ（商標）患者セッションの画像およびビデオを簡単に再検討することができる。さらに、Ｅｅｖａ（商標）システムにおいて提供されるダウンロード可能なレポートおよびビデオは、患者に助言する際に助けとなり、患者の全体的な体験を改善し得る。

[0016]一般的な参考文献として、胚選択におけるタイムラプス（ｔｉｍｅ ｌａｐｓｅ）モニタリングの役割は、Ｐｅｔｅｒ Ｋｏｖａｃｓによって著されたＲＢ＆Ｅ ａｒｔｉｃｌｅ^４において論じられており、このＲＢ＆Ｅ ａｒｔｉｃｌｅは、参照によって本明細書に組み込まれ、当該記事の内容の一部は、ここで以下のように複製される。

[0017]様々なタイムラプスシステムが、現在使用されている。最も広く用いられている技術のうちの２つは、Ｐｒｉｍｏ Ｖｉｓｉｏｎ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ（商標））およびＥｍｂｒｙｏｓｃｏｐｅ（Ｆｅｒｔｉｌｉｔｅｃｈ（商標））システムであり、双方が、明視野技術を使用するのに対して、上述したＥＥＶＡ（商標）（初期胚生存性評価、Ａｕｘｏｇｙｎ）システムは、暗視野技術を使用する。全てのシステムは、５〜２０分のタイムラプス間隔で胚の写真を撮影するデジタル倒立顕微鏡を組み込んでおり、ここで、これらの時間間隔は、顕微鏡観察の分野において一般に使用される期間として、当業者によって十分に理解されている。画像は、カスタム画像取得技法によって処理され、次いで、コンピュータ画面上に表示される。予め設定された間隔または選択された間隔で撮影された写真は、次いで、繋げられて、詳細分析のために巻き戻し、および早送りされ得るショートフィルムになる。

[0018]ＥＥＶＡ（商標）システムは、暗視野照明法を使用し、これは、割球膜のより正確な観察を可能にする。したがって、分裂は、正確にモニタリングされ得るが、本方法は、細胞内モフォロジーに関して極めて少ない情報を与え、細胞数が増加する、２日目を超えた胚を見守るための限られた能力を有する。自動システムは、大きなかけらを割球と混同することがあり、したがって、このことは、その選択精度に影響を及ぼすことがある。下記の表１は、これらのシステムの比較を提供する。

[0019]明視野観察および暗視野観察についてのいくつかの例示的な知られている用途を以下に述べる。
[0020]暗視野照明器は、ＯＣＲ検査の場合に背景と特定の特徴との間のくっきりとしたコントラストを生成するために、または背景と引掻傷およびパッケージの裂け目などの不具合との間のくっきりとしたコントラストを生成するために、反射面上で一般に使用されてきた。暗い領域を生成するために光を使用することは、奇妙な考えのように聞こえるかもしれないが、物体の表面に対して、ある角度をなして光を投影することは、表面のばらつきが光をレンズ内に屈折させない限り、光をカメラから離れるように屈折させるであろう。したがって、表面収差がない場合、何も視覚システムによって見られない。

[0021]Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．は、同社のＲＬ５０６４^５モデルに「組み合わせ」明視野／暗視野照明器を提供する。このデバイスは、明視野と暗視野とが独立して使用され得るコンパクトな筐体において、明視野照明と暗視野照明との二重の機能性を有する。しかしながら、生細胞のイメージングにおける問題は明らかである。この点において、染色された（すなわち、死んだ）細胞は、振幅物体として光を「吸収する」ことができるが、生細胞は、大部分が透明であり、光をほとんど吸収せず、相対的にわずかしか散乱させない。したがって、上記したように、暗視野画像は、蛍光画像のように自己発光性に見えることがある。この設計は、ＬＥＤから試料までの光を制御し、または焦点を合わせるために、レンズを使用しない。これは、デバイスが試料に極めて接近することを必要とし、これは、複雑なシステムにおいて好都合ではない。

[0022]胚評価の目的で胚のタイムラプスイメージングのために開発された全てのシステムは、上述したように、一方または他方のイメージングシステムだけに、すなわち、明視野または暗視野のいずれかに現在依存していることが、留意されるべきである。胚評価における明視野の進歩は多くあり、結果として、あらゆる知られているおよび現行の胚モフォロジー説明および品質評価システムは、明視野画像の使用に依存する。それは、倒立顕微鏡または立体顕微鏡による胚評価の最も一般的な方法であり、最も一般的な方法であった。それはまた、（ある程度の）細胞内の構造ならびに胚体内組織（例えば、内細胞塊と栄養外胚葉の外観、および細胞断片化の度合いとタイプ）についての観察を可能にする。

[0023]胚のモフォロジーおよび発達可能性（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の観察に関して言えば、顕微鏡システムについて複数の望ましい属性がある。望ましい属性は、以下のものを含む。

１．明視野顕微鏡検査照明方法と暗視野顕微鏡検査照明方法との両方を利用して、両方の技法のそれぞれのデータセットから獲得され得る組み合わされた情報を活用すること。明視野照明が生体試料の検査の業界標準であるが、暗視野照明の使用は、より大きなコントラストを可能にし、それは、胚のエッジを検出し、胚を強調するためのアルゴリズムに、より高い精度の情報を提供する。

２．商業上および臨床上の標準は、特定の制御された、かつ、反復可能な位置において照明の焦点を合わせるために、特にカスタマイズされた顕微鏡検査システムを必要とするであろう。

３．商業上の見解から、低コストの照明解決策が非常に望ましい。
４．顕微鏡検査システムが、好適には、構成要素類における複雑化なしに、暗視野顕微鏡検査と明視野顕微鏡検査との両方に適合可能であることも非常に望ましい。

５．暗視野照明および明視野照明のそれぞれに対して２つの特定の光源が要求され得るが、２つの別個の光源を、互いに分離させたままで、単一の構成要素類へと組み合わせることが、非常に求められる。

