DE602004011906T2

DE602004011906T2 - Pharmazeutische zusammensetzung für die intrazelluläre ansäuerung mit cis-urocansäure

Info

Publication number: DE602004011906T2
Application number: DE602004011906T
Authority: DE
Inventors: Lasse Leino; Jarmo Laihia
Original assignee: Biocis Pharma Oy
Current assignee: Biocis Pharma Oy
Priority date: 2003-03-14
Filing date: 2004-03-01
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2024-03-02
Also published as: DE602004011906D1; CY1107346T1; EP1603559B1; US20060035973A1; PT1603559E; JP5398954B2; CA2518885A1; AU2004218944B2; CA2518885C; ATE386515T1; EP1603559A1; US20120315299A1; US8673281B2; EP2014289A1; FI20030379A0; WO2004080456A1; US8673280B2; JP2006520369A; JP2011057708A; DK1603559T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines pharmazeutisch annehmbaren Mittels zum Ansäuern des Zellzytoplasmas und zum nachfolgenden Bewirken von Immunsuppression in einer Person oder einem Tier und die Behandlung oder Prävention bzw. Verhinderung von Erkrankungen oder Störungen, die durch Immunsuppression behandelbar sind.
Die Erfindung betrifft auch eine neue pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein pharmazeutisch annehmbares Mittel, das in der Lage ist, das Zellzytoplasma anzusäuern und nachfolgend Immunsuppression in der Person oder dem Tier zu bewirken.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Druckschriften und andere Materialien, die hierin verwendet werden, um den Hintergrund der Erfindung zu beleuchten, und insbesondere Fälle zum Bereitstellen zusätzlicher Details hinsichtlich der Ausführung sind durch Bezugnahme aufgenommen.
Die Wirkungsweise von UV-Strahlung in der Haut ist eine Hauptherausforderung in der Photoimmunologie. Studien an Tieren und Menschen haben etabliert, dass eine UV-Exposition sowohl zu lokaler als auch systemischer immunologischer Teilnahmslosigkeit („unresponsiveness”) und Toleranz ergibt (Schwarz 1999). Es ist festgestellt worden, dass die Ultraviolett B (UVB)-Wellenlängen (280–315 nm) für den Großteil der immunsuppressiven Aktivität von UV-Bestrahlung verantwortlich sind. Die Mittel bzw. Agentien, die für die direkte Absorption der UVB-Photonen in der Epidermis verantwortlich sind, umfassen Urocansäure (UCA) und DNA. Endogene trans-UCA, synthetisiert durch enzymatische Desaminierung von Histidin im Stratum corneum der Haut, wird bei Exposition gegenüber UVB-Strahlung direkt zu cis-UCA photoisomerisiert. Es ist sowohl in vitro als auch in vivo gut gezeigt worden, dass die Photoisomerisierung von UCA eine Rolle bei der UVB-induzierten Immunsuppression spielt. Beispielsweise kann die durch UVB-Bestrahlung induzierte systemische Suppression bei Mäusen in großem Umfang durch anti-cis-UCA-Antikörper umgekehrt werden (Moodycliffe 1996). In mehreren Tiermodellen erzeugt die lokale oder systemische Verabreichung von cis-UCA darüber hinaus immmunsuppressive Wirkungen, ähnlich einer UVB-Behandlung (Gruner, 1992; el-Ghorr, 1997; Garssen, 1999, Wille, 1999). Einige Experimente haben gezeigt, dass UCA dazu in der Lage ist, bestimmte Funktionen in isolierten Zellen des Immunsystems in vitro zu modulieren, wie z. B. Antigenpräsentation (Beissert 1997, Holáň 1998), NK-Zell-Cytotoxizität (Gilmour 1993, Uksila 1994), Cytokin-Produktion durch Milzzellen (Holáň 1998), Degranulation von Mastzellen (Wille 1999) und Aktivierung von Neutrophilen (Kivistö 1996).
Weder in vivo- noch in vitro-Studien haben bislang geklärt, welche Immunzellen tatsächlich mit UCA nach UVB-Exposition Wechselwirken und durch welchen Mechanismus dieses Molekül die Funktion der Zielzellen auf der molekularen Ebene beeinflusst. Man würde erwarten, dass UCA ein löslicher Mediator bzw. eine lösliche Mittlersubstanz ist, der bzw. die an Zelloberflächenrezeptoren bindet und eine Signalisierungskaskade auslöst. Jedoch ist über den/die putativen Rezeptor(en) von UCA wenig bekannt. Er kann einige gemeinsame Eigenschaften mit dem histaminergen System haben, da Histamin-H₁- und -H₂-Rezeptor-Antagonisten eine cis-UCA-induzierte Immunsuppression partiell blockieren (Hart 1997). Andererseits ist gezeigt worden, dass cis-UCA nicht direkt an Histaminrezeptoren bindet (Laihia, 1998). Vor kurzem haben Verdrängungsstudien darauf hingewiesen, dass UCA auf GABA-Rezeptoren wirken kann, jedoch wurde kein direkter Beweis für eine UCA-Bindung an diesen Rezeptor gezeigt (Laihia, 1998; Uusi-Oukari, 2000).
GEGENSTAND UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben einen bislang unbekannten Wirkungsmechanismus von cis-Urocansäure gezeigt. Sie haben überraschenderweise gezeigt, dass cis-Urocansäure in einer Form in das Zellcytosol einwandert, die dazu in der Lage ist, ein Proton im Cytosol freizusetzen, nachfolgend das Cytoplasma anzusäuern und als ein Ergebnis davon als immunsupprimierendes Mittel zu wirken.
Somit betrifft diese Erfindung gemäß einem Aspekt die Verwendung eines pharmazeutisch annehmbaren Mittels oder Salzes davon, das in der Lage ist, das Zellcytoplasma anzusäuern, wobei das Mittel eine Säure ist, deren Dissoziationskonstante im Bereich von 6,7 bis 7,4 liegt, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Bewirkung einer Immunsuppression beim Menschen oder Tier verwendbar ist, worin eine wirksame Menge des Mittels in einer im Wesentlichen nicht-dissoziierten Form dem Menschen oder Tier verabreicht wird und worin das Mittel mit einem Träger, der den pH der Zusammensetzung auf den pH-Bereich 6,1 bis 7,0 einstellt, vermischt wird und worin die Menge des Mittels im Bereich von 0,1 bis 10% liegt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als aktive Substanz ein pharmazeutisch annehmbares Mittel oder Salz davon, das in der Lage ist, das Cytoplasma anzusäuern, wobei das Mittel eine Säure ist, die ihre Dissoziationskonstante im Bereich von 6,7 bis 7,4 hat, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, der das Mittel im Wesentlichen daran hindert, bei extrazellulären pH-Werten zu dissoziieren, und der in der Lage ist, den pH der Zusammensetzung im Bereich von 6,1 bis 7,0 zuhalten, und worin die Menge des Mittels im Bereich von 0,1 bis 10% liegt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Schema für die chemische Synthese von radioaktiv [¹⁴C]-markierter trans- und cis-UCA.
2 zeigt die UCA-Akkumulation bei lebenden Neutrophilen. Die Datenpunkte geben den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts bzw. SEM in Röhrchen bei doppelter Wiederholung nach Abzug des Leerwerts wieder. Die Zellen (7,0 × 10⁶ Zellen/ml HBSS) wurden mit den [¹⁴C]UCA-Isomeren bei 4°C für 30 min inkubiert, gewaschen und in Szintillationsfläschchen überführt. Kontrollfläschchen ohne Zellen, bezeichnet als „Gesamt-UCA", durchliefen eine ähnliche Inkubation um jeglichen unspezifischen Bindungseffekt durch die Inkubationsröhrchen zu eliminieren. Schraffierte Symbole, geschätzte Werte der Zählereignisse pro Minute („estimated cpm values") sind für Gesamt-UCA-Proben mit > 10⁷ Zählereignissen pro Minute aufgrund der technischen maximalen Zählgrenze verwendet worden.
