JP5435432B2 - タンパク質、ペプチド、および他の分子のｆ−１８標識のための改良された方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、米国特許出願第１１／９６０，２６２号（２００７年１２月１９日出願）の一部継続出願であり、左記は米国仮特許出願第６０／８８４，５２１号（２００７年１月１１日出願）の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での恩典を主張する。これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

ある実施形態において、本発明は、インビボ画像化に有用なペプチドをＦ−１８で標識する簡単な方法に関する。Ｆ−１８標識ペプチドの好ましい比放射能は、患者への投与時に、１，０００〜２，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌであると考えられる。１００〜数万Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲の比放射能も有用であると考えられる。ある画像化用途にはより高い比放射能が好ましいが、他の代替の実施形態では、より低い比放射能のＮＯＴＡ（ｌ，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−三酢酸）または別のキレート部分との金属−Ｆ−１８錯体が、例えば、血流を画像化するための腎血流画像化剤としてまたは心臓および脳の画像化剤のために有用であり得る。好ましくは、Ｆ−１８標識は、未標識ペプチドを標識ペプチドから分離するための精製工程を必要とせずに達成される。より好ましくは、Ｆ−１８標識ペプチドは、例えば、ヒト血清中などの、インビボ条件下で安定である。

陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）による画像化によって、ＰＥＴ画像からの高い解像度と定量性が得られる。ペプチドまたは他の小分子は、陽電子放射体（いくつか挙げると^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^６６Ｇａ、^６８Ｇａ、^７６Ｂｒ、^９４ｍＴｃ、^８６Ｙ、および^１２４Ｉ）で標識することができる。同位体の核から放射される陽電子は、使用する同位体によって異なるエネルギーで放出される。陽電子が１個の電子と反応すると、２個の５１１ｋｅＶのガンマ線が反対方向に放射される。放出陽電子のエネルギーは、陽電子が電子に衝突して消滅するまでに移動する平均距離を制御する。放出エネルギーが高ければ高いほど、陽電子は電子と衝突するまでにより大きく移動する。ＰＥＴカメラで撮影される２個の５１１ｋｅＶのガンマ線を発生するまでに陽電子が標的部位から移動する距離を最小にするために、ＰＥＴ同位体に適した低放出エネルギーが望ましい。陽電子を放射する多くの同位体は、その崩壊系列において、ガンマ線、アルファ粒子、またはベータ粒子などの他の放射物をも有する。線量測定上のいかなる問題も最小限に抑えられるように純粋な陽電子放射体であるＰＥＴ同位体を有することが望ましい。

同位体をターゲッティング分子に付着させ、その産物を分析し、それを患者に注射し、その産物を局在化させ、標的以外の組織から除去し、その後、画像化することができるように、半減期は長くなければならないので、同位体の半減期も重要である。半減期が非常に長い場合、比放射能は、明瞭な画像に十分な光子を得るほど高くなくてもよく、半減期が非常に短い場合、製造、商品流通、および生体分布に必要な時間が足りない可能性がある。Ｆ−１８（β^＋、６３５ｋｅＶ、９７％、ｔ_１／_２ １１０分）は、陽電子放射エネルギーが低く、側方放射がなく、かつ半減期が好適であるために、最も広く使用されているＰＥＴ放射同位体のうちの１つである。Ｆ−１８は、高比放射能を伴って生成される。ターゲッティング用の分子に同位体を付着させると、通常それに付随して、何らかの未反応のターゲッティング剤が生じるが、これは、放射性標識産物と比較してモル大過剰で存在することが多い。通常、標識産物と未標識産物はインビボで同じ標的を奪い合うことができるので、コールドのターゲッティング剤の存在によって、ターゲッティング剤の実効比放射能が低下する。非常に取込みが高い分子（例えば、２−フルオロ−２−デオキシグルコース（ＦＤＧ））にＦ−１８を付着させる場合、実効比放射能はそれほど重要でない。しかしながら、標識ペプチドで受容体をターゲッティングするかまたは利用できる結合部位の数が限られた免疫ＰＥＴプレターゲッティング研究を実施する場合、コールドのターゲッティング剤は、過剰に存在すると、放射性標識されたターゲッティング剤の取込みを阻止する可能性があると考えられる。

従来のペプチドのＦ−１８標識は、低い比放射能で試薬を標識し、この試薬をＨＰＬＣ精製し、その後、対象とするペプチドにコンジュゲートする必要がある。コンジュゲートは、所望の比放射能の標識ペプチドを得るためにコンジュゲートした後に再精製されることが多い。１つの例は、Ｐｏｅｔｈｋｏら（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２００４；４５：８９２−９０２）の標識法であり、この方法では、まず４−［^１８Ｆ］フルオロベンズアルデヒドを合成および精製し（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｊ．Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９９０；ＸＸＶＩＩＩ：１１８９−１１９９）、その後、ペプチドにコンジュゲートする。その後、ペプチドコンジュゲートをＨＰＬＣで精製し、コンジュゲーションを完了させるために使用した過剰なペプチドを除去する。仮にＦ−１８の半減期が長ければ、２つの反応と精製は問題とならないであろう。しかしながら、Ｆ−１８の半減期はわずか２時間であり、そのため、Ｆ−１８をペプチドに付着させるのに必要な操作全てが、かなりの負担となる。

これらの方法は、退屈な行為であり、標識産物を産生するように特に設計された装置の使用と専門のプロの化学者の尽力を必要とする。それらは、臨床の場でルーチンに使用し得るキット製剤ではない。検出および／または画像化のための好適な比放射能およびインビボ安定性を有するターゲッティングコンストラクトを生じさせる一方で、特殊な装置または高度に訓練された人員に対する必要性を最小限に抑え、かつ技師の高レベル放射能への被爆を減らす、迅速かつ簡単なターゲッティング部分（例えば、タンパク質またはペプチド）のＦ−１８標識方法が必要とされている。さらに、このような新規の方法を実施するのに必要な組成物を提供し得る包装済みキットが必要とされている。

フッ素は、事実上全ての他の元素に結合し、それらの結合のうちのいくつかは比較的安定である。金属結合配位子を有するペプチドは、安定にかつ非常に高い比放射能で放射性金属に結合することが知られている。本方法で利用された手法は、まずＦ−１８を金属に結合させ、その後、このＦ−１８金属錯体をペプチド上の配位子とキレート化させることであった。次の問題は、どの金属（または他の元素、例えば、ホウ素）を選ぶかということであった。文献を素早く検索した上で、ＩＩＩＡ族の元素（ホウ素、アルミニウム、ガリウム、インジウム、およびタリウム）が第一選択であった。リチウムも有用である可能性がある。

あるいは、まず金属原子または他の原子をペプチドに付着させて、その後、Ｆ−１８を付加することも可能である。第二の手法は、例えば、フッ化ホウ素結合に、より有利に働く可能性がある。

フッ化アルミニウム錯体は、インビトロで安定であることが報告されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９；３８：４７６５−４６６０；Ａｎｔｏｎｎｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：６７１０−６７１８）。フッ化アルミニウムは、骨および歯のエナメル質に取り込まれるようになるので、この錯体は、インビボでも安定であることができる（Ｌｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２００３；１４：１００−１１４）。

送達分子と細胞または組織の標的受容体の間のリガンド−受容体結合相互作用に影響を及ぼさないで修飾し得る誘導体化可能な基を含む限りにおいて、画像化目的でＦ−１８を付着させるためにほとんど全ての送達分子を使用することができるということを当業者は理解するであろう。下記の実施例はＦ−１８標識されたペプチド部分に関するものであるが、多くの他の種類の送達分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、血管新生因子、抗血管新生因子、免疫モジュレーター、タンパク質、核酸、抗体、抗体断片、薬物、インターロイキン、インターフェロン、オリゴ糖、多糖、脂質など）をＦ−１８標識し、画像化目的に利用してもよい。同様に、画像化し得る疾患または病気の種類は、この疾患または病気と関連する細胞または組織をターゲッティングするための好適な送達分子の利用可能性によってのみ限定される。下記の実施例で例示するように、多くのこのような送達分子が知られている。例えば、罹患した組織または標的（例えば、癌）に結合する任意のタンパク質またはペプチドを、開示された方法によってＦ−１８で標識し、検出および／または画像化に使用することができる。ある実施形態において、このようなタンパク質またはペプチドとして、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する抗体または断片を挙げることができるが、これらに限定されない。任意の公知のＴＡＡ結合抗体または抗体断片を、記載された方法によってＦ−１８で標識し、例えば、ＰＥＴ走査または他の公知の技術によって、腫瘍の画像化および／または検出に使用し得る。

下記のある実施例において、例示的なＦ−１８標識ペプチドは、二重特異性抗体もしくは抗体断片または多重特異性抗体もしくは抗体断片を利用するプレターゲッティング法におけるターゲッティング可能なコンストラクトとして、画像化目的のために有用であり得る。この場合、この抗体または断片は、疾患または病気と関連する標的（例えば、腫瘍関連抗原もしくは自己免疫疾患関連抗原、またはウイルス、細菌、真菌、もしくは他の微生物などの病原性微生物によって産生もしくは提示される抗原）のための１つ以上の結合部位を含む。第二の結合部位は、ターゲッティング可能なコンストラクトに特異的に結合する。二重特異性抗体または多重特異性抗体を用いるプレターゲッティング法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，９６２，７０２号を参照されたく、これは、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）。同様に、ＨＳＧ（ヒスタミンスクシニルグリシン）に結合する６７９モノクローナル抗体などの、ターゲッティング可能なコンストラクトに結合する抗体またはその断片も、当技術分野において周知である（同上）。一般に、プレターゲッティング法では、二重特異性抗体または多重特異性抗体をまず投与し、細胞または組織の標的抗原に結合させる。未結合抗体が血液循環から除去されるまでの適当な時間の後、例えば、Ｆ−１８標識されたターゲッティング可能なコンストラクトが患者に投与され、標的細胞または標的組織に局在化した抗体に結合し、その後、例えば、ＰＥＴ走査によって、画像が撮影される。

例示的な実施形態において、非ペプチド性受容体ターゲッティング剤（例えば、葉酸）をＮＯＴＡにコンジュゲートし、その後、例えば、ＮＯＴＡに結合するＦ−１８金属錯体で標識することができる。このような非ペプチド性受容体ターゲッティング剤としては、例えば、インテグリンα_vβ₃受容体の非ペプチドアンタゴニストである、ＴＡ１３８を挙げることができる（Ｌｉｕら，２００３，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１４：１０５２−５６）。ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、またはＦ−１８金属錯体用の別のキレート剤にコンジュゲートすることができる当技術分野で公知の類似の非ペプチド性ターゲッティング剤を、特許請求された方法で利用してもよい。ソマトスタチン受容体ターゲッティング剤であるＩｎ−ＤＴＰＡオクトレオチド（ＴＹＣＯ（登録商標））のような、他の受容体ターゲッティング剤が当技術分野で公知である。以下で考察するように、Ｆ−１８金属錯体を、潜在的にＤＴＰＡを用いてキレート化させ、画像化目的に使用することができる。ＮＯＤＡＧＡＴＯＣペプチドは、ソマトスタチン受容体ターゲッティングのためにＡｌＦ−１８で標識することができる（Ｅｉｓｅｎｗｉｅｎｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２００２，１３（３）：５３０−４１）。金属キレートを用いる他の受容体ターゲッティングによる画像化法は当技術分野で公知であり、特許請求された方法の実施で利用することができる（例えば、Ａｎｄｒｅら，２００２，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８８：１−６；Ｐｅａｒｓｏｎら，１９９６，Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｃｈｅｍ．３９：１３６１−７１参照）。

ＰＥＴ走査によるＦ−１８画像化のための画像化技術および装置も当技術分野で周知であり（例えば、米国特許第６，３５８，４８９号；同第６，９５３，５６７号；Ｐａｇｅら，Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１：９１１−９１９，１９９４；Ｃｈｏｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５：５３２３−５３２９，１９９５；Ｚａｌｕｔｓｋｙら，Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．，３３：５７５−５８２，１９９２を参照）、任意のこのような公知のＰＥＴ画像化技術または装置を利用し得る。

下記の実施例はＰＥＴ画像化を目的としたＦ−１８金属錯体の使用を示しているが、安定な金属−フッ素錯体（例えば、非放射性のＡｌ−２７錯体およびＦ−１９錯体）を、ＮＯＴＡまたは他のキレート剤に結合させ、ＭＲＩ造影剤として使用されるペプチドまたは他のターゲッティング剤に付着させることもできるということを当業者は理解するでろう。ＡｌＦ
ＮＯＴＡ錯体をＭＲＩ画像化用のポリマーに付着させることもできる。ＡｌＦ ＮＯＴＡ誘導体をＰＡＲＡＣＥＳＴ ＭＲＩ画像化剤として使用することができる（Ｗｏｅｓｓｎｅｒら，Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．２００５，５３：７９０−９９）。

以下の図は、本発明の特定の実施形態を説明するために含まれるものであり、特許請求された内容の範囲に関して限定するためのものではない。
例示的なペプチドＩＭＰ２７２。 例示的なペプチドＩＭＰ２８８。 例示的なペプチドＩＭＰ３２６。 例示的なペプチドＩＭＰ３２９。 例示的なペプチドＩＭＰ３３１。 例示的なペプチドＩＭＰ３３２。 例示的なペプチドＩＭＰ３３３。 例示的なペプチドＩＭＰ３３４。 例示的なペプチドＩＭＰ３４９。 例示的なペプチドＩＭＰ３６８。 例示的なペプチドＩＭＰ３７５。 例示的なペプチドＩＭＰ３８４。 例示的なペプチドＩＭＰ３８６。 例示的なペプチドＩＭＰ３８９。 例示的なペプチドＩＭＰ４４９。 追加の例示的なペプチドＩＭＰ４２２、ＩＭＰ４２６、およびＩＭＰ４２８。 例示的なＮＯＴＡ誘導体。 例示的なＮＯＤＡ−ペプチド構造。 ＴＦ２二重特異性抗体を用いた場合またはＴＦ２二重特異性抗体を用いない場合のマウスにおけるＩｎ−１１１標識ＩＭＰ４４９とＦ−１８標識ＩＭＰ４４９の比較生体分布。 プレターゲッティングＴＦ１０二重特異性抗ＭＵＣ１抗体を用いた場合またはプレターゲッティングＴＦ１０二重特異性抗ＭＵＣ１抗体を用いない場合の^１１１Ｉｎ−標識ｄｉＨＳＧペプチド（ＩＭＰ２８８）を用いた腫瘍のインビボ画像化。 ^１２４Ｉｎ−標識ペプチドと、ＴＦ２二重特異性抗ＣＥＡ抗体によるプレターゲッティングとを用いた、ヌードマウスの肺内の微小転移性ヒト大腸癌のＰＥＴ画像化。 Ｆ−１８標識とともに使用される追加の例示的なキレート部分。

以下に続く説明において、本明細書における開示を理解しやすくするために、多くの用語を使用し、以下の定義を提供する。明確に定義しない用語は、その普通の一般的な意味で使用する。

本明細書で使用するとき、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つ以上の項目を意味し得る。

本明細書で使用するとき、「および」および「または」という用語は、接続語または離接語のいずれかを意味するために使用し得る。すなわち、両用語は、特に明記しない限り、「および／または」の等価物として理解されるべきである。

本明細書で使用するとき、「約」とは、ある数のプラス１０パーセント以内またはマイナス１０パーセント以内を意味する。例えば、「約１００」は、９０〜１１０の間の任意の数を指すと考えられる。

本明細書で使用するとき、「ペプチド」は、２〜１００アミノ酸残基長、より好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜６アミノ酸長の天然または非天然のアミノ酸の任意の配列を指す。「アミノ酸」は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体、またはアミノ酸模倣体であってもよい。

本明細書で使用するとき、標識分子は、未標識分子から一部または完全に分離されている場合、「精製されて」おり、その結果、この標識分子の画分は、出発混合物と比較して濃縮されている。「精製された」標識分子は、５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５、９７：３、９８：２、９９：１、または１００：０を含むが、これらに限定されない、ほとんどあらゆる比率の標識分子と未標識分子の混合物を含み得る。

本明細書で使用するとき、「病原体」という用語は、真菌、ウイルス、寄生虫、および細菌を含むが、これらに限定されず、このようなものとして、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、サルウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルス、ブルー・タングウイルス、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘモフィリス・インフルエンザＢ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ライム病スピロヘータ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ハンセン菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、およびクロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用するとき、「放射線分解保護剤」とは、Ｆ−１８標識された錯体または分子の放射線分解による崩壊速度を減少させるために、Ｆ−１８標識された錯体または分子に添加し得る任意の分子、化合物、または組成物を指す。アスコルビン酸を含むが、これに限定されない、任意の公知の放射線分解保護剤を使用してもよい。

ターゲッティング可能なコンストラクトペプチド
ある実施形態において、Ｆ−１８標識部分は、ペプチドまたは他のターゲッティング可能なコンストラクトを含んでもよい。画像化および／または検出用のターゲッティングされる細胞、組織、病原生物、または他の標的に直接結合するように、Ｆ−１８標識ペプチド（またはタンパク質）を選択してもよい。他の実施形態において、例えば、ターゲッティング可能なコンストラクトペプチドに対する１つ以上の結合部位と疾患または病気と関連する標的抗原に対する１つ以上の結合部位とを有する二重特異性抗体を用いて、間接的に結合するように、Ｆ−１８標識ペプチドを選択してもよい。二重特異性抗体を、例えば、最初に抗体を対象に投与し得るプレターゲッティング技術で使用してもよい。二重特異性抗体が標的抗原に結合し、未結合抗体が血液循環から除去されるまで十分な時間をかけてもよい。その後、ターゲッティング可能なコンストラクト（例えば、Ｆ−１８標識ペプチド）を対象に投与し、二重特異性抗体に結合させ、罹患した細胞または組織に局在化させてもよく、その後、Ｆ−１８標識されたターゲッティング可能なコンストラクトの分布をＰＥＴ走査または他の公知の技術によって明らかにしてもよい。