６．空間上の制約は不可避であり、そのため、空間上の制約に対処する解決策も非常に望ましい。
７．カスタム皿または生体試料ポッド形状の照明を提供すること。

８．胚に安全な光波長。
９．生体試料用の顕微鏡検査システムの性質を考えると、通常ならば必然的に湿度の高い環境に接する顕微鏡レンズ構造の熱管理を有することは、要件となり得る。

[0024]本明細書において説明される実施形態の目的は、関連技術のシステムの上記した短所のうちの少なくとも１つを克服し、もしくは緩和すること、または関連技術のシステムに対する有用な代替案を少なくとも提供することである。

[0025]１つの態様において、本発明は、顕微鏡検査を利用して、発達可能性について生体試料を評価する方法であって、この方法は、
タイムラプス測定間隔内で、生体試料の明視野画像と暗視野画像とを同時に捕捉するステップを含む、方法を提供する。

[0026]好適には、明視野画像と暗視野画像とを同時に捕捉するステップは、
暗視野光源または明視野光源を選択的に起動するステップと、
明視野および暗視野複合レンズシステムにより、暗視野光路または明視野光路をそれぞれ照明するステップと、
複合レンズシステムの焦点に配置された生体試料の暗視野照明または明視野照明タイムラプス画像をそれぞれ捕捉するステップであって、焦点は、暗視野光路および明視野光路に共通である、捕捉するステップと、
を含む。

[0027]好適には、暗視野光源および明視野光源は、互いに分離されている。好適には、暗視野光路および明視野光路は、互いに分離されている。
[0028]好適には、分離は、
光学的、
電気的、
熱的
のうちの１つまたは組み合わせである。

[0029]好適には、暗視野光源または明視野光源を選択的に起動するステップは、
ソフトウェア制御、
電気スイッチ制御、および、
機械スイッチ制御
のうちの１つまたは組み合わせによって、両光源を独立して制御するステップを含む。

[0030]好適には、本明細書における本方法は、
複数のタイムラプス測定からの捕捉された明視野画像と暗視野画像との組み合わせを含むデータセットを生成するステップと、
分析のために、データセットからの捕捉された画像のうちの１つまたは組み合わせを選択的に表示するステップと、
をさらに含む。

[0031]好適な実施形態において、タイムラプス測定間隔は、およそ５分間である。
[0032]別の態様において、本発明は、生体試料の選択的な明視野照明または暗視野照明のための光路ガイドであって、
明視野光源からの明視野照明の焦点を合わせて、明視野光路を形成するための第１のレンズと、暗視野光源からの暗視野照明の焦点を合わせて、生体試料の明視野画像および暗視野画像の同時の捕捉を可能にするために、明視野光路と同心円状に配置される第２の非球面レンズ構成とを有する複合レンズシステム
を備える、光路ガイドを提供する。

[0033]好適には、非球面レンズ構成は、環状非球面レンズを含む。
[0034]好適には、暗視野光路および明視野光路は、互いに分離されている。
[0035]好適には、本光路ガイドは、非球面レンズ構成と組み合わせて、暗視野照明路を明視野照明路から分離する円錐反射器をさらに備える。

[0036]好適には、複合レンズシステムの焦点は、暗視野光路および明視野光路の焦点と共通である。
[0037]さらなる態様において、本発明は、顕微鏡検査を利用して、発達可能性について生体試料を評価するための装置であって、
明視野光源と暗視野光源とを含む複合光源構成であって、明視野光源および暗視野光源は、互いに分離されている、複合光源構成と、
本明細書において説明されるような光路ガイドと
を備える、装置を提供する。

[0038]好適には、本装置は、光路ガイドの複合レンズシステムの焦点に配置された試料プラットフォームをさらに備える。
[0039]好適には、本装置は、
暗視野光源または明視野光源を選択的に起動するための切り替え手段と、
複合レンズシステムの焦点に配置された生体試料の暗視野照明または明視野照明のタイムラプス測定間隔内でタイムラプス画像をそれぞれ捕捉するためのタイムラプス測定手段であって、焦点は、暗視野光路および明視野光路に共通である、タイムラプス測定手段と
をさらに備える。

[0040]他の態様および好適な形態は、本明細書において開示されており、および／または、本発明の説明の一部を形成する、添付の特許請求の範囲において定義されている。
[0041]胚、またはより一般には、生体試料の発達を観察するために、明視野顕微鏡検査と暗視野顕微鏡検査との両方を使用しようと試みる従来技術には欠陥があるが、それでもなお、明視野が、形態分析を可能にする一方で、暗視野は、胚選択を改善するために良好なモフォロジー胚における重要で微妙な差異を検出することができ、ソフトウェアアルゴリズムも可能にするとすれば、暗視野観察と明視野観察とを組み合わせることは、より多くの情報が得られることを可能にし得る、という認識に本発明は由来する。

[0042]本発明の実施形態の適用可能性のさらなる範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、あくまでも例示として与えられていることが、理解されるべきである。なぜならば、本明細書における開示の趣旨および範囲内の様々な変更および変形は、この詳細な説明から当業者には明らかになるからである。

[0043]本発明の好適な実施形態および他の実施形態のさらなる開示、目的、利点および態様は、添付の図面を併用して、実施形態の下記の説明を参照することによって、当業者によってより良く理解され得る。添付の図面は、あくまでも例示として与えられており、したがって、本明細書における開示を限定しない。

