JP5398954B2 - シス−ウロカニン酸を用いた細胞内酸性化のための医薬組成物 - Google Patents
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Description
本研究の目的は、モデル細胞であるヒト抹消血好中球において放射性標識UCAの結合を調査することである。この細胞はUCAによって影響を及ぼされることが示されている(Kivisto 1996年)。典型的なリガンド−受容体相互作用を示すことができる代わりに、我々は、UCAが、例外的な結合特性を有し、そしてそれは、無傷のUCAをサイトゾルに迅速にそして不可逆的に蓄積させることを見出した。ウロカニン酸は、哺乳類の皮膚におけるでUV照射−吸収物質である。シス−UCAは、インビボで動物モデルでの免疫抑制物質であるが、しかし標的細胞の種類および作用の様式は、はっきりしないままである。我々は、その機能がUCAによって影響を及ぼされることが知られており、そして炎症反応で主要な役割を果たすことが知られている免疫細胞型である、生きているヒトの多形核好中球でのUCAの結合および作用の部位を調査した。我々は、サイトゾルで集中するほぼ95%の細胞結合分画で、予想外に高いインキュベーション濃度(≧30mM)までの放射性標識シス−およびトランス−UCAの線状の濃度依存性蓄積を観察した。異性体は、サイトゾル中で未結合および非代謝形態であるように見えるので、我々は、UCAが、従来の受容体/タンパク質−リガンド相互作用と異なる機序を通して作用し得るかどうか疑問を持った。その異性体は、細胞内pHに影響を及ぼした。FACS分析は、細胞外pH6.5でシス−UCAによる好中球の細胞内区分の酸性化が、トランス−UCA(p=0.00031)によるより明らかに大きかったのに対して、異性体は、中性より上のpHで酸性化しなかったことを示した。pH6.5での同じ条件でシス−UCAは、トランス−UCA(p=0.023)より多くの好中球の呼吸バースト活性を阻害した。この型の立体特異性は、2つの異性体の異なったpKa値によって表現することができ、そして我々は、細胞内酸性化を通してシス−UCA作用についてのモデルを提案する。我々は、シス−UCAが、細胞外pH6.1〜7.0枠での細胞内酸性化を通して好中球の活性化および機能を阻害することによって、生来の免疫性を抑制する可能性があると結論する。
ウロカニン酸および[14C]標識異性体の合成
トランス−ウロカニン酸(トランス−UCA、3−(1H−イミダゾール−4−イル)−2−プロペン酸)を、シグマ(Sigma)(米国ミズーリ州セントルイス(St.Louis,MO,USA))から購入した。シス−UCAを、UV光異性化を用いてトランス−UCAから製造した(下記参照)。UCA異性体の化学的純度は、高圧液体クロマトグラフィ−(HPLC)によって99.7%より上であった。
アミノプロピル固定相カラム・リクロソルブ(Lichrosorb)NH2、ハイバー(Hibar)RT、250×4mm、5μm(メルク、ドイツ ダームスダット(Darmstadt))を使用した。溶離液は、アセトニトリルと2%(v/v)酢酸および0.5%(w/v)酢酸アンモニウムの水溶液との50%(v/v)混合物であった。異性体は、268nmで検出され、そして滞留時間は、Tr(シス)3.7分およびTr(トランス)5.4分であった。
試料を、オプチフェーズHiSafe2シンチレーション液(EG&G ワラック、フィンランド ツルク(Turku))と混合し、そして[14C]UCA放射性活性を、ラックベータ1214シンチレーションカウンター(EG&G ワラック)で測定した。計数効率は、96.7%±0.12%(平均±SEM、n=48)であった。
