JP4825680B2 - ヒトにおいて細胞増殖を抑制または停止するための細胞の細胞質を酸性化することができるウロカニン酸の使用 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトまたは動物において、細胞の細胞質を酸性化し、続いて細胞、特に腫瘍または他の過剰増殖している形質転換細胞もしくは非形質転換細胞の増殖を実質的に抑制または停止するための、ウロカニン酸または別の薬理学的に許容され得る薬剤の使用に関し、また、癌ならびに細胞の成長および増殖を停止させることにより治癒可能な過剰増殖性疾患の治療または予防に関する。

本発明の背景を説明するために本明細書で使用する刊行物および他の資料、および特に、実施に関するさらなる詳細を提供するための事例は、引用により本明細書に組み込まれる。

正常細胞および形質転換細胞の双方における多くの細胞機能は、細胞内ｐＨの維持と関連している。いろいろな研究者らにより、最近、癌細胞の増殖活性が、細胞サイトゾルを酸性化することができる薬剤によって調節され得ることが示された（Cosentiniら2001、Wahlら2002、Thangarajuら1999）。また、細胞内酸性化は、アポトーシスすなわちプログラムされた細胞死のカスケードを活性化する（Gottliebら1996、Matsuyamaら2000）。酸性化は、ＤＮＡ断片化を引き起こす酸性エンドヌクレアーゼおよびセラミドを産生する酸性スフィンゴミエリナーゼなどの重要なアポトーシス誘導酵素に影響を与えると仮定されている（Gottliebら1996）。このため、細胞増殖活性およびアポトーシスの制御は、癌への薬理学的介入のための有望なアプローチであると確認されている（Losら2003に概説）。腫瘍床において、生存能力のある腫瘍細胞のサイトゾル内ｐＨは、典型的には、中性付近に維持されて増殖が促進されるが、細胞外微環境は、細胞代謝産物によって酸性化されている（YamagataおよびTannock1996）。

本発明の発明者らは、ウロカニン酸（ＵＣＡ）のこれまでに知られていない性質を明らかにした。本発明者らにより、予期せずして、ＵＣＡが悪性細胞および非悪性細胞のサイトゾル内に、サイトゾル内でプロトンを放出することができる形態で移動することが示された。続いて、細胞質は酸性化され（ｐＨが低下する）、さらにその結果として、正常細胞または異常細胞の増殖活性が抑制される。

したがって、一側面によれば、本発明は、ヒトまたは動物における細胞増殖を抑制または停止するのに有用な医薬組成物の製造のための、ＵＣＡまたは細胞の細胞質を酸性化することができる別の薬理学的に許容され得る薬剤の使用であって、治療有効量のＵＣＡまたは該別の薬剤を本質的に非解離型で該ヒトまたは動物に投与する、ＵＣＡまたは該薬剤の使用に関する。

別の側面によれば、本発明は、別の治療上活性な薬剤の促進剤としての、ＵＣＡまたは別の薬理学的に許容され得る薬剤の使用に関する。

第３の側面によれば、本発明は、ＵＣＡまたは細胞の細胞質を酸性化することができる別の薬理学的に許容され得る薬剤と、該薬剤が細胞外ｐＨ値で解離するのを本質的に妨げる薬学的に許容され得る担体との組み合わせの医薬組成物に関する。

好ましい実施態様によれば、薬学的に許容され得る化合物はウロカニン酸（ＵＣＡ）であるが、これに制限されない。５．０〜７．４の範囲内、好ましくは６．０〜７．３の範囲内；最も好ましくは約７．０の解離定数を有し、かつ細胞内部に蓄積され得る任意の他の薬学的に許容され得る無毒性の酸または塩基が有用であり得る。かかる化合物は、無機系であっても有機系であってもよいが、好ましくは、ＵＣＡなどの、飽和カルボン酸部分またはより好ましくは不飽和カルボン酸部分が結合した複素環式環を有する有機系の薬剤であり得る。複素環式基は、たとえば、イミダゾール（ＵＣＡの場合）、または細胞質内ｐＨでプロトンを供与し、それにより、細胞質を酸性化する能力を有する任意の他の複素環式基または多環式複素環式基であり得る。他の好適な複素環式基の一例としては、チアゾール、チオフェン、フラン、オキサゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジンおよびトリアジンが挙げられ得る。

薬学的に許容され得る化合物は担体と混合され、担体は、単一の種類の成分であり得、またはより好ましくは、２種類以上の成分の混合物であり得る。該成分の１つは、好適には緩衝剤であり、これは、組成物のｐＨを所望の値に調整する。特にＵＣＡのトランス異性体（トランス−ＵＣＡ）が活性剤である場合、組成物のｐＨを４．０〜６．１、より好ましくは５．０〜６．１に調整することが好ましい。このｐＨ範囲では、トランス−ＵＣＡは、なお非解離である。ＵＣＡのシス異性体（シス−ＵＣＡ）が活性剤である場合、組成物のｐＨを５．０〜７．０、より好ましくは６．０〜７．０に調整することが好ましい。このｐＨ範囲では、シス−ＵＣＡは、なお非解離である。

一実施態様によれば、医薬組成物はまた、その効果がＵＣＡにより増強される別の治療上活性な薬剤を含有し得る。好ましくは、かかる治療上活性な薬剤は、限定されないが、抗増殖剤または抗癌剤である。