従来技術のシステムに係る顕微鏡検査についての明視野照明と暗視野照明との比較を示す図である。 暗視野照明構成を示す、本発明の好適な実施形態に係る顕微鏡検査システムの断面図である。 明視野照明構成を示す、本発明の好適な実施形態に係る顕微鏡検査システムの断面図である。 図２および図３の顕微鏡検査システムのシステム構成要素の分解図である。 図４に示される分解図の構成要素を備える、組み立てられたモジュールの図であり、図２、図３および図４の実施形態の光学系の原位置の図であるが、図４の視点からおおよそ１８０°からの視点の図である。 本発明の好適な実施形態に係る、図２および図３の顕微鏡検査システムにより撮影された、生体試料の培養皿のウェル５および９それぞれからの暗視野試験画像を示す図である。 本発明の好適な実施形態に係る、図２および図３の顕微鏡検査システムにより撮影された、生体試料の培養皿のウェル５および９それぞれからの明視野試験画像を示す図である。 本発明の一実施形態に係る、選択的な暗視野および明視野照射用の同心円状に配置されたＬＥＤを備える照明源のためのプリント回路アセンブリ（ＰＣＡ）を示す図である。 例示的な従来技術の暗視野照明モジュールが、知られている培養器および培養計装に適合しないことを識別する、現行の培養器アセンブリの上に組み付けられた例示的な従来技術の暗視野照明モジュールを示す図である。 エッジの両側の影によって強調された、不十分な画像品質を提供する従来技術の暗視野システムを使用して照明される試料ウェルを示す図である。 ユーザまたは自動アルゴリズムによる胚生存性の評価を支援するために再検討のための十分な品質を提供する暗視野照明を使用して、好適な実施形態に従って捕捉された画像の図である。 知られている培養器および培養機器上の所要位置にある暗視野の従来技術の顕微鏡検査モジュールを示す図である。明視野照明空間エンベロープが、暗視野照明源の中心において強調されている。 代替の密閉オプションを備えた、本発明のさらなる実施形態に係る顕微鏡光学配置を示し、同様のレンズおよび照明構成要素を包含する組立プロセスを示す図である。

[0044]本発明の好適な実施形態の下記の説明は、複数の生体試料を収容するための試料ウェルを備えた培養皿内の胚／生体試料のイメージングのための、暗視野照明および明視野照明のうちの１つまたはこれらの組み合わせを提供する。

[0045]図２および図３を参照すると、胚用のタイムラプス培養器において使用するための組み合わされた暗視野および明視野照明器２００が示されている。明視野照明（図３においてＢＦとして最もよく示される）は、ＰＣＡ１７７（ただし、「ＰＣＡ」は、プリント回路アセンブリまたはＰＣＢＡ（Ｐｒｉｎｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｂｏａｒｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ：プリント回路基板アセンブリ）を指す）の上に搭載された光源１７５、好適にはＬＥＤを備え、ＰＣＡ１７７は、培養皿１６６に存在する試料の真上に存在する。この明視野ビームは、円筒状の光を、レンズ１１５を通って試料上に収束させるように、円筒の形状内に収容される。

[0046]明視野顕微鏡検査における進歩からの利益に加えて、胚評価用途における暗視野顕微鏡検査の利点は、胚／細胞輪郭およびエッジなどの外部詳細を検出するその能力にあり、その検出能力により、細胞の数およびサイズならびに胚サイズを検出するのによく適したものとなる。明視野観察タイプと暗視野観察タイプとの両方それ自体が、胚発達の見込みを評価するために別々に使用され得、かつ使用されてきたが、それらを組み合わせ、収集された全ての情報を利用するアルゴリズムの開発および適用を可能にすることは、本発明の実施形態をＩＶＦクリニックにとって格別に強力なツールにする。図２を特に参照すると、暗視野照明の場合、ＰＣＡ１７７上に搭載された光源１８０は、明視野光ビームと平行に、ただし、明視野照明光路に干渉し、または逸脱することなく、光を照らす。

[0047]序文において説明したようなＡｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．のシステムモジュールは、本発明のための好適な顕微鏡検査システム内で明視野照明を特に生成するために利用されてもよい。

[0048]好適な実施形態によれば、暗視野照明源１８０は、好適には、明視野照明源ＬＥＤ１７５の周りの２つの同心円状の輪内の４２個のＬＥＤである。ＬＥＤのこの構成における、１２０度ごとにある３つの２ｍｍの切れ目が、支持用の構造リブの包含を可能にする。図２においてＤＦとして最もよく示されるこの光ビームは、明視野照明のために使用されるカラー１８１の外側に収容される。この光は、反射器１７０によっても収容され、反射器１７０は、わずかにテーパを付けられており、光に環状の非球面レンズアセンブリ１６９を通過させる。これは、暗視野照明のための環状の光路を生成する。レンズ１６９は、試料／物体上に焦点が合わせられる、円錐形の、ただし環状でもあるビームを生成する。明視野照明ＬＥＤ１７５に電力が供給されない場合には、暗視野の形成が可能になり、その結果、明視野照明なしに、試料の後ろに暗い領域を生成する。

[0049]レンズ１１５および１６９は、生体試料上への各照明路の焦点を提供するための一致する焦点平面を提供するために特に選択される。したがって、レンズは、試料／物体が位置する明視野の場合と暗視野の場合との両方に一致する特定の位置へ光路を導くように、アセンブリ内に配置される。

[0050]レンズ１１５および１６９は、低コストである。この点において、暗視野非球面レンズアセンブリ１６９の中心は、明視野照明の設置のために、中心に約１４ｍｍの直径の穴部を有するように変更されている。低コストのレンズ構成、および複数のレンズの代わりの多数のレンズは、同じ照明を生成する、より小さく、かつ、より安い構成要素類を可能にする。

[0051]２つの別個の光ビームパスが互いから分離されている一方で、暗視野照明および明視野照明は、同じ軸を中心として同心円状に生成される。光学上は、光源は、図２および図３に示されるように、２つの別個のパスを進む。物理的な分離によって、暗視野領域からの光は、明視野領域に到着することができない。ＬＥＤ光源は、独立しており、個々に制御され得る。光路の構成は、互いに同心的である。ソフトウェアは、顕微鏡アセンブリによって焦点を変更することなく、暗視野から明視野へ切り替えることができる。