このようなターゲッティング可能なコンストラクトは、多様な構造であることができるし、また、このターゲッティング可能なコンストラクトに高い親和性で結合する抗体または断片が利用可能であるという理由からだけでなく、プレターゲッティング法と二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）または多重特異性抗体とともに使用された場合に迅速にインビボでクリアランスされるという理由からも選択される。疎水性の薬剤が強い免疫応答を誘発するのに最も優れているのに対して、親水性の薬剤は、迅速なインビボでのクリアランスに好ましい。したがって、疎水性と親水性とのバランスを確立させる。これは、親水性キレート剤を用いて、多くの有機部分の固有の疎水性を相殺することによって、ある程度は達成することができる。反対の溶液特性を有するターゲッティング可能なコンストラクトのサブユニット、例えば、様々なアミノ酸を含有し、その中には疎水性のアミノ酸もあれば、親水性のアミノ酸もあるペプチドを選択することもできる。ペプチドの他に、炭水化物を使用してもよい。

わずか２アミノ酸残基、好ましくは２〜１０残基を有するペプチドを使用してもよく、これを他の部分（例えば、キレート剤）と連結させてもよい。リンカーは、キレート中の金属イオンを含む、好ましくは５０，０００ダルトン未満、有利には約２０，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、または５，０００ダルトン未満の分子量を有する、低分子量コンジュゲートであるべきである。より通常としては、ペプチドＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（配列番号１）（式中、ＤＯＴＡは１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸であり、ＨＳＧはヒスタミンスクシニルグリシル基である）などの、ターゲッティング可能なコンストラクトペプチドは、４個以上の残基を有する。あるいは、ＤＯＴＡを、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−三酢酸）部分またはＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）部分に置き換えてもよい。

ターゲッティング可能なコンストラクトはまた、インビボでのペプチドの安定性を増大させるために骨格構造中に非天然のアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）を含んでもよい。代替の実施形態において、非天然アミノ酸およびペプトイドから構築される骨格構造のような他の骨格構造。

ターゲッティング可能なコンストラクトとして使用されるペプチドは、固相支持体と反復直交脱保護・カップリング（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）の標準的な技術とを用いる自動化ペプチド合成機で好都合に合成される。ペプチドの遊離アミノ基は、キレートとのコンジュゲーションのために後で使用されることになるが、これを標準的な保護基（例えば、Ｂｏｃ基）で有利にブロッキングする一方で、血清安定性を増大させるためにＮ末端残基をアセチル化してもよい。このような保護基は当業者に公知である。ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９９（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。後から二重特異性抗体システムで使用するためにペプチドを調製する場合には、インビボのカルボキシペプチダーゼ活性を阻害するために、ペプチドを樹脂から有利に切断し、対応するＣ末端アミドを生成させる。

免疫原のハプテンは、認識部分、例えば、化学的ハプテンを含む。化学的ハプテン、好ましくは、ＨＳＧハプテンを使用することにより、リンカーの抗体に対する高い特異性が示される。ＨＳＧハプテンに対して惹起された抗体が知られており、それらを適当な二重特異性抗体の中に容易に組み込むことができる（例えば、米国特許第６，９６２，７０２号、同第７，１３８，１０３号、および同第７，３００，６４４号を参照されたく、これらはその各々のテキスト全体が参照により本明細書に組み入れられる）。したがって、リンカーを付着ハプテンと結合すれば、抗体または抗体断片に対して極めて特異的になると考えられる。

キレート部分
いくつかの実施形態において、Ｆ−１８標識分子は、１つ以上の親水性キレート部分を含んでもよく、これは、金属イオンに結合することができ、迅速なインビボでのクリアランスを確実にするよう役立つこともできる。キレート剤は、その特定の金属結合特性から選択されてもよく、容易に取り替えられてもよい。

特に有用な金属−キレートの組合せとしては、２−ベンジル−ＤＴＰＡとそのモノメチル類似体およびシクロヘキシル類似体が挙げられる。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−三酢酸）、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）などの大環状キレート剤も、種々の金属に関して有用であり、Ｆ−１８コンジュゲーションのための配位子として潜在的に使用し得る。

ＤＴＰＡ型キレート剤およびＤＯＴＡ型キレート剤は、その配位子が硬い塩基キレート官能基（例えば、カルボキシラート基またはアミン基）を含むが、これらは、硬い酸カチオン、特に、ＩＩａ族およびＩＩＩａ族の金属カチオンをキレート化させるのに最も有効である。このような金属−キレート錯体は、環のサイズを対象となる金属に合わせることによって非常に安定なものにすることができる。大環状ポリエーテルなどの他の環型キレート剤は、核種と安定に結合するために注目されている。ポルフィリンキレート剤を多くの金属錯体とともに使用することができる。２種類以上のキレート剤を、複数の金属イオンと結合させるために担体にコンジュゲートすることができる。キレート剤、例えば、米国特許第５，７５３，２０６号に開示されたキレート剤、特に、チオセミカルバゾニルグリオキシルシステイン（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）キレート剤およびチオセミカルバジニル−アセチルシステイン（Ｔｓｃａ−Ｃｙｓ）キレート剤は、軟らかい塩基配位子と強固に結合するＴｃ、Ｒｅ、Ｂｉ、および他の遷移金属、ランタニド類、ならびにアクチニド類という軟らかい酸カチオンと結合させるために有利に使用される。２種類以上のキレート剤をペプチドに結合させるのは有用であり得る。ｄｉ−ＤＴＰＡハプテンに対する抗体は公知であり（Ｂａｒｂｅｔら，米国特許第５，２５６，３９５号）、二重特異性抗体を形成するようにターゲッティング抗体に容易に連結されるので、プレターゲッティングプロトコルにおいて、ペプチドハプテンを、コールドのｄｉ−ＤＴＰＡキレート剤およびＦ−１８錯体と結合させるための別のキレート剤とともに使用することが可能である。このようなペプチドの１つの例は、Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ_２（配列番号２）である。他の硬い酸キレート剤（例えば、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡなど）を、ＤＴＰＡ基および／またはＴｓｃｇ−Ｃｙｓ基に代用することができ、抗ｄｉ−ＤＴＰＡ
ＭＡｂを作製するのに使用される技術と類似の技術を用いて、これらに特異的なＭＡｂを産生することができる。

別の有用なキレート剤は、例えば、Ｃｈｏｎｇら（参照により本明細書に組み入れられる、Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｍｏｄａｌ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｅ−ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ １２−７−０７）に開示されているような、ＮＯＴＡ型の部分を含むことができる。Ｃｈｏｎｇらは、^１７７Ｌｕまたは^{２０５／２０６}Ｂｉと錯体形成した場合に最大１４日間の血清中安定性を示す、ＮＯＴＡ構造をベースにした、二官能性のＣ−ＮＥＴＡ配位子の産生および使用を開示している。

カチオンの異なるサイズ、キレート環の形状、およびカチオンの好ましい錯体イオン構造によって、２つの異なる硬い酸カチオンまたは軟らかい酸カチオンに優先的に結合させるために、２つの異なる硬い酸キレート剤または軟らかい酸キレート剤を組み込んで、例えば、異なるキレート環サイズを有するターゲッティング可能なコンストラクトにすることができるということが理解されるであろう。これにより、プレターゲッティングされた二重特異性抗体によって最終的に捕捉されるターゲッティング可能なコンストラクトに２つの異なる金属が組み込まれるようになり、この２つの異なる金属のうちの一方または両方をＦ−１８に付着させることができる。

投与の方法
様々な実施形態において、二重特異性抗体およびターゲッティング可能なコンストラクトは、正常な組織または器官および罹患した組織または器官を画像化するために利用し得る（例えば、米国特許第６，１２６，９１６号；同第６，０７７，４９９号；同第６，０１０，６８０号；同第５，７７６，０９５号；同第５，７７６，０９４号；同第５，７７６，０９３号；同第５，７７２，９８１号；同第５，７５３，２０６号；同第５，７４６，９９６号；同第５，６９７，９０２号；同第５，３２８，６７９号；同第５，１２８，１１９号；同第５，１０１，８２７号；および同第４，７３５，２１０号を参照されたく、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。

二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）およびＦ−１８標識されたターゲッティング可能なコンストラクトの投与は、ターゲッティング可能なコンストラクトを投与する前のある時点でｂｓＡｂ抗体を投与することにより実施され得る。試薬の用量および時機は、当業者によって容易に分割されることができ、利用される試薬の特定の性質によって決定される。ｂｓＡｂ−Ｆ（ａｂ'）_２誘導体が最初に投与される場合には、ターゲッティング可能なコンストラクトを投与するまでに２４〜７２時間（あるいは４８〜９６時間）の待機時間が適当であると考えられる。ＩｇＧ−Ｆａｂ' ｂｓＡｂコンジュゲートが主たるターゲッティング可能なベクターである場合には、ターゲッティング可能なコンストラクトを投与するまでに、３〜１０日の範囲の、より長い待機期間が示されると考えられる。ｂｓＡｂが罹患組織をターゲッティングするのに十分な時間が経った後、Ｆ−１８標識されたターゲッティング可能なコンストラクトが投与される。ターゲッティング可能なコンストラクトが投与された後、画像化を実施することができる。

ある実施形態は、特許出願第６０／２２０，７８２号に記載されているような少なくとも３つの異なる標的結合部位を有する多価の標的結合タンパク質の使用に関する。多価の標的結合タンパク質は、化学的リンカーを介していくつかのＦａｂ様断片を架橋することによって作製されている。米国特許第５，２６２，５２４号；同第５，０９１，５４２号、およびＬａｎｄｓｄｏｒｐら，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：６７９−８３（１９８６）を参照されたい。多価の標的結合タンパク質は、いくつかの単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）を共有結合させて単一のポリペプチドを形成することによっても作製されている。米国特許第５，８９２，０２０号を参照されたい。基本的にｓｃＦｖ分子の凝集体である多価の標的結合タンパク質は、米国特許第６，０２５，１６５号および同第５，８３７，２４２号に開示されている。３つのｓｃＦｖ分子を含む三価の標的結合タンパク質は、Ｋｒｏｔｔら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０（４）：４２３−４３３（１９９７）に記載されている。

あるいは、「ドック・ロック」（ｄｏｃｋ−ａｎｄ−ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ）として知られる技術が、２つ以上の異なる抗体または抗体断片を含む複合体を含む、種々の多価複合体の簡単でかつ再現性のある構築について示されている（例えば、米国特許出願第１１／３８９，３５８号（２００６年３月２４日出願）；同第１１／３９１，５８４号（２００６年３月２８日出願）；同第１１／４７８，０２１号（２００６年６月２９日出願）；同第１１／６３３，７２９号（２００６年１２月５日出願）；および同第１１／９２５，４０８号（２００７年１０月２６日出願）を参照されたく、これらのテキストは各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。このようなコンストラクトも、本明細書に記載の特許請求された方法および組成物の実施に有用である。

二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）の投与とターゲッティング可能なコンストラクトの投与の間に投与される除去剤を使用してもよい。新規の機械的作用の除去剤、すなわち、ｂｓＡｂの疾患ターゲッティングアームをターゲッティングするグリコシル化された抗イディオタイプＦａｂ'断片を使用してもよい。１つの例において、抗ＣＥＡ（ＭＮ−１４Ａｂ）×抗ペプチドｂｓＡｂを投与し、疾患標的に最大限まで付着させる。残存するｂｓＡｂを除去するために、ＷＩ−２と呼ばれる、ＭＮ−１４に対する抗イディオタイプＡｂを、好ましくはグリコシル化されたＦａｂ'断片として投与する。除去剤は、多価形式でｂｓＡｂに結合するが、その付加されたグリコシル残基によって複合体全体が肝臓に向かい、そこで迅速な代謝が起こる。その後、Ｆ−１８標識されたターゲッティング可能なコンストラクトを対象に投与する。ＷＩ２−Ｆａｂ'が一価の部分であるために、架橋を必要としないので、ｂｓＡｂのＭＮ−１４アームに対するＷＩ２ Ａｂは高親和性を有し、そのクリアランス機構は他の開示されている機構（Ｇｏｏｄｗｉｎら，前記を参照）と異なる。しかしながら、除去剤についての代替の方法および組成物が公知であり、任意のそのような公知の除去剤を使用し得る。

製剤および投与
Ｆ−１８標識分子は、１つ以上の薬学的に好適な賦形剤、１つ以上の追加の成分、またはこれらのある組合せを含む組成物を得るように処方し得る。これらを公知の方法により達成し、１つ以上の薬学的に好適な賦形剤との混合物に活性成分（すなわち、Ｆ−１８標識分子）を組み合わせた、薬学的に有用な投薬を調製することができる。滅菌リン酸緩衝化生理食塩水は、薬学的に好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤は当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌら，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，第５版（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、およびＧｅｎｎａｒｏ（編），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、ならびにそれらの改訂版を参照されたい。

本明細書に記載された組成物の好ましい投与の経路は、非経口注射である。注射は、静脈内、動脈内、リンパ管内、髄腔内、または体腔内（すなわち、非経口）であってもよい。非経口投与において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤と関連した、溶液、懸濁液、または乳濁液などの単位投薬量の注射可能な形態で処方される。このような賦形剤は、本質的に非毒性かつ非治療的である。このような賦形剤の例は、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。固定油およびエチルオレエートなどの非水性賦形剤を使用してもよい。好ましい賦形剤は、生理食塩水中の５％デキストロースである。賦形剤は、等張性および化学的安定性を増強する物質などの少量の添加剤を含有してもよく、これには緩衝剤および防腐剤が含まれる。経口投与を含む、他の投与方法も企図される。

Ｆ−１８標識分子を含む処方組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入を介する静脈内投与に使用することができる。注射用組成物は、例えば、アンプルまたは複数用量容器中の単位投薬量形態として、添加された防腐剤とともに提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液のような形態を取ることもでき、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような処方剤を含有することができる。あるいは、組成物は、使用前に、好適なビヒクル（例えば、滅菌パイロジェンフリー水）で構成される粉末形態とすることができる。

組成物は、溶液として投与してもよい。溶液のｐＨは、ｐＨ５〜９．５、好ましくは６．５〜７．５の範囲にあるべきである。その製剤は、薬学的に許容される好適な緩衝剤（例えば、リン酸塩、ＴＲＩＳ（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ、またはクエン酸塩など）を有する溶液中にあるべきである。緩衝剤の濃度は、１〜１００ｍＭの範囲にあるべきである。処方溶液はまた、濃度５０〜１５０ｍＭの塩（例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）を含有してもよい。有効量の安定化剤（例えば、グリセロール、アルブミン、グロブリン、界面活性剤、ゼラチン、プロタミン、またはプロタミンの塩）が含まれてもよい。組成物は、皮下に、静脈内に、筋肉内に、または他の非経口経路で哺乳動物に投与してもよい。さらに、投与は、連続注入によるかまたは単回もしくは複数回ボーラスによるものであってもよい。

例えば、プレターゲッティング技術において、二重特異性抗体を投与する場合、ヒトについての投与される抗体の投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態、および過去の病歴のような因子によって様々に異なる。典型的には、画像化目的のために、約１ｍｇ〜２００ｍｇの範囲の投薬量の二重特異性抗体を単回静脈内注入としてレシピエントに提供することが望ましいが、状況によっては、より低い投薬量またはより高い投薬量を投与してもよい。典型的には、典型的な成人に対して抗体が体表面積１平方メートル当たり約１０ｍｇまたは１７ないし１８ｍｇの範囲の投薬量でレシピエントに提供することが望ましいが、状況によっては、より低い投薬量またはより高い投薬量を投与してもよい。画像化目的のためにヒト対象に投与し得る二重特異性抗体の投薬量の例は、１〜２００ｍｇ、より好ましくは１〜７０ｍｇ、最も好ましくは１〜２０ｍｇであるが、より高い用量またはより低い用量を使用してもよい。

一般に、投与するＦ−１８標識の投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態、および過去の病歴のような因子によって様々に異なる。好ましくは、飽和用量のＦ−１８標識分子を患者に投与する。Ｆ−１８標識分子の投与については、投薬量をミリキュリー単位で測定してもよい。Ｆ−１８画像化研究のための典型的な範囲は、５〜１０ｍＣｉであると考えられる。

ペプチドの投与
特許請求された方法および／または組成物の様々な実施形態は、対象に投与される１つ以上のＦ−１８標識ペプチドに関するものであってもよい。投与は、当技術分野で公知の任意の経路で起こることができ、それには、経口、鼻腔内、口腔内、吸入、直腸、膣、局所、同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄腔内、または静脈内注射が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｆ−１８標識ペプチドがプレターゲッティングプロトコルで投与される場合、ペプチドは好ましくは静脈内投与されると考えられる。