ｐＨを４．０〜７．０に調整するための好適な緩衝剤の一例としては、これに制限されないが、５５ｍＭ塩化ナトリウムを加えた５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞培養培地、および１３３ｍＭ塩化ナトリウムを加えた１０ｍＭ Ｐｉｐｅｓが挙げられ得る。

本発明による方法および組成物は、癌および細胞内酸性化により治癒可能な過剰増殖性疾患の治療または予防に有用である。本明細書で使用される細胞内酸性化という用語は、真核生物細胞のサイトゾル区画または亜細胞区画内の水素イオン濃度の上昇をいう。

本発明にしたがって治療または予防され得る過剰増殖症状は、任意の形態の癌、たとえば、限定されないが、脳の癌、皮膚癌（黒色腫など）、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、頭部の癌、頚部癌、食道癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓癌、婦人科系の癌（卵巣癌など）または甲状腺癌など；他の上皮腫；種々の器官内の嚢腫；ウイルス感染により誘発されるいぼおよびいぼ様腫瘍；線維肉腫ならびにその転移であり得る。別の実施態様では、本発明は、非癌性過剰増殖性障害（たとえば、皮膚または前立腺の良性過形成（たとえば、良性前立腺肥大）、慢性関節リウマチにおける滑膜過形成、炎症性腸疾患、再狭窄、アテローム性動脈硬化、血栓症、強皮症または線維症などの治療に関する。最も好ましくは、本発明の方法および組成物の標的細胞は、皮膚の充実性腫瘍を含む細胞である。

本発明の目的のため、薬学的に許容され得る薬剤は、種々の経路により、全身または局所のいずれかに投与され得る。好適な投与形態としては、たとえば、皮膚用製剤；静脈内、筋肉内、皮内および皮下注射などの腫瘍内注射；滑液嚢内注射；ならびに粘膜、局所、経皮、経鼻、吸入または経直腸製剤が挙げられる。特に好適な製剤は、局所送達用の製剤、たとえば、軟膏、ゲル、クリーム、泥膏、液剤、懸濁剤、ローションおよびエマルジョンの形態の局所製剤などである。また、リポソームおよびナノ粒子などの標的化ドラッグデリバリーシステムは、上記の投与形態との組み合わせで、薬学的に許容され得る薬剤の投与に使用され得る。

薬学的に許容され得る化合物の必要用量は、治療対象の具体的な症状、その症状の重篤度、治療の持続期間、投与経路および用いる具体的な化合物によって変化しうる。局所製剤では、薬学的に許容され得る化合物の量は、典型的には、０．０１％〜５０％の範囲、好ましくは０．１〜１０％の範囲内であり得る。

本発明を、以下の非制限的な実施例の項により説明する。

実施例
本研究の目的は、ＵＣＡが、適切な細胞外環境において形質転換細胞株内に進入し、その細胞質を酸性化し、続いて該細胞の増殖を阻害するという仮説について調べることであった。

先の公報（国際公開第２００４／０８０４５６号パンフレット）では、本発明者らは、シス−ＵＣＡおよびトランス−ＵＣＡの双方が、急速かつ不可逆的にヒトの生きた多形核好中球のサイトゾル内に蓄積することを明らかにした。また、ＵＣＡが細胞内小器官に結合し得るという示唆も、これがサイトゾル内で代謝され得るという示唆もなかった。細胞外ｐＨが６．１〜７．０のｐＨ範囲の場合、シス−ＵＣＡは、好中球の細胞内ｐＨに影響を及ぼしたが、トランス−ＵＣＡは影響を与えなかった。このような条件ではシス−ＵＣＡは、なお非解離であるが、ｐＫ_aが６．１のトランス−ＵＣＡは、ほとんど、または完全に解離しており、それにより、プロトンをサイトゾル内に輸送することができなかった。しかしながら、細胞外ｐＨが６．１未満、たとえば、５．０〜６．０の範囲の場合、トランス−ＵＣＡもまた、プロトン担体として作用することができ、これは細胞内酸性化を誘導する。明確にする目的で、本明細書における実験結果は、シス−ＵＣＡの効果のみを示すが、適切なｐＨ範囲においてトランス−ＵＣＡでも同様の結果が得られ得る。

細胞内酸性化は、多くの細胞機能の変化（たとえば、成長停止）の必要条件として有効であることが知られている。形質転換細胞株（たとえば、癌細胞株など）の成長（増殖）は、細胞内酸性化を引き起こすことができる薬剤によって阻害され得ることが知られている。癌の臨床治療におけるかかる化合物（通常、有機酸）の利用は、その有害な副作用または毒性によって妨げられることがある。

