MX2010006728A - Metodos y composiciones mejorados para el marcado con fluor-18 de proteinas, peptidos y otras moleculas. - Google Patents

Abstract

La presente solicitud describe composiciones y métodos de síntesis y el uso de moléculas marcadas con F-18 de uso, por ejemplo, en la formación de imágenes con técnicas de PET. En las modalidades particulares, las moléculas marcadas pueden ser péptidos o proteínas, aunque otros tipos de moléculas incluyendo, de manera no exclusiva aptámeros, oligonucleótidos y ácidos nucleicos pueden marcarse y utilizarse para tales estudios de formación de imágenes. En las modalidades preferidas, la marca de F-18 puede conjugarse a una molécula objetivo mediante la formación de un complejo metálico y unir el complejo de F18-metal a una porción quelante, tal como DOTA, NOTA, DTPA, TETA o NETA. En otras modalidades, el metal puede conjugarse primero al grupo quelante y posteriormente unir el F-18 al metal. En otras modalidades preferidas, la porción marcada con F-18 puede comprender un conjugado seleccionable que puede utilizarse en combinación con un anticuerpo biespecífico o multiespecífico para dirigir el F-18 a una antígeno expresando en una célula o tejido asociado con una enfermedad, condición médica o patógeno. Los resultados ejemplares muestran que los péptidos conjugados seleccionables marcados con F-18 son estables en suero humano a 37°C durante varias horas, tiempo suficiente para realizar la formación de imágenes con análisis PET.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES MEJORADOS PARA EL MARCADO CON FLÚOR- 18 DE PROTEÍNAS, PÉPTIDOS Y OTRAS MOLÉCULAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 11/960,262, presentada en Diciembre 19 del 2007, la cual reclama el beneficio bajo 35 USC § 119(e) de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No 60/884,521, presentada en Enero 11 del 2007, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

CAMPO En ciertas modalidades, la presente invención se relaciona con un método simple para marcar péptidos con F-18, que son de uso para la formación de imágenes in vivo. La actividad específica preferida del péptido marcado con F-18 sería de aproximadamente 1,000 a 2,000 Ci/mmoles al momento de la administración al paciente. Las actividades específicas que están en el intervalo de 100 a decenas de miles de Ci/mmoies, también serían de uso. Aunque las actividades específicas más altas se prefieren para ciertas aplicaciones de formación de imágenes, en otras modalidades alternas, una actividad específica menor de un complejo metal-F-18 con: NOTA (ácido 1 , 4 , 7 - riaza-ciclononano- 6641.9 ?,?' , " -triacético) u otra porción quelante podría ser de uso, por ejemplo, como un agente para formación de imágenes del flujo renal o para agentes para formación de imágenes del corazón y el cerebro para formar imágenes del flujo del cerebro. De manera preferida, el marcado con F-18 se logra sin la necesidad de un paso de purificación para separar el pép ido no marcado del marcado. De manera más preferida, los péptidos marcados con F-18 son estables bajo condiciones in vivo, tales como en el suero humano.

ANTECEDENTES La formación de imágenes con Tomografía con Emisión de Positrones (PET por sus siglas en inglés) , proporciona una alta resolución y cuantificación de las imágenes con PET. Los péptidos u otras moléculas pequeñas pueden marcarse t con los emisores de positrones 18F, 64Cu, 56Ga, 68Ga, 76Br,' 94mTc, 86Y y 124I por nombrar unos cuantos. El positrón emitido de los núcleos del isótopo se expulsa con diferentes energías, dependiendo del isótopo utilizado. Cuando el positrón reacciona con un electrón, dos rayos gamma de 511 keV son emitidos en direcciones opuestas. La energía del positrón expulsado controla la distancia promedio que un positrón se desplaza antes de que sea aniquilado al chocar con un electrón. Entre más alta sea la energía de expulsión, más lejos se desplaza el positrón antes de la colisión con un electrón. Una baja energía de expulsión para un isótopo de la PET es deseable para reducir al mínimo la distancia que el positrón se desplaza desde el sitio objetivo, antes de que genere los dos rayos gamma de 511 keV que se forman en imágenes mediante la cámara de la PET. Muchos isótopos que emiten positrones también tienen otras emisiones, tales como rayos gamma, partículas alfa o partículas beta en su cadena de decaimiento. Es deseable tener un isótopo de la PET que sea un emisor de positrones puro, de manera que cualesquier problemas de dosimetría se reduzcan al mínimo. La vida media del isótopo es también importante, puesto que la vida media debe ser suficientemente larga para unir el isótopo a una molécula objetivo, analizar el producto, inyectarlo en el paciente, y permitir que el producto se localice, se elimine de los tejidos no objetivo, y a continuación forme una imagen. Si la vida media es demasiado larga, la actividad específica puede no ser suficientemente alta para obtener suficientes fotones para una imagen clara y si es demasiado corta, el tiempo requerido para la fabricación, distribución comercial y biodistribución puede no ser suficiente. El F-18 (ß+ 635 keV 97%, ti/ 2 110 minutos), es uno de los isótopos que emiten PET utilizados más ampliamente, debido a su baja energía de emisión de positrones, falta de emisiones laterales y vida media adecuada. El F-18 se produce con una alta actividad específica. Cuando un isótopo se une a una molécula para la selección del objetivo, está acompañado usualmente por algo de agente de selección del objetivo sin reaccionar, que con frecuencia está presente en un exceso molar grande en comparación con el producto radiomarcado . Usualmente, el producto marcado y el producto no marcado pueden competir por el mismo objetivo in vivo, de manera que la presencia del agente para formación de imágenes frío disminuye la actividad específica efectiva del agente de selección del objetivo. Si F-18 se une a una molécula que tiene una captación muy alta, tal como 2-fluoro-2-desoxiglucosa (FDG) , entonces la actividad específica efectiva no es tan importante. Sin embargo, si uno está seleccionando como objetivo un receptor con péptido marcado o realizando un estudio de preselección del objetivo con inmunoPET con un número limitado de sitios de unión disponibles, el agente de selección del objetivo frío, podría bloquear potencialmente la captación del agente de selección del objetivo radiomarcado si' el agente de selección del objetivo frío está presente en exceso. El marcado con F-18 convencional de los péptidos, involucra el marcado de un reactivo a baja actividad específica, purificación con HPLC del reactivo, y a continuación conjugación al péptido de interés. El conjugado se repurifica con frecuencia después de la conjugación, para obtener la actividad específica deseada del péptido marcado. Un ejemplo es el método de marcado de Poethko et al. (J. Nucí. Med. 2004; 45: 892-902), en el cual el 4 - [18F] fluorobenzaldehído se sintetiza primero y purifica (Wilson et al, J. Labeled Compounds and Radiopharm. 1990; XXVIII: 1189-1199) , y a continuación se conjuga al péptido. El conjugado peptídico se purifica a continuación mediante HPLC para eliminar el exceso de péptido que se utilizó para llevar la conjugación a término. Las dos reacciones y la purificación no serían un problema si el F-18 tuviera una vida media larga. Sin embargo, la vida media de F-18 es de únicamente 2 horas, de manera que las manipulaciones que se necesitan para unir a F-18 al péptido son una carga significativa. Estos métodos son tediosos de realizar, y requieren el uso de equipo diseñado de manera específica para producir el producto marcado y/o los esfuerzos de químicos profesionales especializados. No hay formulaciones de un equipo que pudieran utilizarse de manera rutinaria en un entorno clínico. Existe la necesidad de un método rápido, simple, de marcado con F-18 de las porciones de selección del objetivo, tales como proteínas o péptidos, que resulten en constructos de selección del objetivo de una actividad especifica y estabilidad in vivo adecuadas para la detección y/o formación de imágenes, mientras que reduzca al mínimo los requisitos de equipo especializado o de personal altamente entrenado y reduzca la exposición del operador a altos niveles de radiación. Existe la necesidad adicional de equipos preempácados que pudieran proporcionar las composiciones requeridas para realizar tales métodos novedosos .

SUMARIO El fluoruro se une a prácticamente todos los otros elementos, y algunos de estos enlaces son relativamente estables. Los péptidos que portan los ligandos que se unen al metal, son conocidos por unirse a los radiometales de manera estable y a una actividad específica muy |alta. El procedimiento utilizado en el presente método, fue unir primero el F-18 a un metal, y a continuación quelar el complejo de F-18 y un metal con un ligando en el péptido. La cuestión fue entonces, cuál metal (u otro elemento, por ejemplo, boro) elegir. Los elementos en el grupo IIIA (boro, aluminio, galio, indio y talio) , fueron la primera elección basándose en una búsqueda rápida de la literatura. El lutecio también fue de uso.

De manera alterna, uno puede unir primero el metal u otro átomo al péptido, y a continuación agregar el F-18. El segundo procedimiento puede funcionar mejor, por ejemplo, para una conexión de fluoruro de boro. Los complejos de fluoruro de aluminio se reportan como estables in vitro (Martínez et al, Inorg. Chem. 1999; 38: 4765-4660; Antonny et al. J. Biol. Chem. 1992; 267: 6710-6718) . El' fluoruro de aluminio se incorpora en el hueso y en el esmalte de los dientes de manera que los complejos pueden también ser estables in vivo (Li, Crifc. Rev. Oral Biol. Med . 2003; 14: 100-114) . El experto con experiencia se dará cuenta que virtualmente cualquier molécula de suministro puede utilizarse para unir el F-18 para propósitos de formación de imágenes, siempre que contenga grupos derivados que puedan modificarse sin afectar la interacción de unión del ligando-receptor entre la molécula de suministro y el receptor objetivo celular o de te ido. Aunque los ejemplos siguientes se relacionan con porciones peptidicas marcadas con F-18, muchos otros tipos de moléculas de suministro, tales como oligonucleótidos , hormonas, factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, factores angiogénicos , factores antiangiogénicos , inmunomoduladores , proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, fármacos, interleucinas , interferones , oligosacáridos , polisacáridos , lípidos, etc., pueden marcarse con F-18 y utilizarse para propósitos de formación de imágenes. De manera similar, el tipo de enfermedades o condiciones de las que pueden formarse imágenes, está limitado únicamente por la disponibilidad de una molécula de suministro adecuada para seleccionar una célula o tejido asociada con la enfermedad o condición. Se conocen muchas de tales moléculas de suministro, como se ejemplifica en los Ejemplos siguientes. Por ejemplo, cualquier proteína o péptido que se une a un tejido u objetivo enfermo, tal como cáncer, puede marcarse con F-18 mediante los métodos descritos y utilizarse para la detección y/o formación de imágenes. En ciertas modalidades, tales proteínas o péptidos pueden incluir, de manera no exclusiva, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a Antígenos Asociados con el Tumor (TAA, por sus siglas en inglés) . Cualquier anticuerpo o fragmento que se une al TAA conocido, puede marcarse con F-18 mediante los métodos descritos, y utilizarse para la formación de imágenes y/o detección de tumores, por ejemplo, mediante exploración con PET u otras técnicas conocidas . En ciertos Ejemplos siguientes, los péptidos marcados con F-18 ejemplares pueden utilizarse para propósitos de formación de imágenes como constructos seleccionables en un método de preselección del objetivo, utilizando anticuerpos biespecificos o multiespecíficos o fragmentos de anticuerpos. En este caso, el anticuerpo o fragmento comprenderá uno o más sitios de unión para un objetivo asociado con una enfermedad o condición, tal como un antígeno asociado con un tumor o asociado con una enfermedad autoinmune o un antigeno producido o representado por un organismo patogénico, tal como un virus, bacteria, hongo u otro microorganismo. Un segundo sitio de unión se unirá de manera especifica al constructo seleccionable . Los métodos para preseleccionar el objetivo utilizando los anticuerpos biespecificos o multiespecíficos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,962,702, el contenido total de la cual se incorpora en la presente como referencia) . De manera similar, los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a constructos seleccionables , 1 son también bien conocidos en la técnica (Id.), tales como el anticuerpo monoclonal 679 que se une a la Histamina Succinil Glicina (HSG, por sus siglas en inglés) . Generalmente, en los métodos de preselección del objetivo, el anticuerpo biespecífico o multiespecífico se administra primero y se deja unir a los antígenos objetivo de células o tejidos. Después de una cantidad apropiada de tiempo para que el anticuerpo no unido se elimine de la circulación, por ejemplo, el constructo seleccionable marcado con F-18 se administra al paciente y se une al anticuerpo localizado en las células o tejidos objetivo, a continuación se toma una imagen, por ejemplo, mediante exploración con PET. En una modalidad ejemplar, un agente de selección del objetivo del receptor no peptídico, tal como el ácido fólico, puede conjugarse a NOTA y a continuación marcarse con, por ejemplo, un complejo de F-18 metal que se une a NOTA. Tales agentes de selección del objetivo del receptor no peptídicos pueden incluir, por ejemplo, TA 138, un antagonista no peptídico para el receptor a?ß3 de la integrina (Liu et al., 2003, Biocon . Chem. 14: 1052-56). Los agentes de selección del objetivo no peptídicos similares conocidos en la técnica, que pueden conjugarse a DOTA, NOTA u otro agente quelante para los complejos de F-18 -metal pueden utilizarse en los métodos reclamados. Otros agentes de selección del objetivo del receptor son conocidos en la técnica, tales como el agente de selección del objetivo del receptor de la somatostatina octreótido In-DTPA (TYCO®)'. Como se discute a continuación, un complejo de F-18-metal podría quelarse potencialmente , utilizando DTPA y utilizarse para propósitos de formación de imágenes. El péptido NODAGATOC podría marcarse con Al-F-18 para seleccionar como objetivo el receptor de la somatostatina (Eisenwiener et. al. Bioconj. Chem. 2002, 13 (3 ) : 530-41 ) . Otros métodos de formación de imágenes con selección del receptor utilizando quelatos metálicos se conocen en la técnica, y pueden utilizarse en la práctica de los métodos reclamados (véase, por ejemplo, Andre et al., 2002, J. Inorg . Biochem. 88:1-6; Pearson et al., 1996, J. Med., Chem. 39: 1361-71). Las técnicas y aparatos para formación de imágenes para la formación de imágenes con F-18 mediante exploración con PET también son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,358,489; 6,953,567; Page et al., Nuclear Medicine and Biology, 21:911-919, 1994; Choi et al., Cáncer Research 55:5323-5329, 1995; Zalutsky et al., J. Nuclear Med., 33:575-582, 1992), y puede utilizarse cualquiera de tales técnicas o aparatos conocidos para formación de imágenes con PET. Aunque los Ejemplos siguientes demuestran el uso de los complejos de F-18-metal para la formación de imágenes con PET, el experto con experiencia se dará cuenta que los complejos estables de metal -fluoruro, tales como el complejo no radioactivo de Al-27 y F-19, podría también unirse a NOTA u otros quelantes y unirse al péptido u a otros agentes de selección del objetivo para utilizarse como un agente de contraste para la Imagen de Resonancia Magnética (MRI por sus siglas en inglés) . Los complejos de Al-F NOTA también podrían unirse a los polímeros para formación de MRI . Los derivados de Al-F NOTA podrían utilizarse como agentes para la formación de imágenes de MRI PARACEST (Woessner et . al. Magn. Reson. Med. 2005, 53: 790-99) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las siguientes Figuras se incluyen para ilustrar las modalidades particulares de la invención, y no pretenden ser limitantes del alcance de la materia reclamada . Figura 1. Péptido ej emplar IMP 272. Figura 2. Péptido ej emplar IMP 288. Figura 3. Péptido ej emplar IMP 326. Figura 4. Péptido ej emplar IMP 329. Figura 5. Péptido ej emplar IMP 331. Figura 6. Péptido ej emplar IMP 332. Figura 7. Péptido ej emplar IMP 333. Figura 8. Péptido e emplar IMP 334. Figura 9. Péptido ej emplar IMP 349. Figura 10 , . Péptido e emplar IMP 368 Figura 11. . Péptido ej emplar IMP 375 Figura 12. Péptido ej emplar IMP 384 Figura 13. Péptido ej emplar IMP 386 Figura 14. . Péptido ej emplar IMP 389 Figura 15. Péptido ejemplar IMP 449. Figura 16. Péptidos ejemplares adicionales IMP 422, IMP 426 e IMP 428. Figura 17. Derivado de NOTA ejemplar. Figura 18. Estructura de NODA-péptido ejemplar. Figura 19. Biodistribucion comparativa en IMP 449 marcado con ln-lll y F-18 en ratones con o sin anticuerpo biespecífico TF2.. Figura 20. Formación de imágenes in vivo de tumores utilizando un péptido diHSG marcado con 111In (IMP 288) con o sin el anticuerpo anti-MUC 1 biespecífico TF10 preselección . Figura 21. Formación de imágenes con PET del cáncer de colon humano micrometastásico en los pulmones de ratones atímicos, utilizando el péptido marcado con 1 4I y preselección del objetivo con el anticuerpo anti-CEA biespecífico TF2!. Figura 22A-22D. Porciones quelantes ejemplares adicionales para utilizarse con el marcado con F-18.

DESCRIPCIÓN DETALLADA En la descripción que sigue, se utilizan varios términos y las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar el entendimiento de la descripción en la presente. Los términos que no se definen de manera explícita, se utilizan de acuerdo con su significado sencillo y ordinario. Como se utiliza en la presente, "un" o "una", puede significar uno o más de un artículo. Como se utiliza en la presente, los términos "y" y "o", pueden utilizarse para significar ya sea conjuntiva o disyuntiva. Esto es, ambos términos deben entenderse como equivalentes a "y/o" a menos que se indique de otra manera . Como se utiliza en la presente, "aproximadamente" significa dentro de más o menos diez por ciento de un número. Por ejemplo, "aproximadamente 100" se referiría a cualquier número entre 90 y 110. Como se utiliza en la presente, un "péptido" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos naturales o no naturales de entre 2 y 100 residuos de aminoácidos de longitud, de manera más preferida, entre 2 y 10, de manera más preferida, entre 2 y 6 aminoácidos de longitud. Un "aminoácido" puede ser un L-aminoácido, un D-aminoácido, un análogo de aminoácido, un derivado de aminoácido o un mimético de aminoácido. Como se utiliza en la presente, una molécula marcada está "purificada" cuando la molécula marcada está parcial o totalmente separada de moléculas no marcadas, de manera que la fracción de las moléculas marcadas está enriquecida en comparación con la mezcla inicial. Una molécula marcada "purificada" puede comprender una mezcla de moléculas marcadas y no marcadas en casi cualquier relación, incluyendo, de manera no exclusiva, aproximadamente 5:95; 10:90; 15:85; 20:80; 25:75; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40; 70:30; 75:25; 80:20; 85:15; 90:10; 95:5; 97:3; 98:2; 99:1 Ó 100:0. Como se utiliza en la presente, el término "patógeno" incluye, de manera no exclusiva, hongos, virus, parásitos y bacterias, incluyendo, de manera no exclusiva, el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH, por sus siglas en inglés) , virus del herpes, citomegalovirus , virus de la rabia, virus de la influenza, virus de la hepatitis B, virus Sendai, virus de la leucemia felina, virus Reo, virus de la polio, virus similares a parvo en suero humano, virus simiano 40, virus sincitial respiratorio, virus del tumor mamario de .ratón, virus de la Varicella- Zoster, virus del Dengue, virus de la rubéola, virus del sarampión, adenovirus, virus de la leucemia de los linfocitos T humanos, virus de Epstein-Barr, virus de la leucemia murina, virus de las paperas, virus de la estomatitis vesicular, virus Sindbis, virus de la coriomeningitis linfocítica, virus de las verrugas, virus de la lengua azul, Streptococcus agalactiae, Legionella pneumophilia, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria menincfitidis, Pneuwococcus, He ophílis influenzae B, Treponema pallidum, Lyme enfermedad spirochetes , Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium leprae, Brucella abort s, Mycobacteriu/n tuberculosis y Chlostridium tetani. Como se utiliza en la presente, un "agente de protección de la radiolisis" , se refiere a cualquier molécula, compuesto o composición que puede agregarse a un complejo o molécula marcado con F-18 para disminuir la proporción de ruptura del complejo o molécula marcado con F-18 mediante radiolisis. Puede utilizarse cualquier agente de protección de la radiolisis conocido, incluyendo, de manera no exclusiva, el ácido ascórbico.