末梢血好中球を、健全な提供者のヘパリン化血または軟膜から単離した。赤血球を、6%デキストランT−500(ファルマシア、スウェーデン)で沈殿させた。好中球を、フィコール−ハイパーク(Ficoll-Hypaque)(ファルマシア)での遠心分離により白血球に富むデキストラン血漿から分離し、残りの赤血球の低張溶解により精製し、そしてCa−およびMg−不含HBSSで洗浄した。細胞内pH実験のために、好中球を、赤血球溶解なしに調製した。細胞、媒体および遠心分離機を、温度変動を避けるために、細胞調製のあいだ室温に保持させた。フローサイトメトリー分析により、99.6%の分離好中球は、CD11b+/CD35+、98%CD45+、98%CD62L+/CD32+、2.0%HLA−DR+、2.1%CD3+、1.0%CD8+、1.2%CD4+、および0.8%CD14+細胞であった。
呼吸バースト活性は、好中球機能の尺度として使用された。UCA異性体は、記述されるとおり(Kivistoら、1996年)オプソニン化チモサンを用いた化学ルミネセンスアッセイで試験した。ピーク値を記録した。
単離好中球を、2〜10×106細胞/mlで、HBSS(pH7.4)に再懸濁させた。[14C]シス−または[14C]トランス−UCA保存溶液を添加して、0.1μM〜30mMまでの濃度範囲を生じ、そして二重に、管を、30分間、4℃で(または25℃および37℃で)インキュベートした。その後、細胞を、氷冷HBSSで1回洗浄し、そして液体シンチレーション容器に移した。各標準濃度から得たサンプルを測定することによって、インキュベーション管中の総[14C]UCA活性を測定し、そしてブランクのシンチレーション値を、データ分析の前に差し引いた。洗浄工程において同じ緩衝液を使用して、示されるとおり、50mMクエン酸ナトリウム/120mM NaCl緩衝液で、いくつかの結合実験を行なった。
膜、サイトゾルおよび核内での細胞結合UCAの局在化を、前記のとおり[14C]シス−UCAとの全細胞のインキュベーションの後に調べた。HBSSを用いた洗浄の後、細胞を、10mMピペス、10mM KCl、3mM NaCl、4mM MgCl2(pH7.0)を含有する氷冷溶解緩衝液(プロティナーゼ阻害剤として0.5mM PMSF、10μMロイペプチンおよび10μMペプスタチンA(全て、シグマから)を補足)中に懸濁させた(200×106細胞/ml)。細胞膜を、氷上での超音波処理により破壊した。溶解液を、遠心分離(800×g、25℃、10分)し、そして後期核上清を、溶解緩衝液中のショ糖の不連続クッションに積層させた。超遠心分離(120000×g、4℃、45分)の後、注意深いピペット採取により、サイトゾル、膜、および核/残骸分画を回収し、そして[14C]活性を測定した。
サイトゾルタンパク質の巨大分画のために、試料(0.5〜2.5ml)を、4℃で、平衡セファクリルS−200ゲル濾過(ファルマシア)カラムにかけ、そしてタンパク質を、約0.6ml/分の流速で、PBS(pH7.0)で溶出させた。タンパク質の溶出を、254nmでのフロースルーUVモニターおよび電位差記録装置を用いて追跡した。典型的な作業は、30の6ml分画から構成され、そしてほとんど6時間続いた。様々な分子量のタンパク質の溶出体積を、標準タンパク質と0.6〜2000kDaのサイズのペプチドとのカクテルを用いて測定した。
標準として仔ウシアルブミンを使用したバイオ−ラッド(ドイツ、ミュンヘン)タンパク質アッセイで、タンパク質濃度を測定した。
好中球における細胞内pHレベルを、pH感受性蛍光染料2’,7’−ビス−(2−カルボキシエチル)−5−(および−6)−カルボキシフルオレセイン(BCECF、アセトキシメチルエステル;モレキュラー・プローブス、オランダ、ライデン)を利用したフローサイトメトリーで観察した。約30×106細胞を、30分間、25℃で0.35μM BCECFを含有する10ml HBSS(pH7.4)中でインキュベートし、HBSSで2回洗浄し、そして1mlの154mM NaCl中に再懸濁させた。既知UCA濃度および照合されたpHを示す適量(235μl)のインキュベ−ション培地を、ポリスチレン管中で細胞(4.5×105細胞/15μl NaCl)に適用し、約20分間、25℃でインキュベートし、そしてフローサイトメトリーで分析した。