方法
ウロカニン酸
トランス−ウロカニン酸［トランス−ＵＣＡ、３−（ｌＨ−イミダゾール−４−イル）−２−プロペン酸、ＭＷ １３８．１４］は、シグマ（セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。シス−ＵＣＡは、トランス−ＵＣＡからＵＶ光異性化により以下のようにして調製した。トランス−ＵＣＡ（１３８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を水（５００ｍｌ）中に溶解した。この溶液を、固形水酸化カリウムでｐＨ９にし、次いで、窒素雰囲気下、１０℃で４時間、放射線を照射した。光異性化は、Ｈａｎａｕ石英水銀高圧灯（５００Ｗ、２７０〜３５０ｎｍ）を備えたＮｏｒｍａｇ流下膜式光反応器内で行なった。得られた混合物（ＨＰＬＣによりトランス／シスが約３０／７０）を蒸発乾固し、残渣を１２．５ｍＭ酢酸中に溶解した。この溶液をｐＨ９に調整し、イオン交換カラム（２５×２．３ｃｍ、２００〜４００メッシュ、アセテート型、バイオ ラッド、 １−ｘ８）にて、１２．５ｍＭ（５００ｍｌ）、２５ｍＭ（５００ｍｌ）および１００ｍＭ（１０００ｍｌ）酢酸を、逐次、溶離液として用い、クロマトグラフィーに供した。シス−ＵＣＡが約１１００ｍｌ後に出現し、トランス−ＵＣＡは、主に、１３００ｍｌの溶離液容量後に出現した。画分から溶媒を除去した後、ジエチルエーテルで洗浄し、６５℃にて五酸化リン上で真空乾燥し、純粋なトランスおよびシス異性体を得た。シス−ＵＣＡの収量は８５ｍｇ（５８％）であり、融点が１７６〜１７８℃で、９９．５％より高い化学純度（ＨＰＬＣ解析による）を有した。アミノプロピル固定相カラム Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ₂、Ｈｉｂａｒ ＲＴ、２５０×４ｍｍ、５μｍ（メルク、ダルムシュタット、ドイツ）をＨＰＬＣ解析に用いた。溶離液は、アセトニトリルと２％（ｖ／ｖ）酢酸および０．５％（ｗ／ｖ）酢酸アンモニウム含有水溶液（ｐＨ約５）との５０％（ｖ／ｖ）混合物とした。異性体は、２６８ｎｍで検出し、保持時間は、Ｔ_r（シス）３．７分およびＴ_r（トランス）５．４分とした。

シス−ＵＣＡを、直接、インキュベーションバッファー中または培養培地中に３０ｍＭ濃度まで溶解し、滅菌ろ過し（０．２μｍ）、各実験の開始直前に所望の濃度に希釈した。

カンプトセシン
カンプトセシン（シグマ、ＭＷ ３４８．４）ストック溶液を、試薬（１．４〜２．１ｍｇ／ｍｌ）を脱イオン水に溶解することにより調製した。溶液を１Ｎ ＮａＯＨでアルカリ性にし、さらに、沸騰水浴中での加熱により溶解を補助した。ストック溶液の希釈は生理食塩水中で行なった。実験における最終濃度は２０〜２０００ｎｍｏｌ／ｌとした。

細胞株
形質転換腫瘍細胞株ＷＭ ２６６−４およびＡ２０５８（皮膚黒色腫）、ＨＴ−１０８０（上皮線維肉腫）、ＨｅＬａ（子宮頚管の上皮腺癌）、ＨＫ２９３（腎臓上皮細胞）およびヒト起源の非形質転換細胞株ＨＳＦ（健常男性志願ドナー由来の皮膚線維芽細胞）は、既報のものである（Liら2003）。Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。

細胞を、＋３７℃、５％ＣＯ₂の加湿インキュベーターにおいて、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を加えたＩＭＤＭ培地（インビトロジェン、ペーズリー、ＵＫ）中で対数増殖期に維持した。接着細胞株を、実験のために０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ含有ＰＢＳで５分間で回収し、次いで、培地中に再懸濁して洗浄した。生存細胞を計測した後、１５，０００〜７５，０００細胞を、平底９６ウェル細胞培養プレート内に、１００または１５０μｌの容量で移した。

増殖アッセイ
培養細胞株の増殖活性を平底９６ウェルプレートにおいてテトラゾリウム誘導体に基づく改変比色アッセイ（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay、プロメガ）により定量した。細胞をカンプトセシンおよび／またはシス−ＵＣＡの存在下で２０〜９２時間培養し、次いで増殖試薬を２時間添加し、４９０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーにおいて測定した。細胞なしの培地を含むウェルにおけるブランク吸光度値を、比較解析前に差し引いた。

細胞内ｐＨのモニタリング
シス−ＵＣＡ存在下の細胞株における細胞内ｐＨを、ｐＨ感受性蛍光色素２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ、アセトキシメチルエステル；モリキュラープローブ、ライデン、オランダ）を用い、フローサイトメトリーにより測定した。２百万個の細胞を、０．３５μＭ ＢＣＥＣＦを含有するｐＨ７．４の５ｍｌ ＤＭＥＭ培地（インビトロジェン）中で、３７℃にて３０分間インキュベートし、ｐＨ７．４リン酸ナトリウムバッファー（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄／Ｎａ₂ＨＰＯ₄、４３ｍＭ ＮａＣｌ）中で１回洗浄し、０．３ｍｌ生理食塩水中に再懸濁した。２０μｌの細胞懸濁液を、フローサイトメトリーチューブ内でピペティングした。シス−ＵＣＡを含む、または含まないリン酸ナトリウムバッファー溶液を、シス−ＵＣＡの添加後、（０．１Ｎ ＨＣｌ／ＮａＯＨで）ｐＨ６．５または７．４に調整し、該チューブ内に添加し、最終容量を５００μｌにした。フローサイトメトリー解析を１時間以内に行なった。