PÉPTIDOS DEL CONSTRUCTO SELECCIONABLE En ciertas modalidades, la porción marcada con F-18 puede comprender un péptido u otro constructo seleccionable . Los péptidos marcados con F-18 (o proteínas) , pueden seleccionarse para unirse directamente a una célula, tejido, organismo patogénico seleccionado u otro objetivo para la formación de imágenes y/o detección. En otras modalidades, los péptidos marcados con F-18 pueden seleccionarse para unirse de manera indirecta, por ejemplo, utilizando un anticuerpo biespecífico con uno o más sitios de unión para un péptido de un constructo seleccionable y uno o más sitios de unión para un antígeno objetivo asociado con una enfermedad o condición. Pueden utilizarse anticuerpos biespecífieos , por ejemplo, en una técnica de preselección del objetivo, en donde el anticuerpo puede administrarse primero a un sujeto. Puede permitirse suficiente tiempo para que el anticuerpo biespecífico se una a un antígeno objetivo y para que el anticuerpo no unido se elimine de la circulación. A continuación, un constructo seleccionable , tal como un péptido marcado con F-18, puede administrarse al sujeto y dejarse unir al anticuerpo biespecífico y localizarse en la célula o tejido enfermo, después de lo cual, la distribución del constructo seleccionable marcado con F-18 puede determinarse mediante exploración con PET u otras técnicas conocidas. Tales constructos seleccionables pueden ser de una estructura diversa y se seleccionan no sólo para la disponibilidad de un anticuerpo o fragmento que se une con alta afinidad al constructo seleccionable, sino también para una rápida eliminación in vivo cuando se utiliza dentro del método de preselección del objetivo y los anticuerpos biespecífieos (bsAb) o anticuerpos multiespecífieos : Los agentes hidrofóbicos son mejores para provocar respuestas inmunes fuertes, mientras que los agentes hidrofílicos se prefieren para una rápida eliminación in vivo. Así, se establece un equilibrio entre el carácter hidrofóbico e hidrofílico. Esto puede lograrse, en parte, utilizando agentes quelantes hidrofílicos para desplazar a la hidrofobicidad inherente de muchas porciones orgánicas. También, pueden elegirse subunidades del constructo seleccionable que tienen propiedades en solución opuestas, por ejemplo, péptidos que contienen aminoácidos, algunos de los cuales son hidrofóbicos y algunos de los cuales son hidrofílicos. Además de los péptidos, también pueden utilizarse carbohidratos. Los péptidos que tienen tan pocos como dos residuos de aminoácidos, de manera preferida, dos a diez residuos, pueden utilizarse y pueden también acoplarse a otras porciones, tales como agentes quelantes. El enlazante debe ser un conjugado de peso molecular bajo, de manera preferida, que tiene un peso molecular de menos que 50,000 daltons, y de manera ventajosa menos que aproximadamente 20,000 daltons, 10,000 daltons o 5,000 daltons, incluyendo los iones metálicos en los quelatos. Más usualmente, el péptido del constructo seleccionable tendrá cuatro o más residuos, tales como el péptido DOTA-Phe-Lys (HSG) -Tyr-Lys (HSG) -NH2 (SEQ ID NO: 1), en donde DOTA es el ácido 1 , , 7 , 10 - tetraazaciclododecantetraacético y HSG es el grupo de histamina succinil glicilo. De manera alterna, el DOTA puede reemplazarse por una porción de NOTA (ácido 1,4,7- triaza-ciclononano- , N ' , " - triacético) o TETA (ácido p-bromoacetamido-bencil-tetraetilamintetraacético) . El constructo seleccionable también puede comprender aminoácidos no naturales, por ejemplo, D-aminoácidos , en la estructura de la cadena principal para incrementar la estabilidad del péptido in vivo. En las modalidades alternas, otras estructuras de la cadena principal, tales como aquéllas construidas de aminoácidos y peptoides . Los péptidos utilizados como constructos seleccionables se sintetizan de manera conveniente en un sintetizador peptídico automatizado utilizando un soporte en fase sólida y técnicas estándar de desprotección y acoplamiento ortogonal repetitivo. Los grupos amino libres en el péptido, que se van a utilizar posteriormente para la conjugación del quelato, se bloquean de manera ventajosa con grupos protectores estándar, tales como el grupo Boc, mientras que los residuos N terminales pueden acetilarse para incrementar la estabilidad en suero. Tales grupos protectores serán conocidos por el experto con experiencia. Véase, Greene and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 1999 (John Wiley and Sons, N. Y.). Cuando los péptidos se preparan para uso posterior dentro del sistema del anticuerpo biespecífico, se escinden de manera ventajosa de las resinas para generar las amidas C terminales correspondientes, con el fin de inhibir la actividad de la carboxipeptidasa in vivo. Los haptenos del inmunógeno comprenden una porción de reconocimiento, por ejemplo, un hapteno químico. Al utilizar un hapteno químico, de manera preferida, el hapteno HSG, la alta especificidad del enlazante por el anticuerpo se exhibe. Los anticuerpos creados para el hapteno HSG son conocidos y pueden incorporarse fácilmente en el anticuerpo biespecífico apropiado (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,962,702; 7,138,103 y 7,300,644, el texto completo de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia) . Así, la unión del enlazante con el hapteno unido sería altamente específica para el anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

PORCIONES DEL QUELATO En algunas modalidades, una molécula marcada con F-18 puede comprender una o más porciones del quelato hidrofílico, que puede unir iones metálicos y también ayudar a asegurar la rápida eliminación in vivo. Los quelantes pueden seleccionarse por sus propiedades unión al metal particulares, y pueden intercambiarse fácilmente. Las combinaciones de metal quelato particularmente . útiles incluyen 2 -bencil -DTPA y sus análogos de monometilo y ciclohexilo. Los quelantes macrocíclicos tales como NOTA (ácido 1 , 4 , 7- triaza-ciclononano-?,?' , " -triacético) , DOTA y TETA (ácido p-bromoacetamido-bencil- tetraetilamintetraacético) , también son de uso con una variedad de metales, que pueden utilizarse potencialmente como ligandos para la conjugación con F-18. Los quelantes del tipo DTPA y DOTA, en donde el ligando incluye funciones quelantes de bases duras, tales como grupos carboxilato o amina, son más efectivas para quelar cationes ácidos duros, especialmente cationes metálicos del Grupo lia y el Grupo Illa. Tales complejos de metal-quelato pueden hacerse muy estables diseñando el tamaño del anillo para el metal de interés. Otros quelantes del tipo anillo tales como los poliéteres macrocíclicos son de interés para los núclidos que se unen de manera estable. Los quelantes de porfirina pueden utilizarse con numerosos complejos metálicos. Más de un tipo de quelante puede conjugarse a un portador para unir múltiples iones metálicos. Los quelantes tales como aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos No. ,753,206, especialmente los quelantes de tiosemicarbazonilglioxilcisteína (Tscg-Cys) y tiosemicarbazinil-acetilcisteína (Tsca-Cys) , se utilizan de manera ventajosa para unir los cationes ácidos suaves de Te, Re, Bi y otros metales de transición, lantánidos y actínidos que se unen de manera estrecha a los ligandos de bases suaves. Puede ser útil enlazar más de un tipo de quelante a un péptido. Debido a que los anticuerpos para un hapteno de di-DTPA son conocidos (Barbet et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,256,395) , y se acopla fácilmente a un anticuerpo de selección del objetivo para formar un anticuerpo biespecífico, es posible utilizar un hapteno peptídico con un quelante de diDTPA frío y otro quelante para unir un complejo de F-18, en un protocolo de preselección del objetivo. Un ejemplo de tal péptido es Ac-Lys (DTPA) -Tyr-Lys (DTPA) -Lys (Tscg-Cys) -NH2 (SEQ ID NO: 2) . Otros quelantes de ácido duro tales como DOTA, TETA y lo similar, pueden sustituirse por los grupos DTPA y/o Tscg-Cys, y los MAb específicos para los mismos pueden producirse utilizando técnicas análogas a aquéllas utilizadas para generar el Mab anti-di-DTPA. Otro quelante útil puede comprender una porción del tipo NOTA, por ejemplo, como se describe en Chong et al. (Rational . design and generation of a bimodal bifunctional ligand for antibody- largeted radiation cáncer therapy, J. Med: Che . , publicado de manera electrónica el 12-7-07, incorporada en la presente como referencia) . Chong et al., describe la producción y uso de un ligando C-NETA bifuncional, basado en la estructura del NOTA, y cuando se compleja con 177Lu o 205/206BÍ muestran estabilidad en suero hasta por 14 días. Se apreciará que dos diferentes quelantes de ácido duro o ácido suave pueden incorporarse en el constructo selecciónatele , por ejemplo, con diferentes tamaños del anillo del quelato, para unirse de manera preferencial a dos diferentes cationes de ácido duro o ácido suave, debido a los tamaños diferentes de los cationes, las geometrías de los anillos del quelato y las estructuras del ion del complejo preferido de los cationes. Esto permitirá que dos metales diferentes, uno o ambos de los cuales pueden unirse a F-18, se incorporen en un constructo seleccionable para la captura eventual por un anticuerpo biespecífico preseleccionado como objetivo.

MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN En varias modalidades, los anticuerpos biespecífieos y: los constructos seleccionables pueden utilizarse para la formación de imágenes de tejidos u órganos normales o enfermos (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,126,916; 6,077,499; 6,010,680; 5,776,095; 5,776,094; 5,776,093; 5,772,981; 5,753,206; 5,746,996; 5,697,902; 5,328,679; 5,128,119; 5,101,827; y 4,735,210, cada una incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . La administración de un anticuerpo biespecífico (bsAb) y un constructo seleccionable marcado con F-18 puede realizarse administrando el anticuerpo bsAb en algún momento antes de la administración del constructo seleccionable. Las dosis y tiempos de los reactivos pueden considerarse fácilmente por algún experto con experiencia, y son dependientes de la naturaleza específica de los reactivos empleados. Si un derivado de bsAb-F(ab' > 2 se proporciona primero, entonces un tiempo de espera de 24-72 horas (de manera alterna 48-96 horas) antes de la administración del constructo seleccionable sería apropiado. Si un conjugado de IgG-Fab' bsAb es el vector de selección primario, entonces un periodo de espera más largo antes de la administración del constructo seleccionable estaría indicado, en el intervalo de 3-10 días. Después de que ha pasado suficiente tiempo para que el bsAb seleccione como objetivo el tejido enfermo, el constructo seleccionable marcado con F-18 es administrado. Posteriormente a la administración del constructo seleccionable, puede realizarse la formación de imágenes. Ciertas modalidades se relacionan con el uso de proteínas que se unen a un objetivo multivalente que tienen al menos tres diferentes sitios de unión objetivo como se describe en la solicitud de patente No. de Serie 60/220,782. Las proteínas multivalentes que se unen al objetivo se han hecho reticulando varios fragmentos similares a Fab vía enlazantes químicos. Véanse las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,262,524; 5,091,542 y Landsdorp et al. Euro. J. Immunol . 16: 679-83 (1986). Las proteínas multivalentes que se unen al objetivo también se han hecho enlazando de manera covalente varias moléculas de Fv de cadena sencilla (scFv) , para formar un solo polipéptido. Véase la Patente de los Estados Unidos No. 5,892,020. Una proteína multivalente que se une al objetivo, que es básicamente un agregado de moléculas scFv, se ha descrito en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,025,165 y 5,837,242. Una proteína trivalente de unión al objetivo que comprende tres moléculas de scFv se ha descrito en Krott et al. Protein Engineering 10(4): 423-433 (1997) . De manera alterna, una técnica conocida como "acoplar y asegurar" (DNL) , se ha demostrado para la construcción simple y reproducible de una variedad de complejos multivalentes, incluyendo complejos que comprenden dos o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpos diferentes. (Véanse, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. de Serie 11/389,358, presentada en Marzo 24 del 2006; 11/391,584, presentada en Marzo 28 del 2006; 11/478,021, presentada en Junio 29 del 2006; 11/633,729, presentada en Diciembre 5 del 2006; y 11/925,408, presentada en Octubre 26 del 2007, el texto de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Tales constructos también pueden utilizarse para la práctica de los métodos y composiciones reclamados descritos en la presente. Puede utilizarse un agente de eliminación que se proporciona entre las dosis del anticuerpo biespecífico (bsAb) y el constructo seleccionable . Puede utilizarse un agente de eliminación de una acción mecanística novedosa, a saber, un fragmento Fab' antiidiotípico glucosilado unido contra los brazos que seleccionan la enfermedad del bsA . En un ejemplo, el bsAb anti-CEA (MN-14 Ab) x antipéptido se proporciona y deja acrecentar en los objetivos de la enfermedad a su extensión máxima. Para eliminar el bsAb residual, se proporciona un Ab antiidiotípico para MN-14, denominado WI2, de manera preferida como un fragmento Fab' glucosilado. El agente de eliminación se une al bsAb de una manera monovalente, mientras que sus residuos de glucosilo unidos dirigen todo el complejo al hígado, en donde tiene lugar el metabolismo rápido. A continuación, el constructo seleccionable marcado con F-18 se proporciona al sujeto. El Ab WI2 para el brazo de MN-14 del bsAb tiene una alta afinidad, y el mecanismo de eliminación difiere de otros mecanismos descritos (véase, Goodwin et al., ibid) , y no involucra reticulación, debido a que WI2-Fab' es una porción monovalente. Sin embargo, se conocen métodos alternos y composiciones para agentes de eliminación y cualquiera de tales agentes de eliminación conocidos puede utilizarse .

FORMULACIÓN Y ADMINISTRACIÓN Las moléculas marcadas con F-18 pueden formularse para obtener composiciones que incluyen uno o más excipientes farmacéuticamente adecuados, uno o más ingredientes adicionales o alguna combinación de éstos. Éstos pueden lograrse mediante métodos conocidos para preparar dosificaciones farmacéuticamente útiles, por lo que los ingredientes activos (es decir, las moléculas marcadas con F-18) , se combinan en una mezcla con uno o más excipientes farmacéuticamente adecuados. La solución salina amortiguada con fosfato estéril, es un ejemplo de un excipiente farmacéuticamente adecuado. Otros excipientes adecuados son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Véanse, por ejemplo, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5a Edición (Lea & Febiger 1990), y Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición (Mack Publishing Company 1990), y las ediciones revisadas de los mismos. La ruta preferida para la administración de las composiciones descritas en la presente es la inyección parenteral . La inyección puede ser intravenosa, intraarterial , intralinfática, intratecal o intracavidad (es decir, parenteralmente) . En la administración parenteral, las composiciones se formularán en una forma inyectable de dosificación unitaria, tal como una solución, suspensión o emulsión, en asociación con un excipiente farmacéuticamente, aceptable. Tales excipientes son, de manera inherente no tóxicos y no terapéuticos. Los ejemplos de tales excipientes son solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Los excipientes no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo también pueden utilizarse. Un excipiente preferido es dextrosa al 5% en solución salina. El excipiente puede contener cantidades menores de aditivos, tales como sustancias para mejorar la isotonicidad y la estabilidad química, incluyendo amortiguadores y conservadores. Otros métodos de administración, incluyendo la administración oral, también están contemplados. Las composiciones formuladas que comprenden las moléculas marcadas con F-18 pueden utilizarse para la administración intravenosa vía, por ejemplo, una inyección de bolo o infusión continua. Las composiciones para la inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes que con múltiples dosis, con un conservador agregado. Las composiciones también pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes formulatorios tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o agentes de dispersión. De manera alterna, las composiciones pueden estar en la forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril antes del uso. Las composiciones pueden administrarse en solución. El pH de la solución debe estar en el intervalo de pH 5 a 9.5, de manera preferida, pH 6.5 a 7.5. La formulación de las mismas debe ser una solución que tiene un amortiguador farmacéuticamente aceptable adecuado, tal como fosfato, TRIS (hidroximetil ) aminometano-HCl o citrato y lo similar. Las concentraciones del amortiguador deben estar en el intervalo de 1 a 100 mM. La solución formulada también puede contener una sal, tal como cloruro de sodio o cloruro de potasio en una concentración de 50 a 150 mM. Una cantidad efectiva de un agente estabilizante tal como glicerol, albúmina, una globulina, un detergente, una gelatina, una protamina o una sal de protamina también puede incluirse. Las composiciones pueden administrarse a un mamífero de manera subcutánea, intravenosa, intramuscular o mediante otras rutas parenterales . Además, la administración puede ser mediante infusión continua o mediante uno solo o múltiples bolos. En donde se administran los anticuerpos biespecíficos , por ejemplo, en una técnica de preselección del objetivo, la dosificación de un anticuerpo administrado para los humanos variará dependiendo de factores tales como la edad, peso, altura, sexo, condición médica general e historial médico del paciente. Típicamente, para propósitos de formación de imágenes, es deseable proporcionar al receptor una dosificación del anticuerpo biespecífico que esté en el intervalo de aproximadamente 1 mg a 200 mg como una sola infusión intravenosa, aunque una dosificación mayor o menor también puede administrarse conforme lo dicten las circunstancias. Típicamente, es deseable proporcionar al receptor una dosificación que está en el intervalo de aproximadamente 10 mg por metro cuadrado de área superficial corporal o 17 a 18 mg del anticuerpo para el adulto típico, aunque una dosificación menor o mayor también puede administrarse conforme lo dicten las circunstancias. Los ejemplos de las dosificaciones de los anticuerpos biespecíficos que pueden administrarse a un sujeto humano para propósitos de formación de imágenes, son de 1 a 200 mg, de manera más preferida, 1 a 70 mg, de manera más preferida, 1 a 20 mg, aunque pueden utilizarse dosis más altas ? más bajas. En general, la dosificación de la marca de F-18 a administrarse, variará dependiendo de factores tales como la edad, peso, altura, sexo, condición médica general e historial médico previo del paciente. De manera preferida, una dosis saturante de las moléculas marcadas con F-18 se administra a un paciente. Para la administración de las moléculas marcadas con F-18, la dosificación puede medirse mediante milicuries. Un intervalo típico para los estudios de formación de imágenes con F-18 sería de cinco a 10 mCi .

ADMINISTRACIÓN DE LOS PÉPTIDOS Varias modalidades de los métodos y/o composiciones reclamadas pueden relacionarse con uno o más péptidos marcados con F-18 a ser administrados a un sujeto. La administración puede ocurrir mediante cualquier ruta conocida en la técnica, incluyendo, de manera no exclusiva, oral, nasal, bucal, mediante inhalación, rectal, vaginal, tópica, ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal , intraarterial , intratecal o inyección intravenosa. En donde, por ejemplo, los péptidos marcados con F-18 se administran en un protocolo de preselección del1 objetivo, los péptidos se administrarán de manera preferida i.v., (intravenosa). Los péptidos no modificados administrados oralmente a un' sujeto, pueden degradarse en el tracto digestivo y dependiendo de la secuencia y estructura, pueden exhibir una absorción deficiente a través del revestimiento intestinal. Sin embargo, los métodos para modificar químicamente los péptidos para volverlos menos susceptibles a la degradación por las proteasas endógenas o más absorbibles a través del tracto alimenticio, son bien conocidos (véanse, por ejemplo, Blondelle el al., 1995, Biophys. J. 69:604-11; Ecker y Crooke, 1995, Biotechnology 13:351-69; Goodman y Ro, 1995, BURGER'S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY, VOL . I, ed . Wollf, John Wiley & Sons; Goodman y Shao, 1996, Puré & Appl . Chem. 68:1303-08). Los métodos para preparar bibliotecas de análogos peptídicos, tales como péptidos que contienen D-aminoácidos ; peptidomiméticos que consisten de moléculas orgánicas que imitan la estructura de un péptido; o peptoides tales como peptoides vinílogos, también se han descrito y pueden utilizarse para construir moléculas marcadas con F-18 basadas en péptidos, adecuadas para la administración oral a un sujeto. En ciertas modalidades, el enlace de unión al péptido estándar puede reemplazarse por uno o más grupos enlazantes alternos, tales como CH2-NH, CH2-S, CH2-CH2, CH=CH, CO-CH2, CHOH-CH2 y lo similar. Los métodos para preparar miméticos peptídicos son bien conocidos (por ejemplo, Hruby, 1982, Life Sci 31:189-99; Holladay et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24:4401-04; Jennings-White et al., 1982, Tetrahedron Lett . 23:2533; Almquiest et al . , 1980, J. Med. Chem. 23:1392-98; Hudson et al . , 1979, Int . J. Pept . Res. 14:177-185; Spatola et al . , 1986, Life Sci 38:1243-49; Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,169,862; 5,539,085; 5,576,423, 5,051,448, 5,559,103, cada uno incorporado en la presente como referencia) . Los miméticos peptídicos pueden exhibir una estabilidad y/o absorción mejorada in vivo en comparación con sus análogos peptídicos. De manera alterna, los péptidos pueden administrarse mediante suministro oral, utilizando la coronación N terminal y/o C terminal para evitar la actividad de la exopeptidasa . Por ejemplo, el término C puede coronarse utilizando péptidos de amida y el término N puede coronarse mediante la acetilación del péptido. Los péptidos también pueden ciclarse para bloquear las exopeptidasas , por ejemplo, mediante la formación de amidas cíclicas, disulfuros, éteres, sulfuros y lo similar. La estabilización del péptido también puede ocurrir mediante ' la sustitución de los D-aminoácidos por los L-aminoácidos naturales, particularmente en ubicaciones en donde se sabe que actúan las endopeptidasas . Las secuencias de unión y escisión de la endopeptidasa son conocidas en la técnica y se han descrito métodos para hacer y utilizar los péptidos que incorporan los D-aminoácidos (por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20050025709, cBride et al., presentada en Junio 14 del 2004, incorporada en la presente como referencia) . En ciertas modalidades, los péptidos y/o proteínas pueden administrarse oralmente mediante coformulación con inhibidores de la proteinasa y/o peptidasa. Otros métodos para el suministro oral de los péptidos terapéuticos se describe en Menta ("Oral delivery and recombinant production of peptide hormones" , Junio 2004, BioPhar International) . Los péptidos se administran en una forma de dosificación sólida con recubrimiento entérico, con excipientes que modulan la actividad proteolítica intestinal y mejoran el transporte del péptido a través de la pared intestinal. La biodisponibilidad relativa de los péptidos intactos utilizando esta técnica, varía del 1% al 10% de la dosificación administrada. La insulina se ha : administrado de manera exitosa en perros utilizando microcápsulas con recubrimiento entérico con colato de sodio y un inhibidor de la proteasa (Ziv et al., 1994, J. Bone Miner. Res. 18 (Supl. 2) :792-94. La administración oral de los péptidos se ha revisado utilizando acilcamitina como un mej orador de la permeación y un recubrimiento entérico (Eudragit L30D-55, Rohm Pharma Polymers, véase :Mehta, 2004) . Los excipientes de uso para los péptidos administrados oralmente pueden incluir generalmente uno o más inhibidores de las proteasas/peptidasas intestinales, junto con detergentes u otros agentes para mejorar la solubilidad o absorción del péptido, que puede empacarse dentro de una cápsula o tableta con recubrimiento entérico (Menta, 2004). Los ácidos orgánicos pueden incluirse en la cápsula para acidificar el intestino e inhibir la actividad de la proteasa intestinal una vez que la cápsula se disuelve en el intestino (Menta, 2004). Otra alternativa para el suministro oral de los péptidos sería incluir la conjugación a los oligómeros anfifílicos basados en polietilenglicol (PEG) , incrementando la absorción y resistencia a la degradación enzimática (Soltero y Ekwuribe, 2001, Pharm. Technol . 6:110).

