JP2024515727A - チューブリン重合阻害剤としての代謝的に安定なピリミジニルジヒドロキノキサリノン - Google Patents

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ウェイ リー，
ケー エー フォイズ マハムード，
デュアン ディー． ミラー，
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ルイ ワン，
ティファニー シーグローブズ，
ライサ クルティリーナ，
ケリー ハートマン，
サティヤナラヤナ ポチャンパリー，
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Abstract

本発明は、より高い治療指数を達成するために、水溶性が著しく改善され、毒性が低減された新規ジヒドロキノキサリノン化合物、並びにそれを使用する癌、ウイルス感染、及び炎症の治療を包含する。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年４月２０日に出願された米国仮出願第６３／１７７，１８３号及び２０２２年３月８日に出願された米国仮出願第６３／３１７，９３１号の優先権の利益を主張する。
（政府の利益の声明）
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与された助成金番号Ｒ０１ＣＡ１４８７０６、１Ｓ１０ＯＤ０１０６７８－０１、ＲＲ－０２６３７７－０１、及び１Ｓ１０ＯＤ０１６２２６の下で全体的又は部分的に政府の支援により行われた。政府は本発明に特定の権利を有してもよい。
動的微小管（ＭＴ）は、細胞骨格の重要な要素であり、細胞増殖、遊走及び有糸分裂に重要な寄与を有することが知られている。ＭＴの会合並びに分解は、チューブリンの重合及び脱重合に依存する。したがって、ＭＴが有糸分裂に深く関与していることを考慮すると、ＭＴダイナミクスの破壊は、抗癌療法において十分に確立された戦略である。
癌の臨床的介入に広く使用されているチューブリン阻害剤の３個の主要なクラスは、タキサン、ビンカアルカロイド、及びエポチロンである。しかしながら、多剤耐性（ＭＤＲ）、末梢神経障害並びに狭い治療指数が発生すると、しばしば臨床におけるこれらの薬物の有効性が制限される。コルヒチンは、αβ－チューブリン二量体の境界面に結合する。コルヒチン及びコルヒチン部位に結合する他の小分子は、チューブリン二量体が重合し、機能的微小管を形成する能力を阻害することが観察されている。したがって、コルヒチン結合部位阻害剤（ＣＢＳＩ）は、多くの研究において、かなりの細胞傷害性を示してきた。コルヒチン自体は、β３－チューブリン（クラスＩＩＩ－βチューブリン）媒介ＭＤＲと同様に流出輸送体になりやすいが、小分子ＣＢＳＩは、現在のＦＤＡ承認チューブリン阻害剤の臨床効果が限られている原因であるこれらのＭＤＲ機序に対してそれほど脆弱ではない。しかしながら、小分子ＣＢＳＩの臨床応用は、正常細胞に対するかなりの望ましくない毒性、低い溶解性並びに低い経口バイオアベイラビリティによって制限されてきた。
近年、コルチシン結合部位を標的とする新しいクラスの小分子ＣＢＳＩ、特に血管破壊剤（ＶＤＡ）に関する広範な研究が行われている。ＶＤＡは、腫瘍の確立された血管ネットワークを破壊し、それによって血管虚脱を介して広範な壊死並びにアポトーシスを導入することによって、血管新生阻害剤（ＡＩ）よりも大きな利点を有する。ＶＤＡが主に固形腫瘍の血流を遮断し、正常組織の血管を無傷のままにすることが知られていることに触れることは注目に値する。現在、コルヒチン部位を標的とするかなりの数のＶＤＡ剤が、多様な癌型の治療の臨床試験が進行中である。
例えば、コンブレタスタチンＡ－４（ＣＡ－４Ｐ）のリン酸類縁体は、未分化甲状腺癌を標的とする第ＩＩＩ相試験中であり、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療の第ＩＩ相試験中である。ベルブリン（ＭＰＣ－６８２７）、Ａｚｉｘａは、腫瘍血流の急速な崩壊及び腫瘍増殖の阻害によって血管破壊を開始する強力な能力を有する非常に強力なチューブリン重合阻害剤として数年前に導入された。ベルブリンは、黒色腫、脳、前立腺、及び乳癌を含む多様な癌に対して低いナノモル効力を示した。しかしながら、ベルブリンは、第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験に進んだ後、潜在的な心血管毒性のために臨床試験から撤退した。
これらの成功により、ＶＤＡは集中的に研究され、著しく高い抗増殖活性を有する小分子ＶＤＡ薬様候補に関する多くの最近の報告がなされた。最近のコルヒチン結合ＶＤＡのほとんどは、有糸分裂阻害剤並びに血管破壊剤としての二重の作用機序のためにかなりの注目を集めており、癌化学療法の成功が大いに期待されている。
本発明の実施形態は、式Ｉの構造を有する化合物であって、
Figure 2024515727000002
式中、
Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり；
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、若しくはＳの少なくとも１つを有するか、又はヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり、又は
一緒になった場合、Ｒ４及びＲ５は、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
本発明の別の実施形態は、式ＩＡの構造を有する化合物であって、
Figure 2024515727000003
式中、
Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
Ｒ４及びＲ５は一緒になって、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、シクロアルキル又は複素環は、少なくとも１つの不飽和を有してもよく、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
本発明の更に別の実施形態は、式ＩＩの構造を有する化合物であって、
Figure 2024515727000004
式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり、又は
一緒になった場合、Ｒ４及びＲ５は、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
別の実施形態において、本発明は、式ＩＩの化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を包含する。
本発明の実施形態は、以下の化合物５ｊ～５ｒ、５ｔ～５ｖ又は１２ａ～１２ｍ及び１２ｏ～１２ｑ、
Figure 2024515727000005
Figure 2024515727000006
のいずれか１つによって表される式Ｉの化合物、若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
別の実施形態において、本発明は、式５ｊ～５ｒ、５ｔ～５ｖ又は１２ａ～１２ｍ及び１２ｏ～１２ｑのいずれか１つの化合物並びに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を包含する。
本発明の実施形態は、５ｓ、
Figure 2024515727000007
によって表される化合物を包含する。
本発明の別の実施形態は、治療有効量の式Ｉの構造の化合物を対象に投与することによって、それを必要とする対象において癌を治療する方法であって、式Ｉの構造は、
Figure 2024515727000008
であり、
式中、
Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり、又は
一緒になった場合、Ｒ４及びＲ５は、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せである、方法を包含する。本方法の更に別の実施形態では、癌は、薬剤耐性腫瘍、転移性癌；又は薬剤耐性癌の少なくとも１つである。本方法の一実施形態において、癌は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、頭頚部癌、膵臓癌、食道癌、腎臓癌又はＣＮＳ癌の少なくとも１つである。
本発明の別の実施形態は、治療有効量の式Ｉの構造の化合物を対象に投与することによって、それを必要とする対象において癌を治療する方法であって、式ＩＡの構造は、
Figure 2024515727000009
であり、
式中、
Ｒ１はハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
Ｒ４及びＲ５は一緒になって、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、シクロアルキル又は複素環は、少なくとも１つの不飽和を有してもよく、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せである、方法を包含する。本方法の更に別の実施形態では、癌は、薬剤耐性腫瘍、転移性癌；又は薬剤耐性癌の少なくとも１つである。本方法の一実施形態において、癌は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、頭頚部癌、膵臓癌、食道癌、腎臓癌又はＣＮＳ癌の少なくとも１つである。
本発明の一実施形態は、治療有効量の式ＩＩの構造の化合物を対象に投与することによって、それを必要とする対象において癌を治療する方法であって、式ＩＩの構造は、
Figure 2024515727000010
であり、
式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり、又は
一緒になった場合、Ｒ４及びＲ５は、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せである、方法を包含する。別の実施形態において、本発明は、式ＩＩの化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を包含する。本方法の実施形態では、癌は、薬剤耐性腫瘍、転移性癌；又は薬剤耐性癌の少なくとも１つである。本方法の更に別の実施形態では、癌は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、膵臓癌、食道癌、腎臓癌又はＣＮＳ癌のうちの少なくとも１つである。
本発明の一実施形態は、以下の化合物、５ｊ～５ｒ、５ｔ～５ｖ又は１２ａ～１２ｍ及び１２ｏ～１２ｑ、
Figure 2024515727000011
Figure 2024515727000012
のいずれか１つによって表される式Ｉの化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを投与することによって、それを必要とする対象において癌を治療する方法を包含する。
別の実施形態では、本発明は、式５ｊ～５ｒ、５ｔ～５ｖ又は１２ａ～１２ｍ及び１２ｏ～１２ｑのいずれか１つの化合物、若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せ、並びに薬学的に許容される賦形剤を含む癌を治療するための医薬組成物を包含する。
本発明の実施形態は、５ｓ：
Figure 2024515727000013
によって表される化合物で癌を治療することを包含する。
方法の実施形態では、癌は、薬剤耐性腫瘍、転移性癌；又は薬剤耐性癌の少なくとも１つである。本方法の更に別の実施形態において、癌は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、頭頚部癌、膵臓癌、食道癌、腎臓癌又はＣＮＳ癌の少なくとも１つである。
本発明の実施形態は、治療有効量の化合物５ｓ、
Figure 2024515727000014
を投与することによりそれを必要とする対象において癌を治療する方法を包含する。
方法の実施形態では、癌は、薬剤耐性腫瘍、転移性癌；又は薬剤耐性癌の少なくとも１つである。本方法の更に別の実施形態において、癌は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、頭頚部癌、膵臓癌、食道癌、腎臓癌又はＣＮＳ癌の少なくとも１つである。
発明とみなされる主題は、本明細書の結論部分で具体的に指摘され、明確に請求される。しかしながら、本発明は、その目的、特徴、及び利点と共に、操作構成及び方法の両方に関して、添付の図面と共に読まれる場合、以下の詳細な説明を参照することによって最もよく理解され得る。
複素環－ピリドピリミジン１ａ及びジヒドロキノキサリノン２ａ、並びにチューブリン中のコルヒチン部位との結合を示す２ａのＸ線結晶構造を示す。 本発明の化合物例えば、５ｊ、５ｌ、５ｍ、５ｒ、及び５ｔの例を示す。 修飾されたＡ－及びＢ－環ジヒドロキノキサリノン類縁体の合成を示す。 エチルアミン置換Ｂ－環ジヒドロキノキサリノン類縁体５ｔ～５ｕの合成を示す。 化合物５ｍ及び５ｔとチューブリンとの結合パターン並びに細胞内での化合物の局在化を示す。図５Ａは、ウシ脳起源のチューブリンタンパク質を用いた５ｍ（１０μＭ）及び５ｔ（１０μＭ）のチューブリン重合アッセイを示す。同一濃度のコルヒチン及びパクリタキセルを使用し、コルヒチンを陽性対照として使用し、パクリタキセルを陰性対照として使用した。図５Ｂは、２ｎＭのコルヒチン、パクリタキセル、５ｍ及び５ｔのインビトロでの処置後の間期（上）及び有糸分裂（下）におけるＡ３７５／ＴｘＲ黒色腫細胞の形態及びα－チューブリン分布の比較を示す。 化合物５ｍ及び５ｔとチューブリンとの結合パターン並びに細胞内での化合物の局在化を示す。図５Ａは、ウシ脳起源のチューブリンタンパク質を用いた５ｍ（１０μＭ）及び５ｔ（１０μＭ）のチューブリン重合アッセイを示す。同一濃度のコルヒチン及びパクリタキセルを使用し、コルヒチンを陽性対照として使用し、パクリタキセルを陰性対照として使用した。図５Ｂは、２ｎＭのコルヒチン、パクリタキセル、５ｍ及び５ｔのインビトロでの処置後の間期（上）及び有糸分裂（下）におけるＡ３７５／ＴｘＲ黒色腫細胞の形態及びα－チューブリン分布の比較を示す。 ２ａ、５ｊ、５ｋ、５ｌ、５ｍ、５ｔ及びコルヒチンとの複合体中のチューブリン－ＲＢ３－ＳＬＤ－ＴＴＬタンパク質のＸ線共結晶構造を示す。図６Ａは、２．６Å分解能での２ａとの複合体を示す。図６Ｂは、２．９Å分解能での５ｊとの複合体を示す。図６Ｃは、２．８Å分解能での５ｋとの複合体を示す。図６Ｄは、２．９Å分解能での５ｌとの複合体を示す。図６Ｅは、２．７Å分解能での５ｍとの複合体を示す。図６Ｆは、２．９Å分解能での５ｔとの複合体を示す。図６Ｇは、５ｍ及び５ｔとの複合体の重なりを示す。図６Ｈは、コルヒチン結合チューブリン複合体（ＰＤＢ ５ ＸＩＷ）との複合体を示す。図６Ａ～６Ｈでは、チューブリンα－モノマーをシアンで示し、β－モノマーを金色で示す。 ２ａ、５ｊ、５ｋ、５ｌ、５ｍ、５ｔ及びコルヒチンとの複合体中のチューブリン－ＲＢ３－ＳＬＤ－ＴＴＬタンパク質のＸ線共結晶構造を示す。図６Ａは、２．６Å分解能での２ａとの複合体を示す。図６Ｂは、２．９Å分解能での５ｊとの複合体を示す。図６Ｃは、２．８Å分解能での５ｋとの複合体を示す。図６Ｄは、２．９Å分解能での５ｌとの複合体を示す。図６Ｅは、２．７Å分解能での５ｍとの複合体を示す。図６Ｆは、２．９Å分解能での５ｔとの複合体を示す。図６Ｇは、５ｍ及び５ｔとの複合体の重なりを示す。図６Ｈは、コルヒチン結合チューブリン複合体（ＰＤＢ ５ ＸＩＷ）との複合体を示す。図６Ａ～６Ｈでは、チューブリンα－モノマーをシアンで示し、β－モノマーを金色で示す。 ２ａ、５ｊ、５ｋ、５ｌ、５ｍ、５ｔ及びコルヒチンとの複合体中のチューブリン－ＲＢ３－ＳＬＤ－ＴＴＬタンパク質のＸ線共結晶構造を示す。図６Ａは、２．６Å分解能での２ａとの複合体を示す。図６Ｂは、２．９Å分解能での５ｊとの複合体を示す。図６Ｃは、２．８Å分解能での５ｋとの複合体を示す。図６Ｄは、２．９Å分解能での５ｌとの複合体を示す。図６Ｅは、２．７Å分解能での５ｍとの複合体を示す。図６Ｆは、２．９Å分解能での５ｔとの複合体を示す。図６Ｇは、５ｍ及び５ｔとの複合体の重なりを示す。図６Ｈは、コルヒチン結合チューブリン複合体（ＰＤＢ ５ ＸＩＷ）との複合体を示す。図６Ａ～６Ｈでは、チューブリンα－モノマーをシアンで示し、β－モノマーを金色で示す。 ２ａ、５ｊ、５ｋ、５ｌ、５ｍ、５ｔ及びコルヒチンとの複合体中のチューブリン－ＲＢ３－ＳＬＤ－ＴＴＬタンパク質のＸ線共結晶構造を示す。図６Ａは、２．６Å分解能での２ａとの複合体を示す。図６Ｂは、２．９Å分解能での５ｊとの複合体を示す。図６Ｃは、２．８Å分解能での５ｋとの複合体を示す。図６Ｄは、２．９Å分解能での５ｌとの複合体を示す。図６Ｅは、２．７Å分解能での５ｍとの複合体を示す。図６Ｆは、２．９Å分解能での５ｔとの複合体を示す。図６Ｇは、５ｍ及び５ｔとの複合体の重なりを示す。図６Ｈは、コルヒチン結合チューブリン複合体（ＰＤＢ ５ ＸＩＷ）との複合体を示す。図６Ａ～６Ｈでは、チューブリンα－モノマーをシアンで示し、β－モノマーを金色で示す。 ２ａ、５ｊ、５ｋ、５ｌ、５ｍ、５ｔ及びコルヒチンとの複合体中のチューブリン－ＲＢ３－ＳＬＤ－ＴＴＬタンパク質のＸ線共結晶構造を示す。図６Ａは、２．６Å分解能での２ａとの複合体を示す。図６Ｂは、２．９Å分解能での５ｊとの複合体を示す。図６Ｃは、２．８Å分解能での５ｋとの複合体を示す。図６Ｄは、２．９Å分解能での５ｌとの複合体を示す。図６Ｅは、２．７Å分解能での５ｍとの複合体を示す。図６Ｆは、２．９Å分解能での５ｔとの複合体を示す。図６Ｇは、５ｍ及び５ｔとの複合体の重なりを示す。図６Ｈは、コルヒチン結合チューブリン複合体（ＰＤＢ ５ ＸＩＷ）との複合体を示す。図６Ａ～６Ｈでは、チューブリンα－モノマーをシアンで示し、β－モノマーを金色で示す。 ２ａ、５ｊ、５ｋ、５ｌ、５ｍ、５ｔ及びコルヒチンとの複合体中のチューブリン－ＲＢ３－ＳＬＤ－ＴＴＬタンパク質のＸ線共結晶構造を示す。図６Ａは、２．６Å分解能での２ａとの複合体を示す。図６Ｂは、２．９Å分解能での５ｊとの複合体を示す。図６Ｃは、２．８Å分解能での５ｋとの複合体を示す。図６Ｄは、２．９Å分解能での５ｌとの複合体を示す。図６Ｅは、２．７Å分解能での５ｍとの複合体を示す。図６Ｆは、２．９Å分解能での５ｔとの複合体を示す。図６Ｇは、５ｍ及び５ｔとの複合体の重なりを示す。図６Ｈは、コルヒチン結合チューブリン複合体（ＰＤＢ ５ ＸＩＷ）との複合体を示す。図６Ａ～６Ｈでは、チューブリンα－モノマーをシアンで示し、β－モノマーを金色で示す。 ２ａ、５ｊ、５ｋ、５ｌ、５ｍ、５ｔ及びコルヒチンとの複合体中のチューブリン－ＲＢ３－ＳＬＤ－ＴＴＬタンパク質のＸ線共結晶構造を示す。図６Ａは、２．６Å分解能での２ａとの複合体を示す。図６Ｂは、２．９Å分解能での５ｊとの複合体を示す。図６Ｃは、２．８Å分解能での５ｋとの複合体を示す。図６Ｄは、２．９Å分解能での５ｌとの複合体を示す。図６Ｅは、２．７Å分解能での５ｍとの複合体を示す。図６Ｆは、２．９Å分解能での５ｔとの複合体を示す。図６Ｇは、５ｍ及び５ｔとの複合体の重なりを示す。図６Ｈは、コルヒチン結合チューブリン複合体（ＰＤＢ ５ ＸＩＷ）との複合体を示す。図６Ａ～６Ｈでは、チューブリンα－モノマーをシアンで示し、β－モノマーを金色で示す。 ２ａ、５ｊ、５ｋ、５ｌ、５ｍ、５ｔ及びコルヒチンとの複合体中のチューブリン－ＲＢ３－ＳＬＤ－ＴＴＬタンパク質のＸ線共結晶構造を示す。図６Ａは、２．６Å分解能での２ａとの複合体を示す。図６Ｂは、２．９Å分解能での５ｊとの複合体を示す。図６Ｃは、２．８Å分解能での５ｋとの複合体を示す。図６Ｄは、２．９Å分解能での５ｌとの複合体を示す。図６Ｅは、２．７Å分解能での５ｍとの複合体を示す。図６Ｆは、２．９Å分解能での５ｔとの複合体を示す。図６Ｇは、５ｍ及び５ｔとの複合体の重なりを示す。図６Ｈは、コルヒチン結合チューブリン複合体（ＰＤＢ ５ ＸＩＷ）との複合体を示す。図６Ａ～６Ｈでは、チューブリンα－モノマーをシアンで示し、β－モノマーを金色で示す。 コロニー形成アッセイに対する化合物５ｍ及び５ｔの効果を示す。図７Ａは、５ｍを様々な濃度で１週間処理した後のＡ３７５／ＴｘＲ細胞の代表的なコロニー形成画像を示す。図７Ｂは、５ｔを様々な濃度で１週間処理した後のＡ３７５／ＴｘＲ細胞の代表的なコロニー形成画像を示す。コロニー形成率を、コロニー面積密度の％±ＳＥＭとして表す。＊＊＊ｐ＝０．０００４、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 コロニー形成アッセイに対する化合物５ｍ及び５ｔの効果を示す。図７Ａは、５ｍを様々な濃度で１週間処理した後のＡ３７５／ＴｘＲ細胞の代表的なコロニー形成画像を示す。図７Ｂは、５ｔを様々な濃度で１週間処理した後のＡ３７５／ＴｘＲ細胞の代表的なコロニー形成画像を示す。コロニー形成率を、コロニー面積密度の％±ＳＥＭとして表す。＊＊＊ｐ＝０．０００４、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図８Ａ及び８Ｂは、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞遊走に対する化合物５ｍ及び５ｔの効果を示す。ひっかき傷は、ｗｏｕｎｄ ｍａｋｅｒによって作製した。図８Ａは、５ｍでの１２時間又は２４時間の処理後にＩｎｃｕＣｙｔｅによって撮像した創傷治癒の代表的な画像を示し、青線は、細胞単層の創傷縁部を示す。図８Ｂは、５ｔでの１２時間又は２４時間の処理後にＩｎｃｕＣｙｔｅによって撮像した創傷治癒の代表的な画像を示し、青線は、細胞単層の創傷縁部を示す。創傷閉鎖は、各時点での相対的創傷密度のパーセントとして示す。 化合物５ｍ及び５ｔがＡ３７５／ＴｘＲ細胞のＧ２／Ｍ期細胞周期停止及び細胞アポトーシスを誘導したことを示す。図９Ａは、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞に対する化合物５ｍ及び５ｔの細胞周期分析を示す。Ａ３７５／ＴｘＲ細胞を、血清飢餓無しで１ｎＭ、２ｎＭ及び５ｎＭの５ｍ又は５ｔと共に２４時間インキュベートした。細胞を回収し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、次いでフローサイトメトリーによって分析した。細胞周期分布の定量化を、３連の２個の独立した実験に基づいてＧｒａｐｈＰａｄによって分析した。図９Ｂは、化合物５ｍ及び５ｔによる細胞アポトーシスの誘導を示す。Ａ３７５／ＴｘＲ細胞を、パネルＡに示す濃度範囲の５ｍ又は５ｔで２４時間処理した。細胞を収集し、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ及びＰＩで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。右側のヒストグラムは、３連の２個の独立した実験の初期及び後期アポトーシス細胞の合計のパーセンテージを表す。＊＊＊ｐ＝０．０００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照。 化合物５ｍ及び５ｔがＡ３７５／ＴｘＲ細胞のＧ２／Ｍ期細胞周期停止及び細胞アポトーシスを誘導したことを示す。図９Ａは、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞に対する化合物５ｍ及び５ｔの細胞周期分析を示す。Ａ３７５／ＴｘＲ細胞を、血清飢餓無しで１ｎＭ、２ｎＭ及び５ｎＭの５ｍ又は５ｔと共に２４時間インキュベートした。細胞を回収し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、次いでフローサイトメトリーによって分析した。細胞周期分布の定量化を、３連の２個の独立した実験に基づいてＧｒａｐｈＰａｄによって分析した。図９Ｂは、化合物５ｍ及び５ｔによる細胞アポトーシスの誘導を示す。Ａ３７５／ＴｘＲ細胞を、パネルＡに示す濃度範囲の５ｍ又は５ｔで２４時間処理した。細胞を収集し、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ及びＰＩで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。右側のヒストグラムは、３連の２個の独立した実験の初期及び後期アポトーシス細胞の合計のパーセンテージを表す。＊＊＊ｐ＝０．０００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照。 Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植試験における腫瘍増殖のジヒドロキノキサリノンピリミジン類縁体５ｍ阻害を示す。この試験では、１０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル処置を参照対照として含めた。５ｍを、週２回毎に２種類の異なる用量（２及び４ｍｇ／ｋｇ）で静脈内（ＩＶ）投与した。同様に、パクリタキセルを５ｍと同じ頻度で１０ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の用量で投与した。図１０Ａは、接種された腫瘍の腫瘍増殖を示し、図１０Ｂは、治療中に測定されたマウス体重を示す。図１０Ｃは、処置の２１日後に切除された腫瘍の最終重量を示す。図１０Ｄは、撮像した全ての腫瘍を有する画像を示す。群間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネット多重比較検定によって決定した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。データ＝平均±ＳＤ。 Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植試験における腫瘍増殖のジヒドロキノキサリノンピリミジン類縁体５ｍ阻害を示す。この試験では、１０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル処置を参照対照として含めた。５ｍを、週２回毎に２種類の異なる用量（２及び４ｍｇ／ｋｇ）で静脈内（ＩＶ）投与した。同様に、パクリタキセルを５ｍと同じ頻度で１０ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の用量で投与した。図１０Ａは、接種された腫瘍の腫瘍増殖を示し、図１０Ｂは、治療中に測定されたマウス体重を示す。図１０Ｃは、処置の２１日後に切除された腫瘍の最終重量を示す。図１０Ｄは、撮像した全ての腫瘍を有する画像を示す。群間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネット多重比較検定によって決定した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。データ＝平均±ＳＤ。 Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植試験における腫瘍増殖のジヒドロキノキサリノンピリミジン類縁体５ｍ阻害を示す。この試験では、１０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル処置を参照対照として含めた。５ｍを、週２回毎に２種類の異なる用量（２及び４ｍｇ／ｋｇ）で静脈内（ＩＶ）投与した。同様に、パクリタキセルを５ｍと同じ頻度で１０ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の用量で投与した。図１０Ａは、接種された腫瘍の腫瘍増殖を示し、図１０Ｂは、治療中に測定されたマウス体重を示す。図１０Ｃは、処置の２１日後に切除された腫瘍の最終重量を示す。図１０Ｄは、撮像した全ての腫瘍を有する画像を示す。群間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネット多重比較検定によって決定した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。データ＝平均±ＳＤ。 Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植試験における腫瘍増殖のジヒドロキノキサリノンピリミジン類縁体５ｍ阻害を示す。この試験では、１０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル処置を参照対照として含めた。５ｍを、週２回毎に２種類の異なる用量（２及び４ｍｇ／ｋｇ）で静脈内（ＩＶ）投与した。同様に、パクリタキセルを５ｍと同じ頻度で１０ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の用量で投与した。図１０Ａは、接種された腫瘍の腫瘍増殖を示し、図１０Ｂは、治療中に測定されたマウス体重を示す。図１０Ｃは、処置の２１日後に切除された腫瘍の最終重量を示す。図１０Ｄは、撮像した全ての腫瘍を有する画像を示す。群間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネット多重比較検定によって決定した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。データ＝平均±ＳＤ。 ジヒドロキノキサリノンピリミジン類縁体５ｔが、ＮＳＧマウスにおけるＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖を阻害したことを示す。マウスを週２回、２．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ５ｔの静脈内注射で処置した。パクリタキセル処置群（１０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として使用した。図１１Ａは、接種されたＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖曲線を示す。図１１Ｂは、マウスの体重変化をグラフで示す。図１１Ｃは、試験エンドポイントでの最終腫瘍重量をグラフで示す。図１１Ｄは、この試験における代表的な腫瘍画像を示す。データは平均±ＳＤとして示す。一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、続けてダネットの多重比較検定によって分析した、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照。 ジヒドロキノキサリノンピリミジン類縁体５ｔが、ＮＳＧマウスにおけるＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖を阻害したことを示す。マウスを週２回、２．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ５ｔの静脈内注射で処置した。パクリタキセル処置群（１０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として使用した。図１１Ａは、接種されたＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖曲線を示す。図１１Ｂは、マウスの体重変化をグラフで示す。図１１Ｃは、試験エンドポイントでの最終腫瘍重量をグラフで示す。図１１Ｄは、この試験における代表的な腫瘍画像を示す。データは平均±ＳＤとして示す。一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、続けてダネットの多重比較検定によって分析した、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照。 ジヒドロキノキサリノンピリミジン類縁体５ｔが、ＮＳＧマウスにおけるＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖を阻害したことを示す。マウスを週２回、２．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ５ｔの静脈内注射で処置した。パクリタキセル処置群（１０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として使用した。図１１Ａは、接種されたＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖曲線を示す。図１１Ｂは、マウスの体重変化をグラフで示す。図１１Ｃは、試験エンドポイントでの最終腫瘍重量をグラフで示す。図１１Ｄは、この試験における代表的な腫瘍画像を示す。データは平均±ＳＤとして示す。一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、続けてダネットの多重比較検定によって分析した、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照。 ジヒドロキノキサリノンピリミジン類縁体５ｔが、ＮＳＧマウスにおけるＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖を阻害したことを示す。マウスを週２回、２．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ５ｔの静脈内注射で処置した。パクリタキセル処置群（１０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として使用した。図１１Ａは、接種されたＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖曲線を示す。図１１Ｂは、マウスの体重変化をグラフで示す。図１１Ｃは、試験エンドポイントでの最終腫瘍重量をグラフで示す。図１１Ｄは、この試験における代表的な腫瘍画像を示す。データは平均±ＳＤとして示す。一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、続けてダネットの多重比較検定によって分析した、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照。 ５ｍ又は５ｔ処置によって引き起こされたＡ３７５／ＴｘＲ腫瘍の壊死を示す。腫瘍を採取し、固定し、包埋し、切片化し、ヘマトキシリン及びｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｌｉｎ（Ｈ＆Ｅ）で染色し、５ｍ異種移植モデル（５ｍモデル、上パネル）及び５ｔ異種移植モデル（下パネル）のスライドをＰａｎｏｒａｍｉｃ ＦＬＡＳＨ ＩＩＩシステムによってスキャンし、ＣａｓｅＶｉｅｗｅｒを使用して代表的な画像を撮像した。 Ａ３７５／ＴｘＲ皮下異種移植モデルにおける化合物５ｍによる抗肺及び肝自然転移効果を示す。処置の２１日後、図１０Ａ～Ｄに記載されるＡ３７５／ＴｘＲ腫瘍を担持するマウスを屠殺し、肺及び肝臓組織を採取し、固定し、Ｈ＆Ｅ又は抗ヒトミトコンドリア抗体で染色した。図１３Ａは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像の転移領域の割合を平均することによって、全てのマウスにおいて計数された肺転移の数を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。図１３Ｂは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像の転移領域の割合を平均することによって、全てのマウスにおいて計数された肝転移の数を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。図１３Ｃは、ビヒクル又はパクリタキセル処置マウスにおいて黒色腫転移の存在を確認し、５ｍ処置で転移が減少した肺組織の抗ヒトミトコンドリア免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を示す。図１３Ｄは、ビヒクル又はパクリタキセル処置マウスにおいて黒色腫転移の存在を確認し、５ｍ処置で転移が減少した肝臓組織の抗ヒトミトコンドリアＩＨＣ染色を示す。画像は、ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡によって取得し、褐色染色は転移を示す。 Ａ３７５／ＴｘＲ皮下異種移植モデルにおける化合物５ｍによる抗肺及び肝自然転移効果を示す。処置の２１日後、図１０Ａ～Ｄに記載されるＡ３７５／ＴｘＲ腫瘍を担持するマウスを屠殺し、肺及び肝臓組織を採取し、固定し、Ｈ＆Ｅ又は抗ヒトミトコンドリア抗体で染色した。図１３Ａは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像の転移領域の割合を平均することによって、全てのマウスにおいて計数された肺転移の数を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。図１３Ｂは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像の転移領域の割合を平均することによって、全てのマウスにおいて計数された肝転移の数を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。図１３Ｃは、ビヒクル又はパクリタキセル処置マウスにおいて黒色腫転移の存在を確認し、５ｍ処置で転移が減少した肺組織の抗ヒトミトコンドリア免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を示す。図１３Ｄは、ビヒクル又はパクリタキセル処置マウスにおいて黒色腫転移の存在を確認し、５ｍ処置で転移が減少した肝臓組織の抗ヒトミトコンドリアＩＨＣ染色を示す。画像は、ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡によって取得し、褐色染色は転移を示す。 Ａ３７５／ＴｘＲ皮下異種移植モデルにおける化合物５ｍによる抗肺及び肝自然転移効果を示す。処置の２１日後、図１０Ａ～Ｄに記載されるＡ３７５／ＴｘＲ腫瘍を担持するマウスを屠殺し、肺及び肝臓組織を採取し、固定し、Ｈ＆Ｅ又は抗ヒトミトコンドリア抗体で染色した。図１３Ａは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像の転移領域の割合を平均することによって、全てのマウスにおいて計数された肺転移の数を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。図１３Ｂは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像の転移領域の割合を平均することによって、全てのマウスにおいて計数された肝転移の数を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。図１３Ｃは、ビヒクル又はパクリタキセル処置マウスにおいて黒色腫転移の存在を確認し、５ｍ処置で転移が減少した肺組織の抗ヒトミトコンドリア免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を示す。図１３Ｄは、ビヒクル又はパクリタキセル処置マウスにおいて黒色腫転移の存在を確認し、５ｍ処置で転移が減少した肝臓組織の抗ヒトミトコンドリアＩＨＣ染色を示す。画像は、ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡によって取得し、褐色染色は転移を示す。 Ａ３７５／ＴｘＲ皮下異種移植モデルにおける化合物５ｍによる抗肺及び肝自然転移効果を示す。処置の２１日後、図１０Ａ～Ｄに記載されるＡ３７５／ＴｘＲ腫瘍を担持するマウスを屠殺し、肺及び肝臓組織を採取し、固定し、Ｈ＆Ｅ又は抗ヒトミトコンドリア抗体で染色した。図１３Ａは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像の転移領域の割合を平均することによって、全てのマウスにおいて計数された肺転移の数を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。図１３Ｂは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像の転移領域の割合を平均することによって、全てのマウスにおいて計数された肝転移の数を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照）。図１３Ｃは、ビヒクル又はパクリタキセル処置マウスにおいて黒色腫転移の存在を確認し、５ｍ処置で転移が減少した肺組織の抗ヒトミトコンドリア免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を示す。図１３Ｄは、ビヒクル又はパクリタキセル処置マウスにおいて黒色腫転移の存在を確認し、５ｍ処置で転移が減少した肝臓組織の抗ヒトミトコンドリアＩＨＣ染色を示す。画像は、ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡によって取得し、褐色染色は転移を示す。 肺又は肝臓の自然転移における５ｔのインビボ有効性を示す。図１４Ａは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像における転移領域の割合の平均を計数することによる、肺に存在する転移の定量化を示す平均±ＳＥＭの散布図を示す（対照に対して＊ｐ＝０．０１６、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１４Ｂは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像における転移領域の割合の平均を計数することによる、肝臓に存在する転移の定量化を示す平均±ＳＥＭの散布図を示す（対照に対して＊ｐ＝０．０１６、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１４Ｃは、肺切片における転移を検出するための抗ヒト特異的ミトコンドリアについてのＩＨＣ染色を示す。図１４Ｄは、肝臓切片における転移を検出するための抗ヒト特異的ミトコンドリアについてのＩＨＣ染色を示す。画像は、ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡によって取得し、褐色染色は転移を示す。 肺又は肝臓の自然転移における５ｔのインビボ有効性を示す。図１４Ａは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像における転移領域の割合の平均を計数することによる、肺に存在する転移の定量化を示す平均±ＳＥＭの散布図を示す（対照に対して＊ｐ＝０．０１６、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１４Ｂは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像における転移領域の割合の平均を計数することによる、肝臓に存在する転移の定量化を示す平均±ＳＥＭの散布図を示す（対照に対して＊ｐ＝０．０１６、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１４Ｃは、肺切片における転移を検出するための抗ヒト特異的ミトコンドリアについてのＩＨＣ染色を示す。図１４Ｄは、肝臓切片における転移を検出するための抗ヒト特異的ミトコンドリアについてのＩＨＣ染色を示す。画像は、ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡によって取得し、褐色染色は転移を示す。 肺又は肝臓の自然転移における５ｔのインビボ有効性を示す。図１４Ａは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像における転移領域の割合の平均を計数することによる、肺に存在する転移の定量化を示す平均±ＳＥＭの散布図を示す（対照に対して＊ｐ＝０．０１６、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１４Ｂは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像における転移領域の割合の平均を計数することによる、肝臓に存在する転移の定量化を示す平均±ＳＥＭの散布図を示す（対照に対して＊ｐ＝０．０１６、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１４Ｃは、肺切片における転移を検出するための抗ヒト特異的ミトコンドリアについてのＩＨＣ染色を示す。図１４Ｄは、肝臓切片における転移を検出するための抗ヒト特異的ミトコンドリアについてのＩＨＣ染色を示す。画像は、ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡によって取得し、褐色染色は転移を示す。 肺又は肝臓の自然転移における５ｔのインビボ有効性を示す。図１４Ａは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像における転移領域の割合の平均を計数することによる、肺に存在する転移の定量化を示す平均±ＳＥＭの散布図を示す（対照に対して＊ｐ＝０．０１６、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１４Ｂは、各マウスの３～４個の代表的なＨ＆Ｅ画像における転移領域の割合の平均を計数することによる、肝臓に存在する転移の定量化を示す平均±ＳＥＭの散布図を示す（対照に対して＊ｐ＝０．０１６、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図１４Ｃは、肺切片における転移を検出するための抗ヒト特異的ミトコンドリアについてのＩＨＣ染色を示す。図１４Ｄは、肝臓切片における転移を検出するための抗ヒト特異的ミトコンドリアについてのＩＨＣ染色を示す。画像は、ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡によって取得し、褐色染色は転移を示す。 ５ｍ皮下異種移植モデルの肺及び肝臓組織における腫瘍結節の組織病理学的評価を示す。図１５Ａは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセル、２ｍｇ／ｋｇ５ｍ及び４ｍｇ／ｋｇ５ｍで２１日間処置したマウスにおける肺の代表的なＨ＆Ｅ染色画像を示す。図１５Ｂは、図１５Ａと同じ処置群において採取された肝臓の代表的なＨ＆Ｅ染色画像を示し、両方の図において、転移の例は黄色の矢印によって示される。 ５ｍ皮下異種移植モデルの肺及び肝臓組織における腫瘍結節の組織病理学的評価を示す。図１５Ａは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセル、２ｍｇ／ｋｇ５ｍ及び４ｍｇ／ｋｇ５ｍで２１日間処置したマウスにおける肺の代表的なＨ＆Ｅ染色画像を示す。図１５Ｂは、図１５Ａと同じ処置群において採取された肝臓の代表的なＨ＆Ｅ染色画像を示し、両方の図において、転移の例は黄色の矢印によって示される。 抗ヒトミトコンドリア抗体で染色した後２１日間ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセル、２ｍｇ／ｋｇ５ｍ及び４ｍｇ／ｋｇ５ｍで処置した全肺及び肝臓の代表的な画像により、化合物５ｍが、抗ヒトミトコンドリアＩＨＣ染色において強力な抗転移効果を示したことを示す。褐色染色は、ビヒクル又はパクリタキセル群と比較して、５ｍ処理肺で減少し、５ｍ処理群の肝臓は、ビヒクル又はパクリタキセル群よりも明瞭だった。 ５ｔ皮下異種移植モデルにおける組織の黒色腫転移の組織病理学的評価を示す。図１７Ａは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセル、２．５ｍｇ／ｋｇ５ｔ及び５ｍｇ／ｋｇ５ｔで２４日間処置したマウスにおける肺の代表的なＨ＆Ｅ染色画像を示す。図１７Ｂは、図１７Ａと同じ処置群における肝臓の代表的なＨ＆Ｅ染色画像を示す。 ５ｔ皮下異種移植モデルにおける組織の黒色腫転移の組織病理学的評価を示す。図１７Ａは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセル、２．５ｍｇ／ｋｇ５ｔ及び５ｍｇ／ｋｇ５ｔで２４日間処置したマウスにおける肺の代表的なＨ＆Ｅ染色画像を示す。図１７Ｂは、図１７Ａと同じ処置群における肝臓の代表的なＨ＆Ｅ染色画像を示す。 化合物５ｔ処置により、抗ヒトミトコンドリアＩＨＣ染色において黒色腫転移が減少したことを示す。図１８は、抗ヒトミトコンドリア抗体で染色した後２４日間、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセル、２．５ｍｇ／ｋｇ５ｔ及び５ｍｇ／ｋｇ５ｔで処置した全肺及び肝臓の代表的な画像を示し、ビヒクル又はパクリタキセル群と比較して、化合物５ｔ処置肺又は肝臓では、褐色染色が減少した。 