インサイチュでの細胞内ｐＨの較正を、Ｋ⁺／Ｈ⁺イオノフォアニゲリシン（モリキュラープローブ）を用い、カリウム高含有バッファー中で行なった。ＢＣＥＣＦ標識細胞（生理食塩水中２０μｌ）を、フローサイトメトリーチューブ内のｐＨ調整された較正バッファー（４８０μｌの５０ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄、４３ｍＭ ＫＣＩ、ｐＨ６．２、６．５、６．８、７．２および７．５）中に再懸濁した。ニゲリシンストック溶液（１０ｍＭメタノール中）を、生理食塩水で１：１０に希釈し、５μｌを解析の少し（１０〜１５分）前に較正細胞懸濁液に添加した。実験中、細胞は室温で維持した。正確な細胞内ｐＨ値を、ニゲリシン固定較正細胞を参照とした平均ＢＣＥＣＦ蛍光強度から算出した。較正は、各細胞株について個々に同時に行なった。

結果
カンプトセシンは、低ｐＨで増強される抗増殖作用を示す
ほとんどの細胞株におけるベースライン増殖は、ｐＨ７．４培養物においてｐＨ６．５よりも高かった。カンプトセシン（２μＭ）は、すべての細胞株培養物において増殖を阻害し、ｐＨ６．５においてより効率的な阻害を示した（図１）。

シス−ＵＣＡは、癌細胞増殖を阻害し、ｐＨ６．５でカンプトセシンの抗増殖作用を増大させる
シス−ＵＣＡがその非解離分子型において、すなわち、細胞外ｐＨ範囲６．１〜７．０において阻害効果を奏するという末梢血好中球での先の観察に基づき、本発明者らは、シス−ＵＣＡ作用を、黒色腫細胞株Ａ２０５８およびＷＭ２６６−４において２つのｐＨレベルｐＨ６．５およびｐＨ７．４で調べた。１０ｍＭシス−ＵＣＡは、いずれも自身により細胞増殖を有意に阻害し、また、通常の（ｐＨ７．４の）培養細胞をｐＨ６．５培養培地で試験したとき、カンプトセシンによる阻害を増大させた（図２Ａ）。１０ｍＭシス−ＵＣＡ単独による阻害割合は、Ａ２０５８細胞において８３％（ｐ＝０．００２８）およびＷＭ２６６−４細胞において３６％（ｐ＝０．００２０）であった。ｐＨ６．５での試験培養期間を開始する前にまずｐＨ６．７培養条件に３日間適合させた細胞の増殖は、同じ程度であった（シス−ＵＣＡについて、それぞれ、８７％、ｐ＝０．００５６および２８％、ｐ＝０．０９０）（図２Ｂ）。ｐＨ７．４での阻害は２〜３％にすぎなかった（図２Ｃ）。同様に、カンプトセシンの効果は、より低いｐＨにおいて、さらに良好であった（図２）。これらの実験は、シス−ＵＣＡが、細胞外ｐＨが＜ｐＫ_aの場合、すなわち該分子のイミダゾリル部分が非解離型である場合、腫瘍細胞に対して抗増殖剤として作用することを示した。

該細胞株を、２μＭカンプトセシンおよび１０ｍＭシス−ＵＣＡを用いて、またはなしで、１５，０００細胞／全容量１００μｌで、ｐＨ６．５での４４時間培養にて試験した。これらの条件において、シス−ＵＣＡ単独は、細胞増殖を有意に阻害し（２０％〜５０％）、ほとんどの細胞株においてカンプトセシンの阻害効果を増強した（表１）。シス−ＵＣＡの有効な抗増殖濃度範囲をさらに特徴づけするため、増殖をｐＨ６．５での４４時間アッセイにおいて、３０μＭ〜３０ｍＭのシス−ＵＣＡ濃度範囲で測定した。Ａ２０５８黒色腫細胞での結果は、シス−ＵＣＡが、測定可能な阻害を生じるのに少なくとも３ｍＭ濃度を必要とすることを示す（図３）。

さらなる実験では、より低いカンプトセシン濃度（１μＭ）を用い、シス−ＵＣＡのさらなる抗増殖効果を特徴付けした。３種類の被験形質転換細胞株すべてにおいて、シス−ＵＣＡは、３ｍＭまたはそれより高い濃度で増殖を阻害した（図４）。シス−ＵＣＡのカンプトセシンに対するさらなる効果は、細胞株によるが、１〜１０ｍＭの範囲で明白であった。試験した最高のシス−ＵＣＡ濃度（３０ｍＭ）では、シス−ＵＣＡ単独による増殖はカンプトセシンとの組合せと比べ常に同じレベルであり、１μＭカンプトセシン単独よりは低かった（図４）。