MÉTODOS PARA CREAR ANTICUERPOS Los Ab para las cadenas principales peptídicas pueden generarse mediante métodos bien conocidos para la producción de Ab. Por ejemplo, la inyección de un inmunógeno, tal como el (péptido) n-KLH, en donde KLH es hemocianina de lapa calada, y n= 1-30, en adyuvante de Freund completo, seguido por dos inyecciones posteriores del mismo inmunógeno suspendido en adyuvante de Freund incompleto en animales inmunocompetentes , es seguido tres días después por un refuerzo i.v. del antígeno, mediante la recolección de la célula del bazo. Las células del bazo recolectadas se fusionan a continuación con células del mieloma Sp2/0-Agl4 y los sobrenadantes del cultivo de las clonas resultantes se analizan para la reactividad antipeptídica utilizando un ELISA de unión directa. La especificidad de los Ab generados puede analizarse utilizando fragmentos peptídicos del inmunógeno original. Estos fragmentos pueden prepararse fácilmente utilizando un sintetizador peptídico automático. Para la producción del Ab, los hibridomas deficientes de la enzima se aislan para permitir la selección de las líneas celulares fusionadas. Esta técnica también puede utilizarse para crear anticuerpos para uno o más de los quelatos que comprenden el constructo seleccionable, por ejemplo, quelatos de In (III) -DTPA. Se conocen los anticuerpos de ratón monoclonales para In ( III) -di-DTPA (Barbet '395 supra) . Los anticuerpos de selección de uso, por ejemplo, como componentes de los anticuerpos biespecífieos , pueden ser específicos para una variedad de antígenos asociados con el tumor de la superficie celular o intracelulares como sustancias marcadoras. Estos marcadores pueden ser sustancias producidas por el tumor o pueden ser sustancias que se acumulan en el sitio del tumor, en la superficie de las células del tumor o dentro de las células del tumor, ya sea en el citoplasma, el núcleo o en varios organelos o estructuras subcelulares . Entre tales marcadores asociados con el tumor, están aquéllos descritos por Herberman, "Immunodiagnosis of Cáncer", en Fleisher ed., "The Clinical Biochemistry of Cáncer", página 347 (American Association of Clinical Chemists, 1979) y en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,150,149; 4,361,544; y 4,444,744, cada una incorporada en la presente como referencia. Los reportes recientes sobre los antígenos asociados con el tumor incluyen Mizukami et al., (2005, Nature Med. 11:992-97); Hatfield et al., (2005, Curr. Cáncer Drug Targets 5 : 229-48) ; Vallbohmer et al. (2005, J. Clin. Oncol . 23:3536-44); y Ren et al. (2005, Ann. Surg. 242:55-63), cada una incorporada en la presente como referencia. Los marcadores asociados con el tumor se han clasificado por Herberman, supra, en varias categorías, incluyendo los antígenos oncofetales, los antígenos de la placenta, antígenos asociados con el virus oncogénico o de tumor, antígenos asociados con el tejido, antígenos asociados con los órganos, antígenos de hormonas ectópicas y normal o variantes de los mismos. Ocasionalmente, una subunidad de un marcador asociado con el tumor se utiliza de manera ventajosa para crear anticuerpos que tienen una especificidad de^L tumor más alta, por ejemplo, la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana (HCG, por sus siglas en inglés) o la región gamma del antígeno carcinoembriónico (CEA, por sus siglas en inglés) , que estimulan la producción de anticuerpos que tienen una reactividad cruzada reducida en gran medida para las sustancias no tumorales, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,361,644 y 4,444,744. Otro marcador de interés es el activador transmembranal y el CAML- interactor (TACI) . Véase, Yu et al. Nat. Immunol. 1:252-256 (2000) . Brevemente, TACI es un marcador para las malignidades de los linfocitos B (por ejemplo, linfoma) . Además, se sabe que TACI y el antígeno de la maduración de los linfocitos B (BCMA) , están unidos por el homólogo del factor de necrosis del tumor, un ligando que induce la proliferación (APRIL) . El APRIL estimula la proliferación in vitro de los linfocitos B y T primarios e incrementa el peso del bazo debido a la acumulación de linfocitos B in vivo. El APRIL también compite con TALL-I (también llamado BLyS o BAFF) por la unión del receptor. El BCMA y TACI solubles, evitan de manera específica la unión de APRIL y bloquean la proliferación estimulada por APRIL de los linfocitos B primarios. BCMA-Fe también inhibe la producción de los anticuerpos contra la hemocianina de lapa ranurada y Pneumovax en ratones, indicando que la señalización de APRIL y/o TALL-I vía BCMA y/o TACI se requiere para la generación de la inmunidad humoral. Así, APRIL-TALL-I y BCMA-TACI forman una trayectoria de dos ligandos-dos receptores involucrada la estimulación de la función de los linfocitos B y T. Los antígenos objetivo ejemplares de uso para la formación de imágenes de varias enfermedades o condiciones, tales como una enfermedad maligna, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune o una enfermedad neurológica pueden incluir el antígeno p específico del colon (CSAp) , el antígeno carcinoembriónico (CEA), CD4 , CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD45, CD74, CD79a, CD80, HLA-DR, la, Ii, MUC 1, MUC 2, MUC 3, MUC 4, NCA (CEACAM6 o CD66a-d y CD67, así como también CD 138), EGFR, HER 2/neu, TAG-72, EGP-1, EGP-2, A3 , KS-1, Le (y), S100, PSMA, PSA, tenascina, receptor de folato, VEGFR, PIGF, ILGF-1, antígenos de la necrosis, IL-2, IL-6, T101, MAGE , o una combinación de estos antígenos. En particular, los antígenos pueden incluir el antígeno carcinoembriónico (CEA) , tenascina, el receptor del factor de crecimiento epidérmico, el receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas, los receptores del factor de crecimiento del fibroblasto, los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular, gangliósidos , receptores HER/2neu y combinaciones de estos antígenos.

En donde la formación de imágenes o detección involucra un linfoma, leucemia o trastorno autoinmune, los antígenos seleccionados como objetivo pueden seleccionarse del grupo que consiste de CD4 , CD5 , CD8 , CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52 , CD54, CD67, CD74 , CD79a, CD80, CD126, CD138, CD154, B7, MUC1, la, Ii, HM1.24, HLA-DR, tenascina, VEGF, PIGF, ED-B fibronectina , un oncogen, un producto del oncogen, CD66a-d, antígenos de la necrosis, IL-2, T101, TAG, IL-6, MIF, TRAIL-R1 (DR4) y TRAIL-R2 (DR5) . Después de la creación inicial de los anticuerpos para el inmunógeno, los anticuerpos pueden secuenciarse y prepararse posteriormente mediante técnicas recombinantes . La humanización y quimerización de anticuerpos murinos y fragmentos de anticuerpos son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanizados se producen transfiriendo las regiones que determinan la complementariedad del ratón de las cadenas variables pesada y ligera de la : inmunoglobulina de ratón en un dominio variable humano, y a continuación, sustituyendo los residuos humanos en las regiones del marco de las contrapartes murinas . El uso de los componentes del anticuerpo derivados de anticuerpos monoclonales humanizados, evita los problemas potenciales asociados con la inmunogenicidad de las regiones constantes murinas . Las técnicas generales para clonar los dominios variables de la inmunoglobulina murina se describen, por ejemplo, por la publicación de Orlandi et al., Proc . Nat'l Acad. Sci. EUA 86: 3833 (1989), que se incorpora como referencia en su totalidad. Se describen las técnicas para producir MAb humanizados, por ejemplo, por Jones et al., Nature 321:522 (1986), Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988), C rter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit . Rev. Biotech. 12:437 (1992), y Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1993), cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. De manera alterna, los anticuerpos completamente humanos pueden obtenerse de animales no humanos transgénicos . Véanse, por ejemplo, Méndez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997); Patente de los Estados Unidos No. 5,633,425. Por ejemplo, los anticuerpos humanos pueden recuperarse de ratones transgénicos que poseen locus de inmunoglobulina humana. El sistema inmune humoral del ratón es humanizado inactivando los genes de la inmunoglobulina endógena e introduciendo los locus de la inmunoglobulina humana. Los locus de la inmunoglobulina humana son muy complejos y comprenden un gran número de segmentos descritos que ocupan juntos al menos 0.2% del genoma humano. Para asegurar que los ratones transgénicos son capaces de producir los repertorios adecuados de anticuerpos, grandes porciones de los locus de la cadena pesada y ligera humana deben introducirse en el genoma del ratón. Esto se logra en un proceso paso a paso que empieza con la formación de cromosomas artificiales de levadura (YAC) que contienen ya sea los locus de la inmunoglobulina de cadena pesada1 o ligera humana en configuración de línea germinal. Puesto que cada inserto es de aproximadamente 1 Mb de tamaño, la construcción de los YAC requiere la recombinación homologa de fragmentos que se superponen de los locus de inmunoglobulina . Los dos YAC, uno que contiene el locus de la cadena pesada y uno que contiene el locus de la cadena ligera, se introducen de manera separada en los ratones vía la fusión de esferoblastos de levadura que contienen los YAC con células germinales embriónicas de ratón. Las clonas de las células germinales embriónicas se microinyectan a continuación en blastocitos de ratón. Los machos quiméricos resultantes se seleccionan por su capacidad para . transmitir el YAC a través de su línea germinal y se crían con ratones deficientes para la producción del ^anticuerpo murino . La cría de dos razas transgénicas , una que contiene el locus de la cadena pesada humana y la otra que contiene el locus de la cadena ligera humana, crea una progenie que produce anticuerpos humanos en respuesta a la inmunización. Los genes de la inmunoglobulina humana no rearreglados también pueden introducirse en células germinales embriónicas de ratón vía la transferencia del cromosoma mediada por microcélulas (M CT) . Véase, por ejemplo, Tomizuka et al., Nature Genetics, 16:133 (1997). En esta metodología, las microcélulas que contienen los cromosomas humanos se fusionan con células germinales embriónicas de ratón. Los cromosomas transferidos se mantienen de manera estable, y las quimeras adultas exhiben una expresión apropiada específica del tejido. Como una alternativa, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede derivarse de los fragmentos de anticuerpos humanos aislados de una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria. Véanse, por ejemplo, Barbas et al., METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2:119 (1991), y Winter et al., Ann. Rev . Immunol . 12:433 (1994), que se incorporan en la presente como referencia. Muchas de las dificultades asociadas con la generación de anticuerpos monpclonales mediante la inmortalización de los linfocitos B, pueden superarse diseñando y expresando fragmentos de anticuerpos en E. coli, utilizando la representación del fago. Una estrategia similar puede emplearse para obtener scFv de alta afinidad. éase, por ejemplo, Vaughn et al., Nat. Biotechnol . , 14:309-314 (1996). Una biblioteca de scFv con un gran repertorio puede construirse aislando los genes V de los donadores humanos no inmunizados utilizando los cebadores de la PCR que corresponden a todas las familias de genes conocidas VH, ka pa y V80. Después de la amplificación, las colecciones de Vkappa y Viambda se combinan para formar una colección. Estos fragmentos se ligan en un vector de fagémido. El enlazante de scFv (Gly4, Ser)3, se liga a continuación en el fagémido corriente arriba del fragmento VL. Los fragmentos de VH y enlazante -V,, se amplifican y montan en la región JH . Los fragmentos de VH-enlazante-VL resultantes se ligan en un vector de fagémido. La biblioteca del fagémido puede panoramizarse utilizando filtros, como se describió anteriormente, o utilizando inmunotubos (NUNC®; MAXISORP®) . Pueden alcanzarse resultados similares construyendo una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria, de linfocitos o células de bazo de conejos inmunizados y expresando los constructos scFv en P. pastorís . Véase, por ejemplo, Ridder et al., Biotechnology, 13:255-260 (1995). Además, después del aislamiento de un scFv apropiado, los fragmentos de anticuerpos con afinidades de unión mayores y velocidades de disociación más lentas, pueden obtenerse a través de los procesos de maduración por afinidad, tales como mutagénesis CDR3 y rearreglo de la cadena. Véanse, por ejemplo, Jackson et al., Br. J. Cáncer, 78:181-188 (1998); Osbourn et al., Immunotechnology, 2:181-196 (1996). Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un .péptido que codifica una sola CDR. Los péptidos de CDR ("unidades de reconocimiento mínimas"), pueden obtenerse construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable . del ARN de las células que producen el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods : A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", en MONOCLONAL ANTIBODIES : PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), páginas 166-179 (Cambridge University Press 1995) ; y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), páginas 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995). Los anticuerpos biespecífieos pueden preparase mediante técnicas conocidas en el campo, por ejemplo, un Ab de tumor anti-CEA y un Ab antipeptídico se digieren ambos de manera separada con pepsina a sus fragmentos F(ab')2 respectivos. El ' anti-CEA-Ab-F (ab' ) 2 se reduce con cisteína para generar unidades monoméricas de Fab' que se hacen reaccionar además con el reticulador de bis (maleimido) hexano para producir las porciones de Fab' -maleimid . El antipéptido Ab-F(ab')2 se reduce con cisteína y el antipéptido Fab' -SH recuperado purificado se hace reaccionar con anti-CEA- Fab' -maleimida para generar el Ab biespecífico Fab' x Fab' . De manera alterna, el fragmento antipéptido Fab' -SH puede acoplarse con anti-CEA F(ab')2 para generar un constructo de F(ab')2 x Fab', o con la IgG anti-CEA para generar un constructo biespecífico IgG x Fab' . En una modalidad, el constructo IgG x Fab' puede prepararse de una manera específica del sitio uniendo el grupo tiol Fab' del antipéptido a un carbohidrato de cadena pesada de la IgG anti-CEA que se ha oxidado con peryodato, y activado posteriormente mediante la reacción con un reticulador de hidrazida-maleimida comercialmente disponible. Los Ab del componente utilizado pueden quimerizarse o humanizarse mediante técnicas conocidas. Un anticuerpo quimérico es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y las regiones que determinan la complementariedad derivada de un anticuerpo de roedor, mientras que el resto de la molécula del anticuerpo se deriva de un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados son proteínas recombinantes en las cuales las regiones que determinan la complementariedad murina de un anticuerpo monoclonal, se han transferido de las cadenas variable pesada y ligera de la inmunoglobulina murina a un dominio variable humano. Un Ab quimérico se construye ligando el fragmento de ADNc que codifica los dominios variable ligero y variable pesado , de ratón a un fragmento que codifica los dominios C de un anticuerpo humano. Debido a que los dominios C no contribuyen a la unión al antígeno, el anticuerpo quimérico mantendrá la misma especificidad del antígeno que el Ab de ratón original, pero estará más cercano a los anticuerpos humanos en la secuencia. Los Ab quiméricos contienen todavía algunas secuencias de ratón, sin embargo, y pueden ser todavía inmunogénicos . Un Ab humanizado contiene sólo aquellos aminoácidos de ratón necesarios para reconocer el antígeno. Este producto es construido contrayendo en un marco de anticuerpo humano los aminoácidos de las regiones que determinan la complementariedad del ratón. Otros métodos recientes para producir anticuerpos biespecíficos incluyen Ab recombinantes diseñados que tienen residuos de cisterna adicionales, de manera que se reticulan de manera más fuerte que los isotipos de inmunoglobulina más comunes. Véase, por ejemplo, FitzGerald et al., Protein Eng . 10:1221-1225, 1997. Otro procedimiento es diseñar proteínas de fusión recombinantes que se enlazan a dos o más diferentes anticuerpos o segmentos de fragmentos de anticuerpos de una sola cadena con las especificidades dobles necesarias. Véase, por ejemplo, Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997. Una variedad de proteínas de fusión biespecíficas pueden producirse utilizando la ingeniería molecular. En una forma, la proteína de fusión biespecífica es monovalente, que consiste de, por ejemplo, un scFv con un solo sitio de unión para un antígeno y un fragmento Fab con un solo sitio de unión para un segundo antigeno. En otra forma, la proteína de fusión divalente, que consiste de, por ejemplo, una IgG con dos sitios de unión para un antígeno y dos scFv con dos sitios de unión para un segundo antígeno. Los anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos funcionales (bscAb) , también llamados diacuerpos, pueden producirse en células de mamífero utilizando métodos recombinantes . Véase, por ejemplo, Mack et al., Proc . Nati. Acad. Sci.¡, 92: 7021-7025, 1995. Los anticuerpos biespecíficos preferidos son aquéllos que incorporan el Fv del MAb Mu-9 y el Fv del MAb 679 o el Fv de MAb MN-14 y el Fv de MAb 679, y sus contrapartes humanas, quimerizadas o humanizadas. El MN-14, así como sus contrapartes quimerizadas y humanizadas, se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,874,540. También se prefieren los anticuerpos biespecíficos que incorporan una o más de las CDR de Mu- 9 ó 679. El anticuerpo también puede ser una proteína de fusión o un anticuerpo biespecífico que incorpora un anticuerpo anti-CEA Clase III y Fv de 679. Los anticuerpos de Clase III, incluyendo anti-CEA de Clase III se discuten con detalle en la Patente de los Estados Unidos No. 4, 818, 709. El experto con experiencia se dará cuenta de que los anticuerpos biespecífieos pueden incorporar cualquier anticuerpo o fragmento conocido en la técnica, que tenga especificidad de unión por un antígeno objetivo que se sabe que se asocia con un estado o condición de enfermedad. Tales anticuerpos conocidos incluyen, de manera no exclusiva, LL1 (anti-CD74), LL2 y RFB4 (anti-CD22), hA20 (anti-CD20) , RS7 (glucoproteína 1 antiepitelial (EGP-1) ) , PA -4 y KC4 (ambos antimucina) , MN-14 (antígeno anticarcinoembriogénico (CEA, también conocido como CD66e) ) , MN-3 c MN-15 (NCA o CEACAM6), Mu-9 (antígeno p específico de anticolon) , Immu 31 (una antialfa fetoproteína) , TAG-72 (por ejemplo, CC49) , Tn, J591 (anti-PSMA (antígeno de la membrana específico de la próstata) ) , G250 (un MAb anti -anhidrasa carbónica IX) y L243 (anti-HLA-DR) . Tales anticuerpos se conocen en la técnica (por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,686,072; 5,874,540; 6,107,090; 6,183,744; 6,306,393; 6,653,104; 6,730,300; 6,899,864; 6,926,893; 6,962,702; 7,074,403; 7,230,084; 7,238,785; 7,238,786; 7,256,004; 7,282,567; 7,300,655; 7,312,318; y las Publicaciones de las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. 20040185053; 20040202666; 20050271671; 20060193865; 20060210475; 20070087001; cada una incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . Tales anticuerpos conocidos son de uso para la detección y/o formación de imágenes de una variedad de estados o condiciones de enfermedad (por ejemplo, bsMAb hMN-14 o TF2 (carcinomas que expresan a CEA) , bsMab hA20 (TF-4 - linforna) , hPAM4 (cánceres del páncreas TF-10) , bsMAb RS7 (cánceres de pulmón, mama, ovario, próstata) , bsMAb hMN-15 o hMN3 (inflamación), bsMAb gpl20 y/o gp41 humano (VIH), bsMab antiplaquetas y bsMab antitrombina (formación de imágenes de coágulos) , bsMAb antimiosina (necrosis cardiaca) ) . Los anticuerpos anti-VIH candidatos incluyen el anticuerpo anticubierta descrito por Johansson et al. (AIDS. 2006 Oct 3; 20 ( 15 ) : 1911 - 5 ) , así como los anticuerpos anti-VIH descritos y vendidos por Polymun (Viena, Austria) , también descritos en la Patente de los Estados Unidos 5,831,034, la Patente de los Estados Unidos 5,911,989, y Vcelar et al., AIDS 2007; 21 ( 16 ): 2161-2170 y Jóos et al., Antimicrob. Agens Chemother. 2006; 50 ( 5 ) : 1773 - 9 , todos incorporados en la presente en su totalidad como referencia.