対象に経口投与される未修飾ペプチドは消化管で分解され得るが、配列および構造によっては、腸の内層への吸収不良を示す場合がある。しかしながら、ペプチドを化学修飾して、内在性プロテアーゼによる分解を受けにくくするかまたは消化管を通って吸収されやすくする方法が周知である（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら，１９９５，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９：６０４−１１；ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３５１−６９；ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ，１９９５，ＢＵＲＧＥＲ'Ｓ ＭＥＤＩＣＩＮＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ，第Ｉ巻，Ｗｏｌｌｆ編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；ＧｏｏｄｍａｎおよびＳｈａｏ，１９９６，Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６８：１３０３−０８参照）。ペプチド類似体（例えば、Ｄ−アミノ酸を含有するペプチド；ペプチドの構造を模倣する有機分子からなるペプチド模倣体；またはビニル性ペプトイドなどのペプトイド）のライブラリーを調製する方法も記載されており、対象への経口投与に好適なペプチドベースのＦ−１８分子を構築するのに使用し得る。

ある実施形態において、標準的なペプチド結合連結を、１つ以上の代替の連結基（例えば、ＣＨ_２−ＮＨ、ＣＨ_２−Ｓ、ＣＨ_２−ＣＨ_２、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＯ−ＣＨ_２、ＣＨＯＨ−ＣＨ_２など）に置き換えてもよい。ペプチド模倣体を調製する方法は周知である（例えば、各々参照により本明細書に組み入れられる、Ｈｒｕｂｙ，１９８２，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９−９９；Ｈｏｌｌａｄａｙら，１９８３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−０４；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら，１９８２，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３：２５３３；Ａｌｍｑｕｉｅｓｔら，１９８０，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−９８；Ｈｕｄｓｏｎら，１９７９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５；Ｓｐａｔｏｌａら，１９８６，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３−４９；米国特許第５，１６９，８６２号；同第５，５３９，０８５号；同第５，５７６，４２３号、同第５，０５１，４４８号、同第５，５５９，１０３号）。ペプチド模倣体は、それらのペプチド類似体と比較して増強されたインビボでの安定性および／または吸収を示し得る。

あるいは、エキソペプチダーゼ活性を抑制するために、Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングを用いて経口送達によってペプチドを投与してもよい。例えば、アミドペプチドを用いてＣ末端をキャッピングしてもよく、ペプチドのアセチル化を用いてＮ末端をキャッピングしてもよい。また、エキソペプチダーゼを阻止するために、例えば、環状アミド、ジスルフィド、エーテル、スルフィドなどの形成によって、ペプチドを環化してもよい。

ペプチドの安定化は、特にエンドペプチダーゼが作用することが知られている位置で、天然のＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸と置換することによっても生じさせることもできる。エンドペプチダーゼの結合配列および切断配列は当技術分野で公知であり、Ｄ−アミノ酸を取り込んでいるペプチドを作製および使用する方法は記載されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、ＭｃＢｒｉｄｅらの米国特許出願公開第２００５００２５７０９号（２００４年６月１４日出願））。ある実施形態において、ペプチドおよび／またはタンパク質は、プロテイナーゼ阻害剤および／またはペプチダーゼ阻害剤を一緒に処方することによって経口投与してもよい。

治療的ペプチドの経口送達のための他の方法は、Ｍｅｈｔａ（「Ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｏｒｍｏｎｅｓ」，２００４年６月，ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に開示されている。ペプチドは、腸のタンパク質分解活性を調節しかつ腸壁の向こう側へのペプチド輸送を増強する賦形剤とともに腸溶性被覆された固体投薬形態で投与される。この技術を用いたインタクトなペプチドの相対的バイオアベイラビリティーは、投与された投薬量の１％〜１０％の範囲であった。インスリンは、コール酸ナトリウムとプロテアーゼ阻害剤とともに腸溶性被覆マイクロカプセルを用いて、イヌで投与が成功している（Ｚｉｖら，１９９４，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１８（Ｓｕｐｐｌ．２）：７９２−９４）。ペプチドの経口投与は、アシルカルニチンを透過増強剤および腸溶性被覆として用いて行なわれている（Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ−５５，Ｒｏｈｍ Ｐｈａｒｍａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｍｅｈｔａ，２００４参照）。経口投与ペプチドに有用な賦形剤としては、一般に、ペプチドの溶解性または吸収を向上させる界面活性剤または他の薬剤（これらは腸溶性被覆されたカプセルまたは錠剤の中に詰め込み得る）と一緒にした、腸のプロテアーゼ／ペプチダーゼの１つ以上の阻害剤を挙げることができる（Ｍｅｈｔａ，２００４）。カプセルが腸で溶けたときに、腸を酸性化し、腸のプロテアーゼ活性を阻害するように、有機酸がカプセルに含まれてもよい（Ｍｅｈｔａ，２００４）。ペプチドの経口送達のための別の代替法としては、吸収および酵素的分解に対する抵抗性を増大させる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの両親媒性オリゴマーへのコンジュゲーションが挙げられる（ＳｏｌｔｅｒｏおよびＥｋｗｕｒｉｂｅ，２００１，Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６：１１０）。

抗体を惹起する方法
ペプチド骨格に対するＡｂは、Ａｂ産生のための周知の方法によって作製し得る。例えば、完全フロイントアジュバント中の（ペプチド）_ｎ−ＫＬＨ（ここで、ＫＬＨはキーホールリンペットヘモシアニンであり、ｎ＝１〜３０である）のような免疫原を注射し、その後２回、不完全フロイントアジュバントに懸濁した同じ免疫原を免疫適格動物に注射した後、抗原を静脈内に追加免疫してから３日後に脾臓細胞を採取する。その後、採取された脾臓細胞をＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させ、得られたクローンの培養上清を、直接結合ＥＬＩＳＡを用いて抗ペプチド反応性について解析する。作製されたＡｂの特異性は、もとの免疫原のペプチド断片を用いることによって解析することができる。これらの断片は、自動ペプチド合成機を用いて容易に調製することができる。Ａｂ産生のために、酵素欠損ハイブリドーマを単離して、融合細胞株の選択をできるようにする。この技術を用いて、ターゲッティング可能なコンストラクト（例えば、Ｉｎ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡキレート）を含むキレートの１つまたは複数に対する抗体を惹起することもできる。Ｉｎ（ＩＩＩ）−ｄｉ−ＤＴＰＡに対するモノクローナルマウス抗体が公知である（Ｂａｒｂｅｔ、上記の‘３９５号）。

例えば、二重特異性抗体の成分として有用なターゲッティング抗体は、マーカー物質としての種々の細胞表面腫瘍関連抗原または細胞内腫瘍関連抗原に特異的であり得る。これらのマーカーは、腫瘍によって産生される物質であってもよく、または腫瘍部位で、腫瘍細胞表面に、もしくは腫瘍細胞内（細胞質、核、もしくは様々な細胞小器官もしくは細胞内構造体を問わない）に蓄積する物質であってもよい。このような腫瘍関連マーカーの中には、各々参照により本明細書に組み入れられる、Ｆｌｅｉｓｈｅｒ編，「Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ」，３４７ページのＨｅｒｂｅｒｍａｎ，「Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ」（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，１９７９）によって開示されている腫瘍関連マーカーならびに米国特許第４，１５０，１４９号；同第４，３６１，５４４号；および同第４，４４４，７４４号に開示されている腫瘍関連マーカーが含まれる。腫瘍関連抗原に関する最近の報告としては、各々参照により本明細書に組み入れられる、Ｍｉｚｕｋａｍｉら（２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１１：９９２−９７）；Ｈａｔｆｉｅｌｄら（２００５，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ５：２２９−４８）；Ｖａｌｌｂｏｈｍｅｒら（２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：３５３６−４４）；およびＲｅｎら（２００５，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２４２：５５−６３）が挙げられる。

腫瘍関連マーカーは、Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ（上記）によって、腫瘍胎児性抗原、胎盤抗原、発癌ウイルスまたは腫瘍ウイルス関連抗原、組織関連抗原、器官関連抗原、異所性ホルモン、および正常な抗原、またはそれらの変異体を含む多数のカテゴリーに分類されている。時には、腫瘍関連マーカーのサブユニットを有利に用いて、より高い腫瘍特異性（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）のβ−サブユニットまたは癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のγ領域）を有する抗体を惹起し、それによって、米国特許第４，３６１，６４４号および同４，４４４，７４４号に開示されているような非腫瘍物質に対する交差反応性が大幅に減少した抗体の産生を刺激する。

対象となる別のマーカーは、膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬ−インタラクター（ＴＡＣＩ）である。Ｙｕら，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２５２-２５６（２０００）を参照されたい。簡潔に説明すると、ＴＡＣＩはＢ細胞悪性腫瘍（例えば、リンパ腫）のマーカーである。さらに、ＴＡＣＩおよびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、腫瘍壊死因子ホモログである増殖誘導性リガンド（ＡＰＲＩＬ）によって結合される。ＡＰＲＩＬは、初代Ｂ細胞および初代Ｔ細胞のインビトロ増殖を刺激し、インビボでのＢ細胞の蓄積によって脾臓重量を増大させる。ＡＰＲＩＬはまた、ＴＡＬＬ−Ｉ（ＢＬｙＳまたはＢＡＦＦとも呼ばれる）と受容体結合を競合する。可溶性のＢＣＭＡおよびＴＡＣＩは、ＡＰＲＩＬの結合を特異的に妨げ、ＡＰＲＩＬによって刺激される初代Ｂ細胞の増殖を阻止する。ＢＣＭＡ−Ｆｃも、マウスでのキーホールリンペットヘモシアニンおよびニューモバックス（Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ）に対する抗体の産生を阻害し、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを介するＡＰＲＩＬおよび／またはＴＡＬＬ−Ｉシグナル伝達が、液性免疫の生成に必要であることを示している。したがって、ＡＰＲＩＬ−ＴＡＬＬ−ＩおよびＢＣＭＡ−ＴＡＣＩは、Ｂ細胞機能およびＴ細胞機能の刺激に関与する２リガンド−２受容体経路を形成する。

様々な疾患または病気（例えば、悪性疾患、心血管疾患、感染性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、または神経学的疾患）を画像化するのに有用な例示的な標的抗原としては、大腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉａ、Ｉｉ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６もしくはＣＤ６６ａ〜ｄおよびＣＤ６７、ならびにＣＤ１３８）、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ａ３、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、ＶＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ，ＩＬＧＦ−１、壊死抗原、ＩＬ−２、ＩＬ−６、Ｔ１０１、ＭＡＧＥ、またはこれらの抗原の組合せを挙げることができる。特に、抗原としては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、テネイシン、上皮増殖因子受容体、血小板由来増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、血管内皮細胞増殖因子受容体、ガングリオシド、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体、およびこれらの抗原の組合せを挙げることができる。

画像化または検出が、リンパ腫、白血病、または自己免疫障害を要件とする場合、ターゲッティングされる抗原は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ６７、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、Ｂ７、ＭＵＣｌ、Ｉａ、Ｉｉ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＧ、ＩＬ−６、ＭＩＦ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）、およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）からなる群より選択され得る。

免疫原に対する抗体を最初に惹起させた後、抗体を配列決定し、その後、組換え技術によって調製することができる。マウス抗体および抗体断片のヒト化およびキメラ化は当業者に周知である。例えば、マウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖に由来するマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移し、その後、マウス対応物のフレームワーク領域中にヒト残基を代入することによって、ヒト化モノクローナル抗体が産生される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用により、マウス定常領域の免疫原性と関連する潜在的な問題が回避される。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローン化するための一般的な技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３（１９８９）という刊行物に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ヒト化ＭＡｂを産生するための技術は、例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）、およびＳｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３）によって記載されており、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

あるいは、完全ヒト抗体は、ヒト以外のトランスジェニック動物から得ることができる。例えば、Ｍｅｎｄｅｚら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）；米国特許第５，６３３，４２５号を参照されたい。例えば、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスから回収することができる。内在性の免疫グロブリン遺伝子を不活化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって、マウスの液性免疫系はヒト化される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、非常に複雑であり、合わせるとヒトゲノムのほぼ０．２％を占める多数の不連続セグメントを含む。トランスジェニックマウスが十分な抗体レパートリーを産生できることを確実にするためには、ヒトの重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の大部分をマウスのゲノムに導入しなければならない。これは、ヒトの重鎖免疫グロブリン遺伝子座または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを生殖系列配置で含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成から始まる段階的プロセスにおいて達成される。各々の挿入物はサイズがおよそ１Ｍｂであるので、ＹＡＣコンストラクトは、免疫グロブリン遺伝子座の重複する断片の相同組換えを必要とする。ＹＡＣを含有する酵母のスフェロブラストをマウス胚性幹細胞と融合することによって、２つのＹＡＣ（重鎖遺伝子座を含有するＹＡＣと軽鎖遺伝子座を含有するＹＡＣ）を別々にマウスに導入する。その後、胚性幹細胞クローンを、マウスの胚盤胞にマイクロインジェクションする。得られたキメラのオスを、その生殖系列を通じてＹＡＣを伝えるその能力についてスクリーニングし、マウス抗体の産生に欠陥があるマウスと交配させる。これらの２つのトランスジェニック系統、すなわち、ヒト重鎖遺伝子座を含有する一方と、ヒト軽鎖遺伝子座を含有するもう一方とを交配することにより、免疫化に応答してヒト抗体を産生する子孫が得られる。

再配置されていないヒト免疫グロブリン遺伝子を、ミクロセル媒介性染色体移入（ＭＭＣＴ）によってマウス胚性幹細胞に導入することもできる。Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：１３３（１９９７）を参照されたい。この方法論では、ヒト染色体を含有するミクロセルをマウス胚性幹細胞と融合させる。移入された染色体は安定に保持され、成体キメラは適切な組織特異的発現を示す。

代替として、抗体または抗体断片は、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから単離されたヒト抗体断片に由来してもよい。例えば、Ｂａｒｂａｓら，ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１１９（１９９１）、およびＷｉｎｔｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３（１９９４）を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み入れる。Ｂ細胞の不死化によってモノクローナル抗体を作製することに関連する困難の多くは、ファージディスプレーを用いて、大腸菌内で抗体断片を改変し、発現させることよって克服することができる。

同様の戦略を利用して、高親和性のｓｃＦｖを得ることができる。例えば、Ｖａｕｇｈｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０９−３１４（１９９６）を参照されたい。大きいレパートリーを有するｓｃＦｖライブラリーは、全て公知のＶ_Ｈ、Ｖ_κ、およびＶ_８０遺伝子ファミリーに対応するＰＣＲプライマーを用いて、免疫化されていないヒトのドナーからＶ−遺伝子を単離することによって構築することができる。増幅後、Ｖ_κとＶ_λのプールを組み合わせて、１つのプールを形成させる。これらの断片をライゲートして、ファージミドベクターに入れる。その後、ｓｃＦｖリンカー、（Ｇｌｙ_４、Ｓｅｒ）_３をライゲートして、ファージミド中、Ｖ_Ｌ断片の上流に入れる。Ｖ_Ｈ断片およびリンカー−Ｖ_Ｌ断片を増幅し、Ｊ_Ｈ領域上で組み合わせる。得られたＶ_Ｈ−リンカー−Ｖ_Ｌ断片をライゲートして、ファージミドベクターに入れる。ファージミドライブラリーを、上記のように、フィルターを用いて、またはイムノチューブ（ＮＵＮＣ（登録商標）；ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標））を用いてパニングすることができる。同様の結果は、免疫化されたウサギのリンパ球または脾臓細胞由来のコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを構築することによって、およびピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）でｓｃＦｖコンストラクトを発現させることによって達成することができる。例えば、Ｒｉｄｄｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：２５５−２６０（１９９５）を参照されたい。さらに、適当なｓｃＦｖを単離した後、ＣＤＲ３突然変異誘発および鎖シャッフリングなどの親和性成熟プロセスを通じて、より高い結合親和性およびより遅い解離速度を有する抗体断片を得ることができる。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７８：１８１−１８８（１９９８）；Ｏｓｂｏｕｒｎら，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：１８１−１９６（１９９６）を参照されたい。

抗体断片の別の形態は、単一のＣＤＲをコードするペプチドである。対象となる抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって、ＣＤＲペプチド(「最小認識単位」)を得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を用いることによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６（１９９１）；ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒら（編），１６６−１７９ページのＣｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；およびＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｂｉｒｃｈら（編），１３７−１８５ページのＷａｒｄら，「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）を参照されたい。

二重特異性抗体は当技術分野で公知の技術によって調製することができ、例えば、抗ＣＥＡ腫瘍Ａｂと抗ペプチドＡｂをともに、ペプシンでそれぞれのＦ（ａｂ'）_２まで個別に消化する。抗ＣＥＡ−Ａｂ−Ｆ（ａｂ'）_２をシステインで還元して、Ｆａｂ'モノマー単位を生成し、これをさらに、架橋剤のビス（マレイミド）ヘキサンと反応させて、Ｆａｂ'−マレイミド部分を生成する。抗ペプチドＡｂ−Ｆ（ａｂ'）_２をシステインで還元し、精製して回収した抗ペプチドＦａｂ'−ＳＨを抗ＣＥＡ−Ｆａｂ'−マレイミドと反応させて、Ｆａｂ'×Ｆａｂ'二重特異性Ａｂを生成する。あるいは、抗ペプチドＦａｂ'−ＳＨ断片を抗ＣＥＡ−Ｆ（ａｂ'）_２と連結して、Ｆ（ａｂ'）_２×Ｆａｂ'コンストラクトを生成してもよく、または抗ＣＥＡ Ｉｇと連結して、ＩｇＧ×Ｆａｂ'二重特異性コンストラクトを生成してもよい。１つの実施形態において、ＩｇＧ×Ｆａｂ'コンストラクトは、過ヨウ素酸酸化を行なった後、市販のヒドラジド−マレイミド架橋剤と反応させることによって活性化した抗ＣＥＡ ＩｇＧ重鎖炭水化物に抗ペプチドＦａｂ'チオール基を付着させることによって部位特異的な様式で調製することができる。使用する成分Ａｂは、公知の技術によってキメラ化またはヒト化することができる。キメラ抗体は、齧歯類抗体に由来する可変ドメインと相補性決定領域を含有する組換えタンパク質であるが、この抗体分子の残りはヒト抗体に由来する。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域がマウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖からヒト可変ドメインに移されている組換えタンパク質である。