[0052]２つの光源は、同じＰＣＡ上に位置しており、好適には、ガスケットの使用によって、互いから分離される。一般に、光源は、ガスケットの使用によって分離される。なぜならば、２つの構成要素（ＰＣＢおよび機械加工されたカラー）の機械加工表面は、完全に平坦ではなく、それら表面を完全に平坦にすることは、コスト効率が良くないからである。したがって、柔らかい発泡材料であるガスケットが、２つの構成要素間の間隔を埋めるために間に置かれ得る。

[0053]２つの光路のこの分離が行われ得る別の手法は、電子機器アセンブリを接着剤に埋め込むこと（ｐｏｔ）、または電子機器アセンブリを接着剤で充填することであり、これは通常、腐食防止および衝撃保護のために使用される。接着剤／充填剤は、光および空気の密閉を生成するであろう。ただし、それは必ずしも容易に可逆的とは限らず、２つの構成要素を互いから取り外すことも可能にしない恒久的な変更となり得る。

[0054]代替的に、独立した集束アセンブリ間で光が伝わることを可能にしない限り、異なる材料が２つの構成要素間のガスケットに使用されてもよい。
[0055]これらの好適な実施形態では、分離の手段は、アセンブリ間で空気が伝わることも可能にするべきではない。

[0056]２つの光源の分離は、２つの別個のＰＣＢまたはＰＣＡ上にＬＥＤを置くことによっても達成され得、これは暗視野ＰＣＡの配置を可能にし、したがって、光はカラー内に収容され、カラーは、その上にキャップと、ＬＥＤへの電力供給を可能にするためにいくつかの電線が通過するための小さい空間のみを有する。

[0057]ＰＣＢに対して留められるガスケットの代わりに、Ｏリングが使用されてもよい（Ｏリングは、硬すぎることがあるので、一般には使用されない）。Ｏリングは、ＰＣＢの上に押し付けられ、暗視野光路から明視野光路への間で光源から漏れる光を遮蔽し、これは、暗視野が機能するように暗いままとなるように必要とされる。単一のＰＣＡは、両方の光源が同じＰＣＢ（プリント回路基板）に適合された状態で構成要素のコストが低減されることを可能にする。明視野光源と暗視野光源との両方の分離は、図４において最もよく示されるように、中央支持体３によって配置され、押し付けられるガスケットの使用によって、１つの構成要素上で得られて、明視野光源を暗視野光源から分離する。有利には、これは、複数の光源を備えた単一のＰＣＡの使用を可能にする単純な構成要素を提供する。

[0058]レンズ構成の空間上の制約は、試料ベッド／皿に対してレンズを近くに配置することを必要とする。非球面レンズアセンブリの使用は、複数のレンズが１つの適当な焦点へ光を集束させる要件を除去する。このように同じ軸上で、ＰＣＢ上で互いに同心的なＬＥＤの使用は、付加的な軸に従う光路を備えた暗視野照明用の反射表面よりも、設計のパッケージングを著しく小さくする。

[0059]顕微鏡光路の作用直径は、約１４ｍｍであり、この両側の１ｍｍ以内では照明が低下する。これは、非球面レンズを制限するために使用され、非球面レンズは、試料皿の形状に起因して生成される画像の明瞭さのために重要である。円錐形の光源は、皿内の全てのウェルを照明するのに十分に狭く、または広くすることができる。これは、円錐形の光ビームのサイズおよび形状ならびに機械加工された構成要素である反射器の形状によって、変更可能または選択可能であり、光を非球面レンズアセンブリへ導くことができる。試験中に、いくつかの形状の円錐反射器が試験されて、ここで使用される基本的な形状が生成された。最も効果的と分かった内部サイズは、約１４ｍｍの直径であり、外形はおよそ２４ｍｍであった。直径は、明視野レンズが適所に保持されることを可能にする構造リブによってのみ途切れさせられる。３つのリブは、１２０度分離して位置し、およそ２ｍｍの厚さである。構造リブの厚さをより小さくし、構造リブを削減することにより、暗視野照明のより均一な光円錐が可能になる。

[0060]特定の波長は、他の波長よりも試料に対して害が少ないことが分かった。この点において、ＬＥＤ波長が６２５ｎｍに近づけば近づくほど、照明の試料に対する弊害が減少する。したがって、選択されるＬＥＤは、６２５ｎｍにできる限り近いものである。

[0061]レンズの熱管理が必要とされる。チャンバへのつながりに起因して、チャンバはＧＥＲＩ特許において説明されているものと同じチャンバであり、この照明モジュールは、このチャンバの壁部へねじで留められ、次いで、Ｏリングを使用して密閉される。このＯリング密閉は、胚にとって適当な湿度範囲を維持するために、チャンバの湿気が漏れないように密閉するために使用され、この適当な湿度範囲は、部分的に温度でもあり、レンズ全域での温度および湿度の違いは、レンズ上での結露を引き起こし、結露は、光が通過する際に回折を引き起こし、したがって、光路を異ならせる。チャンバの一部は、断面図２および断面図３において見ることができる。培養皿１６６の真上の余白である。湿気は変動し、したがって、ＰＣＡは、チャンバの湿気から密閉される必要がある。この密閉は、いくつかのＯリング１７９の使用によって作られる。レンズの結露を生成しないように、レンズの温度の制御を維持するために、我々は、加熱要素の使用によってレンズの温度を積極的に制御しないが、我々は、温度の急な差異ではなく緩やかな変化を与えるために、材料を通じて温度が伝わることを可能にする材料を特に選んだ。レンズ全体の温度差、周囲の搭載構成要素の材料は、レンズの周りに良好な熱伝達を提供して、局所的に制限された温度変化を維持するように選択される。