化合物５ｍ処置が、タキサン耐性黒色腫（Ａ３７５／ＴｘＲ）、化合物１７ｙａ耐性前立腺癌（ＤＵ－１４５／ＶｘＲ）、タキサン及び化合物１７ｙａ耐性乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ）、去勢抵抗性前立腺癌（２２ＲＶ１）、及びタキサン耐性卵巣癌（Ａ２７８０／ＴｘＲ）を含む様々な癌に由来する異種移植片においてタキサン耐性及び／若しくは化合物１７ｙａ耐性又は去勢抵抗性を強力に克服することができることを示す。図１９Ａは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、又は２ｍｇ／ｋｇ若しくは４ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｂは、ビヒクル（対照）、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＤＵ－１４５／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｃは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＰ、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は２ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｄは、ビヒクル（対照）又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおける２２ＲＶ１異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｅは、ビヒクル（対照）、５ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶ、又は２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯでの処置による、マウスの左卵巣（右卵巣は、図に示すように、対照として未変化のままだった）において増殖したＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の画像によって示される腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｆは、図１９Ｅに示されるこれらのＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の腫瘍重量を示す。図１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｅ及び１９Ｆに示されるデータは、５ｍが１７ｙａと比較して予想外に優れた活性を有したことを実証する。データを平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して二元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネットの多重比較検定を分析した。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。 化合物５ｍ処置が、タキサン耐性黒色腫（Ａ３７５／ＴｘＲ）、化合物１７ｙａ耐性前立腺癌（ＤＵ－１４５／ＶｘＲ）、タキサン及び化合物１７ｙａ耐性乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ）、去勢抵抗性前立腺癌（２２ＲＶ１）、及びタキサン耐性卵巣癌（Ａ２７８０／ＴｘＲ）を含む様々な癌に由来する異種移植片においてタキサン耐性及び／若しくは化合物１７ｙａ耐性又は去勢抵抗性を強力に克服することができることを示す。図１９Ａは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、又は２ｍｇ／ｋｇ若しくは４ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｂは、ビヒクル（対照）、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＤＵ－１４５／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｃは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＰ、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は２ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｄは、ビヒクル（対照）又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおける２２ＲＶ１異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｅは、ビヒクル（対照）、５ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶ、又は２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯでの処置による、マウスの左卵巣（右卵巣は、図に示すように、対照として未変化のままだった）において増殖したＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の画像によって示される腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｆは、図１９Ｅに示されるこれらのＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の腫瘍重量を示す。図１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｅ及び１９Ｆに示されるデータは、５ｍが１７ｙａと比較して予想外に優れた活性を有したことを実証する。データを平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して二元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネットの多重比較検定を分析した。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。 化合物５ｍ処置が、タキサン耐性黒色腫（Ａ３７５／ＴｘＲ）、化合物１７ｙａ耐性前立腺癌（ＤＵ－１４５／ＶｘＲ）、タキサン及び化合物１７ｙａ耐性乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ）、去勢抵抗性前立腺癌（２２ＲＶ１）、及びタキサン耐性卵巣癌（Ａ２７８０／ＴｘＲ）を含む様々な癌に由来する異種移植片においてタキサン耐性及び／若しくは化合物１７ｙａ耐性又は去勢抵抗性を強力に克服することができることを示す。図１９Ａは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、又は２ｍｇ／ｋｇ若しくは４ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｂは、ビヒクル（対照）、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＤＵ－１４５／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｃは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＰ、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は２ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｄは、ビヒクル（対照）又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおける２２ＲＶ１異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｅは、ビヒクル（対照）、５ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶ、又は２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯでの処置による、マウスの左卵巣（右卵巣は、図に示すように、対照として未変化のままだった）において増殖したＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の画像によって示される腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｆは、図１９Ｅに示されるこれらのＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の腫瘍重量を示す。図１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｅ及び１９Ｆに示されるデータは、５ｍが１７ｙａと比較して予想外に優れた活性を有したことを実証する。データを平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して二元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネットの多重比較検定を分析した。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。 化合物５ｍ処置が、タキサン耐性黒色腫（Ａ３７５／ＴｘＲ）、化合物１７ｙａ耐性前立腺癌（ＤＵ－１４５／ＶｘＲ）、タキサン及び化合物１７ｙａ耐性乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ）、去勢抵抗性前立腺癌（２２ＲＶ１）、及びタキサン耐性卵巣癌（Ａ２７８０／ＴｘＲ）を含む様々な癌に由来する異種移植片においてタキサン耐性及び／若しくは化合物１７ｙａ耐性又は去勢抵抗性を強力に克服することができることを示す。図１９Ａは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、又は２ｍｇ／ｋｇ若しくは４ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｂは、ビヒクル（対照）、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＤＵ－１４５／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｃは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＰ、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は２ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｄは、ビヒクル（対照）又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおける２２ＲＶ１異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｅは、ビヒクル（対照）、５ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶ、又は２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯでの処置による、マウスの左卵巣（右卵巣は、図に示すように、対照として未変化のままだった）において増殖したＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の画像によって示される腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｆは、図１９Ｅに示されるこれらのＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の腫瘍重量を示す。図１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｅ及び１９Ｆに示されるデータは、５ｍが１７ｙａと比較して予想外に優れた活性を有したことを実証する。データを平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して二元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネットの多重比較検定を分析した。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。 化合物５ｍ処置が、タキサン耐性黒色腫（Ａ３７５／ＴｘＲ）、化合物１７ｙａ耐性前立腺癌（ＤＵ－１４５／ＶｘＲ）、タキサン及び化合物１７ｙａ耐性乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ）、去勢抵抗性前立腺癌（２２ＲＶ１）、及びタキサン耐性卵巣癌（Ａ２７８０／ＴｘＲ）を含む様々な癌に由来する異種移植片においてタキサン耐性及び／若しくは化合物１７ｙａ耐性又は去勢抵抗性を強力に克服することができることを示す。図１９Ａは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、又は２ｍｇ／ｋｇ若しくは４ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｂは、ビヒクル（対照）、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＤＵ－１４５／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｃは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＰ、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は２ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｄは、ビヒクル（対照）又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおける２２ＲＶ１異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｅは、ビヒクル（対照）、５ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶ、又は２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯでの処置による、マウスの左卵巣（右卵巣は、図に示すように、対照として未変化のままだった）において増殖したＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の画像によって示される腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｆは、図１９Ｅに示されるこれらのＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の腫瘍重量を示す。図１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｅ及び１９Ｆに示されるデータは、５ｍが１７ｙａと比較して予想外に優れた活性を有したことを実証する。データを平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して二元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネットの多重比較検定を分析した。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。 化合物５ｍ処置が、タキサン耐性黒色腫（Ａ３７５／ＴｘＲ）、化合物１７ｙａ耐性前立腺癌（ＤＵ－１４５／ＶｘＲ）、タキサン及び化合物１７ｙａ耐性乳癌（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ）、去勢抵抗性前立腺癌（２２ＲＶ１）、及びタキサン耐性卵巣癌（Ａ２７８０／ＴｘＲ）を含む様々な癌に由来する異種移植片においてタキサン耐性及び／若しくは化合物１７ｙａ耐性又は去勢抵抗性を強力に克服することができることを示す。図１９Ａは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、又は２ｍｇ／ｋｇ若しくは４ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｂは、ビヒクル（対照）、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＤＵ－１４５／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｃは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＰ、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯ、又は２ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｄは、ビヒクル（対照）又は１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶでの処置による、ＮＳＧマウスにおける２２ＲＶ１異種移植片の腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｅは、ビヒクル（対照）、５ｍｇ／ｋｇパクリタキセルＩＶ、１ｍｇ／ｋｇ５ｍＩＶ、又は２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａＰＯでの処置による、マウスの左卵巣（右卵巣は、図に示すように、対照として未変化のままだった）において増殖したＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の画像によって示される腫瘍増殖阻害を示す。図１９Ｆは、図１９Ｅに示されるこれらのＡ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌異種移植片の腫瘍重量を示す。図１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｅ及び１９Ｆに示されるデータは、５ｍが１７ｙａと比較して予想外に優れた活性を有したことを実証する。データを平均±ＳＥＭとして表し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して二元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネットの多重比較検定を分析した。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。 ５ｍが、Ｍｉａ ＰａＣａ－２及びＰＡＮＣ－１細胞株におけるパクリタキセル（ＰＴＸ）と同等の細胞傷害性効力を、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞において示したことをグラフで示す。 ５ｍが、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞株Ｍｉａ ＰａＣａ－２及びＰＡＮＣ－１において、パクリタキセル（ＰＴＸ）よりも強力なコロニー形成及び細胞遊走の用量応答性阻害を示したことを示す。図２１Ａは、コロニー形成アッセイにおけるＰＤＡＣ細胞の増殖に対する、ビヒクル処置対照（対照）と比較した５ｍ及びＰＴＸの効果を示す。５ｍ又はパクリタキセル（ＰＴＸ）の両化合物を１ｎＭ、２．５ｎＭ及び５ｎＭで処理したＭｉａ ＰａＣａ－２及びＰＡＮＣ－１細胞株におけるコロニー形成を、示された代表的なコロニー形成画像において比較した。棒グラフは、Ｍｉａ ＰａＣａ－２では、コロニー形成が最低用量（１ｎＭ）の５ｍによって完全に阻害され、一方ＰＴＸでは、完全な阻害は５ｎＭでしか見られなかったことを示している。一方、ＰＡＮＣ－１細胞では、コロニー形成の阻害効力は５ｍ及びＰＴＸで同等であり、５ｎＭ用量のみがコロニー形成のほぼ完全な阻害を実証した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図２１Ｂは、ＩｎｃｕＣｙｔｅによって撮像された創傷治癒の代表画像を示す。細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅでライブモニタリングし、写真を２時間毎に取得した。対照（ビヒクル）と比較して、創傷閉鎖は、棒グラフに要約されるように、各時点での創傷幅（ミクロン（μｍ））として示される。５ｍ（２ｎＭ）及びＰＴＸ（４ｎＭ）は両方とも、対照と比較して、Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞培養において４８時間にわたって細胞遊走を阻害した。棒グラフが示すように、５ｍ（２ｎＭ）は、各時点でＰＴＸ（４ｎＭ）と比較して、創傷治癒をより効果的に阻害した。＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ５ｍが、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞株Ｍｉａ ＰａＣａ－２及びＰＡＮＣ－１において、パクリタキセル（ＰＴＸ）よりも強力なコロニー形成及び細胞遊走の用量応答性阻害を示したことを示す。図２１Ａは、コロニー形成アッセイにおけるＰＤＡＣ細胞の増殖に対する、ビヒクル処置対照（対照）と比較した５ｍ及びＰＴＸの効果を示す。５ｍ又はパクリタキセル（ＰＴＸ）の両化合物を１ｎＭ、２．５ｎＭ及び５ｎＭで処理したＭｉａ ＰａＣａ－２及びＰＡＮＣ－１細胞株におけるコロニー形成を、示された代表的なコロニー形成画像において比較した。棒グラフは、Ｍｉａ ＰａＣａ－２では、コロニー形成が最低用量（１ｎＭ）の５ｍによって完全に阻害され、一方ＰＴＸでは、完全な阻害は５ｎＭでしか見られなかったことを示している。一方、ＰＡＮＣ－１細胞では、コロニー形成の阻害効力は５ｍ及びＰＴＸで同等であり、５ｎＭ用量のみがコロニー形成のほぼ完全な阻害を実証した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図２１Ｂは、ＩｎｃｕＣｙｔｅによって撮像された創傷治癒の代表画像を示す。細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅでライブモニタリングし、写真を２時間毎に取得した。対照（ビヒクル）と比較して、創傷閉鎖は、棒グラフに要約されるように、各時点での創傷幅（ミクロン（μｍ））として示される。５ｍ（２ｎＭ）及びＰＴＸ（４ｎＭ）は両方とも、対照と比較して、Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞培養において４８時間にわたって細胞遊走を阻害した。棒グラフが示すように、５ｍ（２ｎＭ）は、各時点でＰＴＸ（４ｎＭ）と比較して、創傷治癒をより効果的に阻害した。＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 化合物５ｍが用量依存的にＧ２／Ｍ期で細胞周期停止を誘導し、細胞アポトーシスを誘導したことを示す。図２２Ａは、化合物５ｍがＰＡＮＣ－１及びＭｉａ ＰａＣａ－２細胞株においてＧ２／Ｍ期の細胞の割合を用量依存的に増加させる能力を示し、ＰＤＡＣ細胞株における有糸分裂停止を示唆する。図２２Ｂは、化合物５ｍ及びＰＴＸが、切断型ＰＡＲＰ対ＰＡＲＰ比の増加によって測定されるように、Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞においてアポトーシスを誘導したことを示す。Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞株における５ｍによるアポトーシスの誘導は用量依存的であり、ＰＴＸと比較して強力だった。例えば、この比は、２０ｎＭのＰＴＸと比較すると、１０ｎＭの５ｍと同等だった。 化合物５ｍが用量依存的にＧ２／Ｍ期で細胞周期停止を誘導し、細胞アポトーシスを誘導したことを示す。