3 zeigt die Verdrängung von [¹⁴C]cis-UCA-Aufnahme durch unmarkierte cis-UCA. Neutrophile, isoliert aus frisch abgenommenem venösem Blut eines einzelnen Freiwilligen, wurden zu zwei Gelegenheiten (mit sieben Tagen Abstand) auf Verdrängung bei pH 7,4 untersucht. Die Zellen (7,4 × 10⁶/ml in Exp 1 und 6,3 × 10⁶/ml in Exp 2) wurden in HBSS, enthaltend 1 mM [¹⁴C]cis-UCA, mit oder ohne 10 mM unmarkierter cis-UCA (Gesamtvolumen 200 μl) bei den angegebenen Temperaturen für 1 h inkubiert. In Exp 1 wurden die Zellen nach Inkubation lediglich als ein Pellet gewaschen, wohingegen die Zellen in Exp 2 im Waschmedium (HBSS) resuspendiert wurden. Die Daten stammen aus dreifachen Inkubationen.
4 zeigt die Verteilung von aufgenommener cis-UCA in zellulären Fraktionen und nach Inkubationstemperatur. A, Proportionale [¹⁴C]-Aktivität in verschiedenen Fraktionen von Zellen, inkubiert bei 4°C (Mittelwert ± SEM, n = 4 unabhängige Experimente). Neutrophile (50–200 × 10⁶ Zellen/ml), isoliert aus Leukozytenfilmen, wurden mit 1 oder 5 mM [¹⁴C]cis-UCA bei 4°C für 20–30 min inkubiert. Die Zellen wurden mittels (Ultra)Schallbehandlung aufgebrochen, die zellulären Fraktionen wurden durch Saccharose-Ultrazentrifugation getrennt und die gebundene Aktivität wurde in jeder Fraktion gemessen. B, Wirkung der Inkubationstemperatur auf die Aufnahme von cis-UCA auf Neutrophile des peripheren Bluts (Mittelwert ± SEM, n = 4 unabhängige Experimente). C, Verteilung von cis-UCA in zellulären Fraktionen gemäß der Inkubationstemperatur (Mittelwert ± SEM von doppelten Inkubationen).
5 zeigt die Elution von Cytosol-assoziierter [¹⁴C]UCA bei S-200-Gelfiltration. Neutrophile (160 – 190 × 10⁶) wurden mit 1 mM [¹⁴C]UCA-Isomeren bei 4°C für 20 min inkubiert, gewaschen, lysiert und mit Saccharose-Ultrazentrifugation fraktioniert. Die cytosolische Fraktion wurde auf das Gel aufgebracht und der Proteingehalt und die UCA-Aktivität wurden im Eluat gemessen. A, Cytosol von Zellen, inkubiert mit [¹⁴C]cis-UCA. B, Cytosol von Zellen, inkubiert mit [¹⁴C]trans-UCA. C, Flution von Standard-Molekulargewichts-Proteinmarkern und cis-UCA alleine bei den gleichen Bedingungen.
6 zeigt das Fehlen von UCA-Metabolismus unter den Versuchsbedingungen. Cytosolische Proteine von [¹⁴C]UCA-markierten Neutrophilen aus verschiedenen Bindungsassays wurden mit 10% TCA auf Eis über Nacht präzipitiert. Die Menge an radioaktiver Markierung wurde im Präzipitat und im proteinfreien Überstand mittels Szintillationszählung und der Gehalt an intakten (nicht-metabolisierten) UCA-Isomeren im Überstand mittels HPLC gemessen. Die Daten geben Ergebnisse aus einem Satz von Ganzzellinkubationen mit cis-UCA (n = 7) und trans-UCA (n = 2) und aus zwei Experimenten mit Inkubation nach der Lyse mit beiden Isomeren (Pfeil) wieder. Korrelationskoeffizienten nach Pearson und p-Werte sind für beide Isomere berechnet worden.
7 zeigt die pH-Wirkung von UCA-Isomeren auf Standard-Inkubationspuffer. Der pH wurde in PBS-, pH 7,0 (A) und in HBSS-Puffer, pH 7,4 (B), enthaltend abgestufe Konzentrationen von cis-UCA und trans-UCA, gemessen.
8 zeigt das Verhältnis von „respiratory burst"-Aktivität und Ansäuerung des Cytosols durch UCA-Isomere. In drei unabhängigen Experimenten wurden Neutrophile mit 3 mM cis- oder trans-UCA inkubiert und simultan hinsichtlich „respiratory burst"-Chemilumineszenz und pH-Indikator-Fluoreszenz analysiert. A. Intrazelluläre pH-Indikatorfarbstoff-Fluoreszenz, verglichen mit Kontrollleveln beim gleichen extrazellulären pH. Die Zellen wurden mit BCECF beladen, gewaschen, mit UCA inkubiert und mittels Durchflusscytometrie analysiert. Die prozentualen Anteile sind aus dem geometrischen Mittelwert der Fluoreszenzintensitäten berechnet worden. B. „Respiratory burst"-Reaktionen, verglichen mit Kontrollleveln ohne UCA beim gleichen pH. Die Ergebnisse sind aus zwei parallelen Assays innerhalb von jedem der drei Experimente. In A und B wurde der pH des extrazellulären Mediums nach Zugabe von UCA auf 6,5 oder 7,4 eingestellt. C. „Respiratory burst"-Reaktion mit UCA als eine Funktion des extrazellulären pHs. Die Daten sind aus den drei oben abgeschlossenen Experimenten mit Simultaninkubationen, wobei der pH nur gemessen, aber nach der Zugabe von 3 mM UCA nicht eingestellt wurde. D. Abhängigkeit des „respiratory burst" von der intrazellulären Ansäuerung. Korrelationskoeffizienten für cis-(p = 0,048, n = 12) und trans-UCA (p = 0,065, n = 11) wurden aus den gleichen Experimenten wie in B berechnet.
9 zeigt die intrazelluläre pH-Kalibration in UCA-behandelten Neutrophilen in situ. BCECF-markierte Zellen wurden als pH-Referenzzellen, verwendet nach Behandlung mit dem Protonenionophor Nigericin in hoch-Kalium-haltigem Pipes-Puffer bei verschiedenen pH(-Werten). Andere BCECF-markierte Zellen wurden mit oder ohne 3 mM UCA in gering-Kaliumhaltigem Pipes-Puffer, eingestellt auf die gleichen pH-Level wie jene der Kalibrationspuffer, inkubiert. Der intrazelluläre pH wurde unter Verwendung der medianen BCECF-Fluoreszenzintensität, die in der Durchflusscytometrie erhalten wurde, berechnet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einer vorzuziehenden Ausführungsform ist das pharmazeutisch annehmbare Mittel eine Säure, deren Dissoziationskonstante im Bereich von 6,9 bis 7,3, am stärksten bevorzugt (bei) etwa 7,0, liegt.
Die Säure ist vorzugsweise cis-Urocansäure oder ein Salz davon, ist aber nicht hierauf eingeschränkt. Jedes andere pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Mittel, dessen Dissoziationskonstante im oben definierten Bereich liegt und das dazu in der Lage ist, sich im Inneren einer Zelle zu akkumulieren, wäre verwendbar. Derartige Mittel können anorganisch oder organisch sein, vorzugsweise eine organische Säure, die, wie cis-Urocansäure, einen heterocyclischen Ring aufweist, an den eine gesättigte oder bevorzugter eine ungesättigte Carbonsäuregruppierung gebunden ist. Die heterocyclische Gruppe kann z. B. eine Imidazol-(wie für cis-Urocansäure) oder eine beliebige andere heterocyclische oder polyheterocyclische Gruppe sein, die die Fähigkeit, ein Proton bei cytoplasmischem pH abzugeben und dadurch das Cytoplasma anzusäuern, besitzt. Als Beispiele für weitere geeignete heterocyclische Gruppen können Thiazol, Thiophen, Furan, Oxazol, Triazol, Tetrazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrimidin und Triazin genannt werden.
Das pharmazeutisch annehmbare Mittel wird mit einem Träger vermischt, der eine einzelne Komponente oder bevorzugter ein Gemisch von zwei oder mehr Komponenten sein kann. Eine der Komponenten ist geeigneterweise ein pufferndes Mittel, das den pH der Zusammensetzung auf den gewünschten Wert einstellt.
Insbesondere wenn cis-Urocansäure das aktive Mittel ist, ist es vorzuziehen, den pH der Zusammensetzung auf 6,5 bis 7,0, vorzugsweise 6,7 bis 7,0, einzustellen. In diesem pH-Bereich ist cis-Urocansäure noch undissoziiert, wohingegen trans-Urocansäure vollständig dissoziiert ist. Eine derartige Zusammensetzung wird daher hinsichtlich cis-Urocansäure spezifisch sein.