[0062]試験は、明視野照明と暗視野照明との両方を備えた皿内で試料／胚の照明をシミュレーションするために行われた。皿上の反射パターンのいくつかの概念が、非球面レンズアセンブリへの試作反射ガイドの使用によって試験された。光源を「ガイドすること」は、様々な形状の円錐光の焦点を培養皿上へ合わせることを可能にする。試作の数回の反復は、照明が培養皿内の全てのウェルにわたって均一となることを可能にした。好適な実施形態の開発において、例えば、明瞭さまたは影を追求すること、および初期に採用された構成要素を使用することは、概念実証のための試験において反射器１７１を反復することにより、非球面レンズアセンブリ１６９および中心穴部の適当な直径の選択を可能にした。非球面レンズアセンブリ形状内で、最も良く適合する非球面レンズが既製の構成要素として選ばれ、次いで、その中心に穴部が機械加工されて、明視野光路が生成された。これは、ＢＦと現在分類されており、暗視野測定を可能にする光を遮蔽するためのパスとして使用されている。いくつかの試験画像は、添付の図面において示されており、図６は、試料培養皿のウェル５および９それぞれの暗視野画像を示し、図７は、試験中の同じ培養皿のウェル５および９それぞれの明視野画像を示す。

[0063]カスタム皿形状の照明は、カスタム皿の上の既存の障壁の周りの試料への特定の光方向および集束の使用により提供される。特定のレンズが使用されて、培養皿上の全ての試料を照明するための光ビーム形状が生成される。有利には、これは、皿形状に合わせて特にカスタマイズされて、最良の照明結果が達成された。好適な実施形態と共に使用される例示的なカスタム培養皿形状は、本出願人の公開された国際（ＰＣＴ）特許明細書ＷＯ２０１４／１３１０９１号において開示されているものである。本発明の好適な実施形態において有用な別の培養皿は、本出願人の公開された国際（ＰＣＴ）特許明細書ＷＯ２０１４／１０６２８６号において開示されているものである。ＷＯ２０１４／１３１０９１号において開示されているような培養皿形状を使用することにより、照明デバイスは、培養皿上の１つのウェル内の全てのマイクロウェルを照明するために使用されることを必要とされる。前述したように、Ａｕｘｏｇｙｎ，Ｉｎｃ．の照明モジュールは、培養皿上のウェル内のマイクロウェルの全てをはっきりと照明することができない。暗視野照明の特定の形状は、皿上の全てのマイクロウェルを照明すべきものであった。

[0064]図２に戻ると、本発明の一実施形態の断面図が示されており、暗視野照明のための構成を示す。図２に示される矢は、光ビームのパスを概算で表す。ＰＣＡ１７７は、基板に取り付けられたＬＥＤを有する。ＰＣＡ１７７の基板上のＬＥＤによって出力された光は、暗視野拡散器１７２を通って導かれ、暗視野拡散器１７２は、複数の暗視野源ＬＥＤから発せられる個々のスポットよりも均一な光を拡散する。次いで、光ビームは、円錐アウター（ｏｕｔｅｒ）１７０を通ってガイドされ、円錐アウター１７０は、非球面環状レンズアセンブリ１６９の表面へ光をガイドする。次いで、これは、培養皿１６６上に焦点を合わせられるべき光を収束させる。

[0065]図３は、本発明の実施形態の図２と同じ断面図を示し、この例では、図３の矢は、明視野照明の光路を描いている。明視野の場合には、ＰＣＡ１７７は、中心に搭載された単一のＬＥＤを有しており、この単一のＬＥＤは、明視野照明のための光を、培養皿上および試料を含むウェルの真上に導く。光は、ＰＣＡに対して留められる光絶縁体１７８によって中心円筒内に示され、収容される。光は、光の単一の広がりを生成するように拡散する明視野拡散器１７３を通って導かれる。光ビームは、今やカラー内に収容されており、培養皿１６６上に光の焦点を合わせる両凸レンズ１１５を通って導かれる。

[0066]図４は、図２および図３に示されるような好適な実施形態の光学系のアセンブリの分解図を示す。図４の分解図において、ＰＣＡ１７７は、１２０度ごとにある、３つのおよそ２ｍｍの間隔を備えた、円形構成の４２個の暗視野源ＬＥＤ１８０を示し、この３つの間隔は、中心支持体３上の支持リブと一致する。暗視野源ＬＥＤ１８０の配置、または実際には、１つ／複数の明視野源ＬＥＤ１７５の配置は、他の形態で構成されてもよいが、本発明の実施形態に係る暗視野照明に適した照明を依然として提供することが、当業者によって認識されるであろう。

[0067]同じＰＣＡ基板１７７上に明視野照明光源と暗視野照明光源と（それぞれ１７５と１８０）の両方を有する好適な実施形態の円筒状かつ同心的な設計は、非球面レンズアセンブリ１６９と共に利用されて、両方のタイプの照明用の試料ベッド上へ適切に狭められ、焦点を合わせられる環状の光ビームを提供し得る。これは、培養皿上の試料の鮮明な照明を提供しつつ、非常に小さな閉鎖空間内に適合するコンパクトな設計を可能にする。皿へのカスタマイズされた距離は、試料ベッドへの光の集束を提供するための２つのレンズ構成の選択によって適応される。レンズの取り付け位置は、試料の照明にとって重要である。取り付け位置は、光が試料を照明するように、レンズの所定の焦点距離の距離と試料からの距離とが同じであることを必要とされる。焦点距離は、光の焦点が合わせられるレンズからの距離である。取り付け位置は、厳密な位置またはレンズが位置する棚の位置を指定する別の手法である。これの利点は、試料の照明を可能にするために、低コストのレンズが利用可能になり、適切になるということである。この点において、低コストの照明解決策が、好適な実施形態においてＰＣＡ１７７として提供され、ＰＣＡ１７７は、両方の光（明視野と暗視野）源を収容する。さらに、レンズは、好適には、コストを低減するためにアクリルから作製される。コンパクトなアセンブリは、必要とされるレンズのサイズを低減し、光の焦点を合わせるために使用されるレンズの数も低減する。したがって、有利には、明視野光源と暗視野光源との両方が、部分数およびコストを緩和するために同じＰＣＡ上に存在する。