図２２Ａは、化合物５ｍがＰＡＮＣ－１及びＭｉａ ＰａＣａ－２細胞株においてＧ２／Ｍ期の細胞の割合を用量依存的に増加させる能力を示し、ＰＤＡＣ細胞株における有糸分裂停止を示唆する。図２２Ｂは、化合物５ｍ及びＰＴＸが、切断型ＰＡＲＰ対ＰＡＲＰ比の増加によって測定されるように、Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞においてアポトーシスを誘導したことを示す。Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞株における５ｍによるアポトーシスの誘導は用量依存的であり、ＰＴＸと比較して強力だった。例えば、この比は、２０ｎＭのＰＴＸと比較すると、１０ｎＭの５ｍと同等だった。 図２３Ａ～Ｅは、５ｍが、Ｍｉａ ＰａＣａ－２－Ｌｕｃ皮下異種移植モデルにおけるＰＤＡＣ腫瘍増殖を阻害し、毒性の徴候は最小限だったことを示す。図２３Ａは、対照（ビヒクル）と比較した、４２日間にわたって測定した腫瘍体積に対する、化合物５ｍ（２ｍｇ／ｋｇ）の効果を示す。分かるように、５ｍ（２ｍｇ／ｋｇ）は、対照に対して腫瘍増殖を有意に減少させた。図２３Ｂは、対照と比較した、４２日間にわたる体重に対する化合物５ｍの効果を示す。体重は、体重変化％で表した。分かるように、対照と比較して体重がわずかに減少する傾向があったので、５ｍでは限られた全体的毒性が観察された。図２３Ｃは、対照と比較した、４２日間にわたって測定したエクスビボ腫瘍体積に対する、化合物５ｍ（２ｍｇ／ｋｇ）の効果をグラフで示す。図２３Ｄは、対照と比較した、４２日間にわたるエクスビボ腫瘍重量に対する化合物５ｍ（２ｍｇ／ｋｇ）の効果をグラフで示す。図２３Ｅは、対照と比較した、化合物５ｍ処置後の切除された腫瘍サイズの比較を示す。図２３に見られるように、腫瘍体積及び腫瘍重量は、４２日間にわたる対照よりも５ｍ（２ｍｇ／ｋｇ）の処置によって有意に減少し、このことは切除された腫瘍の写真においても理解することができる。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。対照群に関連する有意差は、両側独立ウェルチｔ検定又は二元配置ＡＮＯＶＡ、続けてシダック又はダネット多重比較によって測定されるＰ値＜０．０５（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１）によって表される。ＩＣ５０を非線形回帰によって計算した。全てのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を用いて分析した。 図２４Ａ～Ｅは、５ｍが、ＰＡＮＣ－１－Ｌｕｃ皮下異種移植モデルにおいて毒性の徴候無しにＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害したことを示す。５ｍ（１ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇ；１用量／週で７週間）又はビヒクル（対照）を、各ＮＳＧマウス（雄、６～８週齢）の右側腹部にｉ．ｖ．注射によって投与した。腫瘍体積及び体重を週に３回測定した。図２４Ａは、腫瘍体積に対して対照と比較した化合物５ｍの効果を示す。５ｍは、対照と比較して、異種移植片腫瘍増殖を用量依存的に阻害した。図２４Ｂは、体重（体重変化％）に対して対照と比較した化合物５ｍの効果を示す。２用量の５ｍでの処置の４９日後、対照と比較して処置した動物の体重に差は見られず、５ｍが有意な全体的毒性を示さないことが示された。図２４Ｃは、対照と比較した、エクスビボ腫瘍体積（ｍｍ３）に対する化合物５ｍの効果をグラフで示す。図２４Ｄは、対照と比較した、エクスビボ腫瘍重量（ｇ）に対する化合物５ｍの効果をグラフで示す。腫瘍体積についての結果と一致して、５ｍは、エクスビボ腫瘍体積及びエクスビボ腫瘍重量によって測定した異種移植片腫瘍増殖を、対照と比較して用量依存的に阻害した。図２４Ｅは、対照と比較した、化合物５ｍ処置後の切除された腫瘍サイズの比較を写真で示す。腫瘍体積は、式：体積（ｍｍ３）＝０．５×（長さ×幅２）によって計算した。全ての動物を研究の最後に安楽死させた。腫瘍を切除し、エクスビボ重量及びサイズで記録し、画像化した。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。対照群に関連する有意差は、両側独立ウェルチｔ検定、又は一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネット多重比較、又は二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とそれに続くシダック又はダネット多重比較で測定したＰ値＜０．０５（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１）によって示される。ＩＣ５０を非線形回帰によって計算した。全てのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。 図２４Ａ～Ｅは、５ｍが、ＰＡＮＣ－１－Ｌｕｃ皮下異種移植モデルにおいて毒性の徴候無しにＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害したことを示す。５ｍ（１ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇ；１用量／週で７週間）又はビヒクル（対照）を、各ＮＳＧマウス（雄、６～８週齢）の右側腹部にｉ．ｖ．注射によって投与した。腫瘍体積及び体重を週に３回測定した。図２４Ａは、腫瘍体積に対して対照と比較した化合物５ｍの効果を示す。５ｍは、対照と比較して、異種移植片腫瘍増殖を用量依存的に阻害した。図２４Ｂは、体重（体重変化％）に対して対照と比較した化合物５ｍの効果を示す。２用量の５ｍでの処置の４９日後、対照と比較して処置した動物の体重に差は見られず、５ｍが有意な全体的毒性を示さないことが示された。図２４Ｃは、対照と比較した、エクスビボ腫瘍体積（ｍｍ３）に対する化合物５ｍの効果をグラフで示す。図２４Ｄは、対照と比較した、エクスビボ腫瘍重量（ｇ）に対する化合物５ｍの効果をグラフで示す。腫瘍体積についての結果と一致して、５ｍは、エクスビボ腫瘍体積及びエクスビボ腫瘍重量によって測定した異種移植片腫瘍増殖を、対照と比較して用量依存的に阻害した。図２４Ｅは、対照と比較した、化合物５ｍ処置後の切除された腫瘍サイズの比較を写真で示す。腫瘍体積は、式：体積（ｍｍ３）＝０．５×（長さ×幅２）によって計算した。全ての動物を研究の最後に安楽死させた。腫瘍を切除し、エクスビボ重量及びサイズで記録し、画像化した。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。対照群に関連する有意差は、両側独立ウェルチｔ検定、又は一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネット多重比較、又は二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とそれに続くシダック又はダネット多重比較で測定したＰ値＜０．０５（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１）によって示される。ＩＣ５０を非線形回帰によって計算した。全てのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。 化合物１２ａ～ｎの合成スキームを示す。ａ試薬及び条件：（ｉ）ｔ－ＢｕＯＫ／ｔ－ＢｕＯＨ；（ｉｉ）ＰＯＣｌ３、９０℃；（ｉｉｉ）ＩＰＡ／ＨＣｌ、室温、５～６時間；（ｉｖ）Ｚｎ／ＡｃＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２；（ｖ）クロロアセチルクロリド／Ｋ２ＣＯ３、アセトン、０℃；（ｖｉ）ＮａＨ、ＴＨＦ、０℃～室温；（ｖｉｉ）オキソン、メタノール／水、室温。 図２６Ａ～Ｄは、化合物５ｍ（非標識）、１２ｅ、１２ｊ、１２ｋ、及び５ｖを有するチューブリン－ＲＢ ３＿ＳＬＤ （ｓＴ２Ｒ）複合体の結晶構造を示す。Ａは、分解能２．７Åでの化合物５ｍ（非標識）との元の複合体（ＰＤＢ ＩＤ：ＰＤＢ ６Ｘ１Ｆ）を示す。Ｂは、分解能２．２７Åでの化合物１２ｅを含む結晶構造を示す。Ｃは、分解能２．７０Åでの化合物１２ｊを含む結晶構造を示す。Ｄは、分解能２．１０Åでの化合物１２ｋの結晶構造を示す。図２６Ｅは、分解能２．４０Åでの化合物５ｖの結晶構造を示す。チューブリンα－モノマー及びβ－モノマーは、それぞれシアン及び金色で示す。 ４ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後のマウス（ｎ＝３）における１２ｋの血漿中濃度－時間プロファイル（平均±ＳＥＭ）を示す。 図２８Ａ～Ｅは、ＮＳＧ雄マウスにおけるＰＣ３／ＴｘＲ異種移植腫瘍の増殖に対する化合物１２ｋの抗腫瘍有効性を示す。ＰＣ３／ＴｘＲ細胞（３×１０６細胞／マウス）をＮＳＧマウスの右側腹部に皮下接種した（ｎ＝８）。図２８Ａは、対照（ビヒクル）、１０ｍｇ／ｋｇ（１回／週）パクリタキセル、及び化合物２．５ｍｇ／ｋｇ（２回／週）１２ｋでの処置を比較した経時的な腫瘍増殖曲線をグラフで示す。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡ、続けて多重比較検定を使用して決定された。図２８Ｂは、対照、パクリタキセル、及び化合物１２ｋでの治療を比較した、処置日数中の体重変化の割合（体重％）をグラフで示す。図２８Ｃは、対照、パクリタキセル、及び化合物１２ｋでの処置を比較したエクスビボ腫瘍体積をグラフで示す。図２８Ｄは、対照、パクリタキセル、及び化合物１２ｋでの処置後のエクスビボ腫瘍重量をグラフで示す。図２８Ｅは、対照、パクリタキセル、及び化合物１２ｋでの処置後の３５ｍｍペトリ皿中の単離腫瘍の写真を示す。データは平均＋／－ＳＥＭとして示す。群間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネット多重比較検定によって決定した（＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 ５ｖがチューブリン脱重合を誘導し、微小管ネットワークを破壊することを示す。（Ａ）３７°Ｃでブタ脳チューブリン（３ｍｇ／ｍＬ）及びＧＴＰ（１ｍＭ）を含有するチューブリン混合物中、１０μＭの５ｖによってチューブリン脱重合を誘導した。１０μＭのコルヒチン及びパクリタキセルを陽性対照及び陰性対照として使用した。（Ｂ）コルヒチン（２ｎＭ）、パクリタキセル（２ｎＭ）又は５ｖ（１ｎＭ又は２ｎＭ）で２４時間処理した間期又は有糸分裂期のＡ３７５／ＴｘＲ細胞の代表的な免疫蛍光画像。チューブリン（赤色）をα－チューブリン抗体で染色した。核（青色）をＤＡＰＩで染色した。 ５ｖがタキソール感受性及びタキソール耐性癌細胞のパネルに対して増殖阻害効果を示したことを示す。（Ａ）５個のタキソール感受性癌細胞株（Ａ３７５、Ｍ１４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＰＣｌ３、及びＤＵ１４５）を、０．１ｎＭ～３μＭの範囲のコルヒチン、パクリタキセル（タキソール）、Ａｚｉｘａ、及び５ｖで７２時間処理した。細胞生存率は、ＤＭＳＯ対照と比較して表す。（Ｂ）５種類のタキソール耐性癌細胞株（Ａ３７５／ＴｘＲ、Ｍ１４／ＬＣＣ６ ＭＤＲ１、ＭＤＡ－ＭＢ２３１／ＴｘＲ、ＰＣ３／ＴｘＲ、及びＤＵ１４５／ＴｘＲ）に対する５ｖの抗増殖活性。（Ｃ）５ｖ（０．５ｎＭ、１ｎＭ及び２ｎＭ）で７日間処理したＡ３７５／ＴｘＲ細胞の代表的なコロニー画像及び対照群に対する処理群のコロニー形成密度の定量化。データを総平均±ＳＥＭとして示す（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 ５ｖがタキソール感受性及びタキソール耐性癌細胞のパネルに対して増殖阻害効果を示したことを示す。（Ａ）５個のタキソール感受性癌細胞株（Ａ３７５、Ｍ１４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＰＣｌ３、及びＤＵ１４５）を、０．１ｎＭ～３μＭの範囲のコルヒチン、パクリタキセル（タキソール）、Ａｚｉｘａ、及び５ｖで７２時間処理した。細胞生存率は、ＤＭＳＯ対照と比較して表す。（Ｂ）５種類のタキソール耐性癌細胞株（Ａ３７５／ＴｘＲ、Ｍ１４／ＬＣＣ６ ＭＤＲ１、ＭＤＡ－ＭＢ２３１／ＴｘＲ、ＰＣ３／ＴｘＲ、及びＤＵ１４５／ＴｘＲ）に対する５ｖの抗増殖活性。（Ｃ）５ｖ（０．５ｎＭ、１ｎＭ及び２ｎＭ）で７日間処理したＡ３７５／ＴｘＲ細胞の代表的なコロニー画像及び対照群に対する処理群のコロニー形成密度の定量化。データを総平均±ＳＥＭとして示す（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 ５ｖがタキソール感受性及びタキソール耐性癌細胞のパネルに対して増殖阻害効果を示したことを示す。（Ａ）５個のタキソール感受性癌細胞株（Ａ３７５、Ｍ１４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＰＣｌ３、及びＤＵ１４５）を、０．１ｎＭ～３μＭの範囲のコルヒチン、パクリタキセル（タキソール）、Ａｚｉｘａ、及び５ｖで７２時間処理した。細胞生存率は、ＤＭＳＯ対照と比較して表す。（Ｂ）５種類のタキソール耐性癌細胞株（Ａ３７５／ＴｘＲ、Ｍ１４／ＬＣＣ６ ＭＤＲ１、ＭＤＡ－ＭＢ２３１／ＴｘＲ、ＰＣ３／ＴｘＲ、及びＤＵ１４５／ＴｘＲ）に対する５ｖの抗増殖活性。（Ｃ）５ｖ（０．５ｎＭ、１ｎＭ及び２ｎＭ）で７日間処理したＡ３７５／ＴｘＲ細胞の代表的なコロニー画像及び対照群に対する処理群のコロニー形成密度の定量化。データを総平均±ＳＥＭとして示す（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 ５ｖがＡ３７５／ＴｘＲ細胞における細胞遊走、細胞アポトーシス及び有糸分裂停止の阻害を誘導することを示す。（Ａ）５ｖ（０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ又は５ｎＭ）で処理したときのＡ３７５／ＴｘＲ細胞の遊走能をスクラッチ創傷アッセイによって調べた。代表的な創傷写真を、０時間目、２４時間目、及び４８時間目での５ｖ曝露後にＩｎｃｕＣｙｔｅによって取得した。各群の０時間±ＳＥＭでの細胞に対する創傷閉鎖率を、各時点でＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓｃｒａｔｃｈ Ｗｏｕｎｄ Ｍｏｄｕｌｅによって計算した。（Ｂ）アネキシンＶ／ＰＩ染色による、５ｖ（１ｎＭ、２ｎＭ又は５ｎＭ）で処理したアポトーシスＡ３７５／ＴｘＲ細胞の測定。棒グラフは、各群でのアポトーシス細胞の％±ＳＥＭを表す。（Ｃ）Ｂにおいて同じ処理をしたＡ３７５／ＴｘＲ細胞の細胞周期分布。各処理群のＧ１、Ｓ、又はＧ２／Ｍ期の細胞の割合をプロットした。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。 ５ｖがＡ３７５／ＴｘＲ異種移植モデルにおいて抗腫瘍有効性を示したことを示す。（Ａ）Ａ３７５／ＴｘＲ黒色腫異種移植片の腫瘍体積±ＳＤ。マウスに、ビヒクル、４ｍｇ／ｋｇパクリタキセル、２ｍｇ／ｋｇ５ｖ、又は４ｍｇ／ｋｇ５ｖを週２回静脈内投与した。（Ｂ）腫瘍担持マウスのマウス体重変化±ＳＤ。（Ｃ）ビヒクル群及び処置群における切除された腫瘍の代表的な画像。（Ｄ）各群の最終腫瘍湿重量±ＳＤ。統計的有意性はダネット多重比較検定により評価した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１対ビヒクル。 インビボでの腫瘍アポトーシス、増殖、及び血管新生に対するその５ｖの効果を示す、Ａ３７５／ＴｘＲ腫瘍の実証されたＨ＆Ｅ及びＩＨＣ染色を示す。（Ａ）Ｈ＆Ｅ、Ｋｉ６７、ＣＤ３１、及び切断型カスパーゼ－３で染色した腫瘍切片の代表的な画像。Ｋｅｙｅｎｃｅ顕微鏡倍率、２０倍。スケールバー、５０μｍ。Ｈ＆Ｅ染色腫瘍切片中の黄色矢印は、壊死腫瘍細胞を示す。（Ｂ）ビヒクル対照群と比較した腫瘍切片における平均Ｋｉ６７、ＣＤ３１、及び切断型カスパーゼ－３発現量±ＳＤの定量。統計的有意性は、ダネット多重比較検定により評価した（＊，Ｐ＜０．０５，＊＊＊，Ｐ＜０．００１）。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１対ビヒクル。 インビボでの腫瘍アポトーシス、増殖、及び血管新生に対するその５ｖの効果を示す、Ａ３７５／ＴｘＲ腫瘍の実証されたＨ＆Ｅ及びＩＨＣ染色を示す。（Ａ）Ｈ＆Ｅ、Ｋｉ６７、ＣＤ３１、及び切断型カスパーゼ－３で染色した腫瘍切片の代表的な画像。Ｋｅｙｅｎｃｅ顕微鏡倍率、２０倍。スケールバー、５０μｍ。Ｈ＆Ｅ染色腫瘍切片中の黄色矢印は、壊死腫瘍細胞を示す。（Ｂ）ビヒクル対照群と比較した腫瘍切片における平均Ｋｉ６７、ＣＤ３１、及び切断型カスパーゼ－３発現量±ＳＤの定量。統計的有意性は、ダネット多重比較検定により評価した（＊，Ｐ＜０．０５，＊＊＊，Ｐ＜０．００１）。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１対ビヒクル。 ５ｖがＡ３７５／ＴｘＲ皮下腫瘍の自然転移を抑制したことを示す。（Ａ）Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植モデルにおける各群から収集された腋窩リンパ節の代表的な画像。（Ｂ～Ｃ）抗ヒトミトコンドリアＩＨＣ染色を使用して、各群のマウスの肺及び肝臓切片における転移を検出した。棒グラフは、各群の肺（Ｂ）及び肝臓（Ｃ）に存在する転移の面積を表す。（Ｄ）各群における抗ヒトミトコンドリア染色肺（上）又は肝臓（下）転移の代表的な画像。肺転移及び肝転移の両方を赤色矢印で示す。Ｋｅｙｅｎｃｅ顕微鏡倍率、２０倍。スケールバー、２００μｍ。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１対ビヒクル。 ５ｖに急性毒性が欠如していることを実証したことを示す。各群のマウスの腎臓、心臓、及び脾臓のＨ＆Ｅ染色。処置の３週間後、主要臓器（腎臓、心臓、及び脾臓）をマウスから採取し、Ｈ＆Ｅで染色した。Ｋｅｙｅｎｃｅ顕微鏡倍率、２０倍。スケールバー、５０μｍ。 健常ＮＳＧマウスにおける５ｖの耐用性評価を示す。例えば、５ｖは、５ｍｇ／ｋｇ ＩＰで許容されたが、１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰでは許容されなかった。５ｍｇ／ｋｇ５ｖ（Ａ）又は１０ｍｇ／ｋｇ５ｖ（Ｂ）を、週に５回の投与頻度で腹腔内（ＩＰ）注射によって３匹のＮＳＧマウスに投与した。５ｍｇ／ｋｇ５ｖ（Ｃ）又は１０ｍｇ／ｋｇ５ｖ（Ｄ）を、週に２回の投与頻度で静脈内（ＩＶ）注射によって４匹のＮＳＧマウスに投与した。 ５ｖがＡ３７５／ＴｘＲ腫瘍の自然転移を抑制したことを示す。ビヒクル、４ｍｇ／ｋｇパクリタキセル、２ｍｇ／ｋｇ５ｖ、又は４ｍｇ／ｋｇ５ｖで２３日間処置した、全肺（上）、Ｈ＆Ｅ染色肺（中）及びＨ＆Ｅ染色肝臓（下）の代表的な画像。Ｈ＆Ｅ染色スライド中の肺転移又は肝転移を黄色矢印で示す。 ５ｖがＡ３７５／ＴｘＲ腫瘍の肺及び肝臓への自然転移を抑制したことを示す。腋窩リンパ節が観察されなかった（０）ビヒクル群のマウスの全肺（左）及び全肝臓（右）の代表的な画像。 ５ｍ、１２ｋ、及び５ｖ ＨＣｌが、頭頸部癌の２つの異なる細胞株、Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２において、低いｎＭ～ｐＭ効力の細胞傷害性を有したことを示す。図３９Ａは、頭頸部癌の２つの異なる細胞株、Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２における化合物５ｍ、１２ｋ、及び５ｖ ＨＣｌについてのｎＭで表されるＩＣ５０値を示す。図３９Ｂは、Ａ２５３細胞株の細胞生存率（％）対濃度（ｎＭ）のグラフである。図３９Ｃは、Ｄｅｔｒｏｉｔ－５６２細胞株の細胞生存率（％）対濃度（ｎＭ）のグラフである。ＩＣ５０値は、本明細書の他の箇所に記載されるように計算した。同様に、細胞傷害性実験を、本明細書中の他の箇所に記載されるように実施した。 ５ｍ、１２ｋ、及び５ｖ ＨＣｌが、頭頸部癌の２つの異なる細胞株、Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２において、低いｎＭ～ｐＭ効力の細胞傷害性を有したことを示す。図３９Ａは、頭頸部癌の２つの異なる細胞株、Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２における化合物５ｍ、１２ｋ、及び５ｖ ＨＣｌについてのｎＭで表されるＩＣ５０値を示す。図３９Ｂは、Ａ２５３細胞株の細胞生存率（％）対濃度（ｎＭ）のグラフである。図３９Ｃは、Ｄｅｔｒｏｉｔ－５６２細胞株の細胞生存率（％）対濃度（ｎＭ）のグラフである。ＩＣ５０値は、本明細書の他の箇所に記載されるように計算した。同様に、細胞傷害性実験を、本明細書中の他の箇所に記載されるように実施した。 ５ｍ、１２ｋ、及び５ｖ ＨＣｌが、頭頸部癌の２つの異なる細胞株、Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２において、低いｎＭ～ｐＭ効力の細胞傷害性を有したことを示す。図３９Ａは、頭頸部癌の２つの異なる細胞株、Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２における化合物５ｍ、１２ｋ、及び５ｖ ＨＣｌについてのｎＭで表されるＩＣ５０値を示す。図３９Ｂは、Ａ２５３細胞株の細胞生存率（％）対濃度（ｎＭ）のグラフである。図３９Ｃは、Ｄｅｔｒｏｉｔ－５６２細胞株の細胞生存率（％）対濃度（ｎＭ）のグラフである。ＩＣ５０値は、本明細書の他の箇所に記載されるように計算した。同様に、細胞傷害性実験を、本明細書中の他の箇所に記載されるように実施した。 経過時間（時間）にわたる頭頸部癌細胞増殖（コンフルエンス％）の用量応答性減少を示す。図４０Ａは、Ａ－２５３細胞株における１２ｋについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｂは、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞株における１２ｋについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｃは、Ａ－２５３細胞株における化合物１７ｙａについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｄは、Ａ－２５３細胞株における化合物１７ｙａについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。化合物１２ｋ又は１７ｙａを、示された細胞株について示された数の細胞株を播種したウェルに漸増濃度で添加し、６２時間にわたってコンフルエンス％を監視した。両方の化合物は、Ａ－２５３細胞及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞の両方で細胞増殖の用量応答性減少を示したが、１２ｋは、両方の細胞株においてより強力だった。 経過時間（時間）にわたる頭頸部癌細胞増殖（コンフルエンス％）の用量応答性減少を示す。図４０Ａは、Ａ－２５３細胞株における１２ｋについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｂは、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞株における１２ｋについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｃは、Ａ－２５３細胞株における化合物１７ｙａについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｄは、Ａ－２５３細胞株における化合物１７ｙａについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。化合物１２ｋ又は１７ｙａを、示された細胞株について示された数の細胞株を播種したウェルに漸増濃度で添加し、６２時間にわたってコンフルエンス％を監視した。両方の化合物は、Ａ－２５３細胞及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞の両方で細胞増殖の用量応答性減少を示したが、１２ｋは、両方の細胞株においてより強力だった。 