キメラＡｂは、マウスの軽可変ドメインおよび重可変ドメインをコードするｃＤＮＡ断片を、ヒト抗体のＣドメインをコードする断片にライゲートすることによって構築される。Ｃドメインは抗原結合に寄与しないので、キメラ抗体は、もとのマウスＡｂと同じ抗原特異性を保持するが、配列はヒト抗体により近い。しかしながら、キメラＡｂは依然としていくらかのマウス配列を含み、依然として免疫原性であり得る。ヒト化Ａｂは、抗原を認識するのに必要なマウスアミノ酸だけを含む。この産物は、マウス相補性決定領域由来のアミノ酸をヒト抗体フレームワークに組み込むことによって構築される。

二重特異性抗体を産生するための他の最近の方法は、より一般的な免疫グロブリンアイソタイプよりも強く架橋するように追加のシステイン残基を有する改変された組換えＡｂを含む。例えば、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０：１２２１−１２２５，１９９７を参照されたい。別の手法は、必要とされる二重の特異性を有する２つ以上の異なる単鎖抗体または抗体断片セグメントを連結した組換え融合タンパク質を改変することである。例えば、Ｃｏｌｏｍａら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１５９−１６３，１９９７を参照されたい。種々の二重特異性融合タンパク質を、分子工学を用いて産生することができる。１つの形態では、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば、ある抗原に対する単一の結合部位を有するｓｃＦｖと、第二の抗原に対する単一の結合部位を有するＦａｂ断片とからなる。別の形態では、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、ある抗原に対する２つの結合部位を有するＩｇＧと、第二の抗原に対する２つの結合部位を有する２つのｓｃＦｖとからなる。

ダイアボディーとも呼ばれる、機能的な二重特異性単鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）を、組換え法を用いて哺乳動物細胞で産生することができる。例えば、Ｍａｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：７０２１−７０２５，１９９５を参照されたい。

好ましい二重特異性抗体は、ＭＡｂ
Ｍｕ−９のＦｖとＭＡｂ ６７９のＦｖまたはＭＡｂ ＭＮ−１４のＦｖとＭＡｂ ６７９のＦｖを組み込んだ二重特異性抗体、およびそれらのヒト対応物、キメラ化対応物、またはヒト化対応物である。ＭＮ−１４、ならびにそのキメラ化対応物およびヒト化対応物は、米国特許第５，８７４，５４０号に開示されている。Ｍｕ−９または６７９のＣＤＲの１つまたは複数を組み込んだ二重特異性抗体も好ましい。抗体は、クラスＩＩＩ抗ＣＥＡ抗体および６７９のＦｖを組み込んだ融合タンパク質または二重特異性抗体であることもできる。クラスＩＩＩ抗ＣＥＡを含む、クラスＩＩＩ抗体は、米国特許第４，８１８，７０９号で詳細に考察されている。

当業者は、二重特異性抗体が、疾患状態または病気と関連することが知られている標的抗原に対する結合特異性を有する当技術分野で公知の任意の抗体または断片を組み込み得るということを理解するであろう。そのような公知の抗体としては、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２およびＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１））、ＰＡＭ−４およびＫＣ４（ともに抗ムチン）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅとしても公知））、ＭＮ−３またはＭＮ−１５（ＮＣＡまたはＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ−９（抗大腸特異的抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗α−フェトタンパク質）、ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ
ＭＡｂ）、ならびにＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は当技術分野で公知である（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号；同第５，８７４，５４０号；同第６，１０７，０９０号；同第６，１８３，７４４号；同第６，３０６，３９３号；同第６，６５３，１０４号；同第６，７３０．３００号；同第６，８９９，８６４号；同第６，９２６，８９３号；同第６，９６２，７０２号；同第７，０７４，４０３号；同第７，２３０，０８４号；同第７，２３８，７８５号；同第７，２３８，７８６号；同第７，２５６，００４号；同第７，２８２，５６７号；同第７，３００，６５５号；同第７，３１２，３１８号；および米国特許出願公開第２００４０１８５０５３号；同第２００４０２０２６６６号；同第２００５０２７１６７１号；同第２００６０１９３８６５号；同第２００６０２１０４７５号；同第２００７００８７００１号；これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。このような公知の抗体は、種々の疾患状態または病気の検出および／または画像化に有用である（例えば、ｈＭＮ−１４またはＴＦ２
ｂｓＭＡｂ（ＣＥＡを発現する癌腫）、ｈＡ２０ ｂｓＭａｂ（ＴＦ−４リンパ腫）、ｈＰＡＭ４（ＴＦ−１０膵癌）、ＲＳ７ ｂｓＭＡｂ（肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌）、ｈＭＮ−１５またはｈＭＮ３
ｂｓＭＡｂ（炎症）、ヒトｇｐ１２０および／またはｇｐ４１ ｂｓＭＡｂ（ＨＩＶ）、抗血小板ｂｓＭａｂおよび抗トロンビンｂｓＭＡｂ（血餅画像化）、抗ミオシンｂｓＭＡｂ（心臓壊死））。

候補抗ＨＩＶ抗体としては、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（ＡＩＤＳ．２００６ Ｏｃｔ ３；２０（１５）：１９１１−５）によって記載されている抗エンベロープ抗体、ならびにＰｏｌｙｍｕｎ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって記載および販売されており、米国特許第５，８３１，０３４号、米国特許第５，９１１，９８９号、ならびにＶｃｅｌａｒら，ＡＩＤＳ ２００７；２１（１６）：２１６１−２１７０、およびＪｏｏｓら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００６；５０（５）：１７７３−９にも記載されている抗ＨＩＶ抗体が挙げられ、これらの文献は全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

ある実施形態において、上で考察されているｂｓＡｂ
Ｆ−１８標識されたターゲッティング可能なコンストラクトは、米国特許第６，０９６，２８９号に記載されているような手術中の腫瘍および病変の検出、生検、および治療、血管内での腫瘍および病変の検出、生検、および治療、ならびに／または内視鏡による腫瘍および病変の検出、生検、および治療で使用し得る。

標識分子を用いた画像化
標識分子を用いた画像化の方法は当技術分野で周知であり、任意のそのような公知の方法を、本明細書に開示されているフッ素標識分子とともに使用し得る。例えば、米国特許第６，２４１，９６４号；同第６，３５８，４８９号；同第６，９５３，５６７号、および公開されている米国特許出願公開第２００５０００３４０３号；同第２００４００１８５５７号；同第２００６０１４０９３６号を参照されたく、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。Ｐａｇｅら，Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１：９１１−９１９，１９９４；Ｃｈｏｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５：５３２３−５３２９，１９９５；Ｚａｌｕｔｓｋｙら，Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ．，３３：５７５−５８２，１９９２；Ｗｏｅｓｓｎｅｒら，Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．２００５，５３：７９０−９９も参照されたい。

ある実施形態において、Ｆ−１８標識分子は、例えば、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，１２６，９１６号；同第６，０７７，４９９号；同第６，０１０，６８０号；同第５，７７６，０９５号；同第５，７７６，０９４号；同第５，７７６，０９３号；同第５，７７２，９８１号；同第５，７５３，２０６号；同第５，７４６，９９６号；同第５，６９７，９０２号；同第５，３２８，６７９号；同第５，１２８，１１９号；同第５，１０１，８２７号；および同第４，７３５，２１０号に記載されている方法を用いて、正常な組織および器官または罹患した組織および器官を画像化する際に有用であり得る。追加の方法は、米国出願第０９／３３７，７５６号（１９９９年６月２２日出願）および米国出願第０９／８２３，７４６号（２００１年４月３日出願）に記載されている。このような画像化は、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら（２００７，Ｕｐｄａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２：１９−３１）；Ｓｈａｒｋｅｙら（２００８，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ２４６：４９７−５０７）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら（２００８，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４９：１５８−６３）；Ｓｈａｒｋｅｙら（２００７，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：５７７７ｓ−５５８５ｓ）；ＭｃＢｒｉｄｅら（２００６，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４７：１６７８−８８）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら（２００６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４：８２３−８５）に記載されているように、適当なターゲッティング分子の直接的なＦ−１８標識によるか、またはプレターゲッティングによる画像化方法によって実施することができ、また、米国特許公開第２００５０００２９４５号、同第２００４００１８５５７号、同第２００３０１４８４０９号、および同第２００５００１４２０７号を参照されたく、これらの文献は各々、参照により本明細書に組み入れられる。

標識されたペプチドまたはＭＡｂを用いる診断的画像化の方法は周知である。例えば、免疫シンチグラフィー技術では、リガンドまたは抗体を、ガンマ線を放射する放射性同位体で標識し、患者に導入する。ガンマ線カメラを用いて、ガンマ線を放射する放射性同位体の位置および分布を検出する。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（編），ＲＡＤＩＯＬＡＢＥＬＥＤ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＦＯＲ ＩＭＡＧＩＮＧ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＹ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９８８）、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏら（編），６２４−６５２ページのＣｈａｓｅ，「Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９０）、およびＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ２２７−４９，Ｐｅｚｚｕｔｏら（編）（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ １９９３）のＢｒｏｗｎ，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」を参照されたい。陽電子を放射する放射性核種（ＰＥＴ同位体）、例えば、５１１ｋｅＶのエネルギーを持つもの（例えば、^１８Ｆ、^６８Ｇａ、^６４Ｃｕ、および^１２４Ｉ）の使用も好ましい。このような放射性核種は、周知のＰＥＴ走査技術によって画像化し得る。

実施例
実施例１．ペプチドＩＭＰ２７２のＦ−１８標識
使用した最初のペプチドは、ＩＭＰ２７２:
ＤＴＰＡ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１５１２）
であった。

酢酸緩衝溶液
− 酢酸１．５０９ｇを約１６０ｍＬの水に溶かし、１Ｍ ＮａＯＨの添加によってｐＨを調整し、その後、２５０ｍＬまで希釈すると、０．１Ｍ溶液（ｐＨ４．０３）が得られた。

酢酸アルミニウム緩衝溶液
− ０．１０２８ｇのＡｌＣｌ_３六水和物を４２．６ｍＬのＤＩ水に溶かすことによって、アルミニウムの溶液を調製した。このアルミニウム溶液の４ｍＬアリコートを、１６ｍＬの０．１Ｍ
ＮａＯＡｃ溶液（ｐＨ４）と混合すると、２ｍＭ Ａｌストック溶液が得られた。

ＩＭＰ２７２酢酸緩衝溶液
− ペプチド（０．００１１ｇ、７．２８×１０^−７ｍｏｌ ＩＭＰ２７２）を、３６４μＬの０．１Ｍ酢酸緩衝溶液（ｐＨ４）に溶かすと、２ｍＭのペプチドストック溶液が得られた。

ＩＭＰ２７２のＦ−１８標識
− アルミニウムストック溶液の３μＬアリコートをＲＥＡＣＴＩ−ＶＩＡＬ（商標）中に入れ、５０μＬのＦ−１８（受け取ったままの状態）および３μＬのＩＭＰ２７２溶液と混合した。この溶液を加熱ブロック中、１１０℃で１５分間加熱し、逆相ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣトレース（図示せず）により、９３％が遊離のＦ−１８標識であり、７％がペプチドに結合していることが示された。この反応物に、さらに１０μＬのＩＭＰ２７２溶液を添加し、それを再び加熱し、逆相ＨＰＬＣで分析した（図示せず）。ＨＰＬＣトレースにより、８％のＦ−１８がボイド容量にあり、９２％の活性がペプチドに付着していることが示された。このペプチド溶液の残りを、１５０μＬのＰＢＳとともに、室温で約１時間インキュベートし、その後、逆相ＨＰＬＣで調べた。ＨＰＬＣ（図示せず）により、５８％のＦ−１８がペプチドに結合しておらず、４２％が依然としてペプチドに付着していることが示された。このデータから、リン酸塩と混合した場合、Ｆ−１８−Ａｌ−ＤＴＰＡ錯体が不安定となり得るということが示される。

逆相ＨＰＬＣ
− 逆相ＨＰＬＣ分析を以下の条件下で行なった。
カラム：ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）
ＸＴＥＲＲＡ（商標） ＭＳ Ｃ_１８ ５μｍ、４．６×２５０ｍｍ
流速：１ｍＬ／分
勾配緩衝液：緩衝液Ｃ（ＤＩ水中の０．１％ＮＨ_４ＯＡｃ）、緩衝液Ｄ（９０％アセトニトリル、１０％水、および０．１％ＮＨ_４ＯＡｃ）
勾配：線形勾配を用いて３０分かけて１００％緩衝液Ｃから１００％緩衝液Ｄへ
操作時間：３０分

サイズ排除ＨＰＬＣ
− サイズ排除ＨＰＬＣを以下の条件下で行なった。
カラム：ＢＩＯＲＡＤ（登録商標）
ＢＩＯ−ＳＩＬ（商標） ＳＥＣ２５０、３００×７．８ｍｍ
勾配：均一濃度（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）
溶出緩衝液：０．２Ｍリン酸塩（ｐＨ６．８）
流速：１ｍＬ／分
操作時間：３０分

ＰＥＲＫＩＮ
ＥＬＭＥＲ（登録商標） ６１０Ｔｒを用いて、全ての放射計トレースを得、Ｆ−１８の放射をモニタリングした。表１〜３は、表形式でデータを表示したものである。

標識ペプチドの溶液を１ｃｃ（３０ｍｇ）ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）
ＨＬＢカラム（品番１８６００１８７９）に適用し、３００μＬの水で洗浄して、未結合のＦ−１８を除去することにより、標識ペプチドを精製した。このカラムを１００μＬのＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１）で２回洗浄することにより、ペプチドを溶出した。精製ペプチドを水中、２５℃でインキュベートし、逆相ＨＰＬＣで分析した（図示せず）。ＨＰＬＣ分析により、Ｆ−１８標識ＩＭＰ２７２が水中で安定でないことが示された。水中で４０分インキュベートした後、８３％は保持されたが、約１７％のＦ−１８がペプチドから放出された（図示せず）。

実施例２．Ｆ−１８
ＩＭＰ２７２の免疫反応性
ペプチド（１６μＬの２ｍＭ
ＩＭＰ２７２、４８μｇ）をＦ−１８で標識し、抗体結合についてサイズ排除ＨＰＬＣで分析した。サイズ排除ＨＰＬＣにより、このペプチドは、ｈＭＮ−１４×６７９に結合するが、関連する二重特異性抗体ｈＭＮ−１４×７３４に結合しないということが示された（図示せず）。

実施例３．他の金属を用いたＩＭＰ２７２のＦ−１８標識
金属ストック溶液の約３μＬアリコート（６×１０^−９ｍｏｌ）を、ポリプロピレン円錐形バイアル中に入れ、７５μＬのＦ−１８（受け取ったままの状態）と混合し、室温で約２分間インキュベートした後、０．１Ｍ
ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の２０μＬの２ｍＭ（４×１０^−８ｍｏｌ） ＩＭＰ２７２溶液と混合した。この溶液を、加熱ブロック中、１００℃で１５分間加熱し、逆相ＨＰＬＣで分析した。ＩＭＰ２７２は、インジウム（２４％）、ガリウム（３６％）、ジルコニウム（１５％）、ルテチウム（３７％）、およびイットリウム（２％）で標識された（図示せず）。

実施例４．他のペプチドのＡｌ−^１８Ｆ結合をスクリーニングするために使用された標準的なＦ−１８ペプチド標識条件
２ｍＭアルミニウムストック溶液の３μＬアリコートをポリプロピレン円錐形バイアル中に入れ、５０μＬのＦ−１８（受け取ったままの状態）と混合し、室温で約２分間インキュベートした後、０．１Ｍ
ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の１６〜２０μＬの２ｍＭペプチド溶液と混合した。この溶液を、加熱ブロック中、１００℃で１５分間加熱し、逆相ＨＰＬＣ（ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（商標）、ＧＥＭＩＮＩ（登録商標）、５μ、Ｃ−１８、１１０Ａ、２５０×４．６ｍｍ
ＨＰＬＣカラム）で分析した。