[0068]独立した光源は、ソフトウェアを通じて、明視野照明方法と暗視野照明方法との間の切り替えを可能にするように制御され得る。有利には、機械的な構成要素を移動させることは、必要とされない。さらに、フィルタまたは遮蔽構成要素を所定の位置に移動させることは、必要とされない。

[0069]好適な実施形態の同心円状のレンズおよび照明源の構成は、空間的に制約された領域内にシステムが実装されることを可能にする。同心円状の照明源は、暗視野画像または明視野画像のいずれかを独立して捕捉すること、見ること、または再検討することを可能にするように、明視野照明と暗視野照明との両方が独立して制御されることを必要とする。好適な実施形態では、独立した電子的なプログラム可能なソフトウェア制御の使用は、各光源を独立して選択するために使用され得る。同じフットプリント内へ照明源とレンズとを組み合わせることによって、明視野画像または暗視野画像のいずれかを選択し、見るための機械的動作が必要とされない。

[0070]好適な実施形態において、図３の照明アセンブリは、約２６ｍｍの鉛直高さで実装される。焦点距離、被験試料の位置、および必要とされる照明の領域を含む全体的な設計上の配慮、レンズ選択ならびに設計は、アセンブリのサイズを低減するために、または増加させるために変更され得ることが、当業者によって認識されるであろう。好適な実施形態において、構成要素は、機器アセンブリ全体、顕微鏡、カメラおよび胚皿を照明し、これらの仕様と一致するように、特に設計され、選択され得る。組み合わされ、幾何学的に同心円状の照明源、レンズ構成要素、制御ＰＣＡおよびソフトウェアの原理は、この好適な実施形態以外の幅広い用途に適合するように変更されてもよい。

[0071]好適な実施形態では、および図８を参照すると、単一の中央の発光ダイオード（ＬＥＤ）１７５は、明視野画像を捕捉したり、見たり、または再検討したりするための照明源として使用される。明視野ＬＥＤ１７５は、明視野拡散器１７３へ、および両凸レンズ１１５を通って導かれる。中央のＬＥＤの周りには、ＬＥＤ１８０のアレイが同心円状に存在し、暗視野画像を捕捉したり、見たり、または再検討したりするための照明を生成するために使用される。ＬＥＤ１８０の外側のリングは、均一な光のリングを生成するために使用され、この光のリングは、好適な実施形態において、拡散器１７２を通って、環状非球面レンズアセンブリ１６９内へ渡される。

[0072]タイムラプス画像捕捉は、従来のタイムラプス測定と同じように、好適な実施形態の暗視野および明視野複合顕微鏡レンズアセンブリを用いて実行され得るが、一方では試料の暗視野照明と、他方では暗視野照明との間での選択的な切り替えが可能であり、試料をどちらか１つの光学配置へ移動させる必要がない、またはどちらか１つの照明視野用の光学アセンブリを再配置するために時間をかける必要がない、というさらなる利益を有する。

[0073]また、明視野観察と暗視野観察との両方が実質的にちょうど同時に（数秒以内に）行われ、連続的に記録されるという事実は、著しい変化（例えば、前核膜崩壊）が数分以内に発生し得る重要な時に、人間の胚の急速に発達する性質を考慮に入れる、高度なアルゴリズムの開発を可能にする。

[0074]好適な実施形態において、タイムラプス対応の胚培養器は、以下の有利な特徴を備える。
・組み合わされた暗視野／明視野照明源
・上述したような組み合わせレンズアセンブリおよび非球面レンズの特定構造
・暗視野源および明視野源は、独立制御を有しており、この独立制御は、ソフトウェア、電子的、機械的のうちの１つであってもよい
・光の相互汚染を可能にしないように光源を分離するための能力
・チャンバ環境条件から電子機器／光学系を分離するための能力
・暗視野照明に焦点を合わせるための特定の円錐設計−説明するか？
・胚への害を低減するように特に選ばれた照明波長
・暗視野照明のためのＬＥＤのリング
・明視野画像と暗視野画像との両方の自動的な捕捉
・前記培養器ソフトウェアプラットホーム上で明視野画像と暗視野画像との両方を再検討するための能力
・胚に対する照明器の位置
・手動の介入または環境的に制御されたチャンバからの胚の除去を必要とすることなく、実質的に同じ時点において両方の画像を再検討することを可能にする、暗視野画像および明視野画像の選択的な表示。ＤＦ／ＢＦの両方の捕捉および表示は、いずれのユーザも両方の画像を手動で再検討して、使用されるべき胚の生存性について、より良い成果を得ることを可能にする。
・着床のために最適な胚の選択を支援するための、明視野と暗視野との両方の自動解析。

[0075]本発明は、その特定の実施形態に関して説明されてきたが、本発明はさらなる変形が可能であることが理解されるであろう。本出願は、本発明の原理に一般に従った、本発明の任意のバリエーション、用途、または適応をカバーするように意図されており、本開示からのそのような逸脱を、本発明が関係する技術において知られているまたは慣行的な実施に収まるものとして、および前述された本質的な特徴に適用され得るものとして含む。

[0076]本発明は、本発明の本質的特徴の趣旨から逸脱することなく、いくつかの形態において具現化され得るので、上述した実施形態は、別段の定めがない限り、本発明を限定するべきではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲において定義されるように、本発明の趣旨および範囲内で広く解釈されるべきことが、理解されるべきである。説明された実施形態は、あらゆる点において、あくまでも例示として考慮されるべきであり、制限的に考慮されるべきではない。

[0077]様々な変形および均等な構成は、本発明の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。したがって、特定の実施形態は、本発明の原理が実施され得る多くの手法の例証であることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲において、ミーンズ・プラス・ファンクションの条項は、定義された機能を行うものとしての構造、および構造的な均等物だけでなく、均等な構造をもカバーすることが意図される。例えば、釘とねじとは、釘が、木製の部品を一緒に固定するために円筒形の面を使用するのに対して、ねじは、木製の部品を一緒に固定するために螺旋形の面を使用するという点において、構造的な均等物ではないかもしれないが、木製の部品を留める環境において、釘とねじとは均等な構成である。