経過時間（時間）にわたる頭頸部癌細胞増殖（コンフルエンス％）の用量応答性減少を示す。図４０Ａは、Ａ－２５３細胞株における１２ｋについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｂは、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞株における１２ｋについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｃは、Ａ－２５３細胞株における化合物１７ｙａについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｄは、Ａ－２５３細胞株における化合物１７ｙａについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。化合物１２ｋ又は１７ｙａを、示された細胞株について示された数の細胞株を播種したウェルに漸増濃度で添加し、６２時間にわたってコンフルエンス％を監視した。両方の化合物は、Ａ－２５３細胞及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞の両方で細胞増殖の用量応答性減少を示したが、１２ｋは、両方の細胞株においてより強力だった。 経過時間（時間）にわたる頭頸部癌細胞増殖（コンフルエンス％）の用量応答性減少を示す。図４０Ａは、Ａ－２５３細胞株における１２ｋについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｂは、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞株における１２ｋについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｃは、Ａ－２５３細胞株における化合物１７ｙａについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。図４０Ｄは、Ａ－２５３細胞株における化合物１７ｙａについてのコンフルエンス％対経過時間（時間）のグラフを示す。化合物１２ｋ又は１７ｙａを、示された細胞株について示された数の細胞株を播種したウェルに漸増濃度で添加し、６２時間にわたってコンフルエンス％を監視した。両方の化合物は、Ａ－２５３細胞及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞の両方で細胞増殖の用量応答性減少を示したが、１２ｋは、両方の細胞株においてより強力だった。 図４１Ａ及び４１Ｂは、Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞のコロニー形成も又１２ｋによって強力に阻害されたことを示す。図４１Ａは、Ａ－２５３細胞株のコロニー形成に対する化合物１２ｋの効果を示す。図４１Ｂは、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞株のコロニー形成に対する化合物１２ｋの効果を示す。コロニー形成実験を、本明細書中の他の箇所に記載されるように実施した。 図４２Ａ及び４２Ｂは、１２ｋがウェスタンブロット分析（本明細書の他の箇所に記載されるように実施される）によって明らかにされるアポトーシスマーカー切断型ＰＡＲＰ（ｃ－ＰＡＲＰ）及び切断型ｃａｓ ３（ｃ－ｃａｓ３）の上昇によって実証されるように、頭頸部癌細胞株Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２のアポトーシスを誘導する。図４２Ａは、化合物１２ｋがＡ－２５３細胞株のアポトーシスを誘導することを示す。図４２Ｂは、化合物１２ｋがＤｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞株のアポトーシスを誘導することを示す。 ５ｖを図のスキームに従って合成することができることを示す。 実施例１３に記載されるように処置されたマウスにおける５ｍ及び１２ｋの血漿中及び脳内濃度を示す。 ５ｍが、Ａｚｉｘａ及び１７ｙａと共通の特徴を有する、強力で、安定で、脳透過性の高い化合物であり、タキサン耐性克服能力を維持し、したがって、対象が以前にタキサン又は１７ｙａで治療され、その後脳に転移した場合であっても、後期乳癌の治療に有用であってもよいことを示す。これは現在、満たされていない臨床的必要性である。 ５ｍがＢｒｎＭｅｔｓを抑制し、ＯＳを増加させることを示す。図４６Ａは、８～９週齢のＮＳＧ雌に心臓内（ＩＣ）注射し、ＩＣ注射の２日後に薬物療法を開始し、動物に、ＩＶ経路により週２回投薬した２３１－ＢｒＭ２細胞（２００，０００）に対する化合物５ｍの効果を示す。全てのマウスを処置の２４日目に安楽死させ、エクスビボバイオイメージング後のエンドポイントで脳シグナルを示した。ビヒクル（上）及び５ｍ処置（下）マウスの全脳の代表的な画像を図４６Ａに示す。図４６Ｂは、全生存（ＯＳ）を測定するための独立した実験において、２３１－ＢｒＭ２細胞（１００，０００個）を８～９週齢のＮＳＧ雌にＩＣ注射し、２４時間後に治療を開始したことを示す。動物に、ＩＶ経路により週２回投薬した。マウスを週１回バイオイメージングし、動物は、局所ＩＡＣＵＣ基準によって瀕死になったら試験から除外した。生存マウス（頭部のみ）の全光束データを２８日目まで示す。６匹のビヒクルマウスのうち２匹が、２４日目の画像化後に瀕死／打ち切られ、２８日目に平均光束が減少したことに留意されたい。ｙ軸はｌｏｇ１０スケールでプロットされている。生存データを以下の図５１に示す。 ５ｍがＢｒｎＭｅｔｓを抑制し、ＯＳを増加させることを示す。図４６Ａは、８～９週齢のＮＳＧ雌に心臓内（ＩＣ）注射し、ＩＣ注射の２日後に薬物療法を開始し、動物に、ＩＶ経路により週２回投薬した２３１－ＢｒＭ２細胞（２００，０００）に対する化合物５ｍの効果を示す。全てのマウスを処置の２４日目に安楽死させ、エクスビボバイオイメージング後のエンドポイントで脳シグナルを示した。ビヒクル（上）及び５ｍ処置（下）マウスの全脳の代表的な画像を図４６Ａに示す。図４６Ｂは、全生存（ＯＳ）を測定するための独立した実験において、２３１－ＢｒＭ２細胞（１００，０００個）を８～９週齢のＮＳＧ雌にＩＣ注射し、２４時間後に治療を開始したことを示す。動物に、ＩＶ経路により週２回投薬した。マウスを週１回バイオイメージングし、動物は、局所ＩＡＣＵＣ基準によって瀕死になったら試験から除外した。生存マウス（頭部のみ）の全光束データを２８日目まで示す。６匹のビヒクルマウスのうち２匹が、２４日目の画像化後に瀕死／打ち切られ、２８日目に平均光束が減少したことに留意されたい。ｙ軸はｌｏｇ１０スケールでプロットされている。生存データを以下の図５１に示す。 ５ｍ処置によりマウスが２４日目まで体重を維持することができ、一方ビヒクル処置マウスの体重は１５日目から２４日目まで一様に減少したことを示す。体重の減少は、マウスが転移負荷のため病気になるので一般的である。更に、体重減少は、嗜眠、歩行困難、頭部傾斜などを含む脳転移の徴候及び症状と関連していた。 ２４日目に採取したビヒクル処置マウス（上）及び５ｍ処置マウス（下）の切除された脳をエクスビボバイオイメージング後に示すことを示す。定量分析から、５ｍ処置は、ビヒクル処置と比較して、総光束を平均６．４×１０７ｐ／秒～２．２×１０７ｐ／秒に減少させることが実証され、この差は統計的に有意だった（ｐ＝０．０４４）。 ビヒクル及び５ｍ処置動物について、同じ動物の無傷マウスのインビボで画像化された頭部（各処置の右側パネル）及び次いでその後エクスビボで画像化された頭部（各処置の左側パネル）の比較を示す。図４９Ａは、ビヒクル処置マウスを示す。図４９Ｂは、化合物５ｍで処置したマウスを示す。同一の撮像時間（１分）を使用して、エクスビボ脳の光束の減少を更に理解することができ、５ｍ処置したエクスビボ脳において観察された光束（右端の画像を参照、１．５１×１０７ｐ／秒）は、ビヒクル処置された脳（左から２番目のパネル；６．０１×１０７ｐ／秒）と比較して減少する。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＸＭＲＳ装置を用いて動物を画像化した。 ビヒクル及び５ｍ処置動物について、同じ動物の無傷マウスのインビボで画像化された頭部（各処置の右側パネル）及び次いでその後エクスビボで画像化された頭部（各処置の左側パネル）の比較を示す。図４９Ａは、ビヒクル処置マウスを示す。図４９Ｂは、化合物５ｍで処置したマウスを示す。同一の撮像時間（１分）を使用して、エクスビボ脳の光束の減少を更に理解することができ、５ｍ処置したエクスビボ脳において観察された光束（右端の画像を参照、１．５１×１０７ｐ／秒）は、ビヒクル処置された脳（左から２番目のパネル；６．０１×１０７ｐ／秒）と比較して減少する。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＸＭＲＳ装置を用いて動物を画像化した。 ＢｒＭ２細胞が骨、肺、及び脾臓に転移することを示す。両方の処置群において頭蓋外転移が観察されるが、５ｍでの処置は、ＭＢＣの脳への転移増殖を低減又は遅延させただけでなく（上で実証されたように）、同じ実験でこれらの臓器においてエクスビボで測定された総光束の減少によって決定されるように、骨、肺、及び脾臓への転移も統計的に低減した。図５０Ａは、エクスビボでの骨に対する効果を示す。図５０Ｂは、エクスビボでの肺に対する効果を示す。図５０Ａは、エクスビボでの脾臓に対する効果を示す。 ＢｒＭ２細胞が骨、肺、及び脾臓に転移することを示す。両方の処置群において頭蓋外転移が観察されるが、５ｍでの処置は、ＭＢＣの脳への転移増殖を低減又は遅延させただけでなく（上で実証されたように）、同じ実験でこれらの臓器においてエクスビボで測定された総光束の減少によって決定されるように、骨、肺、及び脾臓への転移も統計的に低減した。図５０Ａは、エクスビボでの骨に対する効果を示す。図５０Ｂは、エクスビボでの肺に対する効果を示す。図５０Ａは、エクスビボでの脾臓に対する効果を示す。 ＢｒＭ２細胞が骨、肺、及び脾臓に転移することを示す。両方の処置群において頭蓋外転移が観察されるが、５ｍでの処置は、ＭＢＣの脳への転移増殖を低減又は遅延させただけでなく（上で実証されたように）、同じ実験でこれらの臓器においてエクスビボで測定された総光束の減少によって決定されるように、骨、肺、及び脾臓への転移も統計的に低減した。図５０Ａは、エクスビボでの骨に対する効果を示す。図５０Ｂは、エクスビボでの肺に対する効果を示す。図５０Ａは、エクスビボでの脾臓に対する効果を示す。 ５ｍが、２３１ ＢｒＭ２ ＢｒｎＭｅｔｓ担持するマウスの全生存（ＯＳ）を有意に改善することを示す。生存データは、５ｍを用いた実験＃２でのみ生成された。１００，０００個の細胞を投与し、２４時間後に治療を開始し、マウスは瀕死になったら打ち切った。採取日まで脳をインビボで画像化し、採取日にはエクスビボでも画像化した。全てのビヒクルマウスを含む最後のデータは２４日目であり、全ての５ｍ処置されたマウスを含む最後のインビボ画像化日は２８日目だった。 ５ｍで処置したマウスが、経時的な体重変化％によっても明らかなようにより長く生存したことを示す（生存試験（実験＃２）を参照）。更に、５ｍコホートは投与の２１日目まで体重が増加し、一方ビヒクル処置マウスは１１日目までに体重が減少し始めた。両方のコホートにおける体重の％変化は、平均値がその日にまだ生存している動物のみを反映するため、及び極度の体重減少（１５～２０％）が主要な安楽死基準であるため、実験の後期段階で変化するようである。矢印は、５ｍ又はビヒクルが投与された日を示す。 ５ｍ処置が、１４日目を超える各時点での平均総光束の減少によって観察される脳内の転移進行を遅延させたことを示した（図中に追跡されたシグナルは脳のみからのものである）。データのばらつきが高いにもかかわらず、５ｍ処置の効果は、２８日目に統計的に有意だった（ｐ値０．０１４１）。 各コホートからの１匹の代表的なマウス（ｎ＝１、したがってエラーバー無し）のインビボイメージングが、エクスビボイメージングと同じ傾向を明らかにしたことを示す。図５４Ａは、化合物５ｍ及びビヒクルの効果のグラフ表示を示す。図５４Ｂは、ビヒクル処置マウス及び化合物５ｍで処置したマウスのエクスビボイメージングを示す。各コホートからの１匹の代表的なマウスを経時的に追跡した（同一のバイオイメージング撮像時間を使用する）。又、１４日目までに、ビヒクル処置マウスと５ｍ処置マウスとの間の総光束の差は発散し始め、又、各マウスがＢｒｎＭｅｔｓ光量束では同様の開始値を示すにもかかわらず（７．５×１０５対６．３×１０５）、５ｍが転移進行を遅延させ、２８日目に転移が６．７倍増加したことを示した。更に、代表的なビヒクル処置マウスは２８日目に死亡し、一方５ｍ処置マウスは３５日目まで生存した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＸＭＲＳ装置を用いて動物を画像化した。 各コホートからの１匹の代表的なマウス（ｎ＝１、したがってエラーバー無し）のインビボイメージングが、エクスビボイメージングと同じ傾向を明らかにしたことを示す。図５４Ａは、化合物５ｍ及びビヒクルの効果のグラフ表示を示す。図５４Ｂは、ビヒクル処置マウス及び化合物５ｍで処置したマウスのエクスビボイメージングを示す。各コホートからの１匹の代表的なマウスを経時的に追跡した（同一のバイオイメージング撮像時間を使用する）。又、１４日目までに、ビヒクル処置マウスと５ｍ処置マウスとの間の総光束の差は発散し始め、又、各マウスがＢｒｎＭｅｔｓ光量束では同様の開始値を示すにもかかわらず（７．５×１０５対６．３×１０５）、５ｍが転移進行を遅延させ、２８日目に転移が６．７倍増加したことを示した。更に、代表的なビヒクル処置マウスは２８日目に死亡し、一方５ｍ処置マウスは３５日目まで生存した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＸＭＲＳ装置を用いて動物を画像化した。 （表を含む）５ｍが生存率を増加させたことを示す。各コホートの生存率を経時的に追跡し、カプラン・マイヤー生存曲線上にプロットした。表は、各コホートにおける６匹のマウスの各々の安楽死日を示す。全てのビヒクル処置マウスは３０日までに死亡し、一方全ての５ｍ処置マウスは３０日より長く生存した。５ｍ処置マウスの生存期間中央値は、ビヒクル処置マウスでの２５日に対して３６．５日だった。最後に、カプラン・マイヤー曲線は、５ｍ処置コホートについて罹患まで生存率の統計学的に有意な増加を示し、ハザード比は５．１３で、ｐ値は０．０１８だった。
実例を単純かつ明確にするために、図に示される要素は、必ずしも縮尺通りに描かれていないことが理解されるであろう。例えば、いくつかの要素の寸法は、明確にするために他の要素に比較して誇張され得る。更に、適切であると考えられる場合、対応する要素又は類似の要素を示すために、参照番号が図の間で繰り返され得る。
複素環－ピリドピリミジン１ａ（図１参照）及びヒドロキノキサリノン２ａ（図１参照）は、顕著な血管破壊能を有する強力なチューブリン重合阻害剤であることが分かった。Ｘ線共結晶構造から、１ａ及び２ａがチューブリン中のコルヒチン部位に結合することを実証された（図１）。結晶構造から、これらの分子のピリミジン部分がβ－Ｃ２３９及びβ－Ｖ２３６と水媒介水素結合を形成することが明らかになり、これらの類縁体はチューブリン重合の最も強力な阻害剤の１つとされている。更に、化合物２ａ及びその誘導体において、ジヒドロキノキサリノン部分は、α－Ｔ１７９と水素結合を形成する。したがって、化合物２ａは、微小管重合の強力な阻害剤であり、ヒト（ｔ１／２＝５．５時間）、マウス（ｔ１／２＝１時間）、及びラット（ｔ１／２＝５．０７時間）の肝ミクロソームに対して改善された代謝安定性を有する。化合物２ａは、多様な黒色腫、前立腺、肺及び乳癌細胞株に対して１桁のナノモル効力を有することが分かった。しかしながら、化合物２ａは水溶性が低く、腹腔内又は静脈内のいずれのインビボ実験のいずれにおいても働くことが非常に困難である。又、最大耐用量（ＭＴＤ）試験における化合物２ａは、１ｍｇ／ｋｇ用量を超える毒性を示し、マウスは体重減少及び死亡し、非常に望ましくない特性だった。
これらの欠点に対処するために、本発明は、より高い治療指数を達成するために、水溶性が著しく改善され、毒性が低減された新規ジヒドロキノキサリノン化合物を包含する。本発明は、様々なＡ環を有する新規クラスのピリミジン類縁体を包含する（図１参照）。本発明の化合物は、とりわけ、図２に示されるジヒドロキノキサリノン頭基を有するａ）縮合複素環－ピリミジン、ｂ）縮合飽和シクロアルカン－ピリミジン、又はｃ）開環置換ピリジン－ピリミジン類縁体などのＡ環を含む。しかしながら、理論によって限定されるものではないが、本発明は、縮合ピリドピリミジン尾部基から他の縮合複素環ピリミジン及び縮合飽和炭化水素ピリミジン尾部基へと切り替えると、２つの利点：ａ）水溶性の改善；及びｂ）一方はα－チューブリンモノマーのＴ－５ループとの相互作用、他方は水によって媒介されるβ－モノマーのＨ－７ヘリックスとの相互作用の、重要な水素結合相互作用を保持しながら毒性を低減することを提供するという考えに基づく。これらの様々な構造を分子内に組み込むことによって、本発明では、他の化合物に見られる溶解性及び毒性の欠点を克服しようとした。
理論によって限定されるものではないが、尾部基に縮合炭化水素環を包含する実施形態では、化合物がβ－チューブリン中の主に疎水性のポケットと疎水性相互作用を形成する能力が高くなり、したがって、チューブリン結合が強まり、抗癌活性が改善されるはずであると考えられる。
本発明は、式Ｉの構造を有する化合物であって、
Figure 2024515727000015
式中、
Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり；
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み、
Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり、又は
一緒になった場合、Ｒ４及びＲ５は、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
本発明は、式ＩＡの構造を有する化合物であって、
Figure 2024515727000016
式中、
Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり；
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み、
Ｒ４及びＲ５は一緒になって、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、シクロアルキル又は複素環は、少なくとも１つの不飽和を有してもよく、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
本発明は、式ＩＩの構造を有する化合物であって、
Figure 2024515727000017
式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み、
Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり、又は
一緒になった場合、Ｒ４及びＲ５は、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。別の実施形態において、本発明は、式ＩＩの化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を包含する。
本発明は、式ＩＩＡの構造を有する化合物であって、
Figure 2024515727000018
式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み、
Ｒ４及びＲ５は一緒になって、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、シクロアルキル又は複素環は、少なくとも１つの不飽和を有してもよく、シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
別の実施形態において、本発明は、式ＩＩの化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を包含する。
本発明の実施形態は、以下の化合物５ｊ～５ｒ、５ｔ～５ｖ又は１２ａ～１２ｍ及び１２ｏ～１２ｑ、
Figure 2024515727000019
Figure 2024515727000020
のいずれか１つによって表される式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、又はＩＩＡの化合物、若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
別の実施形態において、本発明は、式５ｊ～５ｒ、５ｔ～５ｖ又は１２ａ～１２ｍ及び１２ｏ～１２ｑのいずれか１つの化合物並びに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を包含する。
本発明の実施形態は、５ｓ、
Figure 2024515727000021
によって表される化合物を包含する。
本発明は、式ＩＩＩの構造を有する化合物であって、
Figure 2024515727000022
式中、
Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり；
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み、
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
本発明は、式ＩＩＩＡの構造を有する化合物であって、
Figure 2024515727000023
式中、
Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり；
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み、
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
本発明は、式ＩＩＩＢの構造を有する化合物であって、
Figure 2024515727000024
式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み、
ｎは、１～３である、化合物、
若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
本発明の１つの実施形態は、以下の化合物５ｌ～５ｎ、５ｖ、１２ａ～１２ｍ及び１２ｏ～１２ｑ、
Figure 2024515727000025
Figure 2024515727000026
のいずれか１つによって表される式ＩＩＩの化合物若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを包含する。
別の実施形態において、本発明は、５ｌ～５ｎ、５ｖ、１２ａ～１２ｍ及び１２ｏ～１２ｑのいずれか１つによって表される式ＩＩＩの化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を包含する。
本発明の実施形態は、５ｓ、
Figure 2024515727000027
によって表される化合物を包含する。
本発明は、本発明の化合物と酸又は塩基との反応によって作製されてもよい、上述の本発明の化合物の「薬学的に許容される塩」を含む。ある特定の化合物、特に酸性基又は塩基性基を有する化合物は又、塩、好ましくは薬学的に許容される塩の形態であってもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、生物学的又はその他の点で望ましくないものではない、遊離塩基又は遊離酸の生物学的有効性及び特性を保持する塩を指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、オキシル酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステインなどの有機酸で形成される。他の塩は、当業者に既知であり、本発明に従って使用するために容易に適合することができる。