Als Beispiele für geeignete puffernde Mittel zum Einstellen des pH auf 6,5–7,0 können 50 mM Natriumphosphat, supplementiert mit 55 mM Natriumchlorid, 50 mM Natriumcitrat, supplementiert mit 120 mM Natriumchlorid, und 10 mM Pipes, supplementiert mit 133 mM Natriumchlorid, genannt werden.
Das Verfahren und die Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung sind verwendbar zur Behandlung oder Prävention jeder Erkrankung oder Störung, die durch erhöhte Immunsuppression behandelbar ist. Der hierin verwendete Begriff Immunsuppression bezieht sich auf eine Regulation, typischerweise Herabregulation, des Immunsystems des Körpers durch Beeinflussung der Aktivität und Funktion der Zellen des Immunsystems auf eine Weise, die die unerwünschten schädlichen Wirkungen einer Immunreaktion verhindert. Beispiele für die Zielzellen des Verfahrens und der Zusammensetzungen der Erfindung sind Granulozyten (Neutrophile, Eosinophile, Basophile), NK-Zellen, T- und B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, Mastzellen und Antigen-präsentierende Zellen, wie dendritische Zellen, und deren Vorläuferzellen und spezifische funktionelle und phänotypische Untergruppen („subsets"). Am stärksten bevorzugt ist, dass die Zielzellen des Verfahrens und der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Zellen des angeborenen Immunsystems, wie Neutrophile und NK-Zellen, sind.
Es ist gut etabliert, dass die geeignete Funktion von Zellen des Immunsystems unerlässlich ist für die Abwehr bzw. das Überleben des Wirts gegenüber eindringenden Pathogenen, Parasiten und selbst physikalischen Gefahren (z. B. inhalierte mikroskopische Partikel), die in der Lebensumgebung gefunden werden. Normalerweise erkennen, isolieren und eliminieren Immunzellen lokal infektiöse/schädigende Mittel bzw. Agentien in einem gut abgestimmten Vorgang. Zu diesem Zweck sind die Immunzellen mit verschiedenen biochemischen Antwortmechanismen bewaffnet, die während der infektiösen Attacke aktiv werden. Zum Beispiel entfalten neutrophile Lymphozyten, Neutrophile, einen hoch spezifischen Enzymkomplex, das NADPH-Oxidasesystem, das, wenn es bei Zellaktivierung ausgelöst wird, dazu in der Lage ist, große Mengen an toxischen Sauerstoffmetaboliten zu erzeugen, die eine Anzahl schädigender Wirkungen gegenüber biologischem Material ausüben können und auch als proinflammatorische Signale für andere Zelltypen wirken können. Im Allgemeinen führt eine Lymphozytenaktivierung zu einer lokalen entzündlichen bzw. inflammatorischen Reaktion, die ein wesentlicher Teil der Immunreaktion des Wirts ist und die die Auflösung des infektiösen Angriffs fördert und den Heilungsvorgang initiiert. Falls jedoch normale Wirtsgewebe in unzweckmäßiger Weise als fremde oder geschädigte Strukturen identifiziert werden oder aufgrund der Hyperaktivierung des Immunsystems des Wirts, die mit einigen pathologischen Zuständen assoziiert ist, wird normales Gewebe durch Immunzellen angegriffen, die ihr volles zerstörerisches Potential gegen den Wirt selbst auslösen. Als Beispiele für derartige Zustande können Gruppen von Zuständen, wie lokale und systemische inflammatorische Erkrankungen, Autoimmunkrankheiten und allergische Zustande, genannt werden. Als Beispiele für spezifische Erkrankungen oder Störungen können Überempfindlichkeitsreaktionen, wie Kontaktüberempflindlichkeit oder Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ, genannt werden. Vorzugsweise ist der Zustand, der durch das Verfahren und die Zusammensetzungen dieser Erfindung behandelt oder verhindert werden kann, eine lokale oder systemische inflammatorische Reaktion, die die Aktivierung der bevorzugten Zielzellen involviert, wie entzündliche Zustände der Haut, einschließlich Psoriasis, akuter oder chronischer Dermatitis; entzündliche Zustande von mukösen Membranen oder des Bindegewebes der Mundhöhle, der Augen und Genitalien, wie Peridontitis, Konjunktivitis, Vaginitis; entzündliche Zustände von Brustdrüsen, einschließlich Masititis; oder ein beliebiger anderer lokaler oder systemischer Zustand, der eine anerkannte entzündliche Komponente in der Pathogenese oder dem Fortschreiten der Erkrankung manifestiert, wie Vaskulitis, akute Transplantatabstoßung, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung, Asthma, Reperfusionsschädigung und Sepsis, assoziiert mit Gewebeschädigung. Jedoch sind die Zustände, die gemäß dieser Erfindung behandelt oder verhindert werden können, nicht auf die voran stehend genannten Beispiele eingeschränkt.
Für den Zweck dieser Erfindung kann das pharmazeutisch annehmbare Mittel auf verschiedenen Wegen, entweder systemisch oder lokal, verabreicht werden. Die geeigneten Verabreichungsformen umfassen z. B. orale Formulierungen; parenterale Formulierungen, einschließlich intravenöser, intramuskulärer, intradermaler und subkutaner Injektionen; und mukosale, topische, transdermale, Inhalations-, nasale oder rektale Formulierungen. Besonders geeignete Formulierungen sind Formulierungen für eine lokale Abgabe, wie topische Formulierungen in Form von Salben, Gelen, Cremes, Pasten, Lösungen, Suspensionen, Lotionen und Emulsionen.
Die erforderliche Dosierung des pharmazeutisch annehmbaren Mittels wird mit dem speziellen Zustand, der behandelt wird, der Schwere des Zustandes, der Dauer der Behandlung, dem Verabreichungsweg und der spezifischen Verbindung, die eingesetzt wird, variieren. In einer topischen Formulierung kann die Menge der pharmazeutisch annehmbaren Säure typischerweise von 0,1 bis 10% reichen.
Die Erfindung wird im folgenden experimentellen Abschnitt im Detail beleuchtet.
EXPERIMENTELLER ABSCHNITT
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Bindung von radioaktiv markierter UCA in einer Modellzelle, dem Neutrophilen des humanen peripheren Bluts, bei dem eine Beeinflussung durch UCA gezeigt worden ist (Kivistö 1996), zu untersuchen. Anstatt in der Lage zu sein, eine typische Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung zu zeigen, haben wir festgestellt, dass UCA eine außerordentliche Bindungseigenschaft hat, die zu einer raschen und irreversiblen Akkumulation von intakter UCA in das Cytosol führt. Urocansäure ist eine UV-Strahlung absorbierende Substanz in der Säugerhaut. Die cis-UCA ist ein Immunsuppressivum in Tiermodellen in vivo, jedoch sind der/die Zielzelltyp(en) und Wirkungsweise(n) unklar geblieben. Wir untersuchten die Bindung und den Wirkort von UCA in lebenden humanen polymorphonukleären Neutrophilen, ein Immunzelltyp, dessen Funktion dafür bekannt ist, durch UCA beeinflusst zu werden, und der dafür bekannt ist, eine Hauptrolle bei inflammatorischen Reaktionen zu spielen. Wir beobachteten eine linear konzentrationsabhängige Akkumulation von radiomarkierter cis- und trans-UCA bis zu unerwartet hohen Inkubationskonzentrationen (≥ 30 ml), wobei sich beinahe 95% der zellgebundenen Fraktion im Cytosol konzentrieren. Da die Isomeren in einer ungebundenen und nicht-metabolisierten Form im Cytosol auftraten, stellten wir die Frage, ob UCA durch einen Mechanismus, der von einer herkömmlichen Rezeptor/Protein-Ligand-Wechselwirkung verschieden ist, wirken könnte. Die Isomeren beeinflussten den intrazellulären pH. FACS-Analysen zeigten, dass die Ansäuerung der intrazellulären Kompartimente von Neutrophilen durch cis-UCA bei extrazellulärem pH von 6,5 signifikant größer war als durch trans-UCA (p = 0,00031), wohingegen die Isomeren bei einem pH über dem Neutralpunkt nicht ansäuerten. Unter den gleichen Bedingungen bei pH 6,5 inhibierte cis-UCA die „respiratory burst"-Aktivität von Neutrophilen stärker als trans-UCA (p = 0,023). Die Stereospezifität dieses Typs könnte durch unähnliche pK_a-Werte der zwei Isomeren erklärt werden und wir schlagen ein Modell für cis-UCA-Wirkung durch intrazelluläre Ansäuerung vor. Wir folgern, dass cis-UCA die angeborene bzw. eigene Immunität mittels Inhibieren von Neutrophilen-Aktivierung und -Funktion durch intrazelluläre Ansäuerung in einem extrazellulären pH-Fenster von 6,1–7,0 supprimieren kann.