En ciertas modalidades, los constructos seleccionables marcado con F-18 del bsAb, discutidos anteriormente, pueden utilizarse en la detección intraoperatoria, intravascular y/o endoscópica de tumores y lesiones, biopsia y terapia como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,096,289.

FORMACIÓN DE IMÁGENES UTILIZANDO MOLÉCULAS MARCADAS Los métodos para la formación de imágenes utilizando moléculas marcadas son bien conocidos en la técnica, y cualquiera de tales métodos conocidos puede utilizarse con las moléculas marcadas con fluoruro descritas en la presente. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,241,964; 6,358,489; 6,953,567 y las Publicaciones de las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos publicadas Nos. 20050003403; 20040018557; 200,60140936, cada una incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Véanse también, Page et al., Nuclear Medicine And Biology, 21:911-919, 1994; Choi et al., Cáncer Research 55:5323-5329, 1995; Zalutsky et al., J. Nuclear Med., 33:575-582, 1992; Woessner et . al. Magn. Reson. Med. 2005, 53: 790-99. En ciertas modalidades, las moléculas marcadas con F-18 pueden utilizarse en la formación de imágenes de tejidos y órganos normales o enfermos, por ejemplo, utilizando los métodos descritos en las Patentes de los Estados Unidos NOS. 6,126,916; 6,077,499; 6,010,680; 5,776,095; 5,776,094; 5,776,093; 5,772,981; 5,753,206; 5,746,996; 5,697,902; 5,328,679; 5,128,119; 5,101,827; y 4,735,210, cada una incorporada en la presente como referencia. Los métodos adicionales se describe en la Solicitud de los Estados Unidos No. de Serie 09/337,756, presentada en Junio 22 de 1999 y en la Solicitud de los Estados Unidos No. de Serie 09/823,746, presentada en Abril 3 del 2001. Tal formación de imágenes puede realizarse mediante el marcado directo con F-18 de las moléculas de selección apropiadas, o mediante un método de formación de imágenes preseleccionado, como se describe en Goldenberg et al. (2007, Update Cáncer Ther. 2:19-31) ; Sharkey et al. (2008, Radiology 246:497-507) ; Goldenberg et al. (2008, J. Nucí. Med. 49:158-63) ; Sharkey et al. (2007, Clin. Cáncer Res. 13 : 5777S-5585S) ; McBride et al. (2006, J. Nucí. Med. 47:1678-88) ; Goldenberg et al. (2006, J. Clin. Oncol . 24:823-85) , véase también las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. 20050002945, 20040018557, 20030148409 y 20050014207, cada una incorporada en la presente como referencia. Los métodos de formación de imágenes de diagnóstico con péptidos marcados o MAb son bien conocidos. Por ejemplo, en la técnica de la inmunoscintigrafia, los ligandos o anticuerpos se marcan con un radioisótopo que emite gamma y se introducen en un paciente. Una cámara gamma se utiliza para detectar la ubicación y distribución de los radioisótopos que emiten gamma. Véanse, por ejemplo, Srivastava (ed) , RADIOLABELED MONOCLONAL A TIBODIES FOR I AGING AND THERAPY (Plenum Press 1988) , Chase, "Medical Applications of Radioisotopes" , en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES , 18a Edición, Gennaro et al. (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990), y Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies" , en BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49, Pezzuto et al. (eds.) (Chapman & Hall 1993) . También se prefiere el uso de radionúclidos que emiten positrones (isótopos PET) , tales como con una energía de 511 keV, tales como 18F, 68Ga, 64Cu y 12 I. Pueden formarse imágenes de tales radionúclidos mediante técnicas de exploración con PET bien conocidas.

' EJEMPLOS EJEMPLO 1. MARCADO CON F-18 DEL PÉPTIDO IMP 272 El primer péptido que se utilizó fue el IMP 272: DTPA-Gln-Ala-Lys (HSG) -D-Tyr-Lys (HSG) -N¾ MH+ 1512. Solución de amortiguador de acetato -El ácido acético, 1.509 g se diluyó en -160 mL de agua y el pH se ajustó mediante la adición de NaOH 1 M, a continuación se diluyó a 250 mL para proporcionar una solución 0.1 M a pH 4.03. Solución de amortiguador de acetato de aluminio -Se preparó una solución de aluminio disolviendo 0.1028 g de hexahidrato de A1C13 en 42.6 mL de agua DI. Una alícuota de 4 mL de la solución de aluminio se mezcló con 16 mL de una solución de NaOAc 0.1 M a pH 4 para proporcionar una solución madre de Al 2 mM. Solución de amortiguador de acetato IMP 272 -El péptido, 0.0011 g, 7.28 x 10~7 moles de IMP 272, se disolvió en 364 L de la solución del amortiguador de acetato 0.1 M pH 4, para obtener una solución madre 2 mM del péptido. Marcado con F-18 de IMP 272 - una alícuota de 3 L de la solución madre de aluminio se colocó en un REACTI-VIAL™ , y se mezcló con 50 L de F-18 (como se recibió) y 3 ? de la solución de IMP 272. La solución se calentó en un bloque de calentamiento a 110 °C durante 15 minutos, y se analizó mediante HPLC en fase inversa. Las trazas del HPLC (no mostradas) , mostraron 93% de F-18 libre y 7% unido al péptido. 10 µL adicionales de la solución de IMP 272 se agregaron a la reacción y se calentó nuevamente y analizó mediante HPLC en fase inversa (no mostrado) . Las trazas de HPLC mostraron 8% de F-18 en el volumen hueco y 92% de la actividad unidad al péptido. El resto de la solución peptídica se incubó a temperatura ambiente con 150 µL de PBS durante ~1 hora, y a continuación se examinó mediante HPLC en fase inversa. La HPLC (no mostrada), mostró 58% de F-18 no unido y 42% todavía unido al péptido. Los datos indican que el complejo de F-18-A1-DTPA puede ser inestable cuando se mezcla con fosfato. HPLC en Fase inversa - El análisis de HPLC en fase inversa se realizó bajo las siguientes condiciones: Columna: WATERS® XTERRA™ MS C18 5 µp?, 4.6 x 250 mm Velocidad de Flujo: 1 mL/minuto Amortiguadores del Gradiente: Amortiguador C, 0.1% de NH,,OAc en agua DI, Amortiguador D, 90% de acetonitrilo, 10% de agua y 0.1% de NH^OAc Gradiente: 100% de Amortiguador C a 100% de Amortiguador D, utilizando un gradiente lineal durante 30 minutos . Tiempo de la Corrida: 30 minutos HPLC con Exclusión de Tamaños -La HPLC con exclusión de tamaños se realizó bajo las siguientes condiciones : Columna: BIORAD® BIO-SIL™ SEC 250, 300 x 7.8 mm Gradiente: Isocrátrico Amortiguador Eluyente : Fosfato 0.2 M, pH 6.8 Velocidad de Flujo: 1 mL/minuto Tiempo de la Corrida: 30 minutos Todas las trazas radiométricas se obtuvieron utilizando un PERKIN ELMER® 610Tr para verificar la emisión de F-18. Las Tablas 1-3 son representaciones tabulares de los datos . Tabla 1 F-18 + IMP 272 + A1C13 calentado a 110°C durante 15 minutos, seguido por análisis mediante HPLC en fase inversa . Regiones ; F-18 Detector: FSA Nombre Inicio Final Retención Altura Área % de % (minutos) ' (minutos) (minutos) (CPM) (CPM) ROI (%) Total (%) Fondo 1 2.20 2. 0 2.20 130. 0 Región 1 2.30 3.30 2.60 85270. 0 200050.0 93 .15 96.31 Fondo 2 4.40 4.50 4.40 210. 0 Región 2 8.70 9.80 9.00 5590. 0 14720.0 6 .85 7.09 2 Picos 214770.0 100.00 103.40 Tabla 2 F-18 + exceso de IMP 272 + A1C13 calentado a 110 °C durante 15 minutos, seguido por análisis mediante HPLC en fase inversa.

Regiones ¦¦ F-18 . Detector: FSA Nombre Inicio Final Retención Altura Área % de % (minutos) (minutos) (minutos) (CPM) (CPM) ROI Total (%) (%) Fondo 1 2.20 2.30 2.20 340.0 Región 1 2.40 3.20 2.70 6450.0 20549.6 7.76 8.23 Fondo 2 7.10 7.20 7.10 630.0 Región 2 7.30 .8.70 8.50 3140.0 13113.6 4.95 5.25 Región 3 8 . 70 10 .. 00 9 . 00 93700 . 0 231023 . 9 87 . 28 92 . 57 Fondo 3 10 . 70 io . . 80 10 . 70 520 . 0 3 Picos 264687 . 1 100 . 00 .106 , 06 Tabla 3 Exposición al Fosfato en PBS durante 90 minutos a temperatura ambiente. Alícuota de F-18 + exceso de IMP 272 + A1C13 calentado a 110 °C durante 15 minutos y analizado mediante HPLC en fase inversa. Regiones : F-18 Detector: FSA Nombre Inicio Final Retención Altura Área % de % Total (minutos) (minutos) (minutos) (CPM) (CPM) ROI (%) (%) Fondo 1 2 . 00 7...10 2 . 00 350 . 0 Región 1 2 . 40 3 . 30 2 . 70 8.1930 . . 0 1624 03 . 6 58 . 23 62 . 44 Fondo 2 4 . 20 4 . 30 4 . 20 4.10 . 0 Región 2 7 . 50 7 . 60 7 . 50 780 . 0 Fondo 3 7 . 80 8 . 60 8 . 40 2.110 . 0 5564 . 7 2 . 00 2 . .14 Región 3 8 . 60 j 9 . 80 8 . 90 44 590 . 0 110942 . 0 3 9 . 78 42 . 66 Fondo 4 10 . 50 10 . 60 10 . 50 4 60 . 0 3 Picos 278910 . 3 .100 . 00 10 . 24 El péptido marcado se purificó aplicando la solución del péptido marcado en una columna WATERS® HLB de 1 ce (30 mg) (Parte # 186001879) , y lavado con 300 ih de agua para eliminar el F-18 no unido. El péptido se eluyó lavando la columna con 2 x 100 L de MeOH/H20 1:1. El péptido purificado se incubó en agua a 25 °C y se analizó mediante HPLC en fase inversa (no mostrado) . El análisis con HPLC mostró que el IMP 272 marcado con F-18 no era estable en agua. Después de 40 minutos de incubación en agua, aproximadamente 17% del F-18 se liberó del péptido, mientras que 83% se retuvo (no mostrado) .

EJEMPLO 2. INMUNORREACTIVIDAD DEL IMP 272 F-18 El péptido (16 pL de IMP 272 2 mM, 48 pg) , se marcó con F-18 y se analizó para la unión al anticuerpo mediante HPLC con exclusión de tamaños. La HPLC con exclusión de tamaños mostró que el péptido se unió a hMN-14 x 679, pero no se unió al anticuerpo biespecífico irrelevante hMN-14 x 734 (no mostrado) .

EJEMPLO 3. MARCADO CON IMP 272 F-18 CON OTROS METALES Una alícuota de ~3 pL de la solución madre del metal (6 x 10"9 moles) , se colocó en un vial cónico de polipropileno y se mezcló con 75 pL de F-18 (como se recibió) , se incubó a temperatura ambiente durante ~2 minutos y a continuación se mezcló con 20 pL de una solución de IMP 272 2 mM (4 x 10"8 moles) en amortiguador de NaOAc 0.1 M, pH 4. La solución se calentó en un bloque de calentamiento a ' 100°C durante 15 minutos y se analizó mediante HPLC en fase inversa. El IMP 272 se marcó con indio (24%), galio (36%), zirconio (15%), lutecio (37%) e itrio (2%) (no mostrado) .

EJEMPLO 4. CONDICIONES ESTÁNDAR DE MARCADO DEL PÉPTIDO CON F-18 UTILIZADAS PARA SELECCIONAR OTROS PÉPTIDOS PARA LA UNIÓN A AL-18-F Una alícuota de 3 µ?. de la solución madre de aluminio 2 mM se colocó en un vial cónico de polipropileno y se mezcló con 50 pL de F-18 (como se recibió) , se incubó a temperatura ambiente durante ~2 minutos y a continuación se mezcló con 16 a 20 L de una solución del péptido 2 mM en amortiguador de NaOAC 0.1 M, pH 4. La solución se calentó en un bloque de calentamiento a 100 °C durante 15 minutos y se analizó mediante HPLC en fase inversa ( PHENOMENEX™" , GEMINI®, 5µ, C-18, 110A, Columna de HPLC 250 x 4.6 mm) .

PÉPTIDOS PROBADOS IMP 272 DTPA-Gln-Ala-Lys (HSG) -D-Tyr-Lys (HSG) -NH2 MH+ 1512 (Figura 1) IMP 288 DOTA-D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2 MH+ 1453 (Figura 2) IMP 326 DTPA-ITC-NH-NH-Phe-CO-D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2 MH+ 1477 (Figura 3) IMP 329 Deferoxamina-NH-CS-NH-NH-Ph-CO-D-Tyr-D-Lys (HSG) -D-Glu-D- ys (HSG) -NH2 MH 1804 (Figura 4) IMP .331 NTA- iAsp-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D- Lys(HSG)-NH2 MH'' 1240 (Figura 5) I P 332 EDTADpr-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D- Lys (HSG) -NH2 MH+ 1327 (Figura 6) IMP 333 DTPA-Dpr (DTPA) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH+ 1845 (Figura 7) IMP 334 (H203P) 2-C (OH) - (CH2) 3-NH-Gly-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-Lys (HSG) -NH2 MH¡ 1192 (Figura 8) IMP 337 Ac-D-Ser (P03H2) -D-Ser (P03H2) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH+ 1291 IMP 338 Ac-D-Ser (PO3H2) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D- Lys (HSG) -NH2 MH+ 1126 IMP 345 DTPA-D-Ser (PO3H2) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH+ 1459 IMP 349 DTPA-D-Cys ( (H203P) 2-CH-CH2-S) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH+ 1583 (Figura 9) IMP 361 DTPA-Dpr (BrCH2CO-) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH' 1498 IMP 366 DTPA-Dpr (Ph-S-CH2CO- ) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH'1 1528 IMP 368 Sym-DTPA-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D- Lys (HSG) -NH2 MH" 1292 (Figura 10) IMP 369 Sym-DTPA-NH-CH ( 2 -Br- Phe- ) -CH2-CO-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH" 1517 IMP 370 Sym-DTPA-NH-CH ( 2 -02N-Phe- ) -CH2 -CO-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH+ 1484 IMP 371 DTPA-NH-CH(2-02N-Phe-) -CH2-CO-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH'1' 1484 IMP 372 DTPA-Dpr (Ser) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys(HSG) -NH2 MH'1 1465 IMP 373 DTPA-Dpr ( Sym-DTPA) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D- Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH'1' 1753 IMP 374 DTPA-Dpr ( Cl -CH2CO-Cys (Et ) - ) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH+ 1585 IMP 375 DTPA-Dpr (2-Br-Phe-CHNH2-CH2-CO- ) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH+ 1603 (Figura 11) IMP 376 DTPA-Cys (HO3S-S) -D-Tyr-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 H'" 1558 IMP 379 DTPA-Dpr ( 2 -H2N- Phe-CO- ) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH'" 1497 IMP 382 DTPA-Dpr (H) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D- Lys (HSG) -NH2 MH+ 1378 IMP 383 DTPA-Dpr (Gla-) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG)-NH2 MH'*' 1507 IMP 384 DTPA-Dpr ( 2 -HO- Phe-CHNH2 -CH2- CO- ) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH' 1541 (Figura 12) IMP 385 DTPA-Dpr (Dpr) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2 MH1 1464 IMP 386 DTPA-Dpr ( 2 -piridilo- CH2 -CHNH2-CO- ) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 ??'" 1526 (Figura 13) IMP 387 DTPA-Dpr (D- 9-antrilalanina) -D-Ala-D- Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MW 1625 IMP 389 DTPA-Dpr (2-carboxipipericinilo) -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Ala-D-Lys (HSG) -NH2 MH'1 1490 (Figura 14) I P 460 NODA-GA-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2 H+ 1366. Los ejemplos adiciones de péptidos de uso posible se muestran en la Figura 15 y 16. La Figura 16 muestra las estructuras del IMP 422, I P 426 e IMP 428. Como se discute a continuación, el IMP 449 (Figura 15) muestra una estabilidad particular del péptido conjugado con F-18 bajo condiciones in vivo, para utilizarse en las técnicas de marcado y de formación de imágenes. La Figura 17 muestra una configuración alterna para un ligando del tipo NOTA. La porción NOTA podría hacerse de D o L para-nitrofenilalanina y la porción del ácido iminodiacético vendría del ácido diaminopropiónico, que podría ser D ;o L. Además, la posición del puente de etileno podría cambiarse con el ácido diaminopropiónico para proporcionar ¡una configuración diferente de los grupos en el ligando. Todas estas modificaciones podrían afectar la cinética de unión y la estabilidad del complejo, que se forma posteriormente. La Figura 18 ilustra la estructura de un péptido NODA-Ga que podría marcarse con, por ejemplo, Ga-68 o F-18. En ciertas modalidades, las porciones quelantes alternas pueden utilizarse para unirse a los complejos de 18F-metal o 18F-boro. La Figura 22A-D ilustra algunas porciones quelantes potenciales ejemplares basadas en la estructura de NETA. Como se discutió anteriormente, Chong et al. (2007), reportan que los ligandos de NETA pueden mostrar una estabilidad en suero mejorada cuando se complejan con varios metales. El diseño del quelante también puede optimizarse para incrementar la afinidad de unión del péptido para 38F-metal.

RESULTADOS DEL ESTUDIO DE SELECCIÓN DEL MARCADO DEL PÉPTIDO La mayoría de los derivados de DTPA mostraron un marcado comparable con el marcado del IMP 272. Hubo excepciones, IMP 349, que porta el grupo bisfosfonato en una cadena lateral de cisteína, se marcó de manera muy deficiente. El ligando de DOTA no se unió a Al-18F. El ligando de DTPA ITC del IMP 326 no se unió a Al-18F así como a DTPA. El ligando NTA de IMP 331 no se unió a A1-18F. El ligando de EDTA de IMP 332 se unió a A1-18F, pero no tan bien como al DTPA. El ligando simétrico de DTPA no se unió a A1-18F. Los grupos fosfonato y fosfato probados no se unieron bien a Á1-18F bajo las condiciones probadas. La selección mostró ' que un grupo que estaba unido cerca de DTPA, podría influenciar la estabilidad del complejo de A1-18F-DTPA. La selección mostró que el IMP 375 se marcó mejor y formó un complejo que era significativamente más estable que IMP 272. IMP 375 se marcó bien y fue estable en agua, mostrando 95.4% de unión restante después de 5 horas a 25 °C (no mostrado) . Para el uso in vivo, se preferiría un péptido con alta estabilidad en suero. El estudio de selección del marcado del péptido sólo observó la unión de Al-18F. Algunos de los péptidos que no se marcaron bien con Al-18F pueden marcarse mejor con otro metal que se una a F-18.