本発明の方法で使用される化合物のアミンの好適な薬学的に許容される塩は、無機酸又は有機酸から調製してもよい。一実施形態では、アミンの無機塩の例は、硫酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、塩化物、ヘミ硫酸塩、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、２－ヒドロキシエチルスルホン酸塩（ヒドロキシエタンスルホン酸塩）、ヨウ素酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、硝酸塩、過硫酸塩、リン酸塩、硫酸塩、スルファミン酸塩、スルファニル酸塩、スルホン酸（アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ハロゲン置換アルキルスルホン酸塩、ハロゲン置換アリールスルホン酸塩）、スルホン酸塩、及びチオシアン酸塩である。
アミンの有機塩の例としては、脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族、複素環式、カルボン酸及びスルホン酸の種類の有機酸が挙げられるがこれらに限定されず、有機塩の例は、酢酸塩、アルギニン、アスパラギン酸塩、アスコルビン酸塩、アジピン酸塩、アントラニル酸塩、アルゲン酸塩、アルカンカルボン酸塩、置換アルカンカルボン酸塩、アルギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、炭酸水素塩、酒石酸水素塩、クエン酸塩、樟脳、カンファースルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、カルシウムエデト酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、クラブラン酸塩、ケイ皮酸塩、ジカルボン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシルスルホン酸塩、二塩酸塩、デカン酸塩、エナント酸塩、エタンスルホン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、フッ化物、ガラクツロン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、グルコレート、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グルセプト酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、グルタル酸塩、グルタミン酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、ヒドロキシカルボン酸、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、フッ化水素酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、メチレンビス（ベータ－オキシナフトエート）、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、臭化メチル、硝酸メチル、メタンスルホン酸塩、マレイン酸一カリウム、ムチン酸塩、モノカルボン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、ナプシル酸塩、Ｎ－メチルグルカミン、シュウ酸塩、オクタン酸塩、オレイン酸塩、パモ酸塩、フェニル酢酸塩、ピクリン酸塩、フェニル安息香酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、フタル酸塩、フェニル酢酸塩、ペクチン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、ピルビン酸塩、キナ酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、ステアリン酸塩、スルファニル酸塩、塩基性酢酸塩、酒石酸塩、テオフィリン酢酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩（トシル酸塩）、トリフルオロ酢酸塩、テレフタル酸塩、タンニン酸塩、テオクル酸塩、トリハロ酢酸塩、トリエチオジド、トリカルボン酸塩、ウンデカン酸塩、及び吉草酸塩である。
カルボン酸又はヒドロキシルの無機塩の例としては、アンモニウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、セシウムを含むアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム、アルミニウムを含むアルカリ土類金属、亜鉛、バリウム、コリン、第４級アンモニウムから選択され得る。カルシウム、マグネシウム、アルミニウムを含むアルカリ土類金属、亜鉛、バリウム、コリン、第四級アンモニウムから選択されてもよい。
カルボン酸又はヒドロキシルの有機塩の例は、アルギニン、脂肪族有機アミン、脂環式有機アミン、芳香族有機アミン、ベンザチン、ｔ－ブチルアミン、ベネタミン（Ｎ－ベンジルフェネチルアミン）、ジシクロヘキシルアミン、ジメチルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、ヒドラバミン、イミダゾール、リシン、メチルアミン、メグラミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、ニコチンアミド、有機アミン、オルニチン、ピリジン、ピコリン、ピペラジン、プロカイン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、トリメチルアミン、トロメタミン及び尿素を含む有機アミンから選択されてもよい。
典型的な塩としては、限定されないが、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、ホウ酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、又はメシル酸塩が挙げられる。好ましい塩としては、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、又はメシル酸塩が挙げられる。より好ましい塩としては、塩酸塩、酢酸塩、又はマレイン酸塩が挙げられる。
塩は、塩が不溶性である溶媒若しくは培地中で、又は水などの溶媒中で、真空下で、又は凍結乾燥によって、又は既存の塩のイオンを別のイオン若しくは適切なイオン交換樹脂と交換することによって除去される、遊離塩基又は遊離酸形態の生成物を１当量以上の適切な酸又は塩基と反応させることなどの従来の手段によって形成され得る。
医薬組成物
本発明は又、薬学的に許容される担体及び上述の化合物の少なくとも１つを含む薬学的組成物を包含する。典型的には、医薬組成物は、上述の少なくとも１つの化合物又はその薬学的に許容される塩、及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、任意の適切なアジュバント、担体、賦形剤、香味剤、又は安定剤を指し、固体又は液体形態のいずれかの医薬製剤において使用することができる。このような形態としては、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤又は乳剤が挙げられるが、これらに限定されない。
対象の状態が改善されると、必要に応じて、維持量の化合物、組成物又は製剤が投与され得る。その後、投与量若しくは投与頻度、又はその両方を、症状に応じて、症状が所望のレベルまで軽減されたときに改善された状態が保持されるレベルまで減少させることができる。しかしながら、対象は、疾患症状の任意の再発時に長期ベースで間欠的治療を必要とする場合がある。
固体単位剤形は、従来のタイプのものであり得る。固体形態は、化合物及び担体を含有する通常のゼラチンタイプなどのカプセルなどであり得る。担体としては、滑沢剤及び不活性充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、又はコーンスターチが挙げられるが、これらに限定されない。製剤は、アカシア、コーンスターチ、又はゼラチンなどの結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、又はアルギン酸などの崩壊剤、及びステアリン酸又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤と組み合わせたラクトース、スクロース、又はコーンスターチなどの従来の錠剤ベースで錠剤化されてもよい。
錠剤、カプセル剤などは、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、又はゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；及びスクロース、ラクトース、又はサッカリンなどの甘味剤を包含し得る。投与単位形態がカプセルである場合、カプセルは、上記のタイプの材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有することができる。
コーティングとして、又は投与単位の物理的形態を変更するために、様々な他の材料が存在してもよい。例えば、錠剤は、シェラック、糖、又は両方でコーティングされ得る。シロップは、活性成分に加えて、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、並びにチェリーフレーバー又はオレンジフレーバーなどの香味剤を含有することができる。
経口治療投与のために、製剤は、賦形剤を含み得、錠剤、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップなどの形態で使用され得る。そのような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有するべきである。これらの組成物中の化合物の割合は、当然のことながら変更することができ、便宜上、単位の重量の約２％～約６０％であり得る。そのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、好適な投与量が得られるような量である。本発明による好ましい組成物は、経口投与単位が約０．１ｍｇ～８０ｍｇの活性化合物、あるいは約１ｍｇ～８００ｍｇ、あるいは約２ｍｇ～１０８ｍｇを含有するように調製される。
本発明の活性化合物は、例えば、不活性希釈剤と共に、若しくは同化性食用担体と共に経口投与されてもよいか、又はそれらは、ハードシェルカプセル若しくはソフトシェルカプセルに封入され得るか、又はそれらは、錠剤に圧縮され得るか、又はそれらは、食事療法の食品に直接組み込まれ得る。製剤は、とりわけ、経口製剤、腹腔内製剤、静脈内製剤であってもよい。
注射用途に好適な医薬形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、その形態は、滅菌であるべきであり、容易な注射針通過性が存在する程度まで流動性でなければならない。その形態は、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、それらの好適な混合物、並びに植物油を含有する溶媒又は分散媒であることができる。
本発明の方法で使用される化合物又は医薬組成物は又、薬学的アジュバント、担体、又は賦形剤と共に生理学的に許容される希釈剤中のこれらの物質の溶液又は懸濁液によって、注射可能な投与量で投与されてもよい。そのようなアジュバント、担体、及び／又は賦形剤には、界面活性剤並びに他の薬学的及び生理学的に許容される構成成分の添加を伴うか又は伴わない、水及び油などの滅菌液体が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な油は、石油、動物、植物、又は合成起源の油、例えば、落花生油、大豆油、又は鉱油である。一般に、水、生理食塩水、デキストロース水溶液及び関連する糖溶液、並びにプロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射溶液にとって好ましい液体担体である。
製剤は又、非経口投与されてもよい。これらの製剤の溶液又は懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中で調製され得る。分散液は又、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの油中混合物中で調製され得る。例示的な油は、石油、動物、植物、又は合成起源の油、例えば、落花生油、大豆油、又は鉱油である。一般に、水、生理食塩水、デキストロース水溶液及び関連する糖溶液、並びにプロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射溶液にとって好ましい液体担体である。通常の保管及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有する。
本発明の方法において製剤を投与する場合、製剤は、全身的に又は連続的に投与されてもよい。投与は、化合物又は医薬組成物を所望の部位に送達するのに有効な任意の方法で達成することができる。例示的な投与様式には、経口、局所、経皮、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内滴下、腔内若しくは膀胱内滴下、眼内、動脈内、病巣内、又は鼻、喉、及び気管支などの粘膜への適用による化合物又は組成物の投与が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、少なくとも１つの本発明の化合物又は少なくとも１つの組成物を、それを必要とする対象に、対象における癌を治療するのに十分な治療有効量で提供することによって、癌を治療する方法を包含する。薬剤耐性は、癌の化学療法の失敗の主な原因である。したがって、本発明は又、ホルモン、化学療法、放射線療法、又は生物学的療法で以前に治療された対象を治療することを包含してもよく、少なくとも１つの本発明の化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
本発明は又、薬剤耐性腫瘍、転移性癌；又は薬剤耐性癌の少なくとも１つである。本発明は又、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、皮膚癌例えば、黒色腫）、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、頭頸部、膵臓、食道、腎臓癌又はＣＮＳ癌例えば、神経膠腫、神経膠芽腫）の少なくとも１つを治療する方法を包含する。
本発明は又、本発明の薬剤を使用して癌を治療することを包含し、癌は、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、脳腫瘍、脳幹腫瘍、乳癌、神経膠腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性、松果体腫瘍、視床下部神経膠腫、乳癌、カルチノイド腫瘍、癌腫、子宮頸癌、結腸癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、子宮内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、ユーイングファミリー腫瘍（Ｐｎｅｔ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼癌、眼内黒色腫、胆嚢癌、胃癌、胚細胞腫瘍、性腺外、妊娠性絨毛腫瘍、頭頸部癌、下咽頭癌、膵島細胞癌、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性白血病、口腔癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経系（原発性）、リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、悪性中皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、転移性扁平上皮癌、多発性骨髄腫、形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻咽頭癌、神経芽腫、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵外分泌癌、膵島細胞癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫癌、下垂体癌、形質細胞腫瘍、前立腺癌、横紋筋肉腫、直腸癌、腎癌、腎細胞癌、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、皮膚癌、カポジ肉腫、皮膚癌、黒色腫、小腸癌、軟部組織肉腫、軟部組織肉腫、精巣腫瘍、胸腺腫、悪性、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、肉腫、小児期の異常な癌、膣癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍、又はこれらの任意の組合せである。別の実施形態において、対象は、ホルモン、化学療法、放射線療法又は生物学的療法で以前に治療されている。好ましくは、癌は、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、又は膵臓癌である。
乳癌療法の著しい進歩にもかかわらず、転移性乳癌（ＭＢＣ）の有効な治療は依然として困難である。ＭＢＣ全体における主要な転移部位には、骨（４１％）、肺（２２％）、肝臓（８％）及び脳（７％）が含まれる。これらの主要な転移部位における正確な分布はＭＢＣサブタイプに依存するが、最も頻度の高い部位は骨であり、治療が最も困難な部位は脳である。骨破壊性病変（溶骨性）の患者は、骨折及び慢性疼痛に特になりやすい。
好ましい実施形態では、本発明は、式ＩＩＩ（式ＩＩＩＡ及び式ＩＩＩＢを含む）の化合物で癌を治療する方法であって、癌が、黒色腫、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、転移性骨癌、又は転移性脳腫瘍を含む方法を包含する。別の好ましい実施形態では、本発明は、式ＩＩＩ（式ＩＩＩＡ及びＩＩＩＢを含む）の化合物で乳癌を治療する方法であって、乳癌が進行した乳癌、転移性乳癌、ＡＲ陽性乳癌、ＥＲ陽性乳癌、ＥＲ、ＰＲ、及び／若しくはＨＥＲ２の発現を伴う若しくは伴わないＡＲ陽性乳癌、トリプルポジティブ乳癌（ＥＲ、ＰＲ、かつＨＥＲ２陽性）、ＥＲの発現を伴う若しくは伴わないＡＲ陽性乳癌、ＡＲの発現を伴う若しくは伴わないＥＲ陽性乳癌、ＡＲ陽性かつＥＲ陽性の乳癌、難治性乳癌、ＡＲ陽性難治性乳癌、ＥＲ陽性難治性乳癌、ＡＲ陽性転移性乳癌、ＥＲ陽性転移性乳癌の少なくとも１つを含む方法を包含する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、式ＩＩＩ（式ＩＩＩＡ及び式ＩＩＩＢを含む）の化合物でトリプルネガティブ乳癌を治療する方法を包含する。
本明細書で使用される場合、用語「転移性癌」とは、癌の身体の元の部位から別の領域に広がった（転移した）癌を指す。事実上全ての癌が、拡がる可能性がある。転移が発生するかどうかは、癌のタイプ、腫瘍細胞の成熟度（分化）の程度、癌が存在している位置及び期間、並びに他の不完全に理解されている因子を含む、多くの腫瘍細胞因子の複雑な相互作用に依存する。転移は、腫瘍から周囲組織への局所的な進展、血流を通って遠位部位へ、又はリンパ系を通って隣接又は遠位リンパ節へ、の３つの方法で広がる。癌の各種類は、典型的な広がりの経路を有してもよい。腫瘍は、原発部位で呼ばれる（例えば：脳に広がった乳癌は、脳への転移性乳癌と呼ばれる）。本発明の一実施形態では、本発明の化合物は、骨への転移性乳癌の治療に有用である。本発明の一実施形態では、本発明の化合物は、乳癌に罹患している患者の骨への転移性乳癌の発症を予防するのに有用である。本発明の別の実施形態では、本発明の化合物は、脳への転移性乳癌の治療に有用である。本発明の一実施形態において、本発明の化合物は、乳癌に罹患している患者の脳への転移性乳癌の発症を予防するのに有用である。
本明細書で使用される場合、用語「薬剤耐性癌」とは、ホルモン又は化学療法に対する耐性を獲得した癌細胞を指す。癌細胞は、薬物標的の変異若しくは過剰発現、薬物の不活性化、又は細胞からの薬物の排除を含む、幅広い機構によって化学療法に対する耐性を獲得することができる。ホルモン又は化学療法に対する初期応答後に再発する腫瘍は、複数の薬物に耐性であってもよい（腫瘍は多剤耐性である）。薬剤耐性の従来の見方では、腫瘍集団内の１つ又はいくつかの細胞が薬剤耐性を与える遺伝的変化を得る。したがって、薬剤耐性の理由はとりわけ、ａ）ホルモン又は化学療法によって死滅しない細胞の一部が変異（変化）し、薬剤耐性になる。いったんこの細胞が増殖すると、耐性細胞の方が化学療法に感受性のある細胞より多くなってもよく、ｂ）癌細胞が、特定の遺伝子の何百ものコピーを産生してもよい遺伝子増幅。この遺伝子は、抗癌剤を無効にするタンパク質の過剰産生を誘発し、ｃ）癌細胞は、Ｐ－糖タンパク質と呼ばれる分子を使用して、薬物が入ってくるのと同じ速さで細胞から薬物を汲み出してもよく、ｄ）癌細胞は、細胞壁を横切って薬物を輸送するタンパク質が機能を停止するので、薬物の取り込みを停止してもよく、ｅ）癌細胞は、いくつかの抗癌剤によって引き起こされたＤＮＡ切断をどのように修復するかを学習してもよく、ｆ）癌細胞は、薬物を不活性化する機構を発達させてもよい。多剤耐性の１つの主な原因は、Ｐ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）の過剰発現である。このタンパク質は、細胞膜トランスポーターのＡＴＰ結合カセットファミリーに属する臨床的に重要なトランスポータータンパク質である。このタンパク質は、ＡＴＰ依存性機構により、抗癌剤を含む基質を腫瘍細胞から汲み出すことができる。したがって、化学療法で使用される抗癌剤に対する耐性は、悪性疾患における治療の失敗の主な原因であり、腫瘍が耐性になることを促す。薬剤耐性は、癌のホルモン又は化学療法の失敗の主な原因である。
本発明は又、本発明の化合物を投与することによってウイルス感染を治療する方法であって、ウイルス感染が、フラビウイルス科又はヘルペスウイルス科（ＰＭＩＤ：３１８６１０８２）ウイルスによって引き起こされる方法も包含する。本発明の実施形態は、本発明の化合物を投与することによってウイルス感染を治療する方法であって、感染がＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＣＯＶＩＤ－１９又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、感染がＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされるウイルス感染を治療する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、ヘルペスウイルスウイルス感染又は潜伏感染を治療する方法であって、ウイルス感染がＨＳＶ、ＶＺＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、又はＰＲＶによって引き起こされる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、感染がフラビウイルスによって引き起こされるウイルス感染を治療する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、フラビウイルス感染がデング、西ナイル、Ｃ型肝炎、又はジカによって引き起こされる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、ウイルス感染がインフルエンザウイルスによって引き起こされるウイルス感染を治療する方法を包含する。別の実施形態では、インフルエンザウイルスはインフルエンザＡである。別の実施形態では、インフルエンザウイルスはインフルエンザＢである。別の実施形態では、インフルエンザウイルスはインフルエンザＤである。別の実施形態では、インフルエンザウイルスはインフルエンザＣである。