結果は、平均±SEMとして表した。結合研究および機能性試験でのデータの統計学的有意性は、二方向スチューデントt検定で計算した。パーソンの相関係数を、細胞試料のHPLCおよびシンチレーション計数により検出されるUCA異性体濃度について測定した。相関関係についてのp値は、フィッシャーのZトランスフォーメーションの後測定した。
好中球サイトゾルでのUCA蓄積物
単離ヒト末梢血好中球に対するUCAの結合を試験するために、放射性活性[14C]標識UCA異性体を合成した。30分間、4℃で、HBSS中でUCAとインキュベートした細胞は、100nMから30mMまでの試験濃度範囲にわたって、線状の用量依存様式で両方の異性体を取込んだ(図2)。全結合の比率は、シス−UCAについて4.5%±1.1%(範囲2.9〜6.6%)、そしてトランス−UCAについて7.1%±3.2%(範囲3.7〜17%)であった(両方の異性体について二重に、n=12の測定値)。この取込の興味深い特性は、我々が、従来のリガンド−受容体結合で予測するような、[14C]UCA放射性標識の非標識(「冷」)UCAによる置換を示すことができなかったことであった(図3)。サイトゾル、細胞膜および核区画中の細胞−結合UCAの分布を調査するために、細胞を、最初に上のとおり放射性標識UCAとインキュベートし、そしてその後、それらを溶解させ、そして120.000×gショ糖クッション上に分画した。超遠心分離管中の内容物を、サイトゾル、膜および核分画に分けた。各分画の体積を正確に測定した。その後、適量の分画での[14C]UCA活性を測定し、そして総UCA含有量を、各分画について計算した。独立のインキュベーション実験(n=4)は、好中球取込シス−UCAの92.0%±2.2%が、サイトゾルで回収されたことを示した(図4A)。膜に対する結合(平均2.7%±1.8%)は、サイトゾルで見られたもの(p=3.7×10-5)より明らかに低かった。残りの細胞結合シス−UCA(5.3%±2.l%)は、細胞溶解液の核(およびおそらく非溶解細胞)分画で検出された(図4A)。
細胞中に取込まれたUCAのほとんどが、サイトゾルで見られたので、我々は、サイトゾルUCAが、好中球サイトゾルの分子成分に結合されたかどうかを決定した。[14C]UCA前インキュベートした細胞のサイトゾルを、ショ糖超遠心分離で分離し、そしてS−200ゲル濾過カラムにかけた。その後、サイトゾル分画を収集し、そして放射活性を、各分画で測定した。図5Aおよび5Bで示されるとおり、[14C]活性は、検出可能なタンパク質を含まない低分子量分画で見られた。この溶出パタ−ンは、[14C]シス−UCA単独が、ゲル濾過カラムにかけられる経路と一致し(図5C)、そしてUCAが、好中球サイトゾルでのいずれの主要な溶解性タンパク質分画にも結合されないことを示唆した。
次に、我々は、サイトゾル中の[14C]UCAが、放射性活性標識のどれくらいが無傷のUCAと結合したかを測定することによって、取込後に好中球によって代謝されたかどうかを試験した。これは、氷上で、一晩、10%トリクロロ酢酸(TCA)を用いて[14C]UCA標識好中球のサイトゾルタンパク質を沈殿させることによって行われた。その後、放射活性標識の量を、シンチレーション計数により、沈殿およびタンパク質不含上清の両方で測定し、そして上清中の無傷のUCAの含有量を、HPLCによって測定した。全[14C]UCA活性は、上清で見られ、そしてTCAの添加の直後、およびタンパク質沈殿物を沈降させた後のサイトゾル中の放射活性を比較した場合、回収はシス−UCAについては102%±3.9%(n=9)であり、トランス−UCAについては100.2%±0.9%(n=4)であった。タンパク質ペレットでは、放射活性は見られなかった。さらに重要には、無傷のシス−およびトランス−UCAのクロマトグラフィーで測定した濃度は、同じ試料中のシンチレーション計数によって達成された濃度と相関関係があり(図6)、UCA異性体は、好中球サイトゾルにおいて代謝されなかったことを示した。UCA異性体で前処理されなかった細胞では、HPLC分析によって内因性UCAは見られなかった(データは示されず)。