シス−ＵＣＡは、形質転換細胞において細胞内ｐＨを低下させる
シス−ＵＣＡが該細胞株において抗増殖効果を示したため、本発明者らは次にシス−ＵＣＡがこれらの細胞において細胞内酸性化をもたらすか否かを調べた。本発明者らは、以前に、シス−ＵＣＡは、細胞外ｐＨを７．０未満に調整すると、末梢血好中球のサイトゾル内に高濃度で蓄積され、該サイトゾル内ｐＨを低下させることを示した。選択した形質転換細胞株をｐＨ感受性蛍光色素ＢＣＥＣＦで標識し、種々の濃度のシス−ＵＣＡを含む、または含まないｐＨ調整されたバッファー溶液中に入れた。フローサイトメトリー解析により、細胞外ｐＨを７．４に維持した場合、シス−ＵＣＡ濃度を３０ｍＭまで上げても、Ａ２０５８細胞およびＨｅＬａ細胞における細胞内ｐＨは、ほぼ一定のままであることが示された。しかしながら、細胞外バッファーをｐＨ６．５に調整すると、細胞内ｐＨは、０．３〜３０ｍＭの範囲でシス−ＵＣＡ濃度依存的に減少した。この減少は、最高シス−ＵＣＡ濃度で約０．２５ｐＨユニットであった（図５）。Ａ２０５８細胞およびＨｅＬａ細胞でのこれらのデータは、シス−ＵＣＡが形質転換細胞のサイトゾルを酸性化できることを示す。観察された酸性化は、おそらく、シス−ＵＣＡの抗増殖効果の始動事象である。

結論
腫瘍細胞は、形質転換により、細胞分裂の厳しい規制を回避する能力を獲得する。この多段階プロセスにおいて、増殖を抑止する細胞内経路の不活化およびこれを促進する細胞内経路の活性化は重要な事象である。結果として生じる形質転換細胞の異常成長挙動は、なお、医学における主要な課題である。癌細胞は、一般的に、細胞周期進行とアポトーシスの正常な細胞機序にしたがわないため、および充実性腫瘍は異常に酸性な低酸素微環境を生じるため、多くの場合、薬物療法の有効性は損なわれるが、これはまた、腫瘍選択的薬物の設計のための新規な展望をもたらすこともある（Kozinら2001）。充実性腫瘍組織の細胞は、細胞膜をはさんだｐＨ勾配を維持する傾向にあり、サイトゾルｐＨは中性付近であるが、細胞外微環境は、酸性、通常、ｐＨ６．７付近である（Kozinら2001、YamagataおよびTannock 1996）。低い細胞外ｐＨでは、カンプトセシンなどのある種の薬物の細胞内への取込みが増進され（Gabrら1997）、分子構造の可逆的変形のため、効率的な抗増殖活性に酸性細胞内環境が必要とされる（BurkeおよびMi1993）。腫瘍細胞のカンプトセシンに対する化学物質感受性は、細胞内環境を酸性化することができる酸との同時処置によって向上し得ることが示されている（Cosentiniら2001、Gabrら1997）。カンプトセシンは、それ自体が、数時間の時間枠において白血病細胞のサイトゾルを酸性化し、アポトーシスの誘導をもたらす（Goossensら2000）。相補的プロトン担体による細胞内酸性化は、カンプトセシンおよび相当する薬物の効果を増強し得る。同様に、アルキル化剤や白金含有製剤とＤＮＡとの相互作用は、低細胞内ｐＨ環境を好む（Jahdeら1989、Atemaら1993）。

本発明の実験で用いられるシス−ＵＣＡの有効濃度は、ミリモル単位であり、たいてい１〜３０ｍＭである。シス−ＵＣＡの自然な位置は、表皮の表面層であり、その表皮の平均厚みを考慮した全ＵＣＡの公表されている濃度は、０．５〜８．９ｍＭの範囲内である（Laihiaら1998）。したがって、これらの濃度は、病原性微生物、腫瘍および好中球蓄積に対して、それぞれ、生来の抗菌、抗増殖性および抗炎症性の酸性表面環境（「酸マントル」、OhmanおよびVahlquist 1994）の維持において重要であると考えられる。最近の解析により、ＵＣＡが、表皮内の酸／塩基ホメオスタシスにおける主要エフェクター分子であるという証拠が得られている（KrienおよびKermici 2000）。他方において、実験でカンプトセシン抗増殖活性を増大させた他の有機酸の濃度は、同じ範囲である。一例として、ヒストンデアセチラーゼインヒビターであるフェニルブチレートおよびフェニルアセテートは、それぞれ、濃度範囲５〜４０ｍＭで、結腸癌細胞の増殖をインビトロで２０％〜８６％低下させた（Cosentiniら2001）。