検査したペプチド
ＩＭＰ２７２：ＤＴＰＡ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１５１２）（図１）
ＩＭＰ２８８：ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１４５３）（図２）
ＩＭＰ３２６：ＤＴＰＡ−ＩＴＣ−ＮＨ−ＮＨ−Ｐｈｅ−ＣＯ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１４７７）（図３）ＩＭＰ３２９：デフェロキサミン−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−ＮＨ−Ｐｈ−ＣＯ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−ＬｙＳ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１８０４）（図４）
ＩＭＰ３３１：ＮＴＡ−ｉＡｓｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１２４０）（図５）
ＩＭＰ３３２：ＥＤＴＡＤｐｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｓｙ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１３２７）（図６）
ＩＭＰ３３３：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１８４５）（図７）
ＩＭＰ３３４：（Ｈ_２Ｏ_３Ｐ）_２−Ｃ（ＯＨ）−（ＣＨ２）_３−ＮＨ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１１９２）（図８）
ＩＭＰ３３７：Ａｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ_３Ｈ_２）−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ_３Ｈ_２）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１２９１）
ＩＭＰ３３８：Ａｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ_３Ｈ_２）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１１２６）
ＩＭＰ３４５：ＤＴＰＡ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ_３Ｈ_２）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１４５９）
ＩＭＰ３４９：ＤＴＰＡ−Ｄ−Ｃｙｓ（（Ｈ_２Ｏ_３Ｐ）_２−ＣＨ−ＣＨ_２−Ｓ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１５８３）（図９）
ＩＭＰ３６１：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（ＢｒＣＨ_２ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１４９８）
ＩＭＰ３６６：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｐｈ−Ｓ−ＣＨ_２ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１５２８）
ＩＭＰ３６８：Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１２９２）（図１０）
ＩＭＰ３６９：Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ−ＮＨ−ＣＨ（２−Ｂｒ−Ｐｈｅ−）−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１５１７）
ＩＭＰ３７０：Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ−ＮＨ−ＣＨ（２−Ｏ_２Ｎ−Ｐｈｅ−）−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１４８４）
ＩＭＰ３７１：ＤＴＰＡ−ＮＨ−ＣＨ（２−Ｏ_２Ｎ−Ｐｈｅ−）−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１４８４）
ＩＭＰ３７２：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｓｅｒ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１４６５）
ＩＭＰ３７３：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１７５３）
ＩＭＰ３７４：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｃｌ−ＣＨ２ＣＯ−Ｃｙｓ（Ｅｔ）−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１５８５）
ＩＭＰ３７５：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−Ｂｒ−Ｐｈｅ−ＣＨＮＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１６０３）（図１１）
ＩＭＰ３７６：ＤＴＰＡ−Ｃｙｓ（ＨＯ_３Ｓ−Ｓ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１５５８）
ＩＭＰ３７９：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−Ｈ_２Ｎ−Ｐｈｅ−ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１４９７）
ＩＭＰ３８２：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｈ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１３７８）
ＩＭＰ３８３：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｇｌａ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１５０７）
ＩＭＰ３８４：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−ＨＯ−Ｐｈｅ−ＣＨＮＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１５４１）（図１２）
ＩＭＰ３８５：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｄｐｒ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１４６４）
ＩＭＰ３８６：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−ピリジル−ＣＨ_２−ＣＨＮＨ_２−ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１５２６）（図１３）
ＩＭＰ３８７：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｄ−９−アントリルアラニン）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１６２５）
ＩＭＰ３８９：ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−カルボキシピペリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１４９０）（図１４）
ＩＭＰ４６０：ＮＯＤＡ−ＧＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１３６６）

有用である可能性があるペプチドのさらなる例を図１５および図１６に示す。図１６は、ＩＭＰ４２２、ＩＭＰ４２６、およびＩＭＰ４２８の構造を示す。以下で考察するように、ＩＭＰ４４９（図１５）は、標識技術および画像化技術に有用な、Ｆ−１８コンジュゲートされたペプチドのインビボ条件下での特段の安定性を示す。

図１７は、ＮＯＴＡ型配位子の代替の形状を示す。ＮＯＴＡ部分は、ＤパラニトロフェニルアラニンまたはＬパラニトロフェニルアラニンから作ることができ、イミノ二酢酸部分は、ジアミノプロピオン酸（これはＤ体またはＬ体であり得る）に由来する。さらに、エチレン架橋の部分をジアミノプロピオン酸と入れ替えて、この配位子上に異なる形状の基を生じさせることができる。これらの修飾は全て、後に形成される錯体の結合反応速度および安定性に影響を及ぼし得る。図１８は、例えば、Ｇａ−６８またはＦ−１８で標識し得る、ＮＯＤＡ−Ｇａペプチドの構造を示す。

ある実施形態において、代替のキレート部分を用いて、^１８Ｆ−金属錯体または^１８Ｆ−ホウ素錯体に結合させ得る。図２２Ａ〜Ｄは、ＮＥＴＡの構造をベースにしたいくつかの例示的な潜在的キレート部分を示す。上で考察したように、Ｃｈｏｎｇら（２００７）は、様々な金属と錯体を形成したときに、ＮＥＴＡ配位子が血清安定性の向上を示し得るということを報告している。^１８Ｆ−金属に対するペプチドの結合親和性を増大させるように、キレート剤の設計も最適化し得る。

ペプチド標識スクリーニング研究の結果
ほとんどのＤＴＰＡ誘導体は、ＩＭＰ２７２の標識に匹敵する標識を示した。例外もあり、システイン側鎖上にビスホスホン酸基を持つＩＭＰ３４９は、非常に標識されにくかった。ＤＯＴＡ配位子は、Ａｌ−^１８Ｆに結合しなかった。ＩＭＰ３２６のＩＴＣ ＤＴＰＡ配位子は、ＤＴＰＡと同じぐらい十分にはＡｌ−^１８Ｆに結合しなかった。ＩＭＰ３３１のＮＴＡ配位子は、Ａｌ−^１８Ｆに結合しなかった。ＩＭＰ３３２のＥＤＴＡ配位子は、Ａｌ−^１８Ｆに結合したが、ＤＴＰＡほどではなかった。対称ＤＴＰＡ配位子は、Ａｌ−^１８Ｆに結合しなかった。検査したホスホン酸基およびリン酸基は、検査した条件の下では十分にＡｌ−^１８Ｆに結合しなかった。このスクリーニングにより、ＤＴＰＡの近くに付着している基が、Ａｌ−^１８Ｆ−ＤＴＰＡ錯体の安定性に影響を及ぼし得るということが実際に示された。このスクリーニングにより、ＩＭＰ３７５がより良く標識され、ＩＭＰ２７２よりも著しく安定な錯体を形成することが示された。ＩＭＰ３７５は十分に標識され、水中で安定であり、２５℃で５時間経った後、９５．４％が結合したままであることが示された（図示せず）。インビボでの使用のためには、高い血清安定性を有するペプチドが好ましいと考えられる。

ペプチド標識スクリーニング研究では、Ａｌ−^１８Ｆの結合だけを調べた。Ａｌ−^１８Ｆで十分に標識されなかったペプチドの中には、Ｆ−１８に結合した別の金属でより良く標識されるものがある可能性もある。

ペプチド合成
ペプチドは、Ｆｍｏｃ戦略を用いて固相ペプチド合成によって合成した。Ｆｍｏｃ／Ａｌｏｃ保護基を用いることによって基をジアミノアミノ酸の側鎖に付加し、示差的に脱保護した。使用する酢酸に対して１：１の比でピペリジンを添加することを除き、Ｄａｎｇｌｅｓら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８７，５２：４９８４−４９９３）の方法によって、Ａｌｏｃ基を除去した。非対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡは、ＭｃＢｒｉｄｅら（米国特許出願公開第２００５／０００２９４５ Ａ１号、米国特許出願第１０／７７６，４７０号（公開日２００５年１月６日））に記載されている通りに作製した。トリ−ｔ−ブチルＤＯＴＡ、対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡ、およびＩＴＣ−ベンジルＤＴＰＡは、ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣＳ（登録商標）から入手した。Ａｌｏｃ／ＦｍｏｃリジンおよびＤａｐ（ジアミノプロピオン酸誘導体（Ｄｐｒとも呼ばれる））は、ＣＲＥＯＳＡＬＵＳ（登録商標）またはＢＡＣＨＥＭ（登録商標）から入手した。Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂は、ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）から入手した。残りのＦｍｏｃアミノ酸は、ＣＲＥＯＳＡＬＵＳ（登録商標）、ＢＡＣＨＥＭ（登録商標）、ＰＥＰＴＥＣＨ（登録商標）、またはＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）から入手した。

ＩＭＰ２７２を記載されている通りに合成した（ＭｃＢｒｉｄｅら，米国特許出願公開第２００４０２４１１５８ Ａ１号、米国特許出願第１０／７６８，７０７号（２００４年１２月２日出願））。ＩＭＰ２８８を記載されているように作製した（ＭｃＢｒｉｄｅら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２００６，４７：１６７８−１６８８）。

ＩＭＰ３２６：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、および４−（Ｂｏｃ−ＮＨ−ＮＨ−）Ｃ_６Ｈ_４−ＣＯ_２Ｈをこの順に用いて、ヒドラジンペプチド（ＩＭＰ３１９）をＳｉｅｂｅｒアミド樹脂上で作製した。４−（Ｂｏｃ−ＮＨ−ＮＨ−）Ｃ_６Ｈ_４−ＣＯ_２Ｈは、ジオキサン水酸化ナトリウム溶液中の４−ヒドラジノ安息香酸に二炭酸Ｂｏｃを添加することにより作製した。

Ｂｏｃ−ヒドラジドを添加した後、側鎖Ａｌｏｃ基を除去し、トリチル−ＨＳＧ−ＯＨ基をリジンの側鎖に付加した。その後、ＴＦＡを用いてこのペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣで精製すると、所望のヒドラジンビス−ＨＳＧペプチドＩＭＰ３１９（ＭＨ^＋１２０１）が得られた。その後、このヒドラジドペプチド（０．０９１４ｇ）を、３ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．２）中の０．０６５０ｇのＩＴＣ−ベンジルＤＴＰＡと混合した。この溶液のｐＨを１Ｍ
ＮａＯＨを用いて調整し、ｐＨをｐＨ８．２に保った。ペプチドとＩＴＣ−ベンジルＤＴＰＡとの反応が終了した後、ペプチドコンジュゲートをＨＰＬＣで精製した。

ＩＭＰ３２９：１０ｍＬのメタノール／水（１：１）中で１．０４２２ｇのメシル酸デフェロキサミン（１．５９×１０^−３ｍｏｌ）を０．２８３５ｇ（１．５９×１０^−３ｍｏｌ）のチオカルボニルジイミダゾールと混合することによって、デフェロキサミンイソチオシアネートを調製した。トリエチルアミン０．２３ｍＬを添加し、２．５時間後、この反応物を逆相ＨＰＬＣで精製すると、デフェロキサミンイソチオシアネート（ＭＮａ^＋６２５）が得られた。

ヒドラジンペプチドＩＭＰ３１９（０．０５３３ｇ、４．４×１０^−５ｍｏｌ、ＭＨ^＋１２０１）を、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．１）中で０．０２９１ｇのデフェロキサミンイソチオシアネートと２時間混合し、その後、ＨＰＬＣで精製すると、所望の生成物（ＭＨ＋１８０４）が得られた。

ＩＭＰ３３１：以下のアミノ酸を、以下に示す順に、すなわち、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨの順に、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ）に付着させた。Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨをリジンの側鎖に付加した。Ｆｍｏｃを除去した後、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨとＦｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＢｕｔをこの順に付加した（樹脂０．５ｇ）。Ｆｍｏｃを除去し、３．４ｍＬのＮＭＰ中で３ｍＬブロモ酢酸ｔ−ブチルおよび３．６ｍＬジイソプロピルエチルアミンを用いてＡｓｐの窒素を一晩アルキル化した。ペプチドを、ＴＦＡを用いて樹脂から切断し、逆相ＨＰＬＣで精製すると、所望のペプチド（ＭＨ^＋１２４０）が得られた。

ＩＭＰ３３２：ペプチドを３ｇのＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ）上で作製した。以下のアミノ酸を、以下に示す順に、すなわち、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨの順に樹脂に付加した。後の合成のために、この樹脂をいくつかの部分に分けた。樹脂１ｇを取り除き、ジアミノプロピオン酸からＦｍｏｃ基を除去した。３ｍＬブロモ酢酸ｔ−ブチル、３．６ｍＬジイソプロピルエチルアミン、および３．４ｍＬ
ＮＭＰを用いて、ペプチドを一晩アルキル化した。その後、側鎖Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ基を付加した。その後、このペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣで精製すると、生成物（ＭＨ^＋１３２７）が得られた。

ＩＭＰ３３３：ＩＭＰ３３２を作製するのに使用したのと同じ樹脂１ｇを用いてペプチドを作製した。ＤＴＰＡテトラ−ｔ−ブチルエステル（米国特許公開第２００５０００２９４５号）をＤｐｒ基の両方のアミンに付加した。その後、Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ基を付加した。その後、このペプチドを切断し、ＨＰＬＣで精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１８４５）が得られた。

ＩＭＰ３３４：以下のアミノ酸を以下に示す順に、すなわち、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨの順に付加して、１ｇのＲｉｎｋアミド樹脂（０．７ｍｍｏｌ／ｇ）上でペプチドを作製した。Ａｌｏｃ基を除去し、トリチル−ＨＳＧ−ＯＨを付加した。ＴＦＡを用いて、このペプチドを樹脂から切断した。エーテルから沈殿させて粗ペプチドを回収し、乾燥させた。過ヨウ素酸ナトリウム０．３３ｇを１５ｍＬの水に溶かした。粗ペプチドを、１ｍＬの０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、３ｍＬの水、および１ｍＬの過ヨウ素酸溶液に溶かした。さらに３ｍＬの過ヨウ素酸を１ｍＬずつ約２時間かけて添加した。その後、この混合物を逆相ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥すると、アルデヒドＩＭＰ２８９
ＨＣＯ−ＣＯ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋９５９）が得られた。アレンドロン酸塩（０．０２９５ｇ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標））を１５０μＬの０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）に溶かした。このペプチドＩＭＰ２８９（０．０５００ｇ）を１００μＬの水中１３％イソプロパノールに溶かした。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、その混合物をＨＰＬＣで精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１１９２）が得られた。

ＩＭＰ３３７＆ＩＭＰ３３８：以下のアミノ酸を以下に示す順に付加して用いて、すなわち、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ、およびＡｃ_２Ｏの順に、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でペプチドを作製した。Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ基をリジンの側鎖に付加した。このペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣで精製すると、所望の生成物ＩＭＰ３３７（ＭＨ^＋１２９１）とＩＭＰ３３８（ＭＨ^＋１１２６）が得られた。

ＩＭＰ３４５：以下のアミノ酸を以下に示す順に付加して用いて、すなわち、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ、およびテトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡの順に、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でペプチドを作製した。Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ基をリジンの側鎖に付加した。このペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣで精製すると、所望の生成物ＩＭＰ３４５（ＭＨ^＋１４５９）が得られた。

ＩＭＰ３４９：以下のアミノ酸を以下に示す順に付加して用いて、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上で、ペプチドＩＭＰ３４７
ＤＴＰＡ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２を作製した。すなわち、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、およびテトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを付加した。このペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣで精製すると、所望の生成物ＩＭＰ３４７（ＭＨ^＋１３９５）が得られた。このペプチドＩＭＰ３４７、０．０４４６ｇ（３．２×１０^−５ｍｏｌ）を、３ｍＬの水中の０．４６０５ｇ（２．４×１０^−３ｍｏｌ）のエテニリデンビス（ホスホン酸）（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８６，５１：３４８８−３４９０）と混合し、１Ｍ
ＮａＯＨを１滴ずつ添加してこの溶液をｐＨ６．５に合わせた。この反応物を一晩撹拌し、その反応溶液を、過剰なエテニリデンビス（ホスホン酸）を添加することによってｐＨ１．４９に合わせた。この混合物を室温で一晩撹拌した後、ＨＰＬＣで精製すると、所望のペプチドＩＭＰ３４９（ＭＨ^＋１５８３）が得られた。

ＩＭＰ３６１：以下のアミノ酸を以下に示す順に付加して用いて、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でペプチドを作製した。すなわち、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、およびテトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを付加した。Ｄａｐの側鎖上のＡｌｏｃを除去し、無水ブロモ酢酸を用いてブロモアセチルを付加した。粗生成物をＨＰＬＣで精製すると、所望のペプチドＩＭＰ３６１（ＭＨ^＋１４９８）が得られた。

ＩＭＰ３６６：フェニルチオ酢酸を最後に添加してＩＭＰ３６１と同じ方法でペプチドを作製した。粗生成物をＨＰＬＣで精製すると、生成物ＩＭＰ３６６（ＭＨ^＋１５２８）が得られた。

ＩＭＰ３６８：システイン残基を付加しないで、非対称ＤＴＰＡの代わりに対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡ（ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣＳ（登録商標））を使用することを除き、ＩＭＰ３４９について記載されているようにペプチドを作製し、精製した後、所望の生成物ＩＭＰ３６８（ＭＨ^＋１２９２）が得られた。

ＩＭＰ３６９：Ｄ−Ｃｙｓの代わりにＦｍｏｃ−Ｒ−３−アミノ−３−（２−ブロモフェニル）プロピオン酸を付加し、ＤＴＰＡテトラ−ｔ−ブチルエステルの非対称バージョンの代わりに対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを付加して、ＩＭＰ３４９について記載されているようにペプチドを作製した。粗ペプチドを精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１５１７）が得られた。

ＩＭＰ３７０：Ｆｍｏｃ−Ｒ−３−アミノ−３−（２−ブロモフェニル）プロピオン酸の代わりにＦｍｏｃ−Ｒ−３−アミノ−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸を使用することを除き、ＩＭＰ３６９について記載されているようにペプチドを作製した。ＨＰＬＣで精製した後、所望の生成物（ＭＨ^＋１４８４）が得られた。

ＩＭＰ３７１：非対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡをその対称バージョンの代わりに使用することを除き、ＩＭＰ３７０について記載されているようにペプチドを作製した。ＨＰＬＣで精製した後、所望の生成物（ＭＨ^＋１４８４）が得られた。