本発明の実施形態は、本発明の化合物を投与することによってウイルス感染を治療する方法であって、感染がコロナウイルスによって引き起こされる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、本発明の化合物を投与することによってウイルス感染を治療する方法であって、ウイルス感染がＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる、方法を包含する。本発明の好ましい実施形態は、本発明の化合物を投与することによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の対象を治療する方法を包含する。本発明の更なる実施形態は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の対象を治療する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の対象を治療することで死亡率を低下させる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳＣｏＶ－２感染症の対象を治療することで死亡率を低下させる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが罹患率を低下させる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが罹患率を低下させる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが、呼吸不全、ＩＣＵにおける日数、人工呼吸器をつけている日数を減少させるか、又は臨床改善のための臨床的改善についての平均ＷＨＯ順序尺度を改善する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが、呼吸不全、ＩＣＵにおける日数、人工呼吸器をつけている日数を減少させるか、又は臨床改善のためのＷＨＯ順序尺度を改善する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが、６０歳超の対象における死亡率又は呼吸不全を減少させる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが、６０歳超の対象における死亡率又は呼吸不全を低減する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、レムデシビル及び／又はデキサメタゾン及び／又はモルヌピラビル及び／又はソトロビマブ及び／又はベブテロビマブ及び／又はトシリズマブ及び／又はバリシチニブ及び／又は回復期血漿及び／又はバムラニビマブ／エテセビマブ及び／又はカシリビマブ／イムデビマブ及び／又はエンソビベプ及び／又はニルマトレルビル／リトナビルと組み合わせて投与した場合に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の対象を治療することで死亡率又は呼吸不全を低減する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、レムデシビル及び／又はデキサメタゾン及び／又はモルヌピラビル及び／又はソトロビマブ及び／又はベブテロビマブ及び／又はトシリズマブ及び／又はバリシチニブ及び／又は回復期血漿及び／又はバムラニビマブ／エテセビマブ及び／又はカシリビマブ／イムデビマブ及び／又はエンソビベプ及び／又はニルマトレルビル／リトナビルと組み合わせて投与された場合に、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の対象を治療することで死亡率又は呼吸不全を低減する方法を包含する。本明細書で使用される場合、死亡率、罹患率、又は呼吸不全、ＩＣＵでの日数、人工呼吸器での日数などの減少は、プラセボで治療した対象（又は対象集団）と比較した減少を意味する。同様に、ＷＨＯ Ｏｒｄｉｎａｌ Ｓｃａｌｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓなどの任意の改善は、プラセボで治療した対象（又は対象集団）と比較した改善を意味する。
本発明の更に別の実施形態は、少なくとも１つの追加治療を更に含む本発明の化合物を投与することによってウイルス感染を治療する方法を包含する。ウイルス感染を治療する方法の実施形態は、ノイラミニダーゼ阻害剤、レムデシビル、ヒドロキシクロロキン、アジスロマイシン、又はヘマグルチニン阻害剤などの第２の抗ウイルス治療を更に含む。ウイルスを治療する方法の実施形態は、免疫系又は宿主細胞因子を調節する薬剤、例えばデキサメタゾン又は別のコルチコステロイド、ＩＬ－６阻害剤、例えばトシリズマブ、インターフェロン、ＩＬ－１阻害剤、又はキナーゼ阻害剤、例えばバリシチニブを更に含む。本発明の更に別の実施形態では、本方法は、抗体療法、例えば、高力価ＣＯＶＩＤ－１９回復期血漿、ＩＶＩＧ、モノクローナル抗体療法、例えば、カシリビマブとイムデビマブとの併用、バムラニビマブ、又はバムラニビマブとエテセビマブとの併用を更に含んでもよい。本方法の実施形態は、レムデシビル及び／又はデキサメタゾン又は他のコルチコステロイドなどの追加治療を更に含む。本方法の実施形態は、トシリズマブなどの追加治療を更に含む。本方法の実施形態は、バリシチニブなどの追加治療を更に含む。本方法の実施形態は、高力価ＣＯＶＩＤ－１９回復期血漿などの追加治療を更に含む。本方法の実施形態は、ＩＶＩＧなどの追加治療を更に含む。本方法の実施形態は、カシリビマブとイムデビマブの併用などの追加治療を更に含む。本方法の実施形態は、バムラニビマブなどの追加治療を更に含む。本方法の実施形態は、バムラニビマブとエテセビマブとの併用などの追加治療を更に含む。本方法の更に別の実施形態は、ファビピラビル、ロピナビル、リトナビル、レムデシビル、ヤヌスキナーゼ阻害剤、ヒドロキシクロロキン、アジスロマイシン、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン、イドクスウリジン、トリフルリジン、ビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビル、フォスカメット、ジドブジン、ジダノシン、ペラミビル、ザルシタビン、スタブジン、ファムシクロビル、オセルタミビル、ザナミビル、又はバラシクロビルの少なくとも１つである第２の抗ウイルス療法を含む。本方法の更に別の実施形態は、ビタミンＣ若しくはＤ、亜鉛、ファモチジン、イベルメクチン、又はアンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）若しくはアンジオテンシン受容体結合（ＡＲＢ）剤の少なくとも１つである第２の治療を含む。
本発明の実施形態は、本発明の化合物を投与することによってウイルス感染を処置する方法を包含し、本発明の化合物は、約０．１ｍｇ～約１００ｍｇの量で投与される。本発明の化合物を投与することによってウイルス感染を治療する本発明の別の実施形態は、本発明の化合物が約１～約９０ｍｇの量で投与される方法を包含する。本発明の化合物を投与することによってウイルス感染を治療する本発明の別の実施形態は、本発明の化合物が約３～約３０ｍｇの量で投与される方法を包含する。本発明の別の実施形態は、本発明の化合物が約９ｍｇ～約１８ｍｇの量で投与される方法を包含する。本発明の別の実施形態は、本発明の化合物が約４ｍｇ～約４５ｍｇの量で投与される方法を包含する。本発明の更に別の実施形態では、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を包含する。
本発明の化合物を投与することによってウイルス感染を治療する方法は、ウイルス感染に関連する感染症又は疾患を治療するための他の抗ウイルス療法例えば、併用療法と組み合わせて投与されてもよい。本発明の方法と組み合わせて使用することが企図される好適な抗ウイルス剤としては、ヌクレオシド及びヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤及び他の抗ウイルス剤が挙げられてもよい。好適なＮＲＴＩの例としては、ジドブジン（ＡＺＴ）；ジダノシン（ｄｄＩ）；ザルシタビン（ｄｄＣ）；スタブジン（ｄ４Ｔ）；ラミブジン（３ＴＣ）；アバカビル（１５９２Ｕ８９）；アデフォビル・ジピボキシル［ビス（ＰＯＭ）－プメア］；ロブカビル（ＢＭＳ－１８０１９４）；ＢＣＨ－Ｉ０６５２；エムトリシタビン［（－）－ＦＴＣ］；β－Ｌ－ＦＤ４（β－Ｌ－Ｄ４Ｃとも呼ばれ、β－Ｌ－２’，３’－ｄｉｃｌｅｏｘｙ－５－フルオロシチデンとも命名される）；ＤＡＰＤ、（（－）－β－Ｄ－２，６－ジアミノ－プリンジオキソラン）；及びロデノシン（ＦｄｄＡ）が挙げられる。典型的な好適なＮＮＲＴＩとしては、ネビラピン（ＢＩ－ＲＧ－５８７）；デラビラジン（ＢＨＡＰ、Ｕ－９０１５２）；エファビレンツ（ＤＭＰ－２６６）；ＰＮＵ－１４２７２１；ＡＧ－１５４９；ＭＫＣ－４４２（１－（エトキシ－メチル）－５－（１－メチルエチル）－６－（フェニルメチル）－（２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ピリミジンジオン）；並びに（＋）－カラノリドＡ（ＮＳＣ－６７５４５１）及びＢが挙げられる。典型的な好適なプロテアーゼ阻害剤としては、サキナビル（Ｒｏ ３１－８９５９）；リトナビル（ＡＢＴ－５３８）；インジナビル（ＭＫ－６３９）；ネルフィナビル（ＡＧ－１３４３）；アンプレナビル（１４１Ｗ９４）；ラシナビル（ＢＭＳ－２３４４７５）；ＤＭＰ－４５０；ＢＭＳ－２３２２６２３；ＡＢＴ－３７８及びＡＧ－１５４９が挙げられる。他の抗ウイルス剤としては、ヒドロキシ尿素、リバビリン、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ペンタフシド及びＹｉｓｓｕｍ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．１１６０７が挙げられる。
他の抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼ阻害剤、ヘマグルチニン阻害剤、ヒドロキシクロロキン、アジスロマイシン、又は免疫系若しくは宿主細胞因子を調節する薬剤、例えばデキサメタゾンが挙げられるが、これらに限定されない。例としては、ファビピラビル、ロピナビル、リトナビル、レムデシビル、ヤヌスキナーゼ阻害剤、ヒドロキシクロロキン、アジスロマイシン、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン、イドクスウリジン、トリフルリジン、ビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビル、フォスカメット、ジドブジン、ジダノシン、ペラミビル、ザルシタビン、スタブジン、ファムシクロビル、オセルタミビル、ザナミビル、及びバラシクロビルが挙げられるが、これらに限定されない。本方法の実施形態は、レムデシビル及び／又はデキサメタゾンなどの追加治療を更に含む。本方法の実施形態は、カシリビマブとイムデビマブの併用などの追加治療を更に含む。本方法の実施形態は、バムラニビマブなどの追加治療を更に含む。
ウイルス感染を処置する方法は、他の療法を更に含んでもよい。例えば、本方法は、ノイラミニダーゼ阻害剤、レムデシビル、ヒドロキシクロロキン、アジスロマイシン、又はヘマグルチニン阻害剤などの第２の抗ウイルス療法を含んでもよい。本方法に含まれる他の療法は、免疫系又は宿主細胞因子を調節する薬剤、例えばデキサメタゾン、コルチコステロイド、ＩＬ－６阻害剤、例えばトシリズマブ、インターフェロン、ＩＬ－１阻害剤、又はキナーゼ阻害剤、例えばバリシチニブを含み得る。本方法は、抗体療法、例えば、高力価ＣＯＶＩＤ－１９回復期血漿、ＩＶＩＧ、モノクローナル抗体療法、例えば、カシリビマブとイムデビマブとの併用、バムラニビマブ、又はバムラニビマブとエテセビマブとの併用を更に含み得る。本方法は、トシリズマブ又はバリシチニブを更に含み得る。本方法は、追加の療法、例えば、高力価ＣＯＶＩＤ－１９回復期血漿、ＩＶＩＧ、カシリビマブとイムデビマブとの併用、バムラニビマブ、又はバムラニビマブとエテセビマブとの併用を更に含み得る。本方法は、ファビピラビル、ロピナビル、リトナビル、レムデシビル、ヤヌスキナーゼ阻害剤、ヒドロキシクロロキン、アジスロマイシン、アマンタジン、リマンタジン、リバビリン、イドクスウリジン、トリフルリジン、ビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビル、フォスカメット、ジドブジン、ジダノシン、ペラミビル、ザルシタビン、スタブジン、ファムシクロビル、オセルタミビル、ザナミビル、又はバラシクロビルの少なくとも１つである第２の抗ウイルス療法を含んでもよい。本方法は、ビタミンＣ若しくはＤ、亜鉛、ファモチジン、イベルメクチン、又はアンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）若しくはアンジオテンシン受容体結合（ＡＲＢ）剤のうちの少なくとも１つである第２の療法を含み得る。
本発明は又、上述の化合物及び製剤で炎症を治療する方法に関する。この化合物及びその製剤は、チューブリン重合を破壊することによって炎症を治療する際に有用性を有する。製剤は、任意選択的に、その活性が炎症に関連する疾患を治療し、特定の製剤の化合物若しくは投与量に関連する有害作用を治療し、かつ／又は成分の放出を遅延若しくは延長するのに有用である追加の活性成分を含むことができる。
本発明の更に別の実施形態は、本発明の化合物を投与することによって有害な炎症を治療する方法であって、炎症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＣＯＶＩＤ－１９又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされるウイルス感染から生じる、方法を包含する。
本発明の実施形態は、本発明の化合物を約０．１ｍｇ～約１００ｍｇの量で投与する、炎症を治療する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、本発明の化合物を約１～約９０ｍｇの量で投与する、炎症を治療する方法を包含する。本発明の化合物を投与することによって炎症を治療する本発明の別の実施形態は、本発明の化合物を約３～約３０ｍｇの量で投与する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、本発明の化合物を約９ｍｇ～約１８ｍｇの量で投与する、炎症を治療する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、本発明の化合物を約４ｍｇ～約４５ｍｇの量で投与する、炎症を治療する方法を包含する。炎症を治療する方法の更に別の実施形態では、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を包含する。
本発明の方法は、以下の、慢性炎症性疾患及び自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない疾患によって引き起こされる炎症を治療するために使用されてもよい。例としては、ウイルス誘発性炎症、関節炎、痛風、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、アレルギー、アルツハイマー病、喘息、自己免疫疾患、心血管疾患、癌、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、クローン病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、子宮内膜症、脂肪肝疾患、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー、肥満、パーキンソン病、歯周炎、乾癬、関節リウマチ、副鼻腔炎、結核、潰瘍性大腸炎、ａ）関節炎の予防、治療、又は逆転、ｂ）関節炎状態、例えば、ベーチェット病（自己免疫血管炎）、滑液包炎、ピロリン酸カルシウム二水和物結晶（ＣＰＰＤ）、沈着症（又は偽痛風）、手根管症候群、結合組織障害、クローン病、エーラー・ダンロス症候群（ＥＤＳ）、線維筋肉痛、痛風、感染性関節炎、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、若年性関節炎、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、マルファン症候群、筋炎、骨関節症、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、乾癖、乾癬性関節炎、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、ライター症候群、リウマチ性関節炎、硬皮症、シェーグレン症候群、腱炎又は潰瘍性結腸炎の予防、治療又は逆転、ｃ）自己免疫疾患を予防、治療、又は逆転させることが挙げられる。
本発明の方法は、コロナウイルス科（Coronaviridae）、場合によってはフラビウイルス科（Flaviviridae）及びヘルペスウイルス科（Herpesviridae）のスーパーファミリーを含むウイルスによって引き起こされる炎症を治療するために使用されてもよい。又、本発明の方法は、ＲＳＶ、ＫＳＨＶ、ＣＭＶ、ＤＥＮＶ、ＣＨＩＫＶ、ＴＢＥＶ、ＶＳＶ、ＺＩＫＶ、ＨＣＶ、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＣＯＶＩＤ－１９を含むがこれらに限定されないウイルスによって引き起こされる炎症を治療するために使用されてもよい。好ましくは、本発明の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、又はＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされる炎症を治療する。本発明の方法は又、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、又はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）などのヘルペスウイルスによって引き起こされる炎症を処置するために使用されてもよい。
本発明の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる炎症、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を治療するために使用されてもよい。本発明の方法は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療するために使用され得る。対象は、死亡率を低下させるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有し得る。本発明の別の実施形態は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳＣｏＶ－２感染症の対象を治療することで死亡率を低下させる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが罹患率を低下させる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが罹患率を低下させる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが、呼吸不全、ＩＣＵにおける日数、人工呼吸器をつけている日数を減少させるか、又は臨床改善のための臨床的改善についての平均ＷＨＯ順序尺度を改善する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが、呼吸不全、ＩＣＵにおける日数、人工呼吸器をつけている日数を減少させるか、又は臨床改善のためのＷＨＯ順序尺度を改善する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが、６０歳超の対象における死亡率又は呼吸不全を減少させる方法を包含する。本発明の別の実施形態は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが、６０歳超の対象における死亡率又は呼吸不全を低減する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが、レムデシビル及び／又はデキサメタゾンと組み合わせて投薬された場合に死亡率又は呼吸不全を低減する方法を包含する。本発明の別の実施形態は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のリスクが高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する対象を治療することが、レムデシビル及び／又はデキサメタゾンと組み合わせて投与された場合に死亡率又は呼吸不全を低減する方法を包含する。
生物活性
１４個の化合物を合成し、黒色腫及び乳癌細胞株のパネルに対するインビトロ抗癌効力について試験した。結果を以下の表１に示す。
Figure 2024515727000028
１０種の新たに設計されたジヒドロキノキサリノン類縁体は非常に強力であり、特に５ｌ、５ｍ、５ｒ、５ｔ、５ｕ、及び５ｖは、試験した全ての細胞株に対して０．４～２６ｎＭの範囲のＩＣ５０値で、有望な細胞傷害活性を示した。
化合物５ｐも同様に中程度に活性であり、ＩＣ５０値は１９～３７ナノモルの範囲だった。図３に示すように、Ａ環が開環したピリミジン類縁体５ｑ及び５ｒを有する２つの化合物を調製した。化合物５ｒは、４ナノモル～１８ナノモルの範囲のＩＣ５０値で、非常に強力であることが分かった（表１参照）。塩素で置換されたＢ環を有する化合物５ｑは不活性であることが分かった。したがって、Ａ環は自由度が高く、改善された効力並びに水溶性を達成するように修飾することができる。ピリドピリミジン類縁体５ｓを、１ａ及び２ａの１位の窒素原子がチューブリンのβ－Ｃ２３９及びβ－Ｖ２３６との水媒介水素結合に関与するものとして調製した。化合物５ｓは、ＩＣ５０値が１３～２４ｎＭの範囲で、ピリミジン対応物２ａと比較して効力が減少した。更に、Ｂ環に結合した塩素原子はβ－Ｈ７及びβ－Ｔ７ループの間のポケットに位置していた。ポケットは本質的に疎水性であり、更なる合成修飾を可能にするより多くの自由空間を有する。したがって、３つのエチルアミン置換Ｂ環類縁体、５ｔ、５ｕ、及び５ｖを合成した。（実施例４を参照。）エチルアミン部分は、β－Ｈ７及びβ－Ｔ７骨格と水素結合を形成することができ、インビボでのより良好な有効性のために類縁体の水溶性を改善することができる。化合物５ｖは、ＩＣ５０値が０．４～０．８ｎＭのｐＭ範囲で最も高い効力を示した。
タキサンなどの既存のチューブリン阻害剤の主要な臨床的限界は、流出ポンプに対する高い感受性であるので、化合物５ｍ、５ｔ、及び５ｖを、タキサンに対する耐性が高い追加の癌細胞株（Ａ３７５／ＴｘＲ、Ｍ１４／ＬＣＣ６ＭＤＲ１、ＭＢ－２３１／ＴｘＲ、及びＡ５４９／ＴｘＲ）で評価した（表２）。パクリタキセル、コルヒチン、ベルブリン、及び化合物１７ｙａ［（２－（１Ｈ－インドリル－３－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）（３，４，５－トリメトキシフェニル）］を、対照比較のための対照として使用した。これらの細胞株において効力を有意に失ったパクリタキセルとは異なり、５ｍ、５ｔ、５ｖ、及びベルブリンは、効力を保持した（表２）。化合物５ｍ、５ｔ及び５ｖは、黒色腫及び乳癌に対して最も強力な細胞傷害活性の１つを示した（表１）。化合物５ｍ、５ｔ及び５ｖのＩＣ５０値は、タキサン耐性黒色腫、乳癌及び肺癌細胞に対して０．３～５ナノモルの範囲だった（表２）。表２から明らかなのは、化合物５ｖは、タキサン耐性細胞株に対してベルブリンと同程度に強力であり、５ｍ及び５ｔはほぼ同程度の効力であると考えられる。化合物５ｍ、５ｔ、及び５ｖが化合物１７ｙａと異なる点は、化合物１７ｙａ耐性トリプルネガティブ乳癌細胞株において低いｎＭ（１．２～２．９ｎＭ）活性を保持していたことで（ＭＤＡ－ＭＤ－２３１／ＶｘＲ；１００ｎＭ化合物１７ｙａの存在下増殖させた）、これは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１親株での活性に匹敵する（１．０～２．２ｎＭ）。対照的に、化合物１７ｙａの活性は、少なくとも１００倍の耐性を示した（９０３．４ｎＭ対６．１ｎＭ）。
Figure 2024515727000029
創薬における主な障害は、化合物の不十分なインビボ安定性であり、これにより薬理活性が急速に喪失し、潜在的に有毒な代謝物が形成されるので有害作用があらわれる。したがって、ヒト及びマウス肝ミクロソーム中での化合物５ｍの半減期及びクリアランスを測定した。表３にデータを要約する。
Figure 2024515727000030
結果から、化合物５ｍは、げっ歯類と比較してヒトにおいてかなり高い許容可能なミクロソーム安定性を有することが示された。