詳細には試験していないが、癌介入におけるＵＣＡの潜在的薬理物質としての特徴は、有望である。第１に、ＵＣＡは先に説明したように皮膚で大量に合成される天然分子である。ＵＣＡは１２０年以上にわたって知られており、何百もの生物医学の刊行物の主題である。これらの事実は、アレルギー感作に対する予期されない薬理学的毒性または可能性に関する懸念を排除している。第２に、シス−ＵＣＡは、水溶性であり、組織および細胞の細胞質内に容易に浸透する。第３に、哺乳動物におけるシス−ＵＣＡの異化代謝は知られておらず、したがって、生じ得る代謝産物の予測できる有害効果はない。皮膚において、インビボでは、トランス−ＵＣＡはヒスチジンから合成される（BadenおよびPathak 1967）。ＵＶ誘導性光異性化によりシス異性体が生じ、これは、次いで、汗および尿などにて排泄される。シス−ＵＣＡ投薬後、トランス−ＵＣＡに戻る意図的でない光異性化が起こった場合、全身のトランス−ＵＣＡは、グルタミン酸への多数の無害な中間体により、自然に肝臓内で代謝される。皮膚では内因性代謝はない。第４に、シス−ＵＣＡは、そのプロトン解離特性により潜在的な制癌剤となる。ＵＣＡは多塩基性弱酸であり、２つのプロトン供与体部分、すなわちカルボキシル基およびイミダゾリル基を有する。シス−ＵＣＡのカルボキシル基に関する第１ｐＫ_aは、３．３である（Robertsら1982）。したがって、実質的にすべてのシス−ＵＣＡ分子は、ｐＨ＞４において、カルボキシル基が脱プロトン化される。生理学的に関連のあるｐＨレベルでは、イミダゾリル基単独のプロトン化状態が、該分子がプロトンを供与することによって酸性化を促進できるか否かを決定する。シス−ＵＣＡのイミダゾリル基の第２ｐＫ_aは７．０である（Robertsら1982、Krienおよび Kermici2000）。その結果、シス−ＵＣＡのイミダゾリル基はｐＨ＜７．０のときのみプロトン化され、ｐＨ＞７．０を有する細胞質内に侵入したとき、プロトン供与体として作用することができる。癌細胞における酸性化誘導性アポトーシスは、細胞内ｐＨが６．５付近である場合、最も効率的であることが認められた（Thangarajuら1999）。ミトコンドリアシトクロムＣによるカスパーゼの活性化はｐＨ感受性であり、インビトロではｐＨ範囲６．３〜６．８で最高である（Matsuyamaら2000）。ここに示されたデータは、シス−ＵＣＡが、生存能力のある癌細胞において、細胞外ｐＨ６．５で強力な抗増殖活性を有するが、ｐＨ７．４では活性が制限されることを示す。制癌剤のプロトン解離特性はこれまでに検討されているが、細胞取込みの観点のみである（Kozinら2001）。良好な取込み特性に加え、腫瘍において細胞を酸性化するための最適な薬物は、実際の細胞外ｐＨより大きく、かつ細胞内定常状態ｐＨより低いｐＫ_a値を有し得る。弱酸性の細胞外条件では、腫瘍細胞増殖は、シス−ＵＣＡ誘導性細胞内酸性化により抑制されるはずである。この見解はまた、過剰増殖の他の症状、たとえば、慢性関節リウマチにおける滑膜線維芽細胞の増殖などにもあてはまり得る。充実性腫瘍または他の考えられ得る過剰増殖細胞の薬理学的処置の状況において、弱酸性細胞外条件はシス−ＵＣＡの使用に理想的であり得る。

結論として、本発明の研究により、予期せず、癌細胞に対するＵＣＡの抗増殖作用を示すデータが初めて示される。この調節は、細胞サイトゾルを酸性化するＵＣＡの性質と関連する。酸性化する性質はＵＣＡの好都合なｐＫ_aに基づいており、したがって、サイトゾル内ｐＨが中性付近か中性域外かつ細胞外環境が弱酸性である条件に限定される。このようなｐＨ条件は、一般的に、充実性腫瘍組織において効を奏する。

本発明を、以下の非限定的な実施例により、さらに説明する。

本発明による製剤の例
ゲル組成物１（％ ｗ／ｗ）
シス−ウロカニン酸 ０．１〜１０
カルボポール ９７４ １．５
プロピレングリコール １２．５
緩衝剤 ０．０１〜１
精製水で１００まで

ゲル組成物２（％ ｗ／ｗ）
シス−ウロカニン酸 ０．１〜１０
ナトロソール（ヒドロキシエチルセルロース） １．０
緩衝剤 ０．０１〜１
精製水で１００まで

クリーム組成物１（％ ｗ／ｗ）
シス−ウロカニン酸 ０．１〜１０
プロピレングリコール ５０
セトステアリルアルコール １５
ラウリル硫酸ナトリウム １
緩衝剤 ０．０１〜１
精製水で１００まで

クリーム組成物２（％ ｗ／ｗ）
シス−ウロカニン酸 ０．１〜１０
セトステアリルアルコール ６．７５
プロピレングリコール ４０
ラウリル硫酸ナトリウム ０．７５
ポロキサマー ４０７ １
鉱物油 ５
粘質ワセリン １２．５
緩衝剤 ０．０１〜１
精製水で１００まで

軟膏組成物（％ ｗ／ｗ）
シス−ウロカニン酸 ０．１〜１０
鉱物油 ５
緩衝剤 ０．０１〜１
ワセリンで１００まで

本発明の方法は、さまざまな実施態様の形態で組み込まれ得、そのうちのほんのいくつかを本明細書に開示していることは認識されよう。当業者には、他の実施態様が存在し、それは本発明の精神から逸脱しないことが自明である。したがって、記載した実施形態は例示であり、制限的なものと解釈されるべきでない。