ＩＭＰ３７２：Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨを用いてＳｅｒをＤａｐ側鎖に付着させ、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。Ｆｍｏｃを除去し、このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１４６５）が得られた。

ＩＭＰ３７３：対称テトラ−ｔ−ブチルエステルＤＴＰＡを用いてＳｙｍ−ＤＴＰＡをＤａｐ側鎖に付着させ、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１７５３）が得られた。

ＩＭＰ３７４：Ｆｍｏｃ−Ｓ−エチルシステインをＤａｐ側鎖に付加し、その後、クロロ酢酸無水物を介して（システイン窒素上の）クロロアセチルを付加して、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１５８５）が得られた。

ＩＭＰ３７５：Ｆｍｏｃ−Ｒ−３−アミノ−３−（２−ブロモフェニル）プロピオン酸をＤａｐ側鎖に付加し、その後、Ｆｍｏｃ基を切断して、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１６０３）が得られた。

ＩＭＰ３７６：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨを２番目のアラニンの後ろに付加し、その後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＯ_３Ｈ）およびテトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを付加して、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１５５８）が得られた。

ＩＭＰ３７９：Ｂｏｃ−２−Ａｂｚ−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加して、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１４９７）が得られた。

ＩＭＰ３８２：ＡｌｏｃをＤａｐの側鎖から除去して、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１３７８）が得られた。

ＩＭＰ３８３：Ｆｍｏｃ−Ｇｌａ（ＯＢｕｔ）_２−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加して、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋−ＣＯ_２１５０７）が得られた。

ＩＭＰ３８４：Ｆｍｏｃ−Ｂｏｃ−Ｓ−３−アミノ−３−（２−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸をＤａｐの側鎖に付加して、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１５４１）が得られた。

ＩＭＰ３８５：Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加して、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１４６４）が得られた。

ＩＭＰ３８６：Ｂｏｃ−Ｄ−２−ピリジルアラニン−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加して、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１５２６）が得られた。

ＩＭＰ３８７：Ｆｍｏｃ−Ｄ−９−アントリルアラニン−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加して、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１６２５）が得られた。

ＩＭＰ３８９：ビス−Ｂｏｃ−ピペラジン−２−カルボキシレートをＤａｐの側鎖に付加して、ＩＭＰ３６１について記載されているようにペプチドを作製した。このペプチドを樹脂から切断し、精製すると、所望の生成物（ＭＨ^＋１６６４）が得られた。

実施例５．Ｆ−１８標識ペプチドを調製および分離する代替の方法
ある実施形態において、加熱を用いて、Ａｌ−Ｆ−１８錯体をＮＯＴＡキレート基に入れる。あるいは、ＩＴＣベンジルＮＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）をＡｌ−Ｆ−１８で標識し、標識後、他の熱感受性分子（例えば、タンパク質）にコンジュゲートすることができる。高比放射能が必要な場合、ＩＴＣベンジルＮＯＴＡ錯体を精製して、コールドの配位子を除くことができる。

Ａｌをペプチドに付加し、そのＨＰＬＣプロファイルを空のＮＯＴＡペプチドおよびＡｌ−Ｆ−１８ペプチドと比較した。ＡｌペプチドとＡｌ−Ｆ−１８ペプチドは、ＨＰＬＣでほとんど同じ保持時間を有し、未標識ペプチドに対して約１分長い保持時間を有する。３ｍＬ／分の流速を用いてＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（商標）
ＯＮＹＸ（登録商標）モノリシックＣ−１８ １００×４．５ｍｍカラムでペプチドを精製した。緩衝液Ａは、水中の０．１％ＴＦＡであり、緩衝剤Ｂは、９０％ＣＨ_３ＣＮ、１０％水、および０．１％ＴＦＡであった。線形勾配は、１００％緩衝剤Ａから７５：２５のＡ／Ｂへと１５分かけて移行した。Ａｌ錯体はＡｌ−Ｆ−１８錯体と共溶出されるので、添加されるＡｌおよびＦ−１８の量が比放射能を決定すると考えられる。

ＩＭＰ４４９を下記の実施例７に従って調製し、以下のように標識した。水中（約３２５μＬ）に１５ｍＣｉのＦ−１８を含有する２．０ｍＬ
Ｆｉｓｈｅｒ微小遠心管バイアル（０２−６８１−３７４）にＦ−１８を入れた。０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中の３μＬの２ｍＭ ＡｌＣｌ_３をこのＦ−１８溶液に添加し、その後、ボルテックスで混合した。約４分後、０．５Ｍ
ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中の１０μＬの０．０５Ｍ ＩＭＰ４４９を添加した。この試料を再びボルテックスで混合し、１０２℃の加熱ブロック中で１７分間加熱した。その後、この反応物を短く冷却し、その後、バイアルの中身を取り去り、上記のようにＨＰＬＣで精製した。

別々に、ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）
ＡＬＬＩＡＮＣＥ（商標）分析システムで溶出条件を決定し、標識ペプチドを７．５分〜８．５分の間で溶出した。分析的ＨＰＬＣにより、標識ペプチドは、Ａｌ−Ｆ
ＩＭＰ４４９（ＵＶ ２２０ｎｍ）を含有し、錯体を形成しないペプチドを含有せず、結果として比放射能の増大をもたらすことが示された。

ペプチドを水に希釈し、その後、ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＯＡＳＩＳ
ＰＬＵＳ ＨＬＢ（商標）抽出カラムに通した。標識ペプチドを３ｍＬのＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１）で溶出した。溶出物のＨＰＬＣ分析により、このカラムが標識ペプチドを効率的に捕捉し、これによって、このペプチドからアセトニトリルとＴＦＡを洗い流すことができることが確認された。ＨＰＬＣにより、ＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１）溶出物が、希釈後のインジェクションに好適な溶媒中に遊離したＦ−１８を含まない所望の生成物を含有することも示された。精製後の見かけの収率は１１％であった。

実施例６．インビボ研究
ＧＷ−３９ヒト大腸異種移植片腫瘍を担持するヌードマウス（１００〜５００ｍｇ）に二重特異性抗体ｈＭＮ−１４×ｍ６７９（１．５×１０^−１０ｍｏｌ）を注射する。抗体を２４時間除去した後、Ｆ−１８標識ＨＳＧを有するペプチド（８．８μＣｉ、１．５×１０^−１１ｍｏｌ）を注射する。注射してから３時間、２４時間、および４８時間後に、動物を画像化する。ｈＭＮ−１４の腫瘍抗原への結合により腫瘍に局在化する二重特異性ｈＭＮ−１４×ｍ６７９に結合したＦ−１８標識ペプチドのＰＥＴ走査検出によって、異種移植片腫瘍を明瞭に画像化する。

実施例７．血清安定性Ｆ−１８標識ペプチドの産生および使用
ＩＭＰ４４９
ＮＯＴＡ−ＩＴＣベンジル−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１４５９）（図１５）
以下のアミノ酸を以下に示す順序でＳｉｅｂｅｒアミド樹脂に付加することによって、この樹脂上でペプチドＩＭＰ４４８
Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２（ＭＨ^＋１００９）を作製した。すなわち、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨを付加し、最後にＦｍｏｃを切断して、所望のペプチドを作製した。その後、このペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣで精製すると、ＩＭＰ４４８が生成され、その後、これをＩＴＣベンジルＮＯＴＡに結合させた。ペプチドＩＭＰ４４８（０．０７５７ｇ、７．５×１０^−５ｍｏｌ）を、０．０５０９ｇ（９．０９×１０^−５ｍｏｌ）のＩＴＣベンジルＮＯＴＡと混合し、１ｍＬの水に溶かした。その後、撹拌したペプチド／ＮＯＴＡ溶液に無水炭酸カリウム（０．２１７１ｇ）をゆっくりと添加した。炭酸塩を全て添加した後、この反応溶液はｐＨ１０．６であった。この反応物を室温で一晩撹拌した。１４時間後、１Ｍ
ＨＣｌで慎重に反応を静め、ＨＰＬＣで精製すると、所望の生成物ＩＭＰ４４９が４８ｍｇ得られた（図１５）。

ＩＭＰ４４９のＦ−１８標識
ペプチドＩＭＰ４４９（０．００２ｇ、１．３７×１０^−６ｍｏｌ）を、６８６μＬ（２ｍＭペプチド溶液）の０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０２）に溶かした。３μＬの２ｍＭ
Ａｌの酢酸緩衝液（ｐＨ４）溶液を、１５μＬの１．３ｍＣｉ Ｆ−１８と混合した。その後、この溶液を２０μＬの２ｍＭ ＩＭＰ４４９溶液と混合し、１０５℃で１５分間加熱した。逆相ＨＰＬＣ分析により、放射能の３５％（保持時間約１０分）がペプチドに付着し、放射能の６５％がカラムのボイド容量（３．１分、図示せず）で溶出されることが示され、放射能の大部分がペプチドと結合しないことが示された。粗標識混合物（５μＬ）をヒトプール血清と混合し、３７℃でインキュベートした。１５分後にアリコートを取り去り、ＨＰＬＣで分析した。放射能の９．８％が依然としてペプチドに付着している（３５％から減少）ことがＨＰＬＣにより示された。１時間後に別のアリコートを取り去り、ＨＰＬＣで分析した。放射能の７．６％が依然としてペプチドに付着している（３５％から減少）ことがＨＰＬＣにより示されたが、これは１５分での量と本質的に同じであった（データは示さない）。

高線量Ｆ−１８標識
精製ＩＭＰ４４９を用いたさらなる研究により、Ｆ−１８標識ペプチドが、ヒト血清中、３７℃で少なくとも１時間、極めて安定であり（９１％、図示せず）、かつヒト血清中、３７℃で少なくとも４時間、ある程度安定である（７６％、図示せず）ことが示された。これらの結果により、本明細書に開示されたＦ−１８標識ペプチドが、Ｆ−１８画像化研究に使用されるインビボに近似した条件下で十分な安定性を示すことが示されている。

約４００μＬの水中のＦ−１８（約２１ｍＣｉ）を、０．１Ｍ
ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中の９μＬの２ｍＭ ＡｌＣｌ_３と混合した。６０μＬのペプチドＩＭＰ４４９（０．５ ＮａＯＨ（ｐＨ４．１３）中に０．０１Ｍ、６×１０^−７ｍｏｌ）を添加し、この溶液を１１０℃で１５分間加熱した。その後、この反応溶液を１ｃｃ
ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＨＬＢカラム筒に入れ、水で溶出して、未結合のＦ−１８を除去し、次いでＥｔＯＨ／Ｈ２０（１：１）でＦ−１８標識ペプチドを溶出することによって、粗標識ペプチドを精製した。粗反応溶液をカラムに通して廃棄バイアルに入れ、カラムを１ｍＬずつの水で３回洗浄した（１８．９７ｍＣｉ）。その後、ＨＬＢカラムを新しいバイアルの上に置き、２００μＬのＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１）で２回溶出し、標識ペプチドを回収した（１．８３ｍＣｉ）。全ての溶出が終了した後、カラムは０．１ｍＣｉの放射能を保持していた。精製されたＦ−１８標識ペプチドのアリコート（２０μＬ）を、２００μＬのヒトプール血清と混合し、３７℃で加熱した。（上記のように）逆相ＨＰＬＣでアリコートを分析した。この結果により、ヒト血清中でインキュベートしてから０時間、１時間（９１％標識ペプチド）、２時間（７７％標識ペプチド）、および４時間（７６％標識ペプチド）の時点におけるＦ−１８標識された精製ＩＭＰ４４９の３７℃での相対的な安定性が示された（図示せず）。Ｆ−１８標識ＩＭＰ４４９は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーで使用されることもあるＴＦＡ溶液中で安定であることも観察された。本明細書に記載の例示的なＦ−１８標識分子について観察されたＴＦＡ中での安定性とヒト血清中での安定性の間には一般的相関があるように思われる。これらの結果により、本明細書に開示された方法によって生成されるＦ−１８標識ペプチドが、例えば、標識された細胞または組織を検出するのにＰＥＴ走査を使用する、インビボでの標識研究および画像化研究に首尾よく使用されるのに十分なヒト血清中での安定性を示すことが示されている。

実施例８．ＳＣＩＤマウスにおけるＦ−１８標識ＩＭＰ４４９のインビボ生体分布
Ｆ−１８標識ＩＭＰ４４９を上記のように調製した（実施例７）。この物質をＯＡＳＩＳ（登録商標）ＨＬＢカラム（ＷＡＴＥＲＳ（登録商標），Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で精製した。未結合の物質を水で洗い流し、カラムに結合した標識ペプチドを、エタノールと水の１：１混合物で溶出した。両方の画分を逆相Ｃ１８
ＨＰＬＣで分析した。精製ペプチドは、逆ＨＰＬＣカラムでいくつかのピークとして溶出した（図示せず）。ＯＡＳＩＳ（登録商標）カラムから回収された未結合画分は、Ｃ１８カラムからの少ない回収（７％）を示した（図示せず）。

「未結合」画分および精製^１８Ｆ−ＩＭＰ４４９を、ＳＵ−ＤＨＬ６リンパ腫細胞が先に皮下注射されているＳＣＩＤマウスに注射した。ほんの数匹のマウスしか目に見える腫瘍を有していなかった。生体分布データにより、「未結合の」Ｆ−１８画分と精製^１８Ｆ−ＩＭＰ４４９との間の顕著な違いが示された。データを下記の表４〜６に示す。この研究では、標識ペプチドの前に、プレターゲッティング二重特異性抗体が動物に投与されなかったということに留意されたい。これらの結果は、インビボでの遊離のＦ−１８と対比した標識ペプチドの分布を示す。

コンジュゲートしていないＦ−１８は、インビボで骨組織への高レベルの分布を示す。注射２０分後の取込みは、予想通り、主として骨（脊椎）に見られ（約１２〜１５％注射用量／グラム（ＩＤ／ｇ））、腎臓がそれに次いだ（約４％ＩＤ／ｇ）。Ｆ−１８標識の骨組織への局在化は、ターゲッティングペプチドへのコンジュゲーションによって実質的に減少した。ＩＭＰ４４９に結合させた場合、骨への取込みは、注射２０分後に約１％ＩＤ／ｇ、１時間後に０．３％ＩＤ／ｇまで低下し、腎臓への取込みは、注射２０分後に１１％ＩＤ／ｇ、１時間後に３．３％ＩＤ／ｇである。ペプチド単体の腎臓への取込みは、プレターゲッティングされた^１８Ｆ−ＩＭＰ４４９ペプチドの腎臓への取込み（以下の実施例参照）と類似しており、その取込みが、動物が１８時間前にｂｓＭＡｂを投与されていることの結果ではなく、ペプチドの機能であることが示唆された。未結合のＦ−１８と比較して、比較的低い非特異的取込みが、Ｆ−１８標識ペプチドについて脊椎と大腿骨で観察された。

本発明者らは、Ｆ−１８標識ペプチドが、標識研究および画像化研究を首尾よく実施するのに十分なインビボでの安定性を示したと結論付けている。

実施例９．プレターゲッティング抗体を用いたインビボ研究
Ｆ−１８標識ＩＭＰ４４９を以下のように調製した。Ｆ−１８（約０．５ｍＬ中に５４．７ｍＣｉ）を０．１Ｍ
ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の３μＬの２ｍＭ Ａｌと混合した。３分後、０．５Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の１０μＬの０．０５Ｍ ＩＭＰ４４９を添加し、反応物を９６℃の加熱ブロック中で１５分間加熱した。この反応物の中身をシリンジで取り除いた。その後、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ
ＯｎｙｘモノリシックＣ１８、１００×４．６ｍｍカラム（品番ＣＨ０−７６４３）を用いたＨＰＬＣで粗標識ペプチドを精製した。流速は３ｍＬ／分であった。緩衝液Ａは水中の０．１％ＴＦＡであり、緩衝液Ｂは、水中の０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリルであった。勾配は、１００％のＡから７５／２５のＡ：Ｂへと１５分かけて移行した。最初に溶出する標識ペプチドと未標識ペプチドとの間に保持時間の差が約１分あった。ＨＰＬＣ溶出物を０．５分ずつの画分で回収した。使用したＨＰＬＣにもよるが、標識ペプチドは６〜９分の間に溶出された。目的の画分を水に２倍希釈し、その溶液を１ｃｃ Ｗａｔｅｒｓ ＨＬＢカラム筒に入れることによって、ＨＰＬＣ精製したペプチド試料をさらに処理した。このカートリッジを３×１ｍＬの水で溶出して、アセトニトリルとＴＦＡを除去し、次いで４００μＬのＥｔＯＨ／Ｈ２０（１：１）でＦ−１８標識ペプチドを溶出した。

分析的ＨＰＬＣ
Ｃ１８カラムで単一ピークとして溶出される精製^１８Ｆ−ＩＭＰ４４９
４つの増殖の遅い皮下のＣａＰａｎ１異種移植片を担持するＴａｃｏｎｉｃ社製のヌードマウスを使用した。３匹のマウスにＴＦ１０（１６２μｇ）、次いで１８時間後に^１８Ｆ−ＩＭＰ４４９を注射した。ＴＦ１０は、腫瘍画像化研究に有用なヒト化二重特異性抗体であり、ＰＡＭ−４で規定されるＭＵＣ１腫瘍抗原に二価結合し、ＨＳＧに一価結合する（例えば、Ｇｏｌｄら，２００７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５（１８Ｓ）：４５６４参照）。１匹のマウスにはペプチドのみを注射した。ペプチドを注射してから１時間後に、全てのマウスを解剖した。すぐに組織をカウントした。動物＃２は、大腿骨に高いカウントを示した。この大腿骨を新しいバイアルに移し、古い空のバイアルとともに再カウントした。再カウントにより、このカウントが組織に含まれることが示された。この大腿骨を破砕すると、それには大きな筋肉片が付着していた。平均分布を比較することにより、腫瘍ターゲッティング二重特異性抗体の存在下では、どの正常組織よりも実質的に高いレベルのＦ−１８標識ペプチドが腫瘍に局在化することが示された。