SÍNTESIS PEPTÍDICA Los péptidos se sintetizaron mediante síntesis peptídica en fase sólida utilizando la estrategia Fmoc . Los grupos se agregaron a las cadenas laterales de los diamino aminoácidos utilizando los grupos protectores Fmoc/Aloc para permitir la desprotección diferencial. Los grupos Aloe se retiraron mediante el método de Dangles et . al. (J. Org. Chem. 1987, 52:4984-4993), excepto que la piperidina se agregó a una relación de 1:1 al ácido acético utilizado. El DTPA tetra- t -butilo no asimétrico se hizo como se describió en McBride et al. (Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2005/0002945 Al, Solicitud No .; 10/776 , 470 , Fecha de Publicación, Enero 6 del 2005) . El DOTA tri - 1-butilo, el DTPA tetra- 1-butilo simétrico y el; DTPA ITC-bencilo se obtuvieron de ACROCYCLICS® . Aloc/Fmoc, Lisina y Dap (derivados del ácido diaminopropiónico (también Dpr) ) , se obtuvieron de CREOSALUS® o BACHEM®. La resina de Amida Sieber se obtuvo de NOVABIOCHEM® . Los aminoácidos Fmoc restantes se obtuvieron de CREOSALUS®, BACHEM®, PEPTECH® o NOVABIOCHEM®. IMP 272 se sintetizó como se describió (McBride et al., Publicación de la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20040241158 Al, Solicitud No. 10/768,707, Diciembre 2 del 2004). El IMP 288 se hizo como se describió (McBride et al., J. Nucí. Med. 2006, 47 : 1678-1688) . IMP 326 El péptido de hidracina (IMP 319) se hizo sobre resina de amida Sieber utilizando Fmoc-D-Lys (Aloe) -OH, Fmoc-D-Glu (OBut) -OH, Fmoc-D-Lys (Aloe) -OH, Fmoc-D-Tyr(But)-OH y 4 - (BoC-NH-NH- ) C6¾ - C02H en ese orden. El 4 - (Boc-NH-NH- ) C6H^ -C02H se hizo agregando dicarbonato de Boc a ácido 4 -hidrazinobenzoico en una solución de hidróxido de sodio y dioxano. , Después de la adición de Boc-hidrazida, los grupos Aloe de la cadena lateral se eliminaron y los grupos Tritilo-HSG-OH se agregaron en las cadenas laterales de las Usinas. El péptido se escindió a continuación de la resina con TFA y se purificó mediante HPLC para obtener el péptido de hidracina bis-HSG IMP 319 (MH+ 1201) deseado. El péptido de hidrazida (0.0914 g) se mezcló a continuación con 0.0650 g de DTPA ITC-Bencilo en 3 mL de fosfato de sodio 0.1 M, pH 8.2. El pH de la solución se ajustó con NaOH 1 M para mantener el pH a pH 8.2. Después de que la reacción entre el péptido y el DTPA ITC-Bencilo se completó, el conjugado peptídico se purificó mediante HPLC. IMP 329 El isotiocianato de deferoxamina se preparó mezclando 1.0422 g de mesilato de deferoxamina (1.59 x 10"3 moles) con 0.2835 g (1.59 x 10"3 moles) de tiocarbonildiimidazol en 10 mL de metanol/agua 1:1. Se agregó trietilamina, 0.23 mL y la reacción se purificó mediante HPLC en fase inversa después de 2.5 horas para obtener el isotiocianato de deferoxamina Na+ 625. El péptido de hidracina, IMP 319, (0.0533 g, 4.4 x 10"5 moles, MH+ 1201), se mezcló con 0.0291 g de isotiocianato de .deferoxamina en un amortiguador de fosfato de sodio a pH 8.1 durante dos horas, a continuación se purificó mediante HPLC para proporcionar el producto deseado MH+ 1804.' IMP 331 Los siguientes aminoácidos se unieron a la resina de amida Sieber (0.58 mmoles/g) en el orden mostrado; Fmoc-D-Lys (Aloe) -OH, Fmoc-D-Tyr (But) -OH y Fmoc-D-Lys (Aloe ) -OH . Los grupos Aloe se eliminaron y se agregó Trt-HSG-OH a las cadenas laterales de las Usinas. El Fmoc se eliminó, a continuación se agregaron Fmoc-D-Ala-OH y Fmoc-Asp-OBut en ese orden (0.5 g de resina). El Fmoc se eliminó y el nitrógeno de Asp se alquiló durante la noche con 3 mL de bromoacetato de t-butilo y 3.6 mL de diisopropiletilamina en 3.4 mL de NMP . El péptido se escindió de la resina con TFA y se purificó mediante HPLC en fase inversa para obtener el péptido deseado MH+ 1240. IMP 332 El péptido se hizo sobre 3 g de resina de amida Sieber (0.58 mmoles/g) . Los siguientes aminoácidos se agregaron a la resina en el orden mostrado: Fmoc-D-Lys (Aloe) -OH, Fmoc-D-Tyr (But ) -OH, Fmoc-D-Lys (Aloe) -OH, Fmoc-D-Ala-OH y Fmoc-Dpr (Fmoc) -OH . La resina se dividió en porciones para las síntesis posteriores. Un gramo de la resina se retiró y los grupos Fmoc se eliminaron del ácido diaminopropiónico . El péptido se alquiló durante la noche con 3 mL de bromoacetato de t-butilo, 3.6 mL de diisopropiletilamina y 3.4 mL de NMP. Los grupos Aloe de la cadena lateral se eliminaron a continuación y se agregaron los grupos Trt-HSG-OH. El péptido se escindió a continuación de la resina y se purificó mediante HPLC para obtener el producto MH" 1327. IMP 333 El péptido se hizo con 1 g de la misma resina que se utilizó para hacer el IMP 332. El éster tetra- t-butílico de DTPA (Publicación de los Estados Unidos No. 20050002945), se agregó a ambas de las aminas del grupo Dpr . Los grupos Aloe se eliminaron a continuación y se agregó Trt-HSG-OH. El péptido se escindió a continuación y se purificó mediante HPLC para obtener el producto deseado MH+ 1845. I P 334 El péptido se hizo en 1 g de resina de amida de Rink (0.7 mmoles/g) con los siguientes aminoácidos agregados en el orden mostrado: Fmoc-D-Lys (Aloe) -OH, Fmoc-D-Glu (But) -OH, FmOC-D-LyS (Aloe ) -OH , Boc-Ser (But) -OH, Los grupos Aloe se eliminaron y se agregó Tritil-HSG-OH . El péptido se escindió de la resina con TFA. El péptido crudo se recolectó mediante precipitación a partir de éter y se secó. Se disolvió peryodato de sodio, 0.33 g en 15 mL de agua. El péptido crudo se disolvió en 1 mL de fosfato de sodio 0.5 , pH 7.6 , 3 mL de agua y 1 mL de la solución de peryodato. Se agregaron 3 mL más de peryodato en incrementos de un mililitro durante ~2 horas. La mezcla se purificó a continuación mediante HPLC en fase inversa y se liofilizó para obtener el aldehido de IMP 289 HCO-CO-D-Lys (HSG) -D-Glu-D-:Lys (HSG) -NH2 MH* 959. Se disolvió alendronato (0.0295 g, CALBIOCHEM® ) en 150 L de NaOAc 0.1 M, pH 4. El péptido, IMP 289, (0.0500 g) se disolvió en 100 \iL de isopropanol al 13% en agua. Se agregó cianoborohidruro de sodio y la mezcla se purificó mediante HPLC para proporcionar el producto deseado MH'1' 1192. IMP 337, e IMP 338 El péptido se hizo sobre resina de amida Sieber utilizando los siguientes aminoácidos agregados en el orden mostrado Fmoc-D-Lys (Aloe) -OH, Fmoc-D- Ala-OH, Fmoc-D-Lys (Aloe) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-D-Ser (PO (OBzl) OH) -OH, Fmoc-D-Ser ( PO (OBzl ) OH) -OH y Ac20. Los grupos Aloe se eliminaron y se agregaron los grupos Trt-HSG-OH a las cadenas laterales de las Usinas. El péptido se escindió de la resina y se purificó mediante HPLC para proporcionar los productos deseados IMP 337 H+ 1291 e IMP 338 MH+ 1126. IMP 345 El péptido se hizo sobre resina de amida Sieber utilizando los siguientes aminoácidos agregados en el orden mostrado: Fmoc-D-Lys (Aloe) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-D-Lys (Aloe) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-D-Ser ( PO (OBzl ) OH) -OH y DTPA tetra- -butilo . Los grupos Aloe se eliminaron y se agregaron los grupos Trt-HSG-OH a las cadenas laterales de las lisinas. El péptido se escindió de la resina y se purificó mediante HPLC para proporcionar el producto deseado IMP 345 MH* 1459. IMP 349 El péptido IMP 347 DTPA-D- Cys -D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2 se hizo sobre resina de amida Sieber utilizando los siguientes aminoácidos agregados en el orden mostrado Aloc-D-Lys (Fmoc) -OH, Trt-HSG-OH, el Aloe se escindió, se agregaron Fmoc-D-Ala-OH, Aloc-D-Lys (Fmoc ) -OH, Trt-HSG-OH, el Aloe se escindió, se agregaron Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc -D- Cys (Trt) -OH y DTPA tetra- t-butilo . El péptido se escindió de la resina y se purificó mediante HPLC para proporcionar el producto deseado IMP 347 MH+ 1395. El péptido, IMP 347, 0.0446 g (3.2 x 10"5 moles), se mezcló con 0.4605 g (2.4 x 10~3 moles) de etenilidenbis (ácido fosfónico) (Degenhardt et al., J. Orgr. Chem. 1986, 51:3488-3490) en 3 mL de agua, y la solución se ajustó a pH 6.5 con NaOH 1 M agregado gota a gota. La reacción se agitó durante la noche y la solución de reacción se ajustó a pH 1.49 mediante la adición de etenilidenbis (ácido fosfónico) en exceso. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente y a continuación se purificó mediante HPLC para obtener el péptido deseado IMP 349 MH1 1583. IMP 361 El péptido se hizo sobre resina de amida Sieber utilizando los siguientes aminoácidos agregados en el orden mostrado: Aloc-D-Lys (Fmoc) -OH, Trt-HSG-OH, el Aloe se escindió, se agregaron Fmoc-D-Ala-OH, Aloc-D-Lys (Fmoc) -OH, Trt-HSG-OH, el Aloe se escindió, se agregaron Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-Dap (Aloe) -OH y DTPA tetra- t-butilo . El Aloe en la cadena lateral de Dap se eliminó y se agregó bromoacetilo con anhídrido bromoacético . El producto crudo se purificó mediante HPLC para obtener el péptido deseado IMP 361 (MH+ 1498) . IMP 366 El péptido se hizo mediante el mismo método que IMP 361 con ácido feniltioacético agregado al final. El producto crudo se purificó mediante HPLC para proporcionar el producto IMP 366 MH'1' 1528.

IMP 368 El péptido fue como se describió para IMP 349, excepto que el residuo de cisteína no se agregó, y se utilizó DTPA tetra-t-butilo simétrico (MACROCYCLICS®) en lugar del DTPA no simétrico para obtener el producto deseado después de la purificación, IMP 368 MH+ 1292. IMP 369 El péptido se hizo como se describió para IMP 349 con ácido Fmoc-R-3 -amino- 3 - ( 2 -bromofenil ) propiónico agregado en lugar de D-Cys y DTPA tetra-t-butilo simétrico agregado en lugar de la versión no simétrica del éster de DTPA tetra- t-butílico . El péptido crudo se purificó para obtener el producto deseado, MH* 1517. IMP 370 El péptido se hizo como se describió para IMP 369, excepto que se utilizó el ácido Fmoc-R-3-amino-3-(2-nitrofenil) propiónico en lugar de bromo. El producto deseado se obtuvo después de la purificación mediante HPLC MH+ 1484. IMP 371 El péptido se hizo como se describió para IMP 370, excepto que se utilizó DTPA tetra-t-butilo no simétrico en lugar de la versión simétrica. El producto deseado se obtuvo después de la purificación mediante HPLC, MH+ 1484. IMP 372 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con Fmoc-Ser (But) -OH, utilizado para unir la Ser a la cadena lateral de Da . El Fmoc se eliminó, y el péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, ??'" 1465. IMP 373 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con el éster de DTPA tetra- t-butílico simétrico utilizado para unir Sym-DTPA a la cadena lateral de Dap. El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH' 1753. IMP 374 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con Fmoc-S-etil cisteína agregada a la cadena lateral de Dap, seguido por cloroacetilo (en el nitrógeno de la cisteína), agregado vía anhídrido cloroacético . El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH'" 1585. IMP 375 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con ácido Fmoc-R- 3 -amino- 3 - ( 2 -bromofenil) propiónico agregado a la cadena lateral de Dap, seguido por la escisión del grupo Fmoc . El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH+ 1603. IMP 376 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con Fmoc-D-Tyr (But) -OH agregado después de la segunda alanina, seguido por Fmoc-Cys (S03H) y DTPA tetra-t-butilo. El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH" 1558. IMP 379 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con Boc-2-Abz-OH agregado a la cadena lateral de Dap. El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH+ 1497. IMP 382 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con Aloe eliminado de la cadena lateral de Dap. El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH' 1378. IMP 383 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con Fmoc-Gla (OBut) 2 -OH agregado a la cadena lateral de Dap. El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH+-C02 1507. IMP 384 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con ácido Fmoc-Boc-S-3-amino-3- (2-hidroxifenil) propiónico agregado a la cadena lateral de Dap. El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH+ 1541. IMP 385 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con Fmoc-Dpr (Fmoc) -OH agregado a la cadena lateral de Dap. El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH'1 1464. IMP 386 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con Boc-D- 2 -piridilalanina-OH agregado a la cadena lateral de Dap. El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH+ 1526. IMP 387 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con Fmoc-D- 9-antrilalanina-OH agregado a la cadena lateral de Dap. El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH+ 1625. IMP 389 El péptido se hizo como se describió para IMP 361 con bis-Boc-piperacina-2-carboxilato agregado a la cadena lateral de Dap. El péptido se escindió de la resina y se purificó para obtener el producto deseado, MH+ 1664.

EJEMPLO 5. MÉTODOS ALTERNOS PARA PREPARAR Y SEPARAR LOS PÉPTIDOS MARCADOS CON F-18 En ciertas modalidades, se utiliza calentamiento para obtener el complejo de Al-F-18 en el grupo quelante de NOTA. De manera alterna, el NOTA ITC bencilo ( acrocyclics ) podría marcarse con Al-F-18 y a continuación conjugarse a otras moléculas sensibles al calor, tales como proteínas, después del marcado. Si se necesita una alta actividad específica, el complejo de NOTA ITC Bencilo puede purificarse del ligando frío. El Al se agregó al péptido y su perfil de HPLC se comparó con el péptido NOTA vacío y el péptido Al-F-18. El péptido Al y los péptidos de Al-F-18 tienen virtualmente el mismo (RT, tiempo de retención, por sus siglas en inglés) mediante HPLC, con un RT ~1 minuto más largo para el péptido no marcado. El péptido se purificó en una columna PHENOMENEX™ ONYX® monolítica C-18 100 x 4.5 mm, utilizando una velocidad de flujo de 3 mL/minuto. El Amortiguador A fue TFA al 0.1% en agua y el Amortiguador B fue CH3CN al 90%, agua al 10% y TFA al 0.1%. el gradiente lineal fue de Amortiguador A al 100% a A/B 75:25 durante 15 minutos. Puesto que el complejo de Al se coeluye con el complejo de Al-F-18, la cantidad de Al y F-18 agregado determinará la actividad específica. I P 449 se preparó de acuerdo con el Ejemplo 7 siguiente, y se marcó como sigue. El F-18 se recibió en un vial para Microcentrí fuga fisher de 2.0 mL (02-681-374) , que contiene 15 mCi de F-18 en -325 en agua. 3 \xL de A1C13 2 mM en NaOAc 0.1 M, pH 4 se agregaron a la solución de F-18, y a continuación se mezclaron con vórtice. Después de aproximadamente 4 minutos, se agregaron 10 L de IMP 449 0.05 M en NaOAc 0.5 M pH . La mezcla se sometió a vórtice mezclando nuevamente, y se calentó en un bloque de calentamiento a 102 °C durante 17 minutos. La reacción se enfrió entonces .brevemente, y a continuación el contenido del vial se retiró y purificó mediante HPLC como se describió anteriormente. De manera separada, las condiciones de la elución se determinaron en el sistema analítico ATERS® ALLIANCE™ y el péptido marcado se eluyó entre 7.5 y 8.5 minutos. La HPLC analítica mostró que el péptido marcado contenía el IMP 449 Al-F (220 nm UV) y no contenía el péptido no complejado, resultando en una actividad específica incrementada . El péptido se diluyó en agua y a continuación se empujó a través de una columna de extracción WATERS® OASIS PLUS HLB™ . El péptido marcado se eluyó con 3 mL de EtOH/H20 1:1. El análisis con HPLC de los eluyentes confirmó que la columna atrapó de manera eficiente el péptido marcado, ' lo que permitió que el acetonitrilo y el TFA se lavaran del péptido. La HPLC también mostró que el eluyente de EtOH/H20 1:1 contenía el producto deseado libre de F-18 suelto en un solvente adecuado para la inyección después de la dilución. El rendimiento aparente después de la purificación fue de 11%.

EJEMPLO 6. ESTUDIOS IN VIVO Los ratones atímicos que portan tumores de xenoinjerto colónico humano GW-39 (100-500 mg) , se inyectaron con el anticuerpo biespecífico hMN-14 x m679 (1.5 x 10"10 moles). El anticuerpo se dejó eliminar durante 24 horas antes de que el péptido que porta HSG marcado con F-18 (8.8 Ci, 1.5 x 10"" moles) se inyecte. Se formaron imágenes de los animales a 3, 24 y 48 horas postinyección. Los tumores del. xenoinjerto formaron imágenes claramente mediante detección con exploración con PET del péptido marcado con F-18 unido a hMN-14 x m679 biespecífico, que se localiza en los' tumores uniendo hMN-14 al antígeno del tumor .

EJEMPLO 7. PRODUCCIÓN Y USO DE UN PÉPTIDO MARCADO CON F-18 ESTABLE EN SUERO IMP 449 NOTA-ITC bencilo-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Tyr- D-Lys (HSG) -NH2 MH+ 1459 (Figura 15) El péptido, IMP 448 D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2 MH+ 1009, se hizo sobre resina de Amida de Sieber agregando los siguientes aminoácidos en la resina en el orden mostrado: Aloc-D-Lys (Fmoc) -OH, Trt-HSG-OH, el Aloe se escindió, Fmoc-D-Tyr (But ) -OH, Aloc-D-Lys (Fmoc) -OH, Trt-HSG-OH, el Aloe se escindió, Fmoc-D-Ala-OH con escisión final de Fmoc para hacer el péptido deseado. A continuación, el péptido se escindió de la resina y se purificó mediante HPLC para producir el IMP 448, que se acopló a continuación a NOTA ITC-bencilo. El péptido, IMP 448, 0.0757 g (7.5 x 10"5 moles), se mezcló con 0.0509 g (9.09 x 10"5 moles) de NOTA ITC bencilo y se disolvió en 1 mL de agua. A continuación, se agregó lentamente carbonato de potasio anhidro (0.2171 g) a la solución agitada del péptido/NOTA. La solución de reacción estaba a pH 10.6 después de la adición de todo el carbonato. La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se enfrió cuidadosamente con HC1 1 M después de 14 horas y se purificó mediante HPLC para obtener 48 mg de IMP 449, el producto deseado (Figura 15) .

MARCADO CON F-18 DEL I P 449 El péptido IMP 449 (0.002 g, 1.37 x 10"6 moles), se disolvió en 686 µ?, (solución de péptido 2 mM) de NaOAc 0.1 M, pH 4.02. Tres microlitros de una solución 2 mM de Al en amortiguador de acetato pH 4 , se mezclaron con 15 µ?., 1.3 mCi de F-18. La solución se mezcló a continuación con 20 L de la solución de IMP 449 2 mM y se calentó a 105°C durante 15 minutos. El análisis con HPLC en Fase inversa mostró 35% (RT -10 minutos) de la actividad unida al péptido y 65% de la actividad eluida en el volumen hueco de la columna (3.1 minutos, no mostrado), indicando que la mayoría de la actividad no estaba asociada con el péptido. La mezcla marcada cruda (5 pL) , se mezcló con suero humano recolectado e incubado a 37 °C. Una alícuota se retiró después de 15 minutos y se analizó mediante HPLC. La HPLC mostró que 9.8% de la actividad todavía estaba unida al péptido (hasta 35%) . Otra alícuota se retiró después de 1 hora y se analizó mediante HPLC. La HPLC mostró que 7.6% de la actividad estaba todavía unida al péptido (hasta 35%) , que era esencialmente la misma que la traza de 15 minutos (datos no mostrados) .