これまでに報告された結果は、典型的な細胞表層受容体アゴニストのような挙動をする代わりに、UCAは、好中球の内側に高濃度で蓄積し、そこで、UCAは溶解性の細胞内タンパク質に結合したりも、明らかな代謝にかけたりもしないことを示す。それ自体、UCAは、細胞に入り、そしてサイトゾルの物理−化学的微小環境(pH、イオン能力、イオン強度)を改変することによって細胞機能を調節する小イオン(例えば、K+、Na+、H+、Cl-)に類似する。したがって、我々は、高レベルの無傷のUCAが、酸としてのサイトゾルにおけるその受動的存在により簡単に細胞変化をし得ることを仮定した。pKaが、トランス−UCA(Robertsら、1982年、KrienおよびKermici 2000年)については4.0および6.1、そしてシス−UCA(Robertsら、1982年)については3.3および7.0の周辺であるので、1つの可能性のある作用の態様は、生理学的pHでのサイトゾルの酸性化であり得る。最初に緩衝溶液で、そしてその後無傷の細胞で、pHにおけるUCAの効果を試験することによってそのような可能性が近づいた。異性体は、1mMより上の濃度で、用量依存的様式で、標準PBS緩衝液(pH7.0)においてpHを低下させた(図7A)。UCA異性体を、HBSS緩衝液(pH7.4)に添加したとき、1mMより上の濃度が、再度、用量依存的にpHを下降させた(図7B)。興味深いことに、HBSS緩衝溶液のpHを、UCA添加前に6.5に、すなわちシス−UCAの第二のpKaより下に調整した場合、トランス−UCAのみが、pHを際立って減じることができ(図7B)、シス−UCAが、このpHで部分的に脱プロトン化されるのみであることを示唆した。
上に示されるデータは、僅かに酸性の環境でシス−UCAのみが、サイトゾルpHを際立って減少させるとができるのに対して、生理学的pHでは、トランス−も、シス−異性体もなんらの影響を示さなかったことを示唆する。どのようにUCAのサイトゾル酸性化効果が、先に報告された好中球呼吸バースト活性の阻害と相関関係にあるかを試験するために、我々は、好中球の同じバッチにより、そして上に記述されたのと同じ実験条件下で、すなわち、試験溶液のpHが、UCA添加の後にそれの当初のレベルに戻して調整される場合、オプソニン化チモサムで誘導される化学ルミネセンスに対する3mM UCAの影響を測定した。図8Bに示されるとおり、トランス−UCAは、pH7.4で化学ルミネセンスに影響を示さなかったのに対して、14%±4.0%(n=3)の阻害が、pH6.5で観察された。同じ条件下でシス−UCAは、それぞれ、15%±8.4%および44%±1.3%まで呼吸バースト活性を抑制した。興味深いことには、試験溶液のpHが、UCA補足後、調整されないままであった場合、トランス−UCAは、それぞれ、pH6.22±0.02(名目上pH7.4)および5.87±0.06(名目上pH6.5)で、31%±8.4%および48%±4.0%まで化学ルミネセンスを阻害した。シス−UCAについての対応の阻害は、pH6.60±0.02(名目上pH7.4)で、41%±10%、そしてpH6.33±0.07(名目上pH6.5)で、48%±1.6%であった。