Methoden
Urocansäure und Synthese von [¹⁴C]-markierten Isomeren
Trans-Urocansäure (trans-UCA, 3-(1H)-Imidazol-4-yl)-2-propensäure) wurde von Sigma (St. Louis, MO, USA) erworben. Cis-UCA wurde aus trans-UCA mit UV-Photoisomerisierung (siehe unten) hergestellt. Die chemische Reinheit der UCA-Isomeren war über 99,7% gemäß Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC).
Die Synthese von mit [¹⁴C]-radioaktiv markierter trans- und cis-UCA ist in 1 dargelegt. Wir begannen die Synthese von [¹⁴C]-trans-UCA (6) durch Kondensieren von Formamidinacetat (1) und Dihydroxyaceton (2) in flüssigem Ammoniak unter Erhalt von (3), wobei die Verfahrensweise von Griffith et al. (1983) mit mehreren Modifikationen eingesetzt wurde. Nach Neutralisation von (3) zur freien Base (4) wurde es zu 4-Imdidazolcarbaldehyd (5) oxidiert (Lindgren et al., 1980). Eine Kondensation von (5) mit [2-¹⁴C]Malonsäure (Amersham Pharmacia, Little Chalfont, UK) unter Knoevenagel-Bedingungen unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens nach Morrison et al. (Mohammad 1991) ergab trans-UCA (6). Die Verbindung (6) (138 mg, 1 mmol) wurde in Wasser (500 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit festem Kaliumhydroxid auf pH 9 gebracht und dann unter Stickstoffatmosphäre bei 10°C für 4 h bestrahlt. Die Photoisomerisierung wurde in einem Normag-Fallfilm-Photoreaktor mit einer Hanau-Quarz-Quecksilber-Hochdrucklampe (500 W, 270–350 nm, Wasser als Lösungsmittel) durchgeführt. Das resultierende Gemisch (trans/cis ca. 30/70 gemäß HPLC) wurde bis zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in 12,5 mM Essigsäure gelöst. Diese Lösung wurde auf pH 9 eingestellt und an einer Ionenaustauschsäule (25 × 2,3 cm, 200–400 mesh, Acetatform, Bio-Rad 1-x8) chromatographiert, wobei 12,5 mM (500 ml), 25 mM (500 ml) und 100 mM (1000 ml) Essigsäure als aufeinanderfolgende Eluenten verwendet wurden. Cis-UCA erschien nach ca. 1100 ml und trans-UCA hauptsächlich nach 1300 ml Eluentenvolumen. Die Entfernung des Lösungsmittels aus den Fraktionen, gefolgt von Waschen mit Diethylether und Trocknung in vacuo bei 65°C über Phosphorpentoxid ergab reine [¹⁴C]trans- und [¹⁴C]cis-Isomere (6) und (7). Die Ausbeute an (6) aus der vorhergehenden Stufe betrug 35 mg (25%), Fp. 226°C. Die chemische Reinheit des Produkts (6) gemäß HPLC (siehe unten) betrug über 99,8% und die spezifische Aktivität betrug 2,2 mCi/mmol. Die entsprechende Ausbeute an (7) betrug 85 mg (58%), Fp. 176–178°C. Eine HPLC-Analyse zeigte an, dass das Material zu mehr als 99,5% chemisch rein war, mit einer spezifischen Aktivität von 5,8 mCi/mmol. Bei Verwendung in den Experimenten wurden radioaktiv markierte und nicht-markierte cis- und trans-Isomeren direkt in den Inkubationspuffern bis zu Konzentrationen von 100 mM bzw. 30 mM gelöst. Die Auflösung von trans-UCA wurde bei Bedarf durch sanftes Erwärmen in einem Wasserbad unterstützt.
HPLC Analyse von UCA
Eine Säule mit stationärer Aminopropylphase, Lichrosorb NH₂, Hibar RT, 250 × 4 mm, 5 μm (Merck, Darmstadt, Deutschland), wurde verwendet. Der Eluent war ein 50% (V/V)-Gemisch von Acetonitril und einer Lösung von 2% (V/V) Essigsäure und 0,5% (G/V) Ammoniumacetat in Wasser (pH ca. 5). Die Isomeren wurden bei 268 nm detektiert und die Retentionszeiten betrugen T_r(cis) 3,7 min und T_r(trans) 5,4 min.
Szintillationszählung
Proben wurden mit OptiPhase HiSafe2-Szintillationsflüssigkeit (EG&G Wallac, Turku, Finnland) gemischt und die [¹⁴C]UCA-Radioaktivität wurde in einem RackBeta 1214-Szintillationszähler (EG&G Wallac) gemessen. Die Zähleffizienz betrug 96,7% ± 0,12% (Mittelwert ± SEM, n = 48).
Reinigung von Neutrophilen
Neutrophile des peripheren Bluts wurden aus heparinisiertem Blut oder Leukozytenfilmen von gesunden Spender isoliert. Erythrozyten wurden mit 6% Dextran T-500 (Pharmacia, Schweden) sedimentiert. Neutrophile wurden mittels Zentrifugation an Ficoll-Hypaque (Phar macia) aus dem Leukozyten-reichen Dextranplasma abgetrennt, mittels hypotonischer Lyse von verbleibenden Erythrozyten gereinigt und mit Ca- und Mg-freiem HBSS gewaschen. Für die intrazellulären pH-Experimente wurden Neutrophile ohne Erythrozytenlyse hergestellt. Die Zellen, Medien und Zentrifugen wurden während der Zellpräparation auf Raumtemperatur gehalten, um Temperaturschwankungen zu vermeiden. Gemäß Durchflusscytometrieanalyse waren 99,6% der abgetrennten Neutrophilen Zellen vom Typ CD11⁺/CD35⁺, 98% CD45⁺, 98% CD26L⁺/CD32⁺, 2,0% HLA-DR⁺, 2,1% CD3⁺, 1,0% CD8⁺, 1,2% CD4⁺ und 0,8% CD14+.
Assay auf „respiratory barst" Aktivität
Die „respiratory barst"-Aktivität wurde als ein Maß für die Neutrophilenfunktion verwendet. Die UCA-Isomeren wurden in einem Chemilumineszenzassay mit opsonisiertem Zymosam getestet, wie beschrieben (Kivistö et al. 1996). Die Spitzen- bzw. Peakwerte wurden aufgezeichnet.
Ganzzell-Bindungsassays
Isolierte Neutrophile wurden in HBSS, pH 7,4, zu 2–10 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Die [¹⁴C]cis- oder [¹⁴C]trans-UCA-Stammlösungen wurden zugegeben um einen Konzentrationsbereich von 0,1 μM-30 mM zu ergeben und die Röhrchen, in doppelter Wiederholung, wurden bei 4°C (oder bei 25°C und 37°C) für 30 min inkubiert. Die Zellen wurden anschließend einmal mit eiskalter HBSS gewaschen und in Flüssigkeits-Szintillationsfläschchen transferiert. Die Gesamt-[¹⁴C]UCA-Aktivität in den Inkubationsröhrchen wurde bestimmt durch Messen von Proben von jeder Standardkonzentration und Szintillationsleerwerte ("blank scintillation values") wurden vor der Datenanalyse abgezogen. Einige Bindungsexperimente wurden wie angegeben in 50 mM Natriumcitrat-/120 mM NaCl-Puffer, pH 6,5, durchgeführt, wobei der gleiche Puffer in den Waschstufen verwendet wurde.
Präparation von Cytosol- und Membranfraktionen von Neutrophilen