MARCADO CON ALTA DOSIS DE F-18 Los estudios adicionales con IMP 449 purificado, demostraron que el péptido marcado con F-18 era altamente estable (91%, no mostrado) en suero humano a 37 °C durante al menos una hora, y que era parcialmente estable (76%, no mostrado) en suero humano a 37 °C durante al menos cuatro horas. Estos resultados demuestran que los péptidos marcados con F-18 descritos en la presente, exhiben suficiente estabilidad bajo condiciones aproximadas in vivo para utilizarse para los estudios de formación de imágenes con F-18. F-18 -21 mCi en -400 pL de agua, se mezcló con 9 pL de A1C13 2 mM en NaOAc 0.1 M pH 4. El péptido IMP 449, 60 ih (0.01 M, 6 x 10"7 moles en NaOH 0.5, pH 4.13), se agregó y la solución se calentó a 110 °C durante 15 minutos. El péptido crudo marcado se purificó a continuación colocando la solución de reacción en el cuerpo de una columna WATERS® HLB de 1 ce y eluyendo con agua para eliminar el F-18 no unido, seguido por EtOH/H20 1:1 para eluir el péptido marcado con F-18. La solución de reacción cruda se empujó a través de la columna a un vial de desecho, y la columna se lavó con tres fracciones de un mililitro de agua (18.97 mCi) . La columna HLB se colocó entonces en un nuevo vial y se eluyó con dos x 200 L de EtOH/H20 1:1 para recolectar el péptido marcado (1.83 mCi) .

La columna mantuvo 0.1 mCi de actividad después que todas las elusiones se completaron. Una alícuota del péptido marcado con F-18 purificado (20 pL) , se mezcló con 200 \xh de suero humano recolectado y se calentó a 37 °C. Las alícuotas se analizaron mediante HPLC en fase inversa (como se describió anteriormente) . Los resultados mostraron la estabilidad relativa del IMP 449 purificado marcado con F-18 a 37°C en el tiempo cero, una hora (91% del péptido marcado) , dos horas (77% del péptido marcado) y cuatro horas (76% del péptido marcado) de incubación en suero humano (no mostrado) . Se observó también que el IMP 449 marcado con F-18 era estable en solución de TFA, que se utilizó ocasionalmente durante la cromatografía de HPLC en fase inversa. Parece haber una correlación general entre la estabilidad en TFA y la estabilidad en suero humano, observada para las moléculas marcadas con F-18 ejemplares descritas en la presente. Estos resultados demuestran que el péptido marcado con F-18, producido de acuerdo con los métodos descritos en la presente, muestra suficiente estabilidad en suero humano para utilizarse de manera exitosa para estudios de marcado y formación de imágenes in vivo, por ejemplo, utilizando exploración con PET para detectar células o tejidos marcados.

EJEMPLO 8. BIODISTRIBUCION IN VIVO DE IMP 449 MARCADO CON F-18 EN RATONES SCID El IMP 449 marcado con F-18 se preparó como se describió anteriormente (Ejemplo 7) . El material se purificó en una columna OASIS® HLB (WATERS®, Milford, MA) . El material no unido se lavó con agua y el péptido marcado se unió a la columna, se eluyó con una mezcla de etanol : agua 1:1. Ambas 'fracciones se analizaron mediante HPLC C18 en fase inversa. El péptido purificado eluyó con varios picos en la columna de HPLC inversa (no mostrado) . La fracción no unida recolectada de la columna OASIS® mostró una recuperación' deficiente, 7%, de la columna C18 (no mostrada) . La fracción "no unida" y el 18F-IMP 449 purificado se inyectaron en ratones SCID que se inyectaron previamente con células de linfoma SU-DHL6 se. Únicamente unos cuantos ratones tuvieron' tumores visibles. Los datos de la biodistribución mostraron una diferencia significativa entre la fracción F-18 "no unida" y 18F-IMP 449 purificado. Los datos se muestran en las Tablas 4-6 siguientes. Nótese que en este estudio, no se administraron anticuerpos biespecíficos preselección a los animales antes del péptido marcado. Estos resultados demuestran la distribución del péptido marcado vs . F-18 libre in vivo. F-18 no conjugado muestra un nivel alto de distribución en el tejido óseo in vivo. La captación 20 minutos después de la inyección fue, como se esperaba, observada primero en el hueso (columna vertebral) , con aproximadamente 12-15% de la dosis inyectada por gramo (ID/g) , seguido por los ríñones con aproximadamente 4% de ID/g. La ubicación de la marca de F-18 en el tejido óseo disminuyó sustancialmente por la conjugación a un péptido de selección. Cuando se une a IMP 449, la captación en el hueso se redujo ~l% de ID/g a 20 minutos y 0.3% a 1 hora después de la inyección, con la captación renal de 11% a los 20 minutos y 3.3% de ID/g a 1 hora. La captación renal del péptido solo fue similar a aquélla del péptido 18F-IMP 449 preseleccionado (véase el siguiente Ejemplo) , sugiriendo que su captación fue una función del péptido más que una consecuencia de que a los animales se les dio el bs Ab 18 horas antes. Se observó una captación no específica relativamente baja en la columna vertebral y el fémur con el péptido marcado con F-18 en comparación con F-18 no unido.

Tabla 4. Fracción "no unida" de F-18 a los 20 minutos postinyección: % de ID/g media y los animales individuales Animal Animal Animal Tejido Media SD Tumor 0.902 Hígado 2.056 0.244 1.895 2.338 1.937 Bazo 1.869 0.434 1.677 2.366 1.564 Riñon 4.326 0.536 3.931 4.936 4.111 Pulmón 2.021 0.149 1.903 2.188 1.972 Sangre 2.421 0.248 2.355 2.696 2.212 Estómago 0.777 0.409 0.421 1.224 0.687 Intestino delgado 2.185 0.142 2.042 2.325 2.187 Intestino grueso 1.403 0.069 1.482 1.356 1.372 Fémur 11.688 1.519 11.502 13.292 10.270 Columna vertebral 14.343 2.757 1 .506 13.072 12.452 Músculo 1.375 0.160 1.191 1.457 1.478 Tabla 5. X8F-IMP 449 purificado, 80 µ??, 1 x 10~8 moles a los 20 minutos 1 postinyección: % de ID/g media y los animales individuales Animal Animal Animal Animal Animal Tejido n Media SD 1 2 3 4 5 Tumor 1 -- 0 , .891 - - - - -- -- Hígado 5 2. .050 0. 312 1. .672 1. .801 2 .211 2 , .129 2 , .440 Bazo 5 1. .2'97 0. 259 0. .948 1. , 348 1 , 144 1. .621 1. .425 Riñon 5 12. . 20 4. 128 8 , .354 7 , .518 12 .492 15 , .535 16 , .702 Pulmón 5 2 , .580 0. 518 2 .034 2. , 103 2 .804 2. .678 3. .278 Sangre 5 3 .230 0. 638 2 .608 2. , 524 3 .516 3. .512 3 , .992 Estómago 5 1 .017 0. 907 0 .805 0. .775 0 .344 0. .557 2. .605 Intestino 5 1.212 0.636 0.896 0.921 0.927 0.967 2.349 delgado Intestino 5 0.709 0.220 0.526 0.568 0.599 0.793 1.057 grueso Fémur 5 0.804 0.389 0.314 0.560 1.280 0.776 1.087 Columna 5 3.915 6.384 0.819 0.923 1.325 1.177 15.330* vertebral Músculo 5 0.668 0.226 0.457 0.439 0.960 0.673 0.814 *La alta captación en la columna vertebral en el animal #5 se confirmó mediante reconteo.

Tabla 6. 18 -IMP 449 purificado, 80 µ??, 1 x 10 moles hora postinyección : de ID/g media y los animales individuales Animal Animal Animal Animal Tejido Media SD 1 2 3 4 Tumor 0.032 0.064 0.000 0 127 0.000 0.000 Hígado 0.883 0.308 1.103 0.632 0.604 1.191 Bazo 1.061 0.702 1.598 0.631 0.301 1.713 Riñon 3.256 0.591 3.606 2.392 3.362 3.666 Pulmón 0.324 0.094 0.411 0.232 0.256 0.399 Sangre 0.285 0.104 0.378 0.153 0.250 0.358 Estómago 0.152 0.082 0.225 0.041 0.199 0.142 Intestino 1.290 0.228 1.124 1.247 1.166 1.624 delgado Intestino 4 0.115 0.035 0.167 0.091 0.094 0.109 grueso Fémur 006 0.876 2 266 0.448 0.939 0.374 Columna 314 0.076 0.423 0.257 0.268 0.306 vertebral Músculo 591 0.946 0.205 0.077 2.008 0.075 Concluimos que el péptido marcado con F-18 muestra suficiente estabilidad in vivo para realizar de manera exitosa estudios de marcado y de formación de imágenes .

EJEMPLO 9. ESTUDIOS IN VIVO CON EL ANTICUERPO DE PRESELECCIÓN DEL OBJETIVO El IMP ¦ 449 marcado con F-18 se preparó como sigue. El F-18, 54.7 mCi en -0.5 mL, se mezcló con 3 pL de Al 2 mM en amortiguador de NaOAc 0.1 M, pH 4. Después de 3 minutos, se agregaron 10 pL de IMP 449 0.05 M en amortiguador de NaOAc 0.5 M, pH 4 , y la reacción se calentó en un bloque de calentamiento a 96 °C durante 15 minutos. El contenido de la reacción se retiró con una jeringa. El péptido crudo marcado se purificó entonces mediante HPLC en una columna monolítica C18 Phenomenex Onyx, 100 x 4.6 mm, No. de parte CHO-;7643. La velocidad de flujo fue de 3 mL/minutos . El Amortiguador A fue TFA al 0.1% en agua y el Amortiguador B fue acetonitrilo al 90% en agua con TFA al 0.1%. El gradiente fue del 100% de A a A: B 75/25 durante 15 minutos . Hubo aproximadamente 1 minuto de diferencia en RT entre el péptido marcado, que eluyó primero y el péptido no marcado. El eluyente de la HPLC se recolectó en fracciones de 0.5 minutos. El péptido marcado salió entre 6 a 9 minutos, dependiendo de la HPLC utilizada. La muestra del péptido purificado con HPLC se procesó además diluyendo las fracciones de interés dos veces en agua, y colocando la solución en el cuerpo de una columna HLB Waters de 1 ce. El cartucho se eluyó con 3 x 1 mL de agua para eliminar el acetonitrilo y el TFA seguido por 400 pL de EtOH/H20 1:1 para eluir el péptido marcado con F-18. El 18F-IMP 449 purificado se eluyó como un solo pico en una columna C18 para HPLC analítica. Se utilizaron ratones atímicos tacónicos que portan cuatro xerioinj ertos CaPanl se que crecen lentamente. Tres de los ratones se inyectaron con TF10 (162 pg) , seguido con 18F-IMP 449 18 horas más tarde. TF10 es un anticuerpo biespecífico humanizado de uso para estudios de formación de imágenes de tumores, con unión divalente al antígeno del tumor MUC 1 definido con PAM-4 y unión monovalente a HSG (véase, por ejemplo, Gold et al, 2007, J. Clin. Oncol. 25 ( 18S ) : 4564 ) . Un ratón se inyectó con el péptido solo. Todos los ratones se sometieron a necropsia 1 hora posterior a la inyección del péptido. Los tejidos se contaron inmediatamente. El Animal #2 mostró altos conteos en el fémur. El fémur se transfirió a un nuevo vial y se recontó junto con el vial vacío viejo. El reconteo indicó que los conteos estaban en el tejido. Este fémur se rompió y tuvo una gran pieza de músculo unida al mismo. La comparación de las distribuciones medias mostró niveles sustancialmente más altos del péptido marcado con F-18 localizado en el tumor que en cualquier tejido normal en la presencia del anticuerpo biespecífico que selecciona el tumor. La captación del tejido fue similar en los animales a ' los que se les proporcionó el 18F-I P 449 solo o en un entorno de preselección del objetivo. La captación en el xenoinjerto del cáncer pancreático humano, CaPanl , a 1 hora, se incrementó 5 veces en los animales preseleccionados en comparación con el péptido solo (4.6 ± 0.9% de ID/g vs . 0.89% de ID/g) . Se alcanzaron relaciones tumor/no tumor excepcionales en este momento (por ejemplo, las relaciones de tumor/sangre e hígado fueron de 23.4 ± 2.0 y 23 5 ± 2.8, respectivamente) .

Tabla 7. Captación del tejido a 1 hora postinyección del péptido, media y los animales individuales TF10 (162 g) ? 18 h ? »F IMP 449 (10:1) 1SF IMP 449 solo Tejido n Media SD Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 1 Tumor 3 4 59.1 0 854 4 .330 5 .546 3.898 0.893 (masa) (0. 675 g) (0. 306 g) (0.353 g) (0. 21 g) Hígado 3 0 197 0 .041 0 .163 0 .242 0.186 0.253 Bazo 3 0 202 0 .022 0 .180 0 .224 0.200 0.226 Riñon 3 5 624 0 .531 5 .513 6 .202 5.158 5.744 Pulmón 3 0 421 0 .1 7 0 .352 0 .643 0.268 0.474 Sangre 3 0 196 0 . Q28 0 .204 0 .219 0.165 0.360 Estómago 3 0 123 0 .046 0 .080 0 .172 0.118 0.329 Intestino 3 0 248 0 042 0 218 0.295 0 230 0 392 delgado Intestino 3 0 141 0 094 0 065 0 .247 0 112 0 113 grueso Páncreas 3 0 185 0 078 0 259 0 .194 0 103 0 174 Columna 3 0 394 0 427 0 140 0 .888 0 155 0 239 vertebral Fémur 3 3 899 4 098 2 577 8. 494* 0 625 0 237 Cerebro 3 0 064 0 041 0 020 0 .072 0 100 0 075 Músculo 3 0 696 0 761 0 077 1 .545 0 465 0 162 *Los altos conteos en el fémur del Animal #2 se confirmaron recontando después de transferir el fémur a un nuevo vial. El Animal #2 mostró una captación más alta en los tejidos normales que los Animales #1 y #3.

EJEMPLO 10. COMPARACIÓN DE LA BIODISTRIBUCIÓN DE ^IN-IMP 449 VS . 16F- IMP 449 CON EL ANTICUERPO DE PRESELECCIÓN DEL OBJETIVO El objeto de ' este estudio fue comparar la biodistribución del 311In-IMP 449 y el 18F-IMP 449 en ratones atímicos que portan xenoinjertos LS 174 T se después de la preselección del 'objetivo con el anticuerpo biespecífico TF2. El anticuerpo TF2 se hizo mediante el método de acoplamiento y aseguramiento y contiene sitios de unión para el antígeno del tumor CEA y el hapteno de HSG (véanse, por ejemplo, Sharkey et al., Radiology 2008, 246:497-507; Rossi et al., PNAS USA 2006, 103:6841-46). Puesto que hay números insuficientes de ratones con tumores en un solo tiempo, el estudio se realizó en 2 semanas diferentes. ^"in-IMP 449: El marcado con lxlIn se realizó utilizando un procedimiento similar al utilizado para marcar a IMP 288, excepto a una actividad específica menor. La ITLC y la HPLC RP C-18 mostraron -30% de no unión (no mostrado) . El péptido marcado se purificó en una columna HLB (1 mL, 30 mg) . Los análisis del producto purificado mostraron nuevamente 33% de no unión (20% superior de una tira) mediante ITLC revelada en cloruro de sodio saturado. La HPLC RP mostró múltiples picos antes y después de la purificación (no mostrado) . La HPLC SE después de la purificación mostró 47% de desplazamiento de la actividad a HMW cuando se mezcló con un exceso molar de 20x de TF2 (no mostrado) . 18F-IMP 449: El marcado se realizó como se describió anteriormente, excepto que el F-18 se purificó en un cartucho QMA antes de marcar como se describió por otros (Kim et. al. Applied Radiation and Isotopes 61, 2004, 1241-46) . Brevemente, el Cartucho Sep-Pak® Light Waters Accell™ Plus QMA se preparó enjuagándolo abundantemente con 10 mL de KHC03 0.4 M, y a continuación se lavó con 10 mL de agua DI. El 18F (42 mCi) en 2 mL de agua se cargó en un cartucho QMA. El cartucho se eluyó con 10 mL de agua DI para eliminar las impurezas. La columna se eluyó a continuación con 1 mL de KHCO3 0.4 M en fracciones de 200 L. La fracción número dos contenía el grueso de la actividad, 33 mCi . El pH de la solución de F-18 se ajustó entonces con 10 L de ácido acético glacial. El 18F de la fracción #2 se mezcló entonces con 3 L de Al 2 mM en amortiguador de NaOAC 0.1 M, pH . La muestra se mezcló a continuación con 10 pL de IMP 449 0.05 M en amortiguador de NaOAC 0.5 M a pH 4 , y la solución de la reacción se calentó a 94 °C durante 15 minutos. El 18F-IMP 449 se purificó mediante HPLC RP . La fracción que contiene el producto se pasó a través de una columna HLB para intercambiar el amortiguador. La columna se lavó con agua después de cargar la muestra. El producto se eluyó con agua:etanol 1:1 en un volumen de 400 L . La HPLC RP del producto mostró un pico principal con un reborde (no mostrado) . Puesto que el rendimiento fue bajo, la actividad especifica fue baja y se inyectó más péptido al ratón, resultando en una relación de bsMAb : péptido de 6.9:1 en lugar de 10:1.

RESULTADOS El marcado de IMP 449 con In-111 resultó en múltiples productos. Posiblemente algunos pueden ser complejos binucleares. El 1:uIn-IMP 449 mostró una alta captación en el riñon y alta concentración en la sangre. Sin embargo, incluso como múltiples especies, el i:L1In-IMP 449 mostró localización en el tumor cuando se preselecciona con TF2 (Figura 19) .

La Figura 19 muestra la biodistribución comparativa del In-111 y el IMP 449 marcado con F-18 en ratones. Ambos péptidos marcados mostraron de manera similar, altos niveles de localización en los tejidos del tumor en la presencia del anticuerpo TF2 biespecífico . Las especies marcadas con In-111 mostraron una concentración más alta en el riñon que las especies marcadas con F-18 en la presencia o ausencia del anticuerpo TF2. Los datos se resumen en las Tablas 8-11 siguientes. tabla 8. Los ratones se inyectaron con TF2 (163.2 ug, 1.035 x 10"9 moles) i.v, seguido de lllIn-IMP 449 (1.035 x 10"10 moles) 16 horas más tarde. la captación en el tejido del péptido (% de ID/g) a 1 hora posterior a la inyección del péptido se muestra a continuación.