［参考文献］
Anglin JH Jr, Batten WH. Studies on cis urocanic acid. J Invest Dermatol 1968; 50: 463-6.
Atema A, Buurman KJ, Noteboom E, Smets LA. Potentiation of DNA-adduct formation and cytotoxicity of platinum-containing drugs by low pH. Int J Cancer 1993; 54: 166-72.
Baden HP, Pathak MA. The metabolism and function of urocanic acid in skin. J Invest Dermatol 1967; 481: 11-7.
Beissert S, Mohammad T, Torri H, Lonati A, Yan Z, Morrison H, Granstein RD.
Regulation of tumor antigen presentation by urocanic acid. J Immunol 1997; 159: 92-6.
Burke TG, Mi Z. Preferential binding of the carboxylate form of camptothecin by human serum albumin. Anal Biochem 1993; 212: 285-7.
Cosentini E, Haberl I, Pertschy P, Teleky B, Mallinger R, Baumgartner G, Wenzl E, Hamilton G. The differentiation inducers phenylacetate and phenylbutyrate modulate camptothecin sensitivity in colon carcinoma cells in vitro by intracellular acidification. Int J Oncol 2001 ; 19: 1069-74.
El-Ghorr AA, Norval M. The effect of chronic treatment of mice with urocanic acid isomers. Photochem Photobiol 1997; 65: 866-72.
Everett MA, Anglin JH Jr, Bever AT. Ultraviolet induced biochemical alterations in skin. I. Urocanic acid. Arch Dermatol 1961; 84: 717-9.
Gabr A, Kuin A, Aalders M, El-Gawly H, Smets LA. Cellular pharmacokinetics and cytotoxicity of camptothecin and topotecan at normal and acidic pH. Cancer Res 1997; 57: 4811-6.
Garssen J, Norval M, Crosby J, Dortant P, Van Loveren H. The role of urocanic acid in UVB-induced suppression of immunity to Trichinella spiralis infection in the rat. Immunology 1999; 96: 298-306.
Gilmour JW, Vestey JP, George S, Norval M. Effect of phototherapy and urocanic acid isomers on natural killer cell function. J Invest Dermatol 1993; 101 : 169-74.
Goossens JF, Henichart JP, Dassonneville L, Facompre M, Bailly C. Relation between intracellular acidification and camptothecin-induced apoptosis in leukemia cells. Eur J Pharm Sci 2000; 10: 125-31.
Gottlieb RA, Nordberg J, Skowronski E, Babior BM. Apoptosis induced in Jurkat cells by several agents is preceded by intracellular acidification. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 654-8.
Gruner S, Diezel W, Stoppe H, Oesterwitz H, Henke W. Inhibition of skin allograft rejection and acute graft-versus-host disease by cis-urocanic acid. J Invest Dermatol 1992; 98: 459-62.
Holan V, Kuffova L, Zajicova A, Krulova M, Filipec M, Holler P, Jancarek A. Urocanic acid enhances IL-10 production in activated CD4+ T cells. J Immunol 1998; 161: 3237-41.
Jahde E, Glusenkamp KH, Klunder I, Hulser DF, Tietze LF, Rajewsky MF. Hydrogen ion- mediated enhancement of cytotoxicity of bis-chloroethylating drugs in rat mammary carcinoma cells in vitro. Cancer Res 1989; 49: 2965-72.
Kivisto K, Punnonen K, Toppari J, Leino L. Urocanic acid suppresses the activation of human neutrophils in vitro. Inflammation 1996; 20: 451-9.
Kozin SV, Shkarin P, Gerweck LE. The cell transmembrane pH gradient in tumors enhances cytotoxicity of specific weak acid chemotherapeutics. Cancer Res 2001 ; 61 : 4740-3.
Krien PM, Kermici M. Evidence for the existence of a self-regulated enzymatic process within the human stratum corneum-an unexpected role for urocanic acid. J Invest Dermatol 2000; 115: 414-20.
Laihia JK, Attila M, Neuvonen K, Pasanen P, Tuomisto L, Jansen CT. Urocanic acid binds to GABA but not to histamine （H1, H2, or H3） receptors. J Invest Dermatol 1998; 111: 705-6.
Li SP, Junttila MR, Han J, Kahari VM, Westermarck J. p38 Mitogen-activated protein kinase pathway suppresses cell survival by inducing dephosphorylation of mitogen- activated protein/extracellular signal-regulated kinase kinase 1, 2. Cancer Res 2003; 63: 3473-7.
Los M, Burek CJ, Stroh C, Benedyk K, Hug H, Mackiewicz A. Anticancer drugs of tomorrow: apoptotic pathways as targets for drug design. [review] Drug Discov Today 2003; 8: 67-77.
Matsuyama S, Llopis J, Deveraux QL, Tsien RY, Reed JC. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol 2000 ; 2: 318-25.
Moodycliffe AM, Bucana CD, Kripke ML, Norval M, Ullrich SE. Differential effects of a monoclonal antibody to cis-urocanic acid on the suppression of delayed and contact hypersensitivity following ultraviolet irradiation. J Immunol 1996; 157: 2891-9.
Ohman H, Vahlquist A. In vivo studies concerning a pH gradient in human stratum corneum and upper epidermis. Acta Derm Venereol. 1994 Sep; 74 （5）: 375-9.
Roberts JD, Yu C, Flanagan C, Birdseye TR. A nitrogen-15 nuclear magnetic resonance study of the acid-base and tautomeric equilibria of 4-substituted imidazoles and its relevance to the catalytic mechanism of α-lytic protease. J Am Chem Soc 1982; 104: 3945- 9.
Thangaraju M, Sharma K, Liu D, Shen SH, Srikant CB. Interdependent regulation of intracellular acidification and SHP-1 in apoptosis. Cancer Res 1999; 59: 1649-54.
Wahl ML, Owen JA, Burd R, Herlands RA, Nogami SS, Rodeck U, Berd D, Leeper DB, Owen CS. Regulation of intracellular pH in human melanoma: potential therapeutic implications. Mol Cancer Ther 2002; 1: 617-28.
Wille JJ, Kydonieus AF, Murphy GF. Cis-urocanic acid induces mast cell degranulation and release of preformed TNF-alpha: A possible mechanism linking UVB and cis-urocanic acid to immunosuppression of contact hypersensitivity. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 1999; 12: 18-27.
Yamagata M, Tannock IF. The chronic administration of drugs that inhibit the regulation of intracellular pH: in vitro and anti-tumour effects. Br J Cancer 1996; 73: 1328-34.