Die Lokalisierung der zellgebundenen UCA in Membran, Cytosol und Nucleus wurde nach der Inkubation von ganzen Zellen mit [¹⁴C]cis-UCA, wie oben beschrieben, untersucht. Nach Waschen mit HBSS wurden die Zellen in eiskaltem Lysepuffer, enthaltend 10 mM Pipes, 10 nM KCl, 3 mM NaCl, 4 mM MgCl₂, pH 7,0, supplementiert mit 0,5 mM PMSF, 10 μM Leupeptin und 10 μM Pepstatin A (alle von Sigma) als Proteinaseinhibitoren, suspendiert (200 × 10⁶ Zellen/ml). Die Zellmembranen wurden mittels (Ultra)Schallbehandlung auf Eis aufgebrochen. Das Lysat wurde zentrifugiert (800 × g, 25°C, 10 min) und der post-nukleäre Überstand („post-nuclear supernatant") wurde auf diskontinuierliche Polster- bzw. Kissen („discontinuous cushions") aus Saccharose in Lysepuffer geschichtet. Nach Ultrazentrifugation (120.000 × g, 4°C, 45 min) wurden die Cytosol-, Membran- und Nuclei-Debris-Fraktionen durch vorsichtiges Pipettieren gewonnen und die [¹⁴C]-Aktivität wurde gemessen.
Gelfiltration von Neutrophilencytosol
Zur Makrofraktionierung von Cytosolproteinen wurde die Probe (0,5–2,5 ml) bei 4°C auf die äquilibrierte Gelfiltrationssäule vom Typ Sephacryl S-200 (Pharmacia) aufgebracht und die Proteine wurden mit PBS, pH 7,0, bei einer Flussrate von etwa 0,6 ml/min eluiert. Die Flution von Proteinen wurde mit einem Durchfluss-UV-Überwachungsgerät bei 254 nm und einem potentiometrischen Aufzeichnungsgerät verfolgt. Ein typischer Lauf bestand aus dreißig 6 ml-Fraktionen und dauerte beinahe sechs Stunden. Die Elutionsvolumina von Proteinen unterschiedlicher Molekulargewichte wurden mit einem Cocktail von Standardproteinen und -peptiden von 0,6–2000 kDa Größe bestimmt.
Proteinkonzentrationsassay
Die Proteinkonzentration wurde mit einem Proteinassay von Bio-Rad (München, Deutschland) unter Verwendung von Rinderalbumin als Standard bestimmt.
Überwachung des intrazellulären pHs
Intrazelluläre pH-Level in Neutrophilen wurden mit Durchflusscytometrie überwacht, wobei ein pH-empfindlicher Fluoreszenzfarbstoff, 2',7'-Bis(2-carboxyethyl)-5-(und-6)-carboxyfluorescein (BCECF, Acetoxymethylester; Molecular Probes, Leiden, Niederlande) eingesetzt wurde. Etwa 30 × 10⁶ Zellen wurden in 10 ml HBSS, pH 7,4, enthaltend 0,35 μM BCECF, bei 25°C für 30 min inkubiert, zweimal in HBSS gewaschen und in 1 ml 154 mM NaCl resuspendiert. Aliquote (235 μl) des Inkubationsmediums mit bekannten UCA-Konzentrationen und überprüftem pH wurden auf die Zellen (4,5 × 10⁵ Zellen/15 μl NaCl) in Polystyrolröhrchen aufgebracht bzw. angewendet, bei 25°C für etwa 20 min inkubiert und in einem Durchflusscytometer analysiert.
Die Kalibration des intrazellulären pHs wurde in situ unter Verwendung des K⁺/H⁺Ionophors Nigericin durchgeführt. Ein Überschuss an pH-Kalibrationspuffern (10 mM Pipes, 131 mM KCl, pH eingestellt auf 6,10, 6,50, 6,80, 7,10, 7,40 und 7,60 oder 7,70) und 10 μM Nigericin wurde zu den BCECF-markierten Zellen in 154 mM NaCl gegeben. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur gehalten und mittels Durchflusscytometrie innerhalb von 45 min analysiert. Mit oder ohne UCA inkubierte Zellen wurden simultan auf den intrazellulären pH analysiert. Der pH wurde auf die gleichen Werte eingestellt, wie jene in den Kalibrationspuffern. Der intrazelluläre pH wurde aus einer BCECF-Fluoreszenz-Intensitäts-Kalibrationskurve bestimmt.
Statistische Analyse
Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM angegeben worden. Die statistische Signifikanz von Daten in den Bindungsstudien und funktionellen Tests wurde mittels des zweiseitigen Student-t-Tests berechnet. Die Pearson-Korrelationskoeffizienten wurden für UCA-Isomerkonzentrationen, detektiert mittels HPLC und Szintillationszählung von Zellproben, bestimmt. Die p-Werte für die Korrelation wurden nach Fisher-Z-Transformation bestimmt.
Ergebnisse
UCA akkumuliert im Neutrophilen-Cytosol
Radioaktive, [¹⁴C]-markierte UCA-Isomere wurden synthetisiert, um die Bindung von UCA an isolierte Neutrophile aus dem humanen peripheren Blut zu untersuchen. Die Zellen, inkubiert mit UCA im HBSS bei 4°C für 30 min, nahmen beide Isomere in einer linearen dosis abhängigen Weise über den untersuchten Konzentrationsbereich von 100 nM bis 30 mM auf (2). Der Anteil der Gesamtbindung betrug 4,5% ± 1,1% (Bereich 2,9–6,6%) für cis-UCA und 7,1% ± 3,2% (Bereich 3,7–17%) für trans-UCA (n = 12 Messungen in doppelter Wiederholung für beide Isomere). Ein interessantes Merkmal dieser Aufnahme war, dass wir nicht dazu in der Lage waren, eine Verdrängung der radioaktiven [¹⁴C]UCA-Markierung durch nichtmarkierte („kalte") UCA zu zeigen, wie man sie bei einer herkömmlichen Ligand-Rezeptor-Bindung erwarten würde (3).
Um die Verteilung der zellgebundenen UCA in den Cytosol-, Zellmembran- und Kernkompartimenten zu untersuchen, wurden die Zellen zuerst mit radioaktiv markierter UCA wie oben inkubiert und sie wurden anschließend lysiert und an 120.000 × g Saccharose-Kissen ("sucrose cussions") fraktioniert. Die Inhalte der Ultrazentrifugenröhrchen wurden in cytosolische, Membran- und Kernfraktionen aufgeteilt. Das Volumen jeder Fraktion wurde genau bestimmt. Anschließend wurde die [¹⁴C]UCA-Aktivität in Aliquoten der Fraktionen gemessen und der Gesamt-UCA-Gehalt wurde für jede Fraktion berechnet. Unabhängige Inkubationsexperimente (n = 4) zeigten, dass 92,0% ± 2,2% der von Neutrophilen aufgenommenen cis-UCA im Cytosol (wieder)gewonnen wurde (4A). Die Bindung an Membranen (Mittelwert 2,7% ± 1,8%) war signifikant niedriger als das, was im Cytosol gefunden wurde (p = 3,7 × 10^–5). Die verbleibende zellgebundene cis-UCA (5,3% ± 2,1%) wurde in der Kern-(und möglicherweise nicht-lysierten Zell-)Fraktion des Zelllysats detektiert (4A).
UCA ist nicht an cytosolische Proteine gebunden
Da der Großteil der UCA, die in die Zellen inkorporierte bzw. in die Zellen aufgenommen wurde, im Cytosol auftrat, bestimmten wir, ob die cytosolische UCA an molekulare Komponenten des Neutrophilencytosols gebunden war. Cytosol von mit [¹⁴C]UCA vorinkubierten Zellen wurde mit Saccharose-Ultrazentrifugation abgetrennt und in eine S-200-Gelfiltrationssäule eingebracht. Anschließend wurden Cytosolfraktionen gesammelt und die Radioaktivität wurde in jeder Fraktion gemessen. Wie in 5A und 5B gezeigt wurde, wurde [¹⁴C]-Aktivität in Fraktionen mit niederem Molekulargewicht gefunden, die kein detektierbares Protein enthielten. Dieses Elutionsmuster war identisch zu einem Lauf, bei dem [14C]cis-UCA alleine auf die Gelfiltrationssäule aufgebracht wurde (5C), was nahe legt, dass UCA nicht an irgendeine große bzw. bedeutende lösliche Proteinfraktion im Neutrophilen-Cytosol gebunden ist.
Ein zusätzlicher Markierungstest nach der Lyse wurde durchgeführt, um die Ergebnisse aus den Experimenten mit mit [¹⁴C]UCA vorinkubierten Zellen zu verifizieren. In diesem Test wurde nicht-markiertes Neutrophilencytosol wie beschrieben abgetrennt und Aliquote des Cytosols wurden anschließend mit 5 mM cis- oder trans-[¹⁴C]UCA über Nacht auf Eis inkubiert. Das Cytosol wurde anschließend an S-200 fraktioniert. Es wurde keine Protein-assoziierte [¹⁴C]UCA-Aktivität beobachtet und Elutionsprofile, ähnlich zur Inkubation vor der Lyse, wurden aufgezeichnet. Somit wurde gezeigt, dass die löslichen Hauptproteinfraktionen im Neutrophilen-Cytosol nicht dazu in der Lage waren, akkumulierte UCA vor und nach Zelllyse zu binden.
UCA bleibt im Neutrophilen-Cytosol intakt