Animal Animal Animal Animal Animal Tejido n Media SD 1 2 3 4 5 Tumor 5 9. .18 1 .02 9. 22 8. 47 8. .04 9. .45 10.70 Hígado 5 1. .15 ¦ 0 .09 1. .03 .1. 25 1. .20 1. .21 1.08 Bazo 5 0 , 48 0 .06 0. 43 0. 49 0. .58 0. .50 0.42 Riñón 5 6. .63 1 .38 8. 8 6. 21 7. .03 5. .85 5.23 Pulmón 5 1. 03 0 .14 0. 92 1. 14 1. .18 1 , .04 0.86 Sangre 5 0. .99 . 0 .15 1. 04 1. 1 1. .12 0. 83 0.83 Estómago 5 0. 16 0 .05 0 , 25 0. .17 0. , 16 0. .13 0..12 Intestino 5 2. 33 0 .65 2. 21 2. 5.1 2. .01 3. .33 1.59 delgado Intestino 5 0. .20 0 .04 0. 21 0. 25 0. .18 0. .21 0.14 grueso Fémur 5 1. 45 0 .87 0. .59 1. 30 0. .71 2. , 02 2.62 Columna 5 1.18 1.23 0.89 3.35 0.76 0.47 0.43 vertebral Cerebro 5 0. 1 0.16 0.05 0.06 0.13 0.04 0.43 Músculo 5 0.83 0.66 0.25 .1.30 0.23 0.65 1.73 Peso 5 25.4.9 1.4.1 27.89 24.14 25.27 25.10 25.06 corporal Tabla 9. Un grupo de 2 ratones se inyectó con lj In-IMP 449 (1.035 x 1CT10 moles) sin el anticuerpo de preseleccion. La captación en el tejido del péptido ( de ID/g) a 1 hora posterior a la inyección del péptido se muestra a continuación . Animal Animal Tejido n Media SD 1 2 Tumor 2 0. 922 0 .195 0. 784 1. 060 Hígado 2 1. 033 0 .048 0. 999 1. 067 Bazo 2 0. 409 0 .067 0. 362 0. 456 Riñon 2 6. 046 0 .449 5. 729 6. 364 Pulmón : 2 0. 695 0 .032 0. 672 0. 717 Sangre 2 0. 805 0 .182 0. 934 0. 676 Estómago 2 0. 290 0 .055 0. 251 0. 329 Intestino delgado 2 2. 234 0 .594 1. 814 2. 654 Intestino grueso 2 0. 237 0 .022 0. 253 0. 222 Fémur 2 1. 210 1 .072 1. 968 0. 453 Columna vertebral 2 1. 463 1 .213 2. 320 0. 605 Cerebro 2 0. 133 0 .091 0. 068 0. 197 Músculo 2 1. 005 1 .148 1. 817 0. 193 Peso corporal 2 26 : .65 3.19 28 ; .90 24 .39 Tabla 10. Los ratones se inyectaron con TF2 (163.2 ug, 1.035 x 10"9 moles) i.v, seguido por 18F-IMP 449 (1.5 x 10"10 moles) 16 horas más tarde. La captación en el tejido del péptido (% de ID/g) a 1 hora posterior a la inyección del péptido se muestra a continuación. Animal Animal Animal Animal Animal Tejido n Media SD 1 2 3 4 5 Tumor 5 7. 624 3 .080 5. 298 7. 848 12. 719 5. 118 7. 136 Hígado 5 0. 172 0 .033 0. 208 0. 143 0. 196 0. 131 0. 180 Bazo 5 0. 142 0 .059 0. 239 0. 081 0. 132 0. 118 0. 140 Riñon 5 2. 191 0 .125 2. 313 2. 141 2. 154 2. 319 2. 027 Pulmón 5 0. 315 0 .094 0. 474 0. 230 0. 300 0. 305 0. 265 Sangre 5 0. 269 0 .143 0. 431 0. 395 0. 132 0. 126 0. 260 Estómago 5 0. 218 0 .3 1 0. 827 0. 041 0. 098 0. 054 0. 070 Intestino 5 0. 351 0 .313 0. 903 0. 185 0. 297 0. 170 0. 198 delgado Intestino 5 0. 069 0 .028 0. 076 0. 043 0. 111 0. 073 0. 042 grueso Fémur 5 0. 625 0 .358 0. 869 0. 146 0. 811 0. 957 0. 344 Columna 5 0. 585 0 .569 0. 159 0. 119 0. 493 1. 526 0. 626 vertebral Cerebro 5 0. 029 0 .005 0. 033 0. 021 0. 035 0. 026 0. 028 Músculo 5 0. 736 0 .970 0. 190 0. 064 0. 494 2. 438 0. 496 Peso 5 24 .'69 1.20 23 .05 26 .36 24 .45 24 .48 25.1.1 corporal Tabla 11. Los ratones se inyectaron con F-IMP 449 (1.5 x 10"10 moles) sin anticuerpo de preselección. La captación en el tejido del péptido (% de ID/g) a 1 hora posterior a la inyección del péptido se muestra a continuación. Animal Animal Animal Animal Animal Tejido n Media SD 1 2 3 4 5 Tumor 5 0. 472 0 .201 0. 256 0. 344 0. 533 0. 447 0.779 Hígado 5 0. 177 0 .035 0. 1 1 0. 200 0. 141 0. 185 0.217 Bazo 5 0. 118 0 .027 0. 098 0. 094 0. 101 0. 144 0.151 Rifión 5 2. 727 0 .367 2. 430 2. 452 2. 500 3. 080 3.173 Pulmón 5 0. 246 0 .082 0. 206 0. 209 0. 156 0. 301 0.358 Sangre 5 0. 167 0 .072 0. 110 0. 135 0. 104 0. 217 0.267 Estómago 5 0. 114 0 .083 0. 149 0. 241 0. 037 0. 067 0.074 Intestino 5 0. 277 0 .081 0. 407 0. 286 0. 206 0. 213 0.271 delgado Intestino 5 0. 072 0 .029 0. 061 0. 052 0. 047 0. 083 0.118 grueso Fémur 5 0. 100 0 .032 0. 080 0. 144 0. 110 0. 109 0.059 Columna 5 0. 305 0 .268 0. 104 0. 647 0. 099 0. 132 0.545 vertebral Cerebro 5 0. 034 0 .025 0. 018 0. 018 0. 022 0. 034 0.077 Músculo 5 0. 088 0 .022 0. 087 0. 069 0. 069 0. 122 0.092 Peso 5 25i.34 1.72 25 .05 26 .88 26 ; . 0 25 .88 22.51 corporal En resumen, un método simple, reproducible y composiciones, se describen en la presente para producir péptidos de selección marcados con F-18, que son adecuados para utilizarse en la formación de imágenes in vivo de una variedad de estados de enfermedad. El experto con experiencia se dará cuenta de que los anticuerpos biespecíficos descritos anteriormente no son limitantes, sino que pueden comprender cualesquier anticuerpos conocidos contra una amplia variedad de enfermedades o antígenos objetivo patógenos. El método no está limitado a la preselección con los anticuerpos biespecíficos . En otras modalidades, pueden marcarse moléculas o complejos que se unen directamente a las células, tejidos u organismos objetivo de los cuales se van a formar imágenes, con F-18, utilizando los métodos descritos en la presente y administrarse a un sujeto para la formación de imágenes con PET (véase los Ejemplos siguientes) . Los péptidos marcados con Al-F-18, ejemplificados por IMP 449, son suficientemente estables bajo condiciones in vivo para utilizarse en los protocolos conocidos de formación de imágenes, tales como exploración con PET. El presente rendimiento del péptido radiomarcado preparado como se describió anteriormente, varía entre 5 y 20%, e incluso con un breve paso de purificación con HPLC para separar el péptido marcado del no marcado, el rendimiento final es de aproximadamente 5%. Además, los métodos reclamados resultan en la preparación de péptidos de selección del objetivo marcados con F-18 que están listos para la inyección' en el transcurso de 1 hora del tiempo de preparación, bastante dentro del tiempo de decaimiento de F-18 para permitir que se realicen los procedimientos de formación de imágenes. Finalmente, los métodos descritos y reclamados resultan en una exposición mínima del operador a la exposición al radioisótopo, en comparación con los métodos conocidos para preparar los compuestos marcados con F-18 para los estudios de formación de imágenes.

Ejemplo 11. Equipo para el Marcado con F-18. Un equipo de marcado con F-18 se hizo mezclando 8.0 mg de IMP 449 con 0.1549 g de ácido ascórbico. Los dos reactivos se disolvieron en 10.5 mL de agua y la solución se distribuyó en alícuotas de 1.0 mL en 10 viales. El pH no se ajustó. Las soluciones se congelaron, liofilizaron y sellaron bajo vacío.

Ejemplo 12. Formación de Imágenes de Tumores In Vivo Utilizando Péptidos Marcados y Preseleccion del Objetivo con Anticuerpos Biespecífieos Los presentes Ejemplos muestran que las técnicas de formación de imágenes in vivo utilizando la preseleccion del objetivo con los anticuerpos biespecífieos y los péptidos de selección del objetivo marcados, pueden utilizarse para detectar de manera exitosa tumores de tamaño relativamente pequeño. Los anticuerpos de preseleccion utilizados fueron TF2 , descrito anteriormente, o el anticuerpo TF10.

AMORTIGUADOR DE LA FORMULACIÓN El amortiguador de la formulación se hizo mezclando 0.3023 g de ácido ascórbico, 18.4 mL de agua DI y 1.6 mL de NaOH 1 M para ajustar el pH a pH 6.61. El amortiguador se distribuyó en alícuotas de 1 mL en 20 viales y se liofilizó. El F-18 se purificó en un cartucho WATERS® ACCELL™ Plus QMA Light de acuerdo con el procedimiento de la literatura, en donde el cartucho se lavó con 10 mL de KHC03 0.4 M, seguido por un lavado con 10 mL de agua DI. El F-18 en 2 mL de agua se empujó a través del cartucho y a continuación se lavó con 10 mL de agua. El F-18 se eluyó entonces del cartucho en alícuotas de 5 x 200 \xh con KHC03 0.4 M. La mayoría de la actividad se eluyó en la segunda fracción. La actividad en la segunda fracción se mezcló con 3 pL de Al 2 mM en un amortiguador de acetato pH 4. La solución de Al-F-18 se inyectó entonces en el vial marcado con ácido ascórbico e IMP 449 y se calentó a 105°C durante 15 minutos. La solución de reacción se enfrió y mezcló con 0.8 mL de agua DI. El contenido de la reacción se colocó en una Columna WATERS® OASIS® Ice HLB y se eluyó en un vial de desecho. La columna se lavó con 3 x 1 mL de agua DI. La columna se transfirió a un vial de formulación que contiene ácido ascórbico. La columna se eluyó con 2 x 200 L de EtOH/H20 1:1 para eluir el péptido marcado.

PRODUCCIÓN DEL ANTICUERPO BIESPECIFICO TFlO UTILIZANDO LA TECNOLOGÍA DNL El componente del anticuerpo para seleccionar el cáncer en TF10 se deriva de hPAM4 , un MAb anti-MUC 1 humanizado que se ha estudiado como un MAb radiomarcado con detalle (por ejemplo, Gold et al., Clin. Cáncer Res. 13: 7380-7387, 2007) . El componente que se une al hapteno se deriva de h679, un MAb de anti-histaminil-succinil-glicina (HSG) humanizado discutido anteriormente. El anticuerpo biespecífico TF10 ([hPAM4]2 x h679) se produce utilizando el método descrito para la producción del bsAb (anti-CEA)2 x anti-HSG TF2 (Rossi et al., 2006). El constructo de TF10 porta dos Fab PAM4 humanizados y un Fab 679 humanizado. Para TF10, un Fab del anticuerpo hPAM4 humanizado se enlazó utilizando un separador peptidico a una secuencia a. La secuencia es única debido a que se asocia de manera espontánea con otra secuencia a para formar un dímero. En TF10, la estructura contiene 2 Fab hPAM4 anti-MUC 1 enlazados juntos mediante las 2 secuencias (llamado hPAM4-DDD) . El ' otro componente de TF10 se produce enlazando una secuencia ß a Fab' del anticuerpo anti-HSG humanizado. A diferencia de la secuencia a, la secuencia ß no se autoasocia, sino que en su lugar se une a la estructura dimérica formada por las 2 secuencias a (h679-AD) . Así, cuando estas 2 proteínas producidas de manera separada se mezclan juntas, inmediatamente formar una estructura con cada Fab' orientado de manera que permite la unión no impedida a su antígeno. La estabilidad de esta interacción de unión se ha mejorado además colocando de manera estratégica una cisteína en cada una de las secuencias a y ß (2 en la secuencia ß y 1 en la secuencia a) . Debido a que "b" se une a "a2" en una orientación altamente específica, una vez que a2b se monta, pueden formarse puentes de disulfuro entre las porciones a y ß, uniendo así de manera covalente estas 2 proteínas. Ambas secuencias a y ß se encuentran en las proteínas humanas, y por lo tanto, no se espera que se agreguen a la inmunogenicidad del complejo. La proteína de fusión anti-MUCl hPAM4-a se generó mediante la fusión de la secuencia a al extremo C terminal de la cadena Fd. La proteína de fusión anti-HSG 1?679-ß se formó enlazando la secuencia ß al extremo C terminal de la cadena Fd. El bsMAb multivalente unido de manera estable TF10 se formó apareando hPAM4-a con ?679-ß. Las dos . proteínas de fusión (hPAM4-DDD y h679-AD2) se expresan de manera independiente en las células de mieloma transíectadas de manera estable. Los fluidos del sobrenadante del cultivo de tejido se combinaron, resultando en un exceso molar de dos veces de hPAM4-a. La mezcla de reacción: se incubó a temperatura ambiente durante 24 horas bajo condiciones reductivas suaves utilizando glutationa 1 mM reducida. Después de la reducción, la reacción DNL se completó mediante oxidación suave utilizando glutationa 2 mM oxidada. TF10 se aisló mediante cromatografía por afinidad utilizando resina IMP 291-affigel, que se une con alta especificidad a Fab h679. Un panel de la histología completa del tejido y la unión a las células sanguíneas se ha examinado ya para la IgG hPAM4 y para un bsMAb anti-CEA x anti-HSG que está entrando a ensayos clínicos. La unión a hPAM4 se restringió a una unión muy débil a la vejiga urinaria y al estómago en 1/3 de los especímenes (no se observa unión in vivo) , y la falta de unión a los tejidos normales se atribuyó al bsMAb anti-CEA x anti-HSG. Además, los estudios in vitro contra las líneas celulares que portan los receptores de la histamina Hl y H2 no mostraron actividad antagonista o agonista con el péptido IMP-288 di-HSG, y los estudios animales en 2 diferentes especies no mostraron actividad f rmacológica del péptido, relacionada con el componente de la histamina a dosis 20,000 veces más altas que las utilizadas para la formación de imágenes. Así, el derivado de HSG-histamina no tiene actividad farmacológica .

BIODISTRIBUCIÓN. ESTUDIOS DE SELECCIÓN Y DOSIFICACIÓN DEL ANTICUERPO BIESPECÍFICO TFlO Se determinó la biodistribución y selección del tumor de TF10 con dosis que se incrementan de TF10. Estos estudios proporcionan datos Pk básicos para TF10 en un intervalo de dosis. El intervalo primario de la dosis simula las dosis 'equivalentes (HED) entre 1.0 a 50 mg dados a un paciente de 70 kg . Basándose en los lineamientos de la FDA para convertir una dosis dada a un animal a una HED [es decir, (mg/kg en un ratón /12.3) = mg/kg HED] , una dosis de TF10 de 1 mg (6.37 nmoles) dada a un humano de 70 kg sería equivalente a una dosis de 3.5 g (0.022 nmoles) en un ratón de 20 g. Brevemente, se les dio a los animales inyecciones i.v. de 3.5, 17.5, 35 y 70 TF10 (trazas de 125I-TF10 agregadas) . Los animales a los que se les dio dosis de 17.5, 35 y 70 pg ' (HED = 1, 5, 10 y 20 mg) se sometieron a necropsia a l, 6,. 16, 48 y 72 horas (n = 5 por observación, total N = 75 animales/línea celular) . Los estudios con el lote actual de TF10 han indicado una eliminación muy rápida en ratones, similar a aquélla del constructo anti-CEA TF2 descrito anteriormente. Los estudios de Pk también se realizaron con 131i-TF10 en conejos. 1 Los estudios previos con el bsMAb anti-CEA TF2 han indicado que los conejos pueden predecir mejor el comportamiento Pk que se observa en los pacientes, puesto que eliminan la IgG anti-CEA humanizada de una manera idéntica a la encontrada en los pacientes, mientras que los ratones eliminan la IgG humanizada a una velocidad más rápida. Estos estudios involucrarían 4 conejos, 2 a los que se les da una HED de 5 mg y 2 a los que se les da una HED de 20 mg de TF10 adicionada con 131I-TF10 (~700 pCi) . Los conejos se sangraron a los 5 minutos, 1, 3, 6, 24, 48, 72, 96, 120 y 168 horas. Las imágenes del cuerpo completo también se tomaron utilizando una cámara gamma ADAC Solus equipada con un colimador de alta energía. Se coloca 131I-estándar (~20 Ci en una jeringa de 10 mL) en el campo de visión con cada conejo durante cada sesión de formación de imágenes tomada a 3, 24, 48, 120 y 168 horas. El estándar se utiliza entonces para proporcionar datos semicuantitativos sobre la distribución de 131I-TF10.

ESTUDIOS DE FORMACIÓN' DE IMÁGENES UTILIZANDO LA PRESELECCIÓN DEL OBJETIVO CON LOS ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS TF2 Y TF10 Y LOS PÉPTIDOS MARCADOS Los siguientes estudios demuestran la factibilidad de la formación de imágenes in vivo utilizando la técnica de preselección del objetivo con los anticuerpos biespecífieos y los péptidos marcados. Aunque la imágenes no se obtuvieron utilizando un péptido marcado con 18F-metal como se describió anteriormente, la técnica de preselección del objetivo con los anticuerpos biespecífieos puede adaptarse generalmente para utilizarse con cualquier tipo de marca. Así, los estudios son representativos de los resultados que se obtendrían utilizando los péptidos marcados con F-18 reclamados. La Figura 20 y la Figura 21 muestran ejemplos de cómo los tumores delineados claramente pueden detectarse en los modelos animales utilizando un método de preselección del objetivo con bsMAb, con un péptido di-HSG marcado con 1:L1-In, IMP-288. En la Figura 20, se formaron imágenes de ratones atímicos que portan 0.2 a 0.3 g de xenoinjertos de cáncer pancreático, utilizando la preselección con TF10 y el péptido 113 n- IMP-288. Los seis animales en la parte superior de la Figura recibieron 2 diferentes dosis de TF10 (relación molar de 10:1 y 20:1 a las moles de péptido dado) , y al siguiente día, se les dio un péptido diHSG marcado con 111-Jn (IMP 288) . Los otros 3 animales recibieron únicamente 111-In-IMP-288 (sin preselección) . Las imágenes se tomaron 3 horas después de la inyección del péptido marcado y muestran una clara ubicación de tumores de 0.2-0.3 g en los animales preseleccionados , sin localización en los animales a los que se les dio el 111-ln-péptido solo. En este estudio, la captación del tumor promedió 20-25% de ID/g con relaciones tumor/sangre que exceden de 2000:1, relaciones de tumor/hígado de 170:1 y relaciones de tumor/riñón de 18/1. Puesto que la captación del tumor mostrada en los Ejemplos anteriores para el IMP 449 marcado con A1-18F promedió sólo aproximadamente 4-5% de ID/g en el mismo modelo de xenoinjerto CaPanl, se cree que la captación menor con el péptido marcado con 18F simplemente refleja la actividad específica menor del IMP 449 marcado con A1-18F. Sin embargo, los datos de A1-18F-IMP 449 muestran un potencial extraordinario para el péptido preseleccionado fluorado que cuando se combina con la especificidad del bsMAb TF10, sería una herramienta excelente para la formación de imágenes de cáncer pancreático o de otros cánceres. Los datos de la biodistribución para los péptidos marcados con 18F exceden con mucho la capacidad de selección de los anticuerpos radiomarcados directamente y de los constructos del anticuerpo diseñado pequeño marcado directamente con 18F (Cai et al., J". Nucí. Med. 48: 304-310, 2007) . Los datos mostrados en la Figura 21 resaltan además la sensibilidad del método de preselección del objetivo para detectar el cáncer. Aquí, se obtuvo un panel de imágenes con microPET de los ratones atímicos inyectados intravenosamente con la línea celular del cáncer de colon humano y que portan tumores micrometastásicos de 0.2-0.3 mm en los pulmones. A los animales se les administró el bsMAb anti-CEA TF2 , seguido por un péptido marcado con 1Z4I preseleccionado como objetivo. Las imágenes muestran una captación intensa en las secciones transversal y coronal a las 1.5 horas, que persistió incluso a las 21 horas. La sección coronal es una vista más posterior para ilustrar que el 124l-péptido también se observa en el estómago y los ríñones 1.5 horas después de su inyección. Las imágenes muestran lo que parecen ser lesiones individuales en los pulmones (flechas) que cuando se realizó la necropsia, no eran mayores qué 0.3 mm de diámetro (panel superior, secciones transversales a través del pecho) (Sharkey et al., Radiology, 246(2): 497-507, 2008). Un animal de control se preseleccionó con un bsMAb anti-CD22 TF6 y se le dio el mismo péptido marcado con 1241 (lado izquierdo, panel medio) se muestra para ilustrar la especificidad de la localización mediante, en este caso, un bsMAb anti-CEA. La sección coronal de los animales preseleccionados con anti-CEA muestra la captación en el pecho, así como en los ríñones y alguna actividad en el estómago. De manera significativa, l s lesiones del mismo tamaño en los pulmones no se observaron en los animales a los que se les dio 18F-FDG. Así, el uso de anticuerpos de preseleccion del objetivo proporciona una mayor especificidad y sensibilidad de detección en comparación con la sonda estándar de fluorodesoxiglucosa marcada con F-18, utilizada actualmente para la formación de imágenes con PET del cáncer. Estos datos demuestran además la factibilidad de la formación de imágenes utilizando la preselección del objetivo con los anticuerpos biespecífieos y los péptidos marcados con 18F.