組織への取込みは、^１８Ｆ−ＩＭＰ４４９のみを投与された動物またはプレターゲッティング設定の動物で同様であった。１時間でのヒト膵癌異種移植片ＣａＰａｎ１への取込みは、ペプチドのみと比較した場合、プレターゲッティング動物で５倍に増大した（４．６±０．９％ＩＤ／ｇ対０．８９％ＩＤ／ｇ）。抜群の腫瘍／非腫瘍比はこの時点で達成された（例えば、腫瘍／血液比および腫瘍／肝臓比は、それぞれ、２３．４±２．０および２３．５±２．８であった）。

実施例１０．プレターゲッティング抗体を用いた^１１１Ｉｎ−ＩＭＰ４４９対^１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の生体分布の比較
この研究の目的は、二重特異性抗体ＴＦ２をプレターゲッティングした後に、皮下にＬＳ１７４Ｔ異種移植片を担持するヌードマウスにおける^１１１Ｉｎ−ＩＭＰ４４９と^１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の生体分布を比較することであった。ＴＦ２抗体はドック・ロック法により作製されたが、これは、ＣＥＡ腫瘍抗原とＨＳＧハプテンに対する結合部位を含有する（例えば、Ｓｈａｒｋｅｙら，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ２００８，２４６：４９７−５０７；Ｒｏｓｓｉら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００６，１０３：６８４１−４６参照）。一度に十分な数の担腫瘍マウスがいなかったので、この研究は２週に分けて行なった。

^１１１Ｉｎ−ＩＭＰ４４９：より低い比放射能で標識することを除き、ＩＭＰ２２８を標識するのに用いられた手順と同様の手順を用いて^１１１Ｉｎ標識を行なった。ＩＴＬＣおよびＣ−１８逆相ＨＰＬＣにより、約３０％が未結合であることが示された（図示せず）。ＨＬＢカラムで標識ペプチドを精製した（１ｍＬ、３０ｍｇ）。この精製された生成物の分析から、飽和塩化ナトリウム中で発色させたＩＴＬＣによって３３％が未結合である（ストリップの上部２０％）ことが再び示された。逆相ＨＰＬＣにより、精製の前後の複数のピークが示された（図示せず）。精製後のサイズ排除ＨＰＬＣにより、２０倍モル過剰のＴＦ２と混合したとき、放射能の４７％が高分子量に移動することが示された（図示せず）。

^１８Ｆ−ＩＭＰ４４９：他者によって記載されている（Ｋｉｍら，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ ６１，２００４，１２４１−４６）ように標識前にＦ−１８をＱＭＡカートリッジで精製することを除き、上記のように標識を行なった。簡潔に説明すると、Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）
Ｌｉｇｈｔ Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｃｅｌｌ（商標） Ｐｌｕｓ ＱＭＡカートリッジを用意し、１０ｍＬの０．４Ｍ ＫＨＣＯ_３で洗い流し、その後、１０ｍＬのＤＩ水で洗浄した。２ｍＬの水中の^１８Ｆ（４２ｍＣｉ）をＱＭＡカートリッジに充填した。このカートリッジを１０ｍＬのＤＩ水で溶出して、不純物を除去した。その後、このカラムを、２００μＬずつ分割して１ｍＬの０．４Ｍ
ＫＨＣＯ_３で溶出した。画分＃２が放射能の大半（３３ｍＣｉ）を含有していた。その後、Ｆ−１８溶液のｐＨを１０μＬの氷酢酸で調整した。その後、画分＃２由来の^１８Ｆを、０．１Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の３μＬの２ｍＭ Ａｌと混合した。その後、この試料を、０．５Ｍ
ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の１０μＬの０．０５Ｍ ＩＭＰ４４９と混合し、この反応溶液を９４℃で１５分間加熱した。^１８Ｆ−ＩＭＰ４４９を逆相ＨＰＬＣで精製した。生成物を含有する画分をＨＬＢカラムに通して緩衝液を交換した。試料を充填した後、カラムを水で洗浄した。この生成物を４００μＬの容量の水：エタノール（１：１）で溶出した。この生成物の逆相ＨＰＬＣは、肩がある１つの主要ピークを示した（図示せず）。収率が低かったので、比放射能は低く、より多くのペプチドがマウスに注射されたために、ｂｓＭＡｂ：ペプチドの比が、１０：１ではなく、６．９：１になった。

結果
Ｉｎ−１１１でＩＭＰ４４９を標識すると複数の生成物が生じた。おそらくいつくかは二核錯体であると考えられる。^１１１Ｉｎ−ＩＭＰ４４９は、高い腎臓への取込みおよび高い血中濃度を示した。しかしながら、多重種としてでさえも、^１１１Ｉｎ−ＩＭＰ４４９は、ＴＦ２でプレターゲッティングされたときに腫瘍への局在化を示した（図１９）。

図１９は、マウスにおけるＩｎ−１１１標識ＩＭＰ４４９とＦ−１８標識ＩＭＰ４４９の比較生体分布を示す。両方の標識ペプチドは、二重特異性ＴＦ２抗体の存在下において高レベルの腫瘍組織への局在化を同様に示した。Ｉｎ−１１１標識種は、ＴＦ２抗体の存在下または非存在下においてＦ−１８標識種よりも高い腎臓中濃度を示した。データを以下の表８〜１１にまとめる。

要約すると、種々の疾患状態のインビボ画像化で使用するのに好適なＦ−１８標識ターゲッティングペプチドを産生するための、簡単で、再現性のある方法および組成物が本明細書において記載されている。上で開示された二重特異性抗体は限定的ではなく、多種多様な疾患または病原体の標的抗原に対する任意の公知の抗体を含み得るということを当業者は理解するであろう。本方法は、二重特異性抗体でのプレターゲッティングに限定されるものでもない。他の実施形態において、画像化される標的細胞、組織、または生物体に直接結合する分子または錯体を本明細書に開示された方法を用いてＦ−１８で標識し、ＰＥＴ画像化用に対象に投与してもよい（下記の実施例参照）。

ＩＭＰ４４９で例示される、Ａｌ−Ｆ−１８標識ペプチドは、ＰＥＴ走査などの公知の画像化プロトコルで利用されるインビボ条件下で十分に安定である。上記のように調製される放射性標識ペプチドの現在の収率は５〜２０％であり、未標識ペプチドから標識ペプチドを分離するための短時間のＨＰＬＣ精製工程でさえも、最終的な収率は約５％である。さらに、特許請求された方法により、調製時から１時間以内（これは、十分にＦ−１８の崩壊時間の範囲内である）に注射する準備が整ったＦ−１８標識ターゲッティングペプチドが調製され、好適な画像化手順を実施することが可能になる。最後に、記載され、特許請求された方法により、画像化研究用にＦ−１８標識化合物を調製する公知の方法と比較して、技師の放射性同位体への被爆が最小限に抑えられる。

実施例１１．Ｆ−１８標識キット
８．０ｍｇのＩＭＰ４４９を０．１５４９ｇのアスコルビン酸と混合することにより、Ｆ−１８標識キットを作製した。２つの試薬を１０．５ｍＬの水に溶かし、この溶液を１．０ｍＬアリコートずつ１０本のバイアルに分注した。ｐＨは調整しなかった。この溶液を凍結し、凍結乾燥し、真空下で密封した。

実施例１２．標識ペプチドと二重特異性抗体によるプレターゲッティングとを用いたインビボでの腫瘍の画像化
本実施例は、二重特異性抗体によるプレターゲッティングと標識ターゲッティングペプチドを用いたインビボ画像化技術を用いて比較的小さいサイズの腫瘍を首尾よく検出し得るということを示す。利用されたプレターゲッティング抗体は、上記のＴＦ２抗体か、またはＴＦ１０抗体のどちらかであった。

製剤緩衝液：
０．３０２３ｇのアスコルビン酸、１８．４ｍＬのＤＩ水、および１．６ｍＬの１Ｍ
ＮａＯＨを混合して、ｐＨをｐＨ６．６１に合わせることにより、製剤緩衝液を作製した。この緩衝液を１ｍＬアリコートずつ２０本のバイアルに分注し、凍結乾燥した。

文献の手順に従って、ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）
ＡＣＣＥＬＬ（商標） Ｐｌｕｓ ＱＭＡ軽量カートリッジでＦ−１８を精製した。この手順では、カートリッジを、１０ｍＬの０．４Ｍ ＫＨＣＯ_３で洗浄し、次いで１０ｍＬのＤＩ水で洗浄した。２ｍＬの水中のＦ−１８をカートリッジに通し、その後、１０ｍＬの水で洗浄した。その後、カートリッジから、０．４Ｍ
ＫＨＣＯ_３で２００μＬアリコートずつ５回、Ｆ−１８を溶出した。大部分の放射能は２番目の画分に溶出した。２番目の画分中の放射能を、酢酸緩衝液（ｐＨ４）中の３μＬの２ｍＭ
Ａｌと混合した。その後、Ａｌ−Ｆ−１８溶液を、アスコルビン酸ＩＭＰ４４９標識バイアルに注入し、１０５℃で１５分間加熱した。この反応溶液を冷却し、０．８ｍＬのＤＩ水と混合した。この反応物の中身をＷＡＴＥＲＳ（登録商標）
ＯＡＳＩＳ（登録商標） Ｉｃｅ ＨＬＢカラムに入れ、廃棄バイアルに溶出した。カラムを１ｍＬのＤＩ水で３回洗浄した。カラムを、アスコルビン酸を含有する製剤バイアルに移した。カラムを２００μＬのＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１）で２回溶出し、標識ペプチドを溶出した。

ＤＮＬ技術を用いたＴＦ１０二重特異性抗体の産生
ＴＦ１０の癌ターゲッティング抗体成分は、ｈＰＡＭ４（放射性標識ＭＡｂとして詳細に研究されているヒト化抗ＭＵＣ１
ＭＡｂ）に由来する（例えば、Ｇｏｌｄら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：７３８０−７３８７，２００７）。ハプテン結合成分は、ｈ６７９（上で考察されたヒト化抗ヒスタミニル−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）ＭＡｂ）に由来する。（抗ＣＥＡ）_２×抗ＨＳＧ ｂｓＡｂ ＴＦ２の産生について開示された方法（Ｒｏｓｓｉら，２００６）を用いて、ＴＦ１０二重特異性（［ｈＰＡＭ４］_２×ｈ６７９）抗体を産生した。このＴＦ１０コンストラクトは、２つのヒト化ＰＡＭ４
Ｆａｂと１つのヒト化６７９ Ｆａｂを持つ。

ＴＦ１０のために、ペプチドスペーサーを用いてヒト化ｈＰＡＭ４抗体の１つのＦａｂをα−配列に連結した。α−配列は、別のα−配列と自発的に会合して二量体を形成するので独特である。ＴＦ１０において、この構造体は、２つのα−配列によって１つに連結された２つのｈＰＡＭ４抗ＭＵＣ１
Ｆａｂ（ｈＰＡＭ４−ＤＤＤと呼ぶ）を含有する。ＴＦ１０の他の成分は、β−配列をヒト化抗ＨＳＧ抗体のＦａｂ'に連結することによって産生される。α−配列とは異なり、β−配列は自己会合しないが、その代わり、２つのα−配列によって形成された二量体構造に結合する（ｈ６７９−ＡＤ）。したがって、これら２つの別々に産生されるタンパク質を一緒に混合した場合、これらは直ちに、その抗原にスムーズに結合することができるように各々のＦａｂ'を配向させて、「ａ_２ｂ」構造を形成する。この結合相互作用の安定性は、α−配列およびβ−配列の各々に（β−配列中に２つ、α−配列中に１つ）戦略的にシステインを配置することによって、さらに向上する。「ｂ」は、極めて特異的な配向で「ａ_２」に結合するので、ａ_２ｂが会合すると同時に、α−部分とβ−部分の間でジスルフィド架橋が形成され、それによりこれら２つのタンパク質が共有結合することができる。α−配列とβ−配列は両方とも、ヒトタンパク質中に見られるので、この複合体の免疫原性を増すものとは予想されていない。

Ｆｄ鎖のＣ末端にα配列を融合させることによって、抗ＭＵＣ１融合タンパク質ｈＰＡＭ４−αを作製した。Ｆｄ鎖のＣ末端にβ配列を連結させることによって、抗ＨＳＧ融合タンパク質ｈ６７９−βを形成させた。ｈＰＡＭ４−αとｈ６７９−βを対合させることによって安定に連結された多価のｂｓＭＡｂ
ＴＦ１０を形成させた。

安定にトランスフェクトされた骨髄腫細胞で２つの融合タンパク質（ｈＰＡＭ４−ＤＤＤおよびｈ６７９−ＡＤ２）を独立に発現させた。これらの組織培養上製液を組み合わせて、ｈＰＡＭ４−αを２倍モル過剰にした。この反応混合物を、１ｍＭの還元グルタチオンを用いた穏やかな還元条件下、室温で２４時間インキュベートした。還元後、２ｍＭの酸化グルタチオンを用いた穏やかな酸化によってＤＮＬ反応を終了させた。極めて特異的にｈ６７９
Ｆａｂに結合するＩＭＰ２９１アフィゲル樹脂を用いた親和性クロマトグラフィーによってＴＦ１０を単離した。

ｈＰＡＭ４
ＩｇＧと、臨床試験に入っている抗ＣＥＡ×抗ＨＳＧ ｂｓＭＡｂについては、組織の組織学と血液細胞結合の完全なパネルが既に調べられている。ｈＰＡＭ４結合は、３分の１の標本における膀胱および胃への非常に弱い結合に限られており（インビボでは結合が見られなかった）、抗ＣＥＡ×抗ＨＳＧ
ｂｓＭＡｂによる正常組織への結合は見られなかった。さらに、Ｈ１ヒスタミン受容体およびＨ２ヒスタミン受容体を有する細胞株に対するインビトロ研究では、ＩＭＰ−２８８
ｄｉ−ＨＳＧペプチドによるアンタゴニスト活性もアゴニスト活性も示されず、２つの異なる種での動物研究では、画像化に使用される用量よりも２０，０００倍高い用量で、このペプチドのヒスタミン成分に関連した薬理学的活性が示されなかった。したがって、このＨＳＧ−ヒスタミン誘導体は、薬理学的活性を有さない。

ＴＦ１０二重特異性抗体の生体分布、ターゲッティング、および投薬量の研究
ＴＦ１０用量の増加に伴うＴＦ１０の生体分布および腫瘍ターゲッティングを明らかにする。これらの研究により、様々な用量範囲のＴＦ１０についての基礎的なＰｋデータが提供される。初回用量範囲から、７０ｋｇの患者に投与される１．０〜５０ｍｇでヒト等価用量（ＨＥＤ）をシミュレートする。動物への投与用量のＨＥＤへの換算［すなわち、（マウスにおけるｍｇ／ｋｇを１２．３で割ったもの）＝ｍｇ／ｋｇ
ＨＥＤ］に関するＦＤＡガイドラインに基づいて、７０ｋｇのヒトに投与されるＴＦ１０用量１ｍｇ（６．３７ｎｍｏｌ）は、２０ｇのマウスにおける３．５μｇ（０．０２２ｎｍｏｌ）用量と等価であると考えられる。

簡潔に説明すると、３．５、１７．５、３５、および７０
ＴＦ１０(微量の^１２５Ｉ−ＴＦｌ０を添加する) を静脈内注射で動物に投与する。１７．５μｇ、３５μｇ、および７０μｇ用量（ＨＥＤ＝１、５、１０、および２０ｍｇ）を投与された動物を、１時間、６時間、１６時間、４８時間、および７２時間で解剖する（観察当たりｎ＝５、合計Ｎ＝７５動物／細胞株）。現在のロットのＴＦ１０を用いた研究により、上記のＴＦ２抗ＣＥＡコンストラクトのクリアランスと類似した、マウスでの非常に迅速なクリアランスが示されている。

Ｐｋ研究を、^１３１Ｉ−ＴＦｌ０を用いてウサギでも実施する。ＴＦ２抗ＣＥＡ ｂｓＭＡｂを用いた先行研究により、患者で観察されるＰｋ挙動がウサギからより良く予測される可能性があるということが示されている。というのは、マウスがより速い速度でヒト化ＩｇＧを除去するのに対し、ウサギは患者で見られるのと同じようにヒト化抗ＣＥＡ
ＩｇＧを除去するからである。これらの研究では４匹のウサギを必要とし、^１３１Ｉ−ＴＦ１０（〜７００μＣｉ）をスパイクした５ｍｇ ＨＥＤのＴＦ１０を２匹に投与し、２０ｍｇ
ＨＥＤを２匹に投与する。５分、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、および１６８時間でウサギを採血する。高エネルギーコリメータを備えたＡＤＡＣ
Ｓｏｌｕｓガンマカメラを用いて、体全体の画像も撮影する。３時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、および１６８時間で行なわれる各々の画像化セッションの間、各々のウサギとともに^１３１Ｉ−標準品（１０ｍＬシリンジ中、約２０μＣｉ）を視野に置く。その後、標準品を用いて、^１３１Ｉ−ＴＦｌ０の分布に関する半定量的データを提供する。