[0078]「サーバ」、「セキュアサーバ」という用語または同様の用語が本明細書において使用される場合、通信デバイスは、文脈上他の解釈を必要としない限り、通信システム内で使用され得るものと説明され、本発明を任意の特定の通信デバイスタイプに限定するように解釈されるべきでないことが、留意されるべきである。したがって、通信デバイスは、限定なしに、セキュアであっても、またはセキュアでなくてもよい、ブリッジ、ルータ、ブリッジルータ（ルータ）、スイッチ、ノード、または他の通信デバイスを含んでもよい。

[0079]本発明の様々な態様を実証するために、フローチャートが本明細書において使用される場合、そのフローチャートは、本発明を任意の特定の論理フローまたは論理実装例に限定するように解釈されるべきでないことが、さらに留意されるべきである。説明された論理は、全体的な結果を変化させることなく、または別の形で本発明の真の範囲から逸脱することなく、異なる論理ブロック（例えば、プログラム、モジュール、関数またはサブルーチン）へ分割されてもよい。大抵、論理素子は、全体的な結果を変化させることなく、または別の形で本発明の真の範囲から逸脱することなく、追加され、変形され、省略され、異なる順序で実行され、または異なる論理構造（例えば、論理ゲート、ルーピングプリミティブ、条件付きロジック、および他の論理構造）を使用して実装されてもよい。

[0080]本発明の種々の実施形態は、プロセッサ（例えば、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、デジタル信号プロセッサ、または汎用コンピュータ、さらには任意の商用プロセッサを、本発明の実施形態を実施するために、システム内において単一のプロセッサ、直列構成プロセッサ、または並列構成プロセッサのいずれかとして使用することが可能であり、そのようなものとして、商用プロセッサの例は、Ｍｅｒｃｅｄ（商標）、Ｐｅｎｔｉｕｍ（商標）、Ｐｅｎｔｉｕｍ ＩＩ（商標）、Ｘｅｏｎ（商標）、Ｃｅｌｅｒｏｎ（商標）、Ｐｅｎｔｉｕｍ Ｐｒｏ（商標）、Ｅｆｆｉｃｅｏｎ（商標）、Ａｔｈｌｏｎ（商標）、ＡＭＤ（商標）等が含まれるが、これらに限定されない）と共に使用するコンピュータプログラムロジック、プログラマブルロジックデバイス（例えば、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または他のＰＬＤ）と共に使用するプログラマブルロジック、個別部品、集積回路（例えば、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ））または、これらの任意の組み合わせを含む他の任意の手段を含む、様々な多数の形態において具現化され得る。本発明の例示的な実施形態において、ユーザとサーバとの間の通信のほとんど全ては、オペレーティングシステムの制御下で、コンピュータ実行可能な形式に変換され、それ自体コンピュータ読取可能な媒体に保存され、マイクロプロセッサによって実行されるコンピュータプログラム命令のセットとして実装される。

[0081]本明細書において説明した機能性の全部または一部を実装するコンピュータプログラムロジックは、ソースコード形式、コンピュータ実行可能な形式、および様々な中間形式（例えば、アセンブラ、コンパイラ、リンカー、またはロケータによって生成された形式）を含む、様々な形式で具現化され得る。ソースコードは、様々なプログラミング言語（例えば、オブジェクトコード、アセンブリ言語、またはＦｏｒｔｒａｎ、Ｃ、Ｃ＋＋、ＪＡＶＡ（登録商標）、もしくはＨＴＭＬ等の高級言語。さらに、本発明の実施形態を実装するために使用可能であり、様々なオペレーティングシステムまたは動作環境において使用するための、数百の利用可能なコンピュータ言語が存在しており、その中でより一般的なものは、Ａｄａ、Ａｌｇｏｌ、ＡＰＬ、ａｗｋ、Ｂａｓｉｃ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃｏｎｏｌ、Ｄｅｌｐｈｉ、Ｅｉｆｆｅｌ、Ｅｕｐｈｏｒｉａ、Ｆｏｒｔｈ、Ｆｏｒｔｒａｎ、ＨＴＭＬ、Ｉｃｏｎ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ、Ｌｉｓｐ、Ｌｏｇｏ、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ、ＭａｔＬａｂ、Ｍｉｒａｎｄａ、Ｍｏｄｕｌａ−２、Ｏｂｅｒｏｎ、Ｐａｓｃａｌ、Ｐｅｒｌ、ＰＬ／Ｉ、Ｐｒｏｌｏｇ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｒｅｘｘ、ＳＡＳ、Ｓｃｈｅｍｅ、ｓｅｄ、Ｓｉｍｕｌａ、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、Ｓｎｏｂｏｌ、ＳＱＬ、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、Ｖｉｓｕａｌ Ｃ＋＋、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、およびＸＭＬである。）のうち任意のものにおいて実装される一連のコンピュータプログラム命令を含み得る。ソースコードは、様々なデータ構造および通信メッセージを定義し、使用し得る。ソースコードは（例えば、インタープリタを介して）コンピュータ実行可能な形式であってもよく、または（例えば、トランスレータ、アセンブラ、もしくはコンパイラを介して）コンピュータ実行可能な形式に変換されてもよい。