EJEMPLO 13. SÍNTESIS DEL CONJUGADO NOTA DEL ÁCIDO FÓLICO El ácido fólico se activó como se describió (Wang et. al. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 56-62) y se conjugó a BoC-NH-CH2-CH2-NH2. El conjugado se purifica mediante cromatografía. El grupo Boc es eliminado a continuación mediante el tratamiento con TFA. El derivado de aminofolato se mezcla entonces con p-SCN-Bn-NOTA (Macrocyclics) en amortiguador de carbonato. El producto se purificó a continuación mediante HPLC. El derivado de folato-NOTA se marca con A1-18F como se describió en el Ejemplo 10 y a continuación se purifica con HPLC. El folato marcado con 18F se inyecta i.v. en un sujeto y se utilizó de manera exitosa para formar imágenes de la distribución de los receptores de folato, por ejemplo, en cáncer o en enfermedades inflamatorias (véase, por ejemplo, Ke et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 56:1143-60, 2004) .

EJEMPLO 14. FORMACIÓN DE IMÁGENES CON PET CON PRESELECCIÓN DEL OBJETIVO EN HUMANOS Un paciente (1.7 m2 de área de superficie corporal) con la sospecha de un tumor recurrente se inyectó con 17 mg de un anticuerpo monoclonal biespecífico (bsMab) . Se dejó que el bsMab se localizara en el objetivo y se eliminara de la sangre. El péptido marcado con F-18 (5-10 mCi en 5.7 x 10"9 moles), se inyectó cuando 99% del bsMab se había eliminado de la sangre. La formación de imágenes con PET muestra la presencia de tumores micrometastásicos .

EJEMPLO 15. FORMACIÓN DE IMÁGENES DE LOS RECEPTORES DE LA ANGIOGÉNESIS MEDIANTE MARCADO CON F-18 Los péptidos marcados con Arg-Gly-Asp (RGD) se han utilizado para la formación de imágenes de la angiogénesis , por ejemplo, en tejidos isquémicos, en donde está involucrada la integrina a?ß3. (Jeong et al., J. Nucí. Med. 2008, Abril; 15 publicación electrónica) . RGD se conjuga con SCN-Bz-NOTA de acuerdo con Jeong et al. (2008) . A1-18F se une al péptido RGD derivado con NOTA como se describió en el Ejemplo 10 anterior, mezclando la solución madre de aluminio con F-18 y el péptido RGD derivado y calentando a 110 °C durante 15 minutos, utilizando un exceso de péptido para dirigir la reacción de marcado hacia la terminación como se describe en el Ejemplo 10. El péptido RGD marcado con F-18 se utiliza para la biodistribución y formación de imágenes con PET in vivo como se describe en Jeong et al. (2008) . El conjugado de A1-18F de RGD-NOTA se capta en los tejidos isquémicos y proporciona la formación de imágenes con PET de la angiogénesis.

EJEMPLO 16. FORMACIÓN DE IMÁGENES DE LOS TUMORES UTILIZANDO BOMBESINA MARCADA CON F-18 Un derivado de bombesina conjugado con NOTA (NOTA-8-Aoc-BBN(7-14)N¾) se preparó de acuerdo con Prasanphanich et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 2007, 104:12462-467) . El derivado de NOTA-bombesina se marcó con A1-18F de acuerdo con el Ejemplo 10 anterior. El derivado de bombesina marcado con F-18 se separó de la bombesina no marcada en una columna OASIS® (Waters, Milford, MA) , como se describió en el Ejemplo 10. El conjugado de NOTA-bombesina marcado con Al-18F se utilizó de manera exitosa para la formación de imágenes con PET de los tumores que expresan el receptor del péptido que libera la gastrina, de acuerdo con Prasanphanich et al. (2007) .

EJEMPLO 17. FORMACIÓN DE IMÁGENES DE TUMORES UTILIZANDO LOS CONJUGADOS SELECCIONABLES MARCADOS CON F-18 Los derivados de NOTA de péptidos, polipéptidos , proteínas, carbohidratos, citocinas, hormonas o agentes que se unen al receptor celular se prepararon de acuerdo con la Patente de los Estados Unidos No. 7,011,816 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . Los conjugados selecciónateles derivados de NOTA se marcan con A1-18F como se describe en el Ejemplo 10. Los conjugados se administran in vivo y se utilizaron de manera exitosa para la formación de imágenes con PET con F-18 de tumores.

EJEMPLO 18. FORMACIÓN DE IMÁGENES DE TUMORES UTILIZANDO ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS Los anticuerpos biespecífieos que tienen al menos un brazo que se une de manera específica a un tejido seleccionado y al menos otro brazo que se une de manera específica a un conjugado seleccionable se prepararon de acuerdo con la Patente de los Estados Unidos No. 7,052,872, incorporada en la presente como referencia en su totalidad. El conjugado seleccionable comprende una o más porciones quelantes de NOTA. El conjugado seleccionable se marca con A1-18F como se describió en el Ejemplo 10. Un sujeto con una condición de 'enfermedad se inyecta con el anticuerpo biespecífico . Después de dejar un tiempo suficiente para que el anticuerpo biespecífico libre se elimine de la circulación, el sujeto se inyecta con el conjugado seleccionable marcado con F-18. La formación de imágenes de la distribución de la marca de F-18 se realiza mediante exploración con PET. En otra modalidad ejemplar, el anticuerpo anti-CD74 de internalización humanizado o quimérico se prepara como se describió en la Patente de los Estados Unidos No. 7,312,318. El precursor p-SCN-bn-NOTA se marca con Al-18F como se describe en el Ejemplo 7. El Al-18F NOTA se conjuga entonces al anticuerpo utilizando técnicas estándar. Tras la inyección i.v. a un sujeto con un tumor que expresa CD74, el anticuerpo anti-CD74 se localiza en el tumor, permitiendo la formación de imágenes del tumor mediante exploración con PET. En las modalidades alternas, los anticuerpos marcados con F-18 se preparan utilizando el anticuerpo que se une a la alfa- fetoproteína Immu31, hPA 4 , CPAM4, RS7, anti-CD20, anti-CD19, anti-CEA y anti-CD22, como se describió en las Patentes de los Estados Unidos NOS. 7,300,655; 7,282,567; 7,238,786; 7,238,785; 7,151,164; 7,109,304; 6,676,924; 6,306,393 y 6,183,744. Los anticuerpos se conjugan con NOTA utilizando técnicas estándar y se marcan con Al-18F como se describió para el anticuerpo anti-CD74. Los anticuerpos marcados con F-18 se inyectan a los sujetos y proporcionan una formación de imágenes exitosa de tumores mediante exploración con PET.

EJEMPLO 19. USO DE NOTA MARCADO CON 18F PARA LA FORMACIÓN DE IMÁGENES DEL FLOJO RENAL Una solución madre de aluminio (20 pL 0.05 M en amortiguador de NaOAc pH 4) se mezcló con 200 L de F-19 purificado con QMA (como en el Ejemplo 10) . La solución de Al-F-18 se mezcla entonces con 500 L de NOTA 0.2 pH 4 , y se calentó durante 15 minutos. La muestra se diluyó entonces en 5 mL de PBS para la inyección. El NOTA marcado con F-18 se utilizó directamente para la formación de imágenes exitosa del flujo renal.

EJEMPLO 20. ESTUDIOS ADICIONALES DE MARCADO DEL PÉPTIDO CON AL-18F El IMP 460 NODA-GA-D-Ala-D-LyS (HSG) -D-Tyr-D-LyS(HSG)-NH2 se sintetizó de una manera similar a la descrita anteriormente para IMP 361. El ligando NODA-Ga se compró de Chematech y se unió al sintetizador peptídico como los otros aminoácidos. El péptido crudo se purificó para proporcionar el péptido deseado MH+ 1366.

RADIOMARCADO DE IMP 460 El IMP 460 (0.0020 g) se disolvió en 732 pL, de NaOAc 0.1 M pH 4. El F-18 se purificó como se describió en el Ejemplo 10, se neutralizó con ácido acético glacial y se mezcló con la solución de Al. La solución del péptido, 20 L, se tomó a continuación y la solución se calentó a 99 °C durante 25 minutos. El producto crudo se purificó a continuación en una columna Waters HLB como se describió anteriormente. El péptido marcado con Al-F-18 estaba en el eluyente de la columna de EtOH/H20 1:1. Las trazas de la HPLC en fase inversa en amortiguadores de TFA al 0.1% mostraron un solo pico limpio de la HPLC en la ubicación esperada para el péptido marcado.

EJEMPLO 21. MARCADO DE CARBOHIDRATOS Un derivado de NOTA tiosemicarbazida se preparó haciendo reaccionar el p-SCN-bn-NOTA con hidrazina y a continuación purificando el ligando mediante HPLC. Al-F-18 se preparó como se describió en el Ejemplo 10 y Al-F-18 se agregó a NOTA tiosemicarbazida y se calentó durante 15 minutos. Opcionalmente , el complejo de Al-F-18-tiosemicarbazida se purificó mediante HPLC. La Al-F-18-tiosemicarbazida · se conjugó a carbohidratos oxidados mediante métodos conocidos. El carbohidrato marcado con F-18 se utilizó de manera exitosa para estudios de formación de imágenes utilizando exploración con PET.

EJEMPLO 22. MARCADO DE LÍ IDOS Un lípido que comprende un aldehido se conjugó a Al-F-18 NOTA tiosemicarbazida del Ejemplo 21 y el lípido marcado con F-18 se utilizó de manera exitosa para estudios de formación de imágenes utilizando la exploración con PET. En una modalidad alterna, un lipido que comprende un grupo amino se hacer reaccionar con p-SCN-bn-NOTA. El lipido marcado con NOTA se hace reaccionar con Al-F-18 como se describió en los Ejemplos anteriores. El lipido marcado con F-18 se utilizó de manera exitosa para estudios de formación de imágenes utilizando la exploración con PET.

EJEMPLO 23. MARCADO DE APTÁ EROS Un aptámero que comprende un aldehido se conjuga a Al-F-18 NOTA tiosemicarbazida del Ejemplo 21. El aptámero marcado con F-18 se administró a un sujeto y se utilizó de manera exitosa para estudios de formación de imágenes utilizando la exploración con PET.

Claims (47)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para marcar una molécula con F-18 que comprende : a) hacer reaccionar el F-18 con un metal para formar un complejo de F-18 -metal; y b) unir el complejo de F-18-metal a una molécula para formar una o más moléculas marcadas con F-18, para ser administradas a un sujeto.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde el complejo se une a una porción quelante en la molécula .
3. 3. El método según la reivindicación 1, en donde la molécula es una proteína o un péptido.
4. 4. El método según la reivindicación 1, en donde el metal se selecciona del grupo que consiste de aluminio, galio, indio, lutecio y talio.
5. 5. El método según la reivindicación 1, en donde la molécula marcada con F-18 es estable en solución acuosa .
6. 6. El método según la reivindicación 1, en donde la molécula marcada con F-18 es estable en suero.
7. 7. El método según la reivindicación 2, en donde la porción quelante se selecciona del grupo que consiste de DOTA, TETA, NOTA, NETA o un derivado de NOTA.
8. 8. El método según la reivindicación 3, en donde el péptido es IMP 449 (NOTA-ITC bencil-D-Ala-D-Lys (HSG) -D-Tyr-D-Lys (HSG) -NH2) .
9. 9. El método según la reivindicación 1, que comprende además, administrar las moléculas marcadas con F-18 a un sujeto sin separar la molécula marcada con F-18 de las moléculas no marcadas .
10. 10. ?1 método según la reivindicación 1, que además comprende : c) separar las moléculas marcadas con F-18 de las moléculas no marcadas, para producir moléculas marcadas con F-18 purificadas; y d) administrar las moléculas marcadas con F-18 purificadas a un sujeto.
11. 11. El método según la reivindicación 10, en donde las moléculas marcadas con F-18 purificadas se producen en menos que una hora desde el inicio del método.
12. 12. El método según la reivindicación 10, que además comprende, utilizar la exploración con PET para formar imágenes de la distribución de las moléculas marcadas con F-18 purificadas en el sujeto.
13. 13. Un método para marcar una molécula con F-18, que comprende : a) hacer reaccionar el F-18 con boro para formar un complejo de F-18 -boro; y b) unir el complejo de F-18 -boro a una molécula para formar una o más moléculas marcadas con F-18 a ser administradas a un sujeto.
14. 14. Un método para marcar una molécula con F-18, que comprende agregar F-18 a una molécula marcada con metal, bajo condiciones que permitan que el F-18 se una al metal .
15. 15. Un método para marcar una molécula con F-18, que comprende agregar F-18 a una molécula marcada con boro bajo condiciones que permitan que el F-18 se una al boro.
16. 16. Una proteína o péptido marcado con F-18, que comprende un complejo de F-18 -metal unido a la proteína o al péptido.
17. 17. La proteína o el péptido marcado con F-18 según la reivindicación 16, en donde el metal se selecciona del grupo que consiste de aluminio, galio, indio, lutecio y talio .
18. 18. Una, proteína o péptido marcado con F-18, que comprende un complejo de F-18-boro unido a la proteína o al péptido.
19. 19. Un método para la formación de imágenes mediante tomografía con emisión de positrones (PET) con F-18, que comprende: a) hacer reaccionar el F-18 con aluminio, galio, indio, lutecio, boro o talio para formar un complejo de F-18; b) unir el complejo de F-18 a una molécula para formar una o más moléculas marcadas con F-18; c) administrar las moléculas marcadas con F-18 a un sujeto bajo condiciones en donde la molécula marcada se localiza en una o más células, tejidos u órganos; y d) formación de imágenes de la distribución de la molécula marcada con F-18 mediante exploración con PET.
20. 20. El método según la reivindicación 19, en donde la molécula marcada con F-18 se administra al sujeto sin separar las moléculas marcadas con F-18 de las moléculas no marcadas .
21. 21. El método según la reivindicación 19, que además comprende : e) separar las moléculas marcadas con F-18 de las moléculas no marcadas para producir moléculas marcadas con F-18 purificadas antes de que las moléculas marcadas con F-18 se administren al sujeto.
22. 22. El método según la reivindicación 19, en donde la formación de imágenes de la distribución de las moléculas marcadas con F-18 es indicativa de la presencia o ausencia de una enfermedad.
23. 23. El método según la reivindicación 22, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de cánceres sólidos (carcinomas, sarcomas, melanomas, gliomas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer prostático) , cánceres hematopoyéticos (leucemias, linfomas, mielomas) , enfermedad autoinmune, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad cardiaca, infarto al miocardio, falla cardiaca congestiva, necrosis cardiaca, trombosis, apoplejía, inflamación, aterosclerosis , artritis reumatoide, lupus eritematoso, SIDA e infección con un patógeno .
24. 24. El' método según la reivindicación 19, en donde la molécula marcada con F-18 se utiliza para formar imágenes de los receptores .
25. 25. El método según la reivindicación 24, en donde los receptores son receptores de la angiogénesis y la molécula marcada con F-18 es RGD-NOTA conjugado con Al-18F.
26. 26. El método según la reivindicación 19, en donde la molécula marcada con F-18 se utiliza para formar imágenes de tumores .
27. 27. El .método según la reivindicación 26, en donde la molécula marcada con F-18 es bombesina marcada con F-18.
28. 28. El método según la reivindicación 26, en donde la molécula marcada con F-18 es un anticuerpo o fragmento del mismo, seleccionado del grupo que consiste de hLLl, hLL2, hlmmu31, hPAM4 , hRS7 , hA19, hA20, hM -14, hMu-9, hMN-3, hMN-15 y hL243.
29. 29. El método según la reivindicación 19, en donde la molécula marcada con F-18 es NOTA marcado con F-18 y el NOTA marcado con F-18 se utiliza para formar imágenes del flujo renal. 29. El método según la reivindicación 19, en donde la molécula marcada con F-18 es dirigida a sitios de interés utilizando anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o constructos de anticuerpo.
30. 30. El método según la reivindicación 19, en donde la molécula marcada con F-18 es dirigida a sitios de interés utilizando anticuerpos biespecífieos .
31. 31. El método según la reivindicación 30, que comprende además i) administrar un anticuerpo biespecífico a un sujeto, el anticuerpo biespecífico tiene al menos un sitio de unión para un constructo seleccionable y al menos un sitio de unión para un antígeno seleccionado como objetivo, en donde la presencia de un antígeno seleccionado como objetivo es indicativa de una enfermedad o condición y el constructo seleccionable es la molécula marcada con F-18, y ii) dejar una cantidad de tiempo suficiente para que el anticuerpo biespecífico que no está unido al antígeno seleccionado como objetivo se elimine de la circulación antes ; de la administración del constructo seleccionable.
32. 32. El método según la reivindicación 31, en donde el antígeno seleccionado como objetivo es un antígeno asociado con un tumor.
33. 33. El método según la reivindicación 31, en donde el antígeno seleccionado como objetivo está presente en un organismo patogénico.
34. 34. El método según la reivindicación 33, en donde el patógeno es un virus, bacteria, hongo, levadura o microorganismo .
35. 35. El método según la reivindicación 34, en donde el virus se selecciona del grupo que consiste del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) , virus del herpes, citomegalovirus , virus de la rabia, virus de la influenza, virus de la hepatitis B, virus Sendai, virus de la leucemia felina, virus Reo, virus de la polio, virus similar al parvo en suero humano, virus simiano 40, virus sincitial respiratorio, virus del tumor mamario de ratón, virus de la Varicella-Zoster, virus del Dengue, virus de rubéola, virus del sarampión, adenovirus, virus de la leucemia de los linfocitos T humanos, virus de Epstein-Barr, virus de la leucemia murina, virus de las paperas, virus de la estomatitis vesicular, virus Sindbis, virus de la coriomeningitis. linfocítica, virus de las verrugas y virus de la lengua azul; o la bacteria se selecciona del grupo que consiste de Streptococcus agalactiae, Legionella pneumophilia, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pneumococcus, Hewophilis influenzae B, Treponema pallidum, espiroquetas de la enfermedad de Lyme, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium leprae, Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis y Clostridium tetani.
36. 36. El método según la reivindicación 32, en donde el antígeno seleccionado como objetivo, se selecciona del grupo que consiste del antígeno p específico del colon (CSAp) , antígeno carcinoembriónico (CEA), CD4 , CD5 , CD8 , CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD30, CD45, CD66a-d, CD67, CD74 , CD79a, CD80, CD138, HLA-DR, la, Ii, MUC 1, MUC 2, MUC 3, MUC 4, NCA, EGFR, receptor de HER 2/neu, TAG-72, EGP-I, EGP-2, A3 , KS-I, Le (y) , S100, PSMA, PSA, tenascina, receptor del folato, VEGFR, EGFR, PDGFR, FGFR, PIGF, ILGF-I, antígenos de la necrosis, IL-2, IL-6, T101, MAGE o una combinación de estos antígenos.
37. 37. El .método según la reivindicación 36, en donde el anticuerpo biespecífico comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, seleccionado del grupo que consiste de hLLl , hLL2, hlmmu31, hPAM4 , hRS7, hA19, hA20, h. N-14, h u-9, hMN-3, h N-15 y hL243.
38. 38. Un equipo para el marcado con F-18, que comprende : a) un metal o boro para formar un complejo con F-18; b) opcionalmente , un péptido de selección del objetivo que comprende una o más porciones quelantes para unirse al complejo de F-18.
39. 39. El equipo según la reivindicación 38, que además comprende uno o más amortiguadores .
40. 40. El equipo según la reivindicación 38, que además comprende un agente de protección de la radiolisis.
41. 41. El equipo según la reivindicación 40, en donde el agente de protección de la radiolisis es ácido ascórbico .
42. 42. El equipo según la reivindicación 38, en donde el péptido es IMP 449.
43. 43. El equipo según la reivindicación 38, en donde el metal es aluminio, galio, indio, lutecio o talio.
44. 44. El equipo según la reivindicación 38, que además comprende un anticuerpo biespecífico, el anticuerpo con una especificidad de unión para el péptido de selección y otra especificidad de unión para un antígeno objetivo.
45. 45. El equipo según la reivindicación 44, en donde el antígeno objetivo es un antígeno asociado con el tumor .
46. 46. El equipo según la reivindicación 45, en donde el antígeno objetivo se selecciona del grupo que consiste del antígeno p específico del colon (CSAp) , antígeno carcinoembriogénico (CEA), CD4 , CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23 , CD25, CD30, CD45, CD66a-d, CD67, CD74, CD79a, CD80, CD138, HLA-DR, la, Ii, MUC 1, MUC 2, MUC 3, MUC 4, NCA, EGFR, receptor de HER 2/neu, TAG-72, EGP-I, EGP-2, A3 , KS-I, Le (y) , S100, PSMA, PSA, tenascina, receptor de folato, VEGFR, EGFR, PDGFR, FGFR, P1GF, ILGF-1, antígenos de la necrosis, IL-2, IL-6, T101, MAGE o una combinación de estos antígenos.
47. 47. El equipo según la reivindicación 44, que además comprende un agente de eliminación para eliminar un anticuerpo biespecífico que no está unido al antígeno objetivo de la circulación.