ＴＦ２およびＴＦ１０二重特異性抗体によるプレターゲッティングと標識ペプチドを用いた画像化研究
以下の研究は、二重特異性抗体によるプレターゲッティング技術と標識ペプチドを用いたインビボ画像化の実行可能性を示す。画像は、上記のような^１８Ｆ−金属標識ペプチドを用いて得られなかったが、二重特異性抗体によるプレターゲッティング技術を、一般に、任意の種類の標識と一緒に使用するように適合させ得る。したがって、この研究は、特許請求されたＦ−１８標識ペプチドを用いて得られると考えられる結果の代表例である。

図２０および図２１は、^１１１Ｉｎ−標識ｄｉ−ＨＳＧペプチド、ＩＭＰ−２８８とともに、ｂｓＭＡｂプレターゲッティング法を用いる動物モデルにおいて、線で示した腫瘍がどれほど明瞭に検出され得るかということ示している。図２０では、ＴＦ１０によるプレターゲッティングと^１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８ペプチドを用いて、０．２〜０．３ｇのヒト膵癌異種移植片を担持するヌードマウスを画像化した。図の上の６匹の動物に２つの異なる用量のＴＦ１０（投与したペプチドのモルに対して１０：１および２０：１のモル比）を与え、翌日、^１１１Ｉｎ−標識ｄｉ−ＨＳＧペプチド（ＩＭＰ２８８）を投与した。他の３匹の動物には、^１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８（プレターゲッティングなし）のみを与えた。標識ペプチドを注射してから３時間後に画像を撮影した。この画像により、０．２〜０．３ｇの腫瘍が、^１１１Ｉｎ−ペプチドのみを投与された動物に局在しないが、プレターゲッティングされた動物に局在することが明瞭に示されている。

この研究において、腫瘍への取込みは、平均すると、２０〜２５％ ＩＤ／ｇであり、腫瘍／血液比は２０００：１を上回り、腫瘍／肝臓比は１７０：１、腫瘍／腎臓比は１８／１であった。Ａｌ−^１８Ｆ−標識ＩＭＰ４４９について上記の実施例で示された腫瘍への取込みは、同じＣａＰａｎ１異種移植モデルで、平均すると、わずか約４〜５％ＩＤ／ｇであったので、^１８Ｆ−標識ペプチドのより低い取込みは、Ａｌ−^１８Ｆ−標識ＩＭＰ４４９のより低い比放射能を反映しているにすぎないと考えられている。それでもなお、Ａｌ−^１８Ｆ−ＩＭＰ４４９のデータは、ＴＦ１０ ｂｓＭＡｂの特異性と組み合わせた場合に、膵癌または他の癌を画像化するための優れた道具となるプレターゲッティングされるフッ素化ペプチドの並外れた可能性を示す。^１８Ｆ−標識ペプチドの生体分布データは、直接放射性標識された抗体および直接^１８Ｆで標識された小型の改変抗体コンストラクトのターゲッティング能力を遥かに上回る（Ｃａｉら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４８：３０４−３１０，２００７）。

図２１に示すデータは、癌を検出するプレターゲッティング法の感度をさらに強調している。ここでは、ヒト大腸癌細胞株が静脈内注射され、肺に０．２〜０．３ｍｍの微小転移性腫瘍を有するヌードマウスから、マイクロＰＥＴ画像のパネルが得られた。抗ＣＥＡ ｂｓＭＡｂ
ＴＦ２、次いで、プレターゲッティングされる^１２４Ｉ−標識ペプチドが動物に投与された。これら画像は、横断面および冠状断面の両方において１．５時間での強い取込みを示しており、これは２１時間でも持続した。冠状断面は、^１２４Ｉ−ペプチドが、注射の１．５時間後に胃と腎臓でも見られたことを示すためのより後方の像である。これらの画像は、肺で個々の病変のように見えるもの（矢印）が示しているが、これらは解剖したときに直径わずか０．３ｍｍであった（上のパネル、胸部の横断面）（Ｓｈａｒｋｅｙら，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２４６（２）：４９７−５０７，２００８）。抗ＣＤ２２
ＴＦ６ ｂｓＭＡｂをプレターゲッティングされ、同じ^１２４Ｉ−標識ペプチドを投与された対照動物（左側、真ん中のパネル）は、このケースでは、抗ＣＥＡ ｂｓＭＡｂによる局在化の特異性を図説するために示されている。抗ＣＥＡがプレターゲッティングされた動物の冠状断面は、胸部、および腎臓での取込みと、胃でのいくらかの放射能を示している。重要なことに、肺での同じ大きさの病変は、^１８Ｆ−ＦＤＧが投与された動物では見られなかった。したがって、プレターゲッティング抗体の使用により、癌のＰＥＴ画像化に現在使用されている標準的なＦ−１８標識フルオロデオキシグルコースプローブと比較してより大きい検出特異性と検出感度が提供される。

これらのデータにより、二重特異性抗体によるプレターゲッティングと^１８Ｆ-標識ペプチドを用いる画像化の実行可能性がさらに示されている。

実施例１３．葉酸ＮＯＴＡコンジュゲートの合成
葉酸を記載されている通りに活性化し（Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９６，７，５６−６２）、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２にコンジュゲートさせる。このコンジュゲートをクロマトグラフィーで精製する。その後、ＴＦＡで処理することにより、Ｂｏｃ基を除去する。その後、アミノ葉酸誘導体を、炭酸緩衝液中のｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）と混合する。その後、生成物をＨＰＬＣで精製する。葉酸−ＮＯＴＡ誘導体を、実施例１０に記載の通りにＡｌ−^１８Ｆで標識し、その後、ＨＰＬＣで精製する。^１８Ｆ−標識された葉酸塩を対象に静脈内注射し、例えば、癌または炎症性疾患における葉酸受容体の分布を画像化するために首尾よく使用する（例えば、Ｋｅら，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５６：１１４３−６０，２００４参照）。

実施例１４．ヒトにおけるプレターゲッティングされたＰＥＴ画像化
腫瘍再発が疑われる患者（１．７ｍ^２体表面積）に１７ｍｇの二重特異性モノクローナル抗体（ｂｓＭａｂ）を注射する。このｂｓＭａｂを標的に局在化させ、血液から除去する。このｂｓＭａｂの９９％が血液から除去されたときに、Ｆ−１８標識ペプチド（５．７×１０^−９ｍｏｌに５〜１０ｍＣｉ）を注射する。ＰＥＴ画像化により、微小転移性腫瘍の存在が示される。

実施例１５．Ｆ−１８標識による血管新生受容体の画像化
例えば、α_ｖβ_３インテグリンが関与する虚血組織での血管新生の画像化に標識Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドが使用されている（Ｊｅｏｎｇら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２００８，Ａｐｒ．１５ ｅｐｕｂ）。Ｊｅｏｎｇら（２００８）に従って、ＲＧＤをＳＣＮ−Ｂｚ−ＮＯＴＡにコンジュゲートさせる。アルミニウムストック溶液をＦ−１８および誘導体化されたＲＧＤペプチドと混合し、１１０℃で１５分間加熱し、実施例１０で開示されているように過剰なペプチドを使用して標識反応を終了させることによって、上記の実施例１０に記載の通りに、Ａｌ−^１８ＦをＮＯＴＡで誘導体化されたＲＧＤペプチドに付着させる。このＦ−１８標識ＲＧＤペプチドを、Ｊｅｏｎｇら（２００８）に開示されているようなインビボ生体分布およびＰＥＴ画像化に使用する。ＲＧＤ−ＮＯＴＡのＡｌ−^１８Ｆコンジュゲートは、虚血組織に取り込まれ、血管新生のＰＥＴ画像化を提供する。

実施例１６．Ｆ−１８標識ボンベシンを用いた腫瘍の画像化
Ｐｒａｓａｎｐｈａｎｉｃｈら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００７，１０４：１２４６２−４６７）に従って、ＮＯＴＡがコンジュゲートされたボンベシン誘導体（ＮＯＴＡ−８−Ａｏｃ−ＢＢＮ（７−１４）ＮＨ_２）を調製する。上記の実施例１０に従って、ＮＯＴＡ−ボンベシン誘導体をＡｌ−^１８Ｆで標識する。このＦ−１８標識ボンベシン誘導体を、実施例１０に記載の通りに、ＯＡＳＩＳ（登録商標）カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で未標識ボンベシンから分離する。Ｐｒａｓａｎｐｈａｎｉｃｈら（２００７）に従って、Ａｌ−^１８Ｆ標識されたＮＯＴＡ−ボンベシンコンジュゲートを、ガストリン放出ペプチド受容体を発現する腫瘍のＰＥＴ画像化に首尾よく使用する。

実施例１７．Ｆ−１８標識されたターゲッティング可能なコンジュゲートを用いた腫瘍の画像化
米国特許第７，０１１，８１６号（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に従って、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、サイトカイン、ホルモン、または細胞受容体結合剤のＮＯＴＡ誘導体を調製する。ＮＯＴＡで誘導体化されたターゲッティング可能なコンジュゲートを、実施例１０で開示されているようにＡｌ−^１８Ｆで標識する。このコンジュゲートをインビボで投与し、腫瘍のＦ−１８
ＰＥＴ画像化に首尾よく使用する。

実施例１８．二重特異性抗体を用いた腫瘍の画像化
米国特許第７，０５２，８７２号（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に従って、ターゲッティングされる組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームとターゲッティング可能なコンジュゲートに特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体を調製する。ターゲッティング可能なコンジュゲートは１つ以上のＮＯＴＡキレート部分を含む。このターゲッティング可能なコンジュゲートを、実施例１０に記載の通りにＡｌ−^１８Ｆで標識する。疾患状態を有する対象に二重特異性抗体を注射する。遊離の二重特異性抗体が血液循環から除去されるのに十分な時間を取った後、この対象に、Ｆ−１８標識されたターゲッティング可能なコンジュゲートを注射する。Ｆ−１８標識の分布の画像化をＰＥＴ走査により実施する。

別の例示的な実施形態において、米国特許第７，３１２，３１８号に記載されているように、ヒト化されているかまたはキメラの内在化抗ＣＤ７４抗体を調製する。ｐ−ＳＣＮ−ｂｎ−ＮＯＴＡ前駆体を、実施例７に記載の通りにＡｌ−^１８Ｆで標識する。その後、標準的な技術を用いて、Ａｌ−^１８Ｆ ＮＯＴＡを抗体にコンジュゲートさせる。ＣＤ７４発現腫瘍を有する対象に静脈内注射した後、抗ＣＤ７４抗体は腫瘍に局在化し、ＰＥＴ走査による腫瘍の画像化を可能にする。代替の実施形態において、米国特許第７，３００，６５５号；同第第７，２８２，５６７号；同第第７，２３８，７８６号；同第第７，２３８，７８５号；同第第７，１５１，１６４号；同第第７，１０９，３０４号；同第第６，６７６，９２４号；同第第６，３０６，３９３号、および同第第６，１８３，７４４号に記載されているように、α−フェトタンパク質結合抗体Ｉｍｍｕ３１、ｈＰＡＭ４、ｃＰＡＭ４、ＲＳ７、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ１９、抗ＣＥＡ、および抗ＣＤ２２を用いて、Ｆ−１８標識抗体を調製する。標準的な技術を用いて、抗体をＮＯＴＡにコンジュゲートさせ、抗ＣＤ７４抗体について記載されているようにＡｌ−^１８Ｆで標識する。Ｆ−１８標識抗体を対象に注射し、これによってＰＥＴ走査による腫瘍の画像化を成功させる。

実施例１９．腎血流画像化のための^１８Ｆ−標識ＮＯＴＡの使用
アルミニウムストック溶液（２０μＬ、ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中に０．０５Ｍ）を、ＱＭＡで精製した２００μＬのＦ−１８（実施例１０と同様）と混合する。その後、ＡｌＦ−１８溶液を５００μＬの０．２Ｍ
ＮＯＴＡ（ｐＨ４）と混合し、１５分間加熱する。その後、注射用に試料を５ｍＬのＰＢＳに希釈する。Ｆ−１８標識ＮＯＴＡを腎血流の画像化を成功させるために直接使用する。

実施例２０．Ａｌ−^１８Ｆを用いたさらなるペプチド標識研究
ＩＭＰ３６１について上で記載したのと同様の方法でＩＭＰ４６０
ＮＯＤＡ−ＧＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２を合成した。ＮＯＤＡ−Ｇａ配位子をＣｈｅｍａｔｅｃｈから購入し、他のアミノ酸のようにペプチド合成機で付着させた。粗ペプチドを精製すると、所望のペプチド（ＭＨ＋１３６６）が得られた。

ＩＭＰ４６０の放射性標識
ＩＭＰ４６０（０．００２０ｇ）を７３２μＬの０．１Ｍ
ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）に溶かした。Ｆ−１８を実施例１０に記載の通りに精製し、氷酢酸で中和し、Ａｌ溶液と混合した。その後、ペプチド溶液２０μＬを添加し、この溶液を９９℃で２５分間加熱した。その後、粗生成物を上記のようにＷａｔｅｒｓ
ＨＬＢカラムで精製した。Ａｌ−Ｆ−１８標識ペプチドは、ＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１）カラム溶出物中にあった。０．１％ＴＦＡ緩衝液中の逆相ＨＰＬＣトレースにより、標識ペプチドに期待される位置できれいな単一のＨＰＬＣピークが示された。

実施例２１．炭水化物の標識
ｐ−ＳＣＮ−ｂｎ−ＮＯＴＡをヒドラジンと反応させ、その後、配位子をＨＰＬＣで精製することによって、ＮＯＴＡチオセミカルバジド誘導体を調製する。Ａｌ−Ｆ−１８を実施例１０に記載の通りに調製し、このＡｌ−Ｆ−１８をＮＯＴＡチオセミカルバジドに添加して、１５分間加熱する。任意で、Ａｌ−Ｆ−１８−チオセミカルバジド錯体をＨＰＬＣで精製する。Ａｌ−Ｆ−１８−チオセミカルバジドを公知の方法で酸化炭水化物にコンジュゲートさせる。Ｆ−１８標識炭水化物を、ＰＥＴ走査を用いる画像化研究に首尾よく使用する。

実施例２２．脂質の標識
アルデヒドを含む脂質を、実施例２１のＡｌ−Ｆ−１８ＮＯＴＡチオセミカルバジドにコンジュゲートさせ、このＦ−１８標識脂質を、ＰＥＴ走査を用いた画像化研究の成功のために使用する。

代替の実施形態において、アミノ基を含む脂質をｐ−ＳＣＮ−ｂｎ−ＮＯＴＡと反応させる。このＮＯＴＡ標識脂質を上記の実施例に記載の通りにＡｌ−Ｆ−１８と反応させる。このＦ−１８標識脂質を、ＰＥＴ走査を用いた画像化研究の成功のために使用する。

実施例２３．アプタマーの標識
アルデヒドを含むアプタマーを、実施例２１のＡｌ−Ｆ−１８ＮＯＴＡチオセミカルバジドにコンジュゲートさせる。Ｆ−１８標識アプタマーを対象に投与し、ＰＥＴ走査を用いた画像化研究の成功のために使用する。

Claims (8)

1. 送達分子をＦ−１８で標識する方法であって、
   ａ）前記Ｆ−１８を金属と反応させてＦ−１８金属錯体を形成させる工程と、ｂ）前記Ｆ−１８金属錯体を送達分子に付着させて１つ以上のＦ−１８標識送達分子を形成させる工程とを含み、
   前記Ｆ−１８金属錯体が前記送達分子上の、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、またはＮＯＴＡからなる群より選択されるキレート部分に付着しており、かつ前記金属が、アルミニウム、ガリウム、インジウム、ルテニウム、およびタリウムからなる群より選択される、方法。
2. 前記送達分子がタンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｆ−１８標識送達分子が血清中で安定である、請求項１に記載の方法。
4. 前記ペプチドが、ＩＭＰ４４９（ＮＯＴＡ−ＩＴＣベンジル−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ_２）、ＮＯＴＡ−８−Ａｏｃ−ＢＢＮ（７−１４）ＮＨ _２ 、およびＳＣＮ−Ｂｚ−ＮＯＴＡにコンジュゲートさせたＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
5. 前記Ｆ−１８標識送達分子が、本方法の開始から１時間未満で生成される、請求項１に記載の方法。
6. タンパク質またはペプチドに付着したＦ−１８金属錯体を含み、
   前記Ｆ−１８金属錯体が前記タンパク質またはペプチド上の、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、またはＮＯＴＡからなる群より選択されるキレート部分に付着しており、かつ前記金属が、アルミニウム、ガリウム、インジウム、ルテニウム、およびタリウムからなる群より選択される、Ｆ−１８標識タンパク質またはペプチド。
7. ａ）Ｆ−１８との錯体を形成する金属と、ｂ）前記Ｆ−１８錯体に結合するＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、またはＮＯＴＡからなる群より選択される１つ以上のキレート部分を含むターゲッティングペプチドと、ｃ）Ｆ−１８とを含み、
   前記金属が、アルミニウム、ガリウム、インジウム、ルテニウム、またはタリウムである、Ｆ−１８標識用のキット。
8. 放射線分解保護剤としてアスコルビン酸をさらに含む、請求項７に記載のキット。
   

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