UCAは弱い有機酸であるので、細胞の内側のUCAの蓄積が、サイトゾルのpHを調節し得る。しかし、これは、一般に、入ってくるUCA分子のプロトン化状態による。UCAは、2つのプロトン供与部分、カルボキシル基およびイミダゾール基を有する多塩基酸である。カルボキシル基のpKaは、トランス−UCAについては4.0で、そしてシス−UCAについては3.3であり(Roberts 1982年)、そしてそれから、特に全てのUCA分子が、ヘンダーソン−ヘーゼルバルチ方程式(H−H方程式)によって、4より上のpHでカルボキシル基で脱プロトン化されるという結果になる。したがって、生理学的pH範囲で、イミダゾリル基単独のプロトン化状態は、分子がプロトンを供与でき、そしてそれにより酸性化を促進するかどうかを決定する。トランス−UCAのイミダゾリルpKaは、6.1(Robertsら 1982年、KrienおよびKermici 2000年)であり、一方シス−UCAのpKaは、潜在的に、カルボキシル部分とイミダゾリル部分のあいだの分子内水素結合により生じるシス−異性体の安定化互変異性体形態により、明らかに高い7.0である(Roberts 1982年)。結局、pH7.0およびその上でのみ、シス−UCAのイミダゾリル基が、脱プロトン化を好むのに対して、トランス−UCAは、同じpHでほとんど完全に脱プロトン化される。本研究で、これは、pH6.5に調整されたHBSS緩衝液中のトランス−UCAの添加がpHを下降させた一方で、シス−UCAは、ほとんど影響を示さなかった実験によって明瞭に示し得た。
ゲル組成物1(%w/w)
シス−ウロカニン酸 0.1〜10
カルボポール974 1.5
プロピレングリコール 12.5
緩衝剤 0.01〜1
精製水 残部
シス−ウロカニン酸 0.1〜10
ナトロゾル(ヒドロキシエチルセルロース) 1.0
緩衝剤 0.01〜1
精製水 残部
シス−ウロカニン酸 0.1〜10
プロピレングリコール 50
セトステアリルアルコール 15
ラウリル硫酸ナトリウム 1
緩衝剤 0.01〜1
精製水 残部
シス−ウロカニン酸 0.1〜10
セトステアリルアルコール 6.75
プロピレングリコール 40
ラウリル硫酸ナトリウム 0.75
ポロキサマー407 1
鉱油 5
線状ペトロラタム12. 5
緩衝剤 0.01〜1
精製水 残部
シス−ウロカニン酸 0.1〜10
鉱油 5
緩衝剤 0.01〜1
ペトロラタム 残部
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Claims (6)
- 細胞の細胞質を酸性化できる薬学的に許容し得る薬剤もしくはその塩の、ヒトまたは動物において免疫抑制を引き起こすために有用な医薬組成物の製造のための使用であって、有効量の該薬剤がヒトまたは動物に本質的に非解離型で投与され、該組成物のpHが6.1から7.0の範囲であり、かつ該薬剤がシス−ウロカニン酸であり、該医薬組成物が皮膚の炎症症状、または口腔、眼または生殖器の粘膜または結合組織の炎症症状の治療または予防のためのものであり、経皮、経粘膜または局所的に投与される使用。
- 前記組成物のpHが6.5から7.0である請求項1記載の使用。
- 皮膚の炎症症状、または口腔、眼または生殖器の粘膜または結合組織の炎症症状が、乾癬、急性または慢性皮膚炎、歯周炎、結膜炎および膣炎からなる群より選択される請求項1または2記載の使用。
- 薬学的に許容し得る緩衝薬剤と組み合わせて、活性薬剤として細胞の細胞質を酸性化できる薬学的に許容し得る薬剤またはその塩を含む医薬組成物であって、該組成物のpHが6.1から7.0の範囲であり、かつ該薬剤がシス−ウロカニン酸であり、皮膚の炎症症状、または口腔、眼または生殖器の粘膜または結合組織の炎症症状の治療または予防用であって、経皮、経粘膜および局所的に投与される医薬組成物。
- pHが6.5から7.0の範囲である請求項4記載の医薬組成物。
- 皮膚の炎症症状、または口腔、眼または生殖器の粘膜または結合組織の炎症症状が、乾癬、急性または慢性皮膚炎、歯周炎、結膜炎および膣炎からなる群より選択される請求項4または5記載の医薬組成物。
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