カンプトセシンの細胞株に対する抗増殖効果を示す。細胞は、４４時間、２μＭカンプトセシン（ＣＰＴ）とともに、またはこれなしで、ｐＨ６．５または７．４の条件で培養した。増殖分析試薬との２時間のインキュベーション後、４９０ｎｍにおける吸光度を記録した。細胞を、１５０μｌの容量中の密度１５，０００細胞（Ｋ５６２、ＨＴ−１０８０、ＨＫ２９３）または７５，０００細胞（その他の細胞）で培養した。 ヒト由来の２種類の皮膚黒色腫細胞株における、カンプトセシンおよび低ｐＨ適応と組み合わせたシス−ＵＣＡの抗増殖効果を示す。細胞は、３連で、２μＭカンプトセシン（ＣＰＴ）または１０ｍＭシス−ＵＣＡとともに、またはなしで、１５，０００細胞／１５０μｌの密度で９２時間培養した。Ａ：通常のｐＨ７．４培養物から取り出し、ｐＨ６．５の試験条件に供した細胞。Ｂ：低ｐＨ６．７適応培地で３日間培養し、次いで、ｐＨ６．５で試験した細胞。Ｃ：ｐＨ７．４で培養および試験した細胞。 シス−ＵＣＡのＡ２０５８黒色腫細胞増殖に対する濃度応答を示す。増殖は、ｐＨ６．５での４４時間分析において、３０μＭ〜３０ｍＭシス−ＵＣＡおよび２μＭカンプトセシンを用いて測定した。増殖（Ａ）および計算した阻害割合（Ｂ）の両データを示す。 シス−ＵＣＡのさらなる増殖効果を示す。３種類の細胞株を、シス−ＵＣＡおよび／または１μＭカンプトセシンとともに、３０，００細胞／ウェル（１００μｌ）の濃度で４４時間、ｐＨ６．５培地中で培養した。細胞を含まないすべてのシス−ＵＣＡ濃度のブランクウェルも含め、その吸光度を、対応する試験ウェルの吸光度から差し引いた。 インサイチュでのＵＣＡ処置腫瘍細胞の細胞内ｐＨ測定値を示す。細胞をＢＣＥＣＦで標識し、種々の濃度のシス−ＵＣＡを含む、または含まないｐＨ調整されたバッファー溶液中に入れた。左パネル：バッファーｐＨの関数としての、カリウム高含有バッファー中でのニゲリシン処理細胞のＢＣＥＣＦ蛍光強度の較正。右パネル：種々の濃度のシス−ＵＣＡを含む、または含まないバッファー中での細胞内ｐＨ値。すべての試験バッファーは、シス−ＵＣＡの添加後、ｐＨ７．４（％）またはｐＨ６．５（＋）に調整した。結果は、左側の対応する較正曲線を用いて計算した。

Claims (7)

1. ヒトまたは動物における、
   ａ）癌、または
   ｂ）良性前立腺肥大などの皮膚または前立腺の良性過形成；慢性関節リウマチにおける滑膜過形成；炎症性腸疾患；再狭窄；アテローム性動脈硬化；血栓症；強皮症および線維症からなる群より選択される非癌性過剰増殖性障害
   を予防または治療するために有用な医薬組成物の製造のための非解離型シス−ウロカニン酸の使用であって、有効量の該シス−ウロカニン酸が該ヒトまたは動物に投与されるシス−ウロカニン酸の使用。
2. 前記癌が、脳の癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、頭部の癌、頚部癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、食道癌、婦人科系の癌および甲状腺癌から選択される局所または全身性の癌である請求項１記載の使用。
3. シス−ウロカニン酸が、全身または局所に投与される請求項１または２記載の使用。
4. シス−ウロカニン酸が、局所に投与される請求項３項に記載の使用。
5. シス−ウロカニン酸が、限局的に投与される請求項４項に記載の使用。
6. 別の治療上活性な薬剤の促進剤としての請求項１〜５のいずれか１項に記載のシス−ウロカニン酸の使用。
7. ａ）癌、または
   ｂ）良性前立腺肥大などの皮膚または前立腺の良性過形成；慢性関節リウマチにおける滑膜過形成；炎症性腸疾患；再狭窄；アテローム性動脈硬化；血栓症；強皮症および線維症からなる群より選択される非癌性過剰増殖性障害
   の予防または治療用医薬組成物であって、
   治療上活性な薬剤として抗増殖剤または抗癌剤を含み、該薬剤の促進剤としてのシス−ウロカニン酸を、薬学的に許容され得る緩衝剤と組み合わせて含有し、該組成物のｐＨを５．０〜７．０とした医薬組成物。

Images