Als Nächstes untersuchten wir, ob die [¹⁴C]UCA im Cytosol durch Neutrophile nach der Aufnahme metabolisiert wurde, indem bestimmt wurde, wie viel der radioaktiven Markierung mit intakter UCA assoziiert war. Dies wurde durchgeführt, indem die cytosolischen Proteine von [¹⁴C]UCA-markierten Neutrophilen mit 10% Trichloressigsäure (TCA) auf Eis über Nacht präzipitiert bzw. gefällt wurden. Die Menge an radioaktiver Markierung wurde anschließend sowohl im Präzipitat als auch im proteinfreien Überstand mittels Szintillationszählung gemessen und der Gehalt an intakter UCA im Überstand mittels HPLC. Die gesamte [¹⁴C]UCA-Aktivität wurde im Überstand gefunden, wobei die Wiederfindung 102% ± 3,9% (n = 9) für cis-UCA und 100,2% ± 0,9% (n = 4) für trans-UCA betrug, wenn die Radioaktivität im Cytosol sofort nach der Zugabe von TCA und nach Auszentrifugieren des Proteinpräzipitats verglichen wurde. Im Proteinpellet wurde keine Radioaktivität gefunden. Wichtiger, die chromatographisch bestimmten Konzentrationen an intakter cis- und trans-UCA korrelierten mit Konzentrationen, die mittels Szintillationszählung in den gleichen Proben erhalten wurden (6), was anzeigt, dass UCA-Isomeren im Neutrophilen-Cytosol nicht metabolisiert wurden. In Zellen, die nicht mit UCA-Isomeren vorbehandelt wurden, konnte keine endogene UCA mittels HPLC-Analyse gefunden werden (Daten nicht gezeigt).
UCA senkt den extrazellulären und intrazellulären pH
Die bislang beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass UCA anstelle sich wie ein typischer Zelloberflächenrezeptor-Agonist zu verhalten, in hohen Konzentrationen im Inneren eines Neutrophilen akkumuliert, wo es weder an lösliche intrazelluläre Proteine gebunden noch einem signifikanten Metabolismus unterworfen ist. Als solche ähnelt UCA kleinen Ionen (z. B. K⁺, Na⁺, H⁺, Cl^–), die in die Zelle gelangen und Zellfunktionen modulieren, indem sie die physikalischchemische Mikroumgebung (pH, Ionenpotential, Ionenstärke) des Cytosols verändern. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass hohe Level bzw. Konzentrationen an intakter UCA zelluläre Änderungen einfach aufgrund ihrer passiven Präsenz im Cytosol als eine Säure provozieren können. Die pk_a-Werte sind für trans-UCA um 4,0 und 6,1 (Roberts et al. 1982, Krien & Kermici 2000) und 3,3 und 7,0 für cis-UCA (Roberts et al. 1982), so dass die Ansäuerung des Cytosols bei physiologischem pH eine mögliche Wirkweise sein könnte. Eine derartige Möglichkeit wurde durch Testen der Wirkung von UCA auf den pH zuerst in einer Pufferlösung und anschließend in intakten Zellen angegangen. Die Isomere senkten den pH in einem Standard-PBS-Puffer, pH 7,0, auf eine dosisabhängige Weise bei Konzentrationen über 1 mM (7A). Wenn UCA-Isomeren in HBSS-Puffer, pH 7,4, gegeben wurden, verringerten Konzentrationen über 1 mM wiederum den pH dosisabhängig (7B). Wenn der pH der HBSS-Pufferlösung vor UCA-Zugabe auf 6,0 eingestellt wurde, d. h. unter den zweiten pK_a von cis-UCA, war interessan terweise nur trans-UCA dazu in der Lage, den pH merklich zu veringern (7B), was nahe legt, dass cis-UCA bei diesem pH nur teilweise deprotoniert ist.
Um die Wirkung von UCA auf den intrazellulären pH zu testen, wurden Neutrophile mit dem fluoreszierenden pH-Indikatorfarbstoff BCECF beladen und die Fluoreszenz von UCA-behandelten Zellen wurde mit FACS gemessen. Wie die oben stehenden Daten anzeigen, kann UCA selbst den pH der Testlösung in Abhängigkeit vom Isomer und vom anfänglichen pH der Lösung senken. Andererseits ist es gut bekannt, dass der intrazelluläre pH durch den pH der Umgebung beeinflusst wird. Um das Artefakt, dass die Ansäuerung der Testlösung durch UCA-Zugabe die intrazelluläre BCECF-Fluoreszenz beeinflussen könnte, zu vermeiden, stellten wir daher den pH der Testlösung nach der Zugabe von UCA auf den ursprünglichen pH zurück. Unter diesen pH-kontrollierten Bedingungen hatten 3 mM trans- und cis-UCA keine signfikante Wirkung auf das intrazelluläre BCECF-Signal bei pH 7,4 (8A, untere Balken). Wenn der pH auf 6,5 eingestellt wurde, verursachte cis-UCA im Gegensatz dazu eine signifikante Verringerung um 15% ± 4,0% (p = 0,022, n = 4, gepaarter t-Test) im Fluoreszenzsignal als eine Anzeige der cytosolischen Aassäuerung (8A, obere Balken). 8 zeigt Daten aus drei unabhängigen Experimenten, wobei gleichzeitig BCECF-Signale und die „respiratory burst"-Aktivität der Zellen (siehe unten) gemessen wurden. Ein viertes Experiment wurde lediglich hinsichtlich der Messung der intrazellulären BCECF-Fluoreszenz durchgeführt. Auch trans-UCA senkte das Fluoreszenzsignal signifikant um 9,4% ± 4,1% bei pH 6,5 (p = 0,032, n = 4), aber die Wirkung war weniger ausgeprägt. Jedoch war der Unterschied hinsichtlich der proportionalen BCECF-Fluoreszenzverringerung zwischen 3 mM cis-UCA und trans-UCA hoch signifikant (p = 0,00031, n = 4) (8A, obere Balken).
Um eine spezifischere Darstellung der Fähigkeit von cis-UCA, das Cytosol anzusäuern, zu erhalten, wurde der genaue intrazelluläre pH durch Verwendung des K⁺/H⁺-Ionophors Nigericin bestimmt. Eine Inkubation von Neutrophilen mit UCA in gepufferten Lösungen mehrerer pH-Werte im Bereich von 6,1–7,7 zeigte, dass 3 mM cis-UCA den intrazellulären pH auf Dosis- und von extrazellulärem pH abhängige Weise unter pH 7 senkt, wohingegen trans-UCA nur eine geringe Wirkung besitzt (9). Die 0,3 mM-Konzentration von cis-UCA hatte eine viel kleinere Wirkung im gleichen pH-Bereich (nicht gezeigt).
UCA inhibiert den „respiratory burst" von Neutrophilen stereospezifisch und pH-abhängig.
Die oben gezeigten Daten legen nahe, dass in einer leicht sauren Umgebung nur cis-UCA dazu in der Lage ist, den cytosolischen pH merklich zu senken, während weder das trans- noch das cis-Isomere irgendeine Wirkung bei physiologischem pH hatten. Um zu untersuchen, wie die Cytosol-ansäuernde Wirkung von UCA mit der früher beschriebenen Inhibierung der „respiratory burst"-Aktivität von Neutrophilen korreliert, haben wir die Wirkung von 3 mM UCA auf die mit opsonisiertem Zymosan induzierte Chemilumineszenz mittels der gleichen Charge von Neutrophilen und unter den gleichen Versuchsbedingungen wie oben beschrieben gemessen, d. h. wenn der pH der Testlösung nach UCA-Zugabe auf seinen Anfangslevel zurückgestellt wurde. Wie in 8B gezeigt, hatte trans-UCA keine Wirkung auf die Chemilumineszenz bei pH 7,4, wohingegen eine Inhibierung von 14% ± 4,0% (n = 3) bei pH 6,5 beobachtet wurde. Unter den gleichen Bedingungen supprimierte cis-UCA die „respiratory burst"-Aktivität um 15% ± 8,4% bzw. 44% ± 1,3%. Wenn der pH der Testlösung nach UCA-Supplementierung uneingestellt gelassen wurde, inhibierte trans-UCA interessanterweise die Chemilumineszenz um 31% ± 8,4% und 48% ± 4,0% bei pH 6,22 ± 0,02 (nomineller pH 7,4) bzw. 5,87 ± 0,06 (nomineller pH 6,5). Die entsprechenden Inhibierungen für cis-UCA betrugen 41% ± 10% bei pH 6,60 ± 0,02 (nomineller pH 7,4) und 48% ± 1,6% bei pH 6,33 ± 0,07 (nomineller pH 6,5).