[0082]コンピュータプログラムは、任意の形式（例えば、ソースコード形式、コンピュータ実行可能な形式、または中間形式）で、恒久的または一時的に、半導体メモリデバイス（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、もしくはプログラム可能なフラッシュＲＡＭ）、磁気メモリデバイス（例えば、ディスケットもしくは固定ディスク）、光学メモリデバイス（例えば、ＣＤ−ＲＯＭもしくはＤＶＤ−ＲＯＭ）、ＰＣカード（例えば、ＰＣＭＣＩＡカード）、または他の記憶装置などの、有形の記憶媒体に固定され得る。コンピュータプログラムは、アナログ技術、デジタル技術、光技術、無線技術（例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標））、ネットワーク技術、およびインターネットワーク技術を含むが、決してこれらに限定されない、様々な通信技術のうちの任意のものを用いて、コンピュータに伝達可能な信号において任意の形式で固定され得る。コンピュータプログラムは、付随する印刷文書または電子文書を伴う取り外し可能な記憶媒体（例えば、市販のソフトウェア）として任意の形式で頒布されてもよく、コンピュータシステムにプリインストールされてもよく（例えば、システムのＲＯＭ上に、もしくは固定ディスク上に）、または、サーバもしくは電子掲示板から通信システム（例えば、インターネットもしくはワールドワイドウェブ）上で頒布されてもよい。

[0083]本明細書において説明した機能性の全部または一部を実装するハードウェアロジック（プログラマブルロジックデバイスと共に使用するプログラマブルロジックを含む）は、従来の手動の方法を用いて設計してもよく、コンピュータ支援設計（ＣＡＤ）、ハードウェア記述言語（例えば、ＶＨＤＬもしくはＡＨＤＬ）、またはＰＬＤプログラミング言語（例えば、ＰＡＬＡＳＭ、ＡＢＥＬ、もしくはＣＵＰＬ）などの様々なツールを用いて電子的に設計され、捕捉され、シミュレーションされ、または文書化されてもよい。ハードウェアロジックはまた、本発明の実施形態を実装するための表示画面に組み込まれてもよく、この表示画面は、セグメント化された表示画面、アナログ表示画面、デジタル表示画面、ＣＲＴ、ＬＥＤ画面、プラズマ画面、液晶ダイオード画面等であってもよい。

[0084]プログラマブルロジックは、恒久的または一時的に、半導体メモリデバイス（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、もしくはプログラム可能なフラッシュＲＡＭ）、磁気メモリデバイス（例えば、ディスケットもしくは固定ディスク）、光学メモリデバイス（例えば、ＣＤ−ＲＯＭもしくはＤＶＤ−ＲＯＭ）、または他のメモリデバイスなどの、有形の記憶媒体に固定されてもよい。プログラマブルロジックは、アナログ技術、デジタル技術、光技術、無線技術（例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標））、ネットワーク技術、およびインターネットワーク技術を含むが、決してこれらに限定されない、様々な通信技術のうちの任意のものを用いてコンピュータに伝達可能な信号において固定されてもよい。プログラマブルロジックは、付随する印刷文書または電子文書を伴う取り外し可能な記憶媒体として頒布されてもよく（例えば、市販のソフトウェア）、コンピュータシステムにプリインストールされてもよく（例えば、システムのＲＯＭ上に、もしくは固定ディスク上に）、または、サーバもしくは電子掲示板から通信システム（例えば、インターネットもしくはワールドワイドウェブ）を通じて頒布されてもよい。

[0085]「備える／備えている」および「含む／含んでいる」は、本明細書において使用される場合、述べられた特徴、整数、ステップ、または構成要素の存在を特定するものとみなされ、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、構成要素、または、これらのグループの存在または追加を排除しない。したがって、文脈上明らかに他の解釈を必要としない限り、明細書および特許請求の範囲を通じて、「備える」、「備えている」、「含む」、「含んでいる」などの単語は、排他的または網羅的な意味とは対照的に、包含的な意味で、すなわち、「含んでいるが、限定されるものではない」という意味で解釈されるべきものである。

Claims (8)

1. 顕微鏡検査を利用して、発達可能性について生体試料を評価する方法であって、
   タイムラプス測定間隔内で、生体試料の明視野画像と暗視野画像とを同時に捕捉するステップ
   を含み、
   明視野画像と暗視野画像とを同時に捕捉する前記ステップは、
   明視野光源、または前記明視野光源の周囲に同心円状に配置される暗視野光源を選択的に起動するステップと、
   組み合わされた暗視野および明視野照明器の明視野および暗視野複合レンズシステムにより、暗視野光路または明視野光路をそれぞれ照明するステップであって、前記複合レンズシステムは、前記明視野光源からの明視野照明の焦点を合わせて、明視野光路を形成するための第１のレンズと、前記暗視野光源からの暗視野照明の焦点を合わせて、暗視野光路を形成するとともに、前記生体試料の明視野画像および暗視野画像の同時の捕捉を可能にするために、前記明視野光路と同心円状に配置される第２の非球面レンズ構成と、前記非球面レンズ構成と組み合わせて、前記暗視野光路を前記明視野光路から分離する円錐反射器と、を有する、照明するステップと、
   前記複合レンズシステムの焦点に配置された生体試料の暗視野照明または明視野照明のタイムラプス画像をそれぞれ捕捉するステップであって、前記焦点は、前記暗視野光路および前記明視野光路に共通である、捕捉するステップと
   を含む、方法。
2. 前記暗視野光源および前記明視野光源は、互いに分離されている、請求項１に記載の方法。
3. 前記暗視野光路および前記明視野光路は、互いに分離されている、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記分離は、
   光学的、
   電気的、
   熱的
   のうちの１つまたは組み合わせである、請求項２または３に記載の方法。
5. 明視野光源、または前記明視野光源の周囲に同心円状に配置される暗視野光源を選択的に起動する前記ステップは、
   ソフトウェア制御、
   電気スイッチ制御、および、
   機械スイッチ制御
   のうちの１つまたは組み合わせによって、前記両光源を独立して制御するステップを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
6. 複数のタイムラプス測定から捕捉された明視野画像と暗視野画像との組み合わせを含むデータセットを生成するステップと、
   分析のために、前記データセットから捕捉された画像のうちの１つまたは組み合わせを選択的に表示するステップと
   をさらに含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
7. 前記タイムラプス測定間隔は、およそ５分間である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
8. 生体試料を培養するように適合された装置であって、
   所定の命令セットに従って動作するように適合されたプロセッサ手段
   を備え、
   前記命令セットと共に、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法のステップを行うように適合される装置。