Wenn die erhaltenen „respiratory burst"-Antwortdaten gegen den gemessenen pH im Inkubationsmedium aufgetragen werden, ist offensichtlich, dass die Senkung bzw. Verringerung des extrazellulären pHs die „respiratory burst"-Aktivität in Gegenwart von 3 mM UCA supprimiert (8C). Das Diagramm zeigt auch, dass cis-UCA eine bedeutendere inhibitorische Aktivität auf die Zellen im extrazellulären pH-Bereich 6,1–7,0 besitzt als trans-UCA, wohingegen bei einem pH über 7 kein Unterschied festgestellt werden kann. Wenn die „respiratory burst"-Aktivität als Funktion der jeweiligen intrazellulären BCECF-Fluoreszenz in den gleichen Zellen berechnet wird, kann beobachtet werden, dass die Suppression der „respiratory burst"-Aktivität mit der Abnahme des intrazellulären pHs, die durch UCA-Isomere entweder durch extrazelluläre oder intrazelluläre Ansäuerung erzeugt wird, zusammenhängt (8D).
Schlussfolgerungen
Da UCA eine schwache organische Säure ist, könnte die Akkumulation von UCA im Inneren der Zelle den cytosolischen pH regulieren. Dies hängt jedoch in großem Umfang vom Protonierungsstatus der hereingelangenden UCA-Moleküle ab. UCA ist eine mehrprotonige Säure mit zwei Protonen-spendenden Gruppierungen, der Carboxylgruppe und der Imidazolylgruppe. Der PK_a der Carboxylgruppe beträgt 4,0 für trans-UCA und 3,3 für cis-UCA (Roberts 1982), woraus folgt, dass praktisch alle UCA-Moleküle gemäß der Henderson-Hasselbalch-Gleichung (H-H-Gl.) an der Carboxylgruppe bei einem pH über 4 deprotoniert sind. Beim physiologischen pH-Bereich bestimmt daher der Protonierungsstatus der Imidazolylgruppe alleine, ob das Molekül dazu in der Lage ist, ein Proton abzugeben und dadurch eine Ansäuerung zu fördern. Der Imidazolyl-pK_a von trans-UCA beträgt 6,1 (Roberts et al. 1982, Krien & Kermici 2000), während er für cis-UCA merklich höher ist, 7,0, möglicherweise aufgrund der stabilisierten tautomeren Form des cis-Isomeren, verursacht durch intramolekulare Wasserstoffbrückenbindung zwischen den Carboxyl- und Imidazolylgruppierungen (Roberts 1982). Folglich begünstigt die Imidazolylgruppe von cis-UCA nur bei pH 7,0 und darüber die Deprotonierung, während trans-UCA beim gleichen pH beinahe vollständig deprotoniert ist. In der vorliegenden Studie konnte dies eindeutig durch ein Experiment gezeigt werden, bei dem die Zugabe von trans-UCA in HBSS-Puffer, eingestellt auf pH 6,5, den pH senkte, während cis-UCA fast keine Wirkung hatte.
Es kann die Hypothese aufgestellt werden, dass die Fähigkeit von UCA, das Cytosol in lebenden Zellen anzusäuern, von zwei Hauptparametern abhängt: dem pH des extrazellulären Raums und dem Anfangs-pH des Cytosols. Da UCA hauptsächlich in der Haut gefunden wird, sollte man diese zwei Parameter im Kontext der physiologischen Umgebung berücksichtigen. Es ist gut bekannt, dass die menschliche Haut einen Säure(Schutz)-Mantel mit einem OberflächenpH um 4–6 besitzt. Wenn das Stratum corneum Schicht um Schicht abgenommen wird, steigt der pH allmählich und nach vollständiger Entfernung des Stratum corneum beträgt der pH in der verbleibenden Epidermis etwa 6,9 (Öhmann & Vahlquist, 1994). In tieferen Schichten wird der fast neutrale pH des Körperinneren („interior body") erreicht. Eine vor kurzem erstellte Analyse liefert Beweise dahingehend, dass UCA der hauptsächliche pH-regulierende Faktor im menschlichen Stratum corneum ist (Krien & Kermici 2000). Die Hauptmenge an UCA sitzt im Stratum corneum; jedoch diffundiert eine signifikante Menge an UCA in und offensichtlich auch durch die (Epi)Dermis, da erhöhte Level an cis-UCA innerhalb von 1–4 h nach Ganzkörper-UVB-Exposition im Urin detektiert werden können (Kammayer et al. 1997). Hinsichtlich der intrazellulären Umgebung ist der pH im Cytosol von ruhenden Neutrophilen 7,0–7,4, d. h. über dem Imidazolyl-pK_a, was nahe legt, dass beide UCA-Isomere im Neutrophilen-Cytosol hauptsächlich in deprotoniertem Zustand vorliegen. Bei einem extrazellulären pH über dem Imidazolyl-pK_a (6,1 für trans-UCA und 7,0 für cis-UCA) wäre die Mehrheit der UCA-Moleküle in der deprotonierten Form und es würde keine signifikante Ansäuerung nach Eintritt ins Cytosol erfolgen. Im Gegensatz dazu wäre UCA bei einem pH unter dem Imidazolyl-pK_a hauptsächlich in der protonierten Form und bei Eintritt in die Zelle dazu befähigt, eine Cytosolansäuerung zu fördern. Darüber hinaus kann gemäß der H-H-Gl. die Vermutung aufgestellt werden, dass die Menge an UCA-assoziierten Protonen und somit die Verringerung des cytosolischen pHs direkt proportional zur Transmembranen-pH-Differenz zwischen dem Cytosol und der sauren extrazellulären Umgebung sein würden. Um weitere experimentelle Belege für diese Hypothesen zu liefern, maßen wir die Änderung des cytosolischen pHs in UCA-behandelten Zellen. Wenn der extrazelluläre pH im Inkubationsgemisch strikt auf 7,4 kontrolliert bzw. eingeregelt wurde, d. h. über dem pK_a der Imidazolylgruppe von beiden UCA-Isomeren, wurde keine Ansäuerung festgestellt, wie man erwarten konnte. Andererseits senkte cis-UCA mit einem Imidazolyl-pK_a von 7,0 bei einem kontrollierten pH von 6,5 den cytosolischen pH deutlich, während trans-UCA (pk_a 6,1) nur eine geringe Wirkung besaß. Dies war auch ausgehend von einer Berechnung unter Verwendung der H-H-Gleichung vorherzusagen: bei pH 6,5 ist über 70% der cis-UCA im protonierten und 70% der trans-UCA im deprotonierten Zustand. Theoretisch würde uns die Senkung des extrazellulären pHs unter 6,1 ermöglicht haben, einen trans-UCA induzierten Abfall des cytosolischen pHs zu detektieren, jedoch war es nicht möglich, dies mit dem BCECF-Farbstoff zu testen, und zwar aufgrund von dessen beschränktem pH-Arbeitsbereich. Zusammengenommen ist offensichtlich, dass cis-UCA bei leicht saurer Umgebung, wie in den oberen lebensfähigen Schichten der Epidermis, tatsächlich als ein Protonentransporter wirken kann, um den cytosoli schen pH zu verringern. Diese einzigartige Eigenschaft von UCA rührt aus einer Verschiebung im Imidazolyl-pK_a, bewirkt durch eine veränderte Raumstruktur von UCA nach trans-zu-cis-Photoisomerisierung, her.
Es gibt keine früheren Daten in der wissenschaftlichen und Patentliteratur, die nahe legen, dass UCA-Zubereitungen bei dem pH-Bereich, der in der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen wird, formuliert werden sollten. Im U.S. Patent 5,494,676 von Stab et al. wurde beschrieben, dass die Photoisomerisierungsreaktion von 1% trans-UCA in einer wässrigen Lösung durchgeführt wurde, wobei der pH vor der Bestrahlung mit einer UV-Lampe mit NaOH auf 6,9 eingestellt wurde. Diese Lösung, die gleiche Mengen an trans-UCA und cis-UCA enthielt, wurde anschließend verwendet, um topische Ö/W-Cremeformulierungen zuzubereiten. Jedoch war der pH der topischen Zubereitungen nicht pH-eingestellt, noch auf den bevorzugten pH-Bereich der vorliegenden Erfindung pH-gepuffert.
In der Schlussfolgerung zeigt die vorliegende Studie Daten, die erstmalig die stereospezifische Wirkung von UCA auf Immunzellen in vivo erklären. Paradoxerweise scheint eine Modulation der Zellfunktion durch UCA nicht direkt von der Stereoisomerie abzuhängen, sondern vielmehr von einer geringfügigen, aber kritischen Änderung der Säure-Base-Eigenschaften des Moleküls nach Photokonversion von der trans- zur cis-UCA.
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele weiter erhellt.
BEISPIELE FÜR FORMULIERUNGEN GEMÄSS DER ERFINDUNG

Gelzusammensetzung 1 (% G/G)

cis-Urocansäure	0,1–10
Carbopol 974	1,5
Propylenglykol	12,5
Pufferrades Mittel	0,01–1
Gereinigtes Wasser auf	100

Gelzusammensetzung 2 (% G/G)

cis-Urocansäure	0,1–10
Natrosol (Hydroxyethylcellulose)	1,0
Puffernades Mittel	0,01–1
Gereinigtes Wasser auf	100

Cremezusammensetzung 1 (% G/G)

cis-Urocansäure	0,1–10
Propylenglykol	50
Cetostearylalkohol	15
Natriumlaurylsulfat	1
Pufferndes Mittel	0,01–1
Gereinigtes Wasser auf	100

Cremezusammensetzung 2 (% G/G)

cis-Urocansäure	0,1–10
Cetostearylalkohol	6,75
Propylenglykol	40
Natriumlaurylsulfat	0,75
Poloxamer 407	1
Mineralöl	5
Zähes Petrolatum 12.	5
Pufferndes Mittel	0,01–1
Gereinigtes Wasser auf	100

Salbenzusammensetzung (% G/G)

cis-Urocansäure	0,1–10
Mineralöl	5
Pufferndes Mittel	0,01–1
Petrolatum auf	100

Es wird eingesehen werden, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung in Form einer Vielzahl von Ausführungsformen eingebaut werden können, von denen nur einige hierin offenbart sind. Es wird für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass andere Ausführungsformen existieren und nicht vom Geist der Erfindung abweichen. Somit sind die beschriebenen Ausführungsformen erläuternd und sollten nicht als einschränkend ausgelegt werden.
LITERATURVERWEISE

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Wille, J.J. A.F. Kydonieus und G.F. Murphy. 1999. Cis-urocanic acid induces mast cell degranulation and release of preformed TNF-alpha: A possible mechanism linking UVB and cis-urocanic acid to immunosuppression of contact hypersensitivity. Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 12: 18.

Claims

Verwendung eines pharmazeutisch annehmbaren Mittels oder Salzes davon, das in der Lage ist, das Zellzytoplasma anzusäuern, wobei das Mittel eine Säure ist, deren Dissoziationskonstante im Bereich von 6,7 bis 7,4 liegt, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Immunsuppression beim Menschen oder Tier verwendbar ist, worin eine wirksame Menge des Mittels in einer im Wesentlichen nicht dissoziierten Form dem Menschen oder Tier verabreicht wird, worin das Mittel mit einem Träger, der den pH der Zusammensetzung auf den pH-Bereich 6,1 bis 7,0 einstellt, vermischt wird, und worin die Menge des Mittels im Bereich von 0,1 bis 10% liegt.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Mittel eine Säure ist, welche ihre Dissoziationskonstante im Bereich von 6,9 bis 7,3, am meisten bevorzugt etwa 7,0 hat.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Mittel cis-Urocansäure ist und worin der Träger den pH der Zusammensetzung auf 6,5 bis 7,0 einstellen kann.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung oder Störung, die durch Immunsuppression behandelbar ist.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die Erkrankung oder Störung eine lokale oder systemische entzündliche Erkrankung, eine Autoimmunerkrankung oder ein allergischer Zustand ist.
Verwendung nach Anspruch 5, worin die Erkrankung oder Störung eine lokale oder systemische inflammatorische Reaktion, am meisten bevorzugt eine inflammatorische Reaktion ist, welche die Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems involviert, wie eine Kontakthypersensitivität oder Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ, akute Transplantatabstoßung, Psoriasis, Dermatitis, Periodontitis, Mastitis oder Vasculitits.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Mittel systemisch oder lokal, vorzugsweise lokal, am meisten bevorzugt topisch, verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als aktives Mittel ein pharmazeutisch annehmbares Mittel oder Salz davon, das in der Lage ist, das Zellzytoplasma anzusäuern, wobei das Mittel eine Säure ist, die ihre Dissoziationskonstante im Bereich von 6,7 bis 7,4 hat, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, der das Mittel daran hindert, bei extrazellulären pH-Werten zu dissoziieren, und der in der Lage ist, den pH der Zusammensetzung im Bereich von 6,1 bis 7,0 zu halten, und worin die Menge des Mittels im Bereich von 0,1 bis 10% liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin das Mittel eine Säure ist, deren Dissoziationskonstante im Bereich von 6,9 bis 7,3, am meisten bevorzugt etwa 7,0 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, worin das Mittel cis-Urocansäure ist und worin der Träger den pH der Zusammensetzung in dem Bereich von 6,5 bis 7,0 halten kann.