静脈内及び経口投与後のラットにおける化合物５ｍのインビボ薬物動態試験では、高度の代謝変換を示す未変化形態での低い累積尿中排泄を示した。インビボ終末相半減期は、おそらく大きな分布容積のため、１４．７時間の長さだった。濃度－時間曲線下面積として定量化された全身曝露は、ｍｇ用量ベースで、マウスのベルブリンについて観察されたもののほぼ２倍だった［データ示さず］。５ｍの経口バイオアベイラビリティは３．２％だった。表４にデータを要約する。
Figure 2024515727000031
膵臓癌における化合物５ｍの抗腫瘍活性の評価
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、死亡率が高い悪性腫瘍である。化合物５ｍは、コルヒチン結合部位を標的とするチューブリン阻害剤として機能する、本明細書で報告される多くのジヒドロキノキサリノンのうちの１つであり、ＰＤＡＣ及び他の様々な癌の種類における使用を支持する。第一選択治療選択肢の１つであるパクリタキセルと比較した、ＰＤＡＣ細胞株に対する化合物５ｍのインビトロ効果は、驚くべきものであった。化合物５ｍのこの支持されたインビボ試験は、腫瘍進行のライブモニタリング及び皮下マウスモデルにおける抗腫瘍効果の評価のために、ルシフェラーゼ標識Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞株、Ｍｉａ ＰａＣａ－２－ｌｕｃにおいて有効だった。５ｍは、Ｍｉａ ＰａＣａ－２－ｌｕｃ異種移植片において有意な腫瘍増殖阻害を示し、全体的な毒性は低かった（図２３）。同様に、５ｍで処置したＰＡＮＣ－１－ｌｕｃ異種移植片も、ＰＤＡＣ中の化合物５ｍに対して強力及び用量依存的な抗癌活性を示した。実施例７の結果から、化合物５ｍが低ナノモル濃度で用量依存的に細胞増殖、コロニー形成及び細胞遊走を効果的に阻害することが示された。免疫ブロットにより、化合物５ｍが用量依存的に細胞アポトーシスを誘導することも確認された。細胞周期停止アッセイにより、化合物５ｍがＧ２／Ｍ期で細胞を停止させたことが確認された。インビボ試験から、化合物５ｍが、毒性効果をほとんど又は全く伴わずに、皮下異種移植モデルにおいてＰＤＡＣ腫瘍の腫瘍増殖を有意に阻害することが示された。前臨床データから、化合物５ｍがＰＤＡＣ細胞において増殖、細胞遊走を阻害し、アポトーシスを誘導することが実証され、ＰＤＡＣの治療における化学療法剤を示した。
チューブリン重合の阻害。
化合物が微小管へ結合するために強力な抗増殖活性を示すこととを決定するために、２つの化合物５ｍ及び５ｔ、並びに参照化合物、コルヒチン及びパクリタキセルを用いた無細胞チューブリン重合アッセイを実施した。図５に示すように、化合物５ｍ及び５ｔは、陽性対照として働くコルヒチンと同様に、微小管重合を有意に阻害した。陰性対照パクリタキセルは、予想された微小管核形成及び成長の加速を示し、したがって、重合増強を引き起こした。チューブリン重合アッセイと一致して、化合物５ｍ及び５ｔは、微小管断片化に関連する可溶性細胞質チューブリンを実証し、間期Ａ３７５／ＴｘＲ細胞における微小管ダイナミクスを大きく破壊した（図５Ｂ）。一方、ビヒクル対照群の細胞では、間期の間に、凝縮していない染色体を有する核に向かって包まれた規則的な微小管ネットワークが観察された。コルヒチン又はパクリタキセルで処理した細胞は又、２ｎＭの濃度で正常な繊維状配置を有するインタクトなチューブリンネットワークを示した。対照、コルヒチン又はパクリタキセル群において正常に機能する紡錘体を有する有糸分裂細胞と比較して、２ｎＭの５ｍで処理した細胞は、紡錘体が集合できなかったようであり、多極紡錘体及び不整列染色体が形成された。同様の結果が、２ｎＭの５ｔで処理した有糸分裂細胞において観察された。
チューブリンと複合体形成した化合物５ｊ、５ｋ、５ｌ、５ｍ及び５ｔのＸ線結晶解析。
化合物とコルヒチン結合部位との分子相互作用を、５ｊ（ＰＤＢ：６Ｘ１Ｃ、２．９Å分解能）、５ｋ（ＰＤＢ：６Ｘ１Ｅ、２．９Å分解能）、５ｌ（ＰＤＢ：６Ｘ１Ｅ、２．９Å分解能）、５ｍ（ＰＤＢ：６Ｘ１Ｆ、２．７Å分解能）、及び５ｔ（ＰＤＢ：７ＬＺ８、２．９Å分解能）と複合体形成したチューブリン結晶構造によって調べた（図６Ｂ～６Ｇ）。これらの結晶構造から、設計された類縁体が予想通りコルヒチン結合部位に結合することが実証された。
５つ全ての設計された類縁体は、β－チューブリンポケット深くのＡ及びＢ環並びにα－チューブリンとの境界面にあるＣ及びＤ環との結合配向を有した（図６Ｂ～６Ｇ）。共結晶化したリガンドとチューブリンとの分子相互作用のほとんどは、化合物１ａ及び２ａについて観察されたように、シートＳ９からのβ－Ａ３５２、シートＳ８からのβ－Ａ３１４及びβ－Ｉ３１６、シートＳ１０からのβ－β－Ｉ３６８、ヘリックスＨ８からのβ－Ｌ２５３及びβ－Ｍ２５７、ループＴ７からのβ－Ｌ２４６及びβ－Ａ２４８、ヘリックスＨ７からのβ－Ｌ２４０、β－Ｃ２３９及びβ－Ｖ２３６を含めて、本質的に疎水性である。Ｃ環のアミド部分からのＮＨ基は、ループＴ５からの骨格カルボニル基α－Ｔ１７９への水素結合供与体として作用する。Ｃ環中のアミド部分のカルボニル基は、２ａにおいて観察されるように、α－Ｔ１７９及びα－Ｎ１０１との追加の水媒介水素結合を形成する。化合物のうちの２つ、５ｊ及び５ｍは又、Ｂ環中のＮ原子並びにヘリックスＨ７のβ－Ｃ２３９及びβ－Ｖ２３６の間の水媒介性Ｈ結合を保持した。化合物１ａ及び２ａのように、全ての共結晶化構造は、ループＴ５からのα－Ｓ１７８とシートＳ９からのβ－Ｋ３５０との間に新しいＨ結合を示す。したがって、これらの知見から、疎水性Ａ環並びにアミドＣ環を有する新規類縁体は、α－及びβ－チューブリンモノマーの両方とより強い相互作用を有し、したがって、それらのモノマーをより密接な立体構造に近づけて、α－モノマーからの残基とβ－モノマーからの残基との間でＨ結合させる可能性があることが示唆される。５ｍの共結晶構造では、他の化合物よりもコルヒチン結合部位に良好に結合する。チューブリンへの５ｍの最も強い結合は、様々な通常黒色腫及びパクリタキセル耐性黒色腫、乳並びに肺癌細胞株に対する低い一桁のナノモルＩＣ５０値（１～５ ｎＭ）の実験的知見によって支持される。飽和疎水性Ａ環を有するジヒドロキノキサリノン類縁体（５ｌ、５ｍ）は、以前に公開された１ａ並びに２ａよりも強い結合を有し、抗腫瘍有効性が改善される可能性がある。
タキソール耐性黒色腫細胞のコロニー形成及び遊走の阻害。多様なタキソール感受性（親）並びにタキソール耐性癌細胞株に対するジヒドロキノキサリノン類縁体の細胞傷害性効果の結果（表１及び２）に基づいて、２つの類縁体５ｍ及び５ｔを選択して、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞に対する抗癌機構を調べるための更なるインビトロ及びインビボ実験を実施した。癌細胞はコロニーを形成することによって増殖するので、コロニー形成の抑制は、良好な抗癌剤の重要な属性と考えられた。５ｍ及び５ｔがコロニー形成を阻害する効力を調べるためにコロニー形成アッセイを実施した。
図７Ａ及び７Ｂは、新たに合成された化合物が、濃度依存的にＡ３７５／ＴｘＲ細胞のコロニー形成を抑制したことを示す。対照群と比較して、化合物５ｍ及び５ｔは、コロニーの数及びサイズの減少を示し、非常に低い濃度（１ｎＭ）であっても長期の曝露時間（７日間）にわたって細胞増殖を抑制した。化合物５ｍ及び５ｔは、高用量すなわち、２ｎＭでコロニー形成を完全に阻害した（図７Ａ）。
癌細胞遊走は腫瘍進行及び転移において非常に必須であり、転移は癌患者において高い死亡率をもたらす最も一般的な寄与因子であるので、創傷治癒アッセイを使用することによってＡ３７５／ＴｘＲ細胞の遊走を阻害するために、化合物５ｍ及び５ｔを試験した。図８Ａは、創傷の２４時間後に、細胞単層をＤＭＳＯで処理した対照細胞が創傷領域を満たしたが、２ｎＭ又は５ｎＭ５ｍで処理した細胞における創傷は、対照群における創傷よりも遅く治癒したことを示す。５ｎＭの５ｍは、１２時間のインキュベーション後でさえ、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞の遊走を著しく阻害した。図８Ｂは、５ｔ処理がＡ３７５／ＴｘＲ細胞遊走を抑制する強力な能力を有し、その効力が５ｍと同等であったことを示す。まとめると、これらの結果から、５ｍ及び５ｔは、癌細胞のコロニー形成及び遊走を阻害する効力があることが示された。
化合物５ｍ及び５ｔ処理を行うと、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞のＧ２／Ｍ細胞周期停止及び細胞アポトーシスを引き起こした。細胞周期進行の妨害における微小管重合の阻害の中心的役割並びに図５Ｂに示される５ｍ及び５ｔ－で処理したＡ３７５／ＴｘＲ細胞において観察された紡錘体欠損を考慮して、フローサイトメトリーに基づく細胞周期分析を実施して、細胞有糸分裂に対する５ｍ及び５ｔの効果を評価した。Ａ３７５／ＴｘＲ細胞を、様々な濃度（１ｎＭ、２ｎＭ及び５ｎＭ）の化合物５ｍ又は５ｔで２４時間、血清飢餓無しで処理した。図９Ａは、対照細胞の正常な細胞周期分布（Ｇ１：４８％、Ｓ：３３％；Ｇ２／Ｍ：１９％））と比較した、５ｍ又は５ｔ処理で濃度依存的に誘導された、Ｇ２／Ｍ期での有意な細胞周期停止を示す。濃度２ｎＭでは、５ｍ及び５ｔは、それぞれ６０％及び６４％の割合でＡ３７５／ＴｘＲ細胞をＧ２／Ｍ期で停止させた。結果から、５ｍ及び５ｔは、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞に対するＧ２／Ｍ期での細胞周期停止を強力に誘導し、血清飢餓無しでも細胞分裂に影響を及ぼすことができることが実証された。
細胞周期分布を、ＭｏｄＦｉｔ ＬＴ（商標）ソフトウェアを使用して分析し、５ｍ又は５ｔでの処理の２４時間後に、サブＧ１領域における有意なアポトーシスピークが観察された（図９Ａでは、この細胞集団をゲートアウトして、Ｇ２／Ｍ期の細胞の割合を正確に定量化した）。アネキシンＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ染色アッセイにより、細胞周期分析と同じ処理を使用して、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞における細胞アポトーシス誘導に対する５ｍ及び５ｔの効果を検証した。アポトーシス細胞の総割合はすなわち、総細胞数に対する前期及び後期アポトーシス細胞の合計であった。図９Ｂから、処理後２４時間のアポトーシス細胞の割合は、対照群においてはわずか９％であったが、アポトーシス細胞では、２ｎＭの５ｍ及び５ｔによる処理後に、それぞれ３０％及び３３％に増加したことを観察することができる。更に、化合物５ｍ及び５ｔは、Ａ３７５／ＴｘＲの細胞アポトーシスを濃度依存的に誘導した。まとめると、化合物５ｍ及び５ｔは腫瘍細胞のアポトーシスを有意に引き起こし、このことは抗増殖性及び細胞周期停止におけるこれらの化合物の活性と一致した。
Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植モデルに対する化合物５ｍ及び５ｔを用いたインビボ実験。ジヒドロキノキサリノンピリミジン類縁体がインビボ癌治療で治療できる可能性を決定するために、化合物５ｍ及び５ｔを、Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植モデルにおける腫瘍の処置で試験した。Ａ３７５／ＴｘＲ黒色腫細胞を、パクリタキセル療法に対して耐性になるように開発した。この腫瘍モデルは、薬剤耐性獲得が主要な問題である既存の治療を上回る新しい薬剤の治療効果を研究するのに有用である。化合物５ｍによる処置は、Ａ３７５／ＴｘＲ黒色腫腫瘍増殖を用量依存的に阻害した（図１０Ａ）。４ｍｇ／ｋｇの用量で、５ｍは、試験期間を通して腫瘍増殖を有意に抑制した（ｐ＝０．０４５２）。２ｍｇ／ｋｇ５ｍでの処置も、４ｍｇ／ｋｇの腫瘍増殖抑制率の対照と比較して腫瘍が７０．４５％減少した（対照に対して８８．１８％）。パクリタキセル療法は無効であり、ビヒクル処置群と同様の腫瘍増殖傾向を示し、薬剤耐性を示唆した。試験中、個々のマウスの体重を監視した。結果から、体重は一貫して増加し、試験化合物によって引き起こされる明らかな有害反応はないことが示された（図１０Ｂ）。試験エンドポイントで、腫瘍を収集し、秤量した。２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇ５ｍで処置したマウスの腫瘍重量は、ビヒクル群の腫瘍重量と比較して、それぞれ７６．７％及び９１．８％減少した（図１０Ｃ及び１０Ｄ）。比較的高用量のパクリタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍重量の減少に何の利益も示さなかった。化合物５ｔのインビボ抗腫瘍活性を、同じＡ３７５／ＴｘＲ黒色腫モデルで評価し、パクリタキセル処置を陽性対照として使用した。Ａ３７５／ＴｘＲ細胞における５ｔのＩＣ５０（１．３ｎＭ）は５ｍ（１．１ｎＭ）よりもわずかに高いので、Ａ３７５／ＴｘＲ腫瘍を有するマウスにおける処置の間、５ｔの用量を２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇに増加させた。２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ５ｔ処置の両方で、対照及びパクリタキセル処置群とは対照的に、優れた抗腫瘍活性を示した（図１１Ａ）。ビヒクル処置群と比較して、２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ５ｔでの処置は、マウスの最終的なＡ３７５／ＴｘＲ腫瘍体積を、それぞれ６４．６３％及び７８．３８％の比率で減少させた（ｐ＝０．０３７４）。対照と比較して、様々な治療群の間で体重に顕著な差はなかった（図１１Ｂ）。更に、化合物５ｔは、マウスの腫瘍重量を用量依存的に減少させ（ビヒクル群に対して２．５ｍｇ／ｋｇ処置群で６７．３８％の減少及び５ｍｇ／ｋｇ処置群で７８．６５％の減少）、結果は有意であった（ｐ＜０．０００１）（図１１Ｃ）。この試験における全ての腫瘍の写真から、インビボでの５ｔの効力が更に確認された（図１１Ｄ）。まとめると、化合物５ｔは、パクリタキセル耐性黒色腫モデルに対して、明らかな副作用無しに抗腫瘍活性の増強を示した。
化合物５ｍ及び５ｔ処置は、インビボで腫瘍壊死を誘発した。インビトロで観察された細胞アポトーシス誘導における化合物５ｍ及び５ｔの強力な効果のため、Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植モデルの腫瘍を使用して５ｍ及び５ｔのインビボでの破壊的効果を、図１０及び１１に示されるように研究した。測定及び画像化後、腫瘍を１０％緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィンに包埋し、Ｈ＆Ｅ染色用に切片化した。図１２に示すように、ビヒクル処置群では、腫瘍細胞は、円形で無傷の核を有する正常な形状を示し、腫瘍細胞はしっかりと一定に配置された。パクリタキセル処理腫瘍細胞は、同様の細胞形態及び分布を示した。対照的に、５ｍ又は５ｔ処理後、腫瘍細胞は緩く不均一に配置され、いくつかの壊死細胞を有する広範な壊死領域を腫瘍中に明確に観察することができ、この腫瘍壊死領域は用量依存的に増加した。これらの結果から、５ｍ及び５ｔの強力な抗腫瘍能が確認された。
化合物５ｍ及び５ｔ処置は、肺及び肝臓への自然転移を阻害した。悪性黒色腫は、腫瘍細胞が原発部位から内臓臓器に広がる過程である、転移の攻撃的な可能性がある危険な疾患である。転移の１つの主要な段階は、腫瘍細胞の生存及び増殖に適した内臓臓器における腫瘍微小環境の発達である。多くの研究で、黒色腫によって引き起こされる肺又は脳転移の発生などの転移のこの重要な段階を研究するために、自然転移異種移植モデルが広く使用されたことを報告した。肺への自然転移が起こるであろうＡ３７５／ＴｘＲ皮下異種移植モデル（上記参照）の肺及び肝臓組織を用いて、化合物５ｍ及び５ｔの黒色腫自然転移阻害をインビボで調べた。まず、５ｍ異種移植片モデルの肺組織をＨ＆Ｅ染色した。
図１５Ａは、対照群において観察された複数のマクロ転移（黄色矢印）を示し、重度の黒色腫肺転移を示す。一方、５ｍ処置群は、サイズがより小さい限られた数の転移を示し、５ｍ処置は、用量依存的に肺転移を抑制した。パクリタキセル処置群を陽性対照として使用し、ビヒクル処置と比較して肺自然転移に対して効果がなかった。図１３Ａは、肺における腫瘍負荷の定量分析をグラフで示し、転移性腫瘍細胞の遊走に対する５ｍの阻害効果を更に確認した。肝臓は、腫瘍細胞が播種して増殖する別の主要な臓器であるため、肝臓組織のＨ＆Ｅ染色を実施した。図１５Ｂ及び図１３Ｂに示されるように、５ｍ処置群における肝臓表面上の転移の減少により、黒色腫の自然遊走の抑制における５ｍの有効性が確認された。４ｍｇ／ｋｇ５ｍ処置マウスの肝臓は全てきれいであり、肝転移に対する５ｍの強力な阻害効果が実証された。５ｍ処置による腫瘍遊走の有意な阻害は、肺又は肝臓切片における抗ヒトミトコンドリア免疫染色の密度の低下（褐色染色組織）によって更に確認され、これは、Ｈ＆Ｅ染色によって得られた結果と一致した（図１３Ｃ、１３Ｄ、及び図１６）。５ｍ異種移植モデルから得られた有望なデータを考慮して、５ｔ異種移植モデルにおける肺及び肝臓組織のＨ＆Ｅ染色を実施した。最終腫瘍重量によれば、５ｍ異種移植モデル由来の対照又はパクリタキセル群と比較して、肺及び肝転移の数は、５ｔ異種移植モデル由来の対照又はパクリタキセル群において増加し、図１７及び図１４Ａ～Ｂに示されるように、２つの異種移植モデル間の腫瘍進行の差を確認した。Ｈ＆Ｅ染色結果は、５ｔ処置の肺及び肝転移の抑制に対する用量依存的な強力な効果を示した。更に、抗ヒトミトコンドリアＩＨＣ染色も、図１４Ｃ及び１４Ｄ並びに図１８に示されるように、５ｔ処置マウスにおける転移がまばらで小さく、５ｔの用量が増加すると、転移の数及びサイズが減少することを示した。これらのデータは、マウスの肺及び肝臓への黒色腫自然転移の阻害における強力なチューブリン不安定化剤としての５ｍ及び５ｔの役割を支持する。
化合物５ｍは、黒色腫（Ａ３７５／ＴｘＲ）、前立腺癌（ＤＵ－１４５／ＶｘＲ及び２２ＲＶ１）、乳癌（ＭＤＡ－ＭＤ－２３１／Ｖｘ）、及び卵巣癌（Ａ２７８０／ＴｘＲ）のインビボ異種移植モデルにおいて、タキサン及び／若しくは化合物１７ ｙａ又は去勢に対する抵抗性を克服した。
ジヒドロキノキサリノンピリミジン類縁体がインビボ癌治療の可能性を有するかどうかを決定するために、Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植モデルにおいて腫瘍を治療するための代表的な化合物として化合物５ｍを選択した。Ａ３７５／ＴｘＲ黒色腫細胞を、パクリタキセル療法に対して耐性になるように開発した。したがって、この腫瘍モデルは、薬剤耐性獲得が主要な問題である既存の治療を上回る新しい薬剤の治療的利益を研究するのに非常に有用であってもよい。本発明者らは、５ｍ処置がＡ３７５／ＴｘＲ黒色腫腫瘍増殖を用量依存的に強く阻害することを見出した（図１９Ａ）。４ｍｇ／ｋｇの用量で、５ｍは、試験期間を通して腫瘍増殖を有意に抑制した（ｐ＝０．０４５２）。２ｍｇ／ｋｇの５ｍでの処置も、対照と比較して腫瘍が７０．５％減少し、これは４ｍｇ／ｋｇの減少よりもわずかに低かった（対照に対して８８．２％）。予想した通り、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセル療法は無効であり、ビヒクル処置群と同様の腫瘍増殖傾向を示し、タキサン薬剤耐性を示唆した。
化合物１７ｙａ耐性（ＶｘＲ）［化合物１７ｙａは（２－（１Ｈ－インドリル－３－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）（３，４，５－トリメトキシルフェニル）である］に対する５ｍの効果を評価するために、化合物１７ｙａ耐性ＤＵ－１４５／ＶｘＲ細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ細胞を、細胞を化合物１７ｙａと共に連続的にインキュベートすることによって生成した。細胞が１００ｎＭの化合物１７ｙａに対して耐性であった場合、両方の細胞株が化合物１７ｙａに対して耐性であると確認し、インビボ研究用に増殖させた。興味深いことに、ＤＵ－１４５／ＶｘＲ細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ細胞の両方は、腫瘍を有するマウスにおいてゆっくりと増殖する。平均腫瘍体積が～８０ｍｍ３に達するまで１６日間待機し、処置を開始した。治療期間中、本発明者らは、ＤＵ－１４５／ＶｘＲ異種移植片に対する５ｍの有意な腫瘍阻害効果を認めた（図１９Ｂ）。１ｍｇ／ｋｇ ＩＶ５ｍ（２×／週）群のエンドポイント平均腫瘍体積は、開始点とほぼ同じであり、８０ｍｍ３であったが、対照群のエンドポイント平均腫瘍体積は、約３４０ｍｍ３であった。驚くべきことに、２０ｍｇ／ｋｇの高用量ＰＯ化合物１７ｙａ（３×／週）は、この化合物１７ｙａ耐性前立腺癌モデルにおいて依然として有効であった。［５ｍとは異なり、化合物１７ｙａは高い経口バイオアベイラビリティを有する。エンドポイント平均腫瘍体積は、対照群と５ｍ群との間であり、約１９０ｍｍ３だった。それにもかかわらず、２０倍より高い用量の化合物１７ｙａは、５ｍよりも有効性が低かった。
本発明者らは又、同所性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ異種移植モデルを使用して、化合物１７ｙａ耐性のトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）に対する５ｍの効果を決定した。今回、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセル及び２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａの両方を対照として含めた。ＩＶ投与によるマウスの不快感を軽減するために、５ｍの投与量を２ｍｇ／ｋｇに増加させ、投与頻度を週２回から週１回に減少させた。ＤＵ－１４５／ＶｘＲ異種移植モデルと同様に、２０ｍｇ／ｋｇの化合物１７ｙａ（３回／週）は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ異種移植片の増殖を抑制するのに有効であったが、その抗腫瘍活性は、パクリタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ ３回／週）又は５ｍ（１ｍｇ／ｋｇ ＩＶ １回／週）処置のいずれよりも弱く、化合物１７ｙａは、化合物１７ｙａ耐性が発生した場合であっても依然として抗腫瘍活性を有してもよいことが示唆された（図１９Ｃ）。５ｍ処置群の腫瘍増殖阻害は、図１９Ｃに示される平坦な腫瘍増殖曲線によって反映されるように、依然として明白であった。又、この化合物の抗腫瘍効果は、非常に低い用量及び少ない投与頻度であっても、パクリタキセル又は化合物１７ｙａより大きかった。化合物１７ｙａ及び５ｍは両方とも、チューブリンのコルヒチン結合部位を介して作用するので、５ｍが、化合物１７ｙａよりもずっと低い用量であっても、化合物１７ｙａに対する耐性を克服することができることは予想外である。更に、１７ｙａと比較して異なる構造、そして結果的に異なる結合様式を有する本発明の他の化合物も又、１７ｙａ耐性腫瘍を克服することができると予想される。
２２ＲＶ１細胞を使用して、去勢抵抗性前立腺癌に対する５ｍの効果を決定するために、追加の動物試験を行った。本発明者らは、腫瘍体積及びマウス体重に基づいて、マウスを未処置対照群及び１ｍｇ／ｋｇ５ｍ処置群に分けた。２２ＲＶ１前立腺癌異種移植モデルの去勢抵抗性を克服するために５ｍの有効性を評価するのは、今回が初めてであるので、マウスを処置する準備ができたら、５ｍの元の投与量及び投与頻度（１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ、２回／週）を維持した。図１９Ｄに示されるように、１ｍｇ／ｋｇ５ｍが２２ＲＶ１異種移植片の増殖を阻害するのは顕著であり（ｐ＜０．０００１）、去勢抵抗性前立腺癌モデルに対する５ｍの強力な抗腫瘍能力が実証された。
更に、黒色腫、前立腺癌及び乳癌モデルとは別に、侵襲性同所性卵巣癌モデルに対する５ｍの効果も試験した。そして、この試験のためにパクリタキセル耐性Ａ２７８０／ＴｘＲ細胞を選択した。他のモデルと同様に、マウスを３週間処置し、試験エンドポイントで全ての腫瘍を採取した。図１９Ｅに示すように、パクリタキセルが、ＩＶ注射による５ｍｇ／ｋｇの用量であっても、この侵襲性Ａ２７８０／ＴｘＲモデルに対して限定的な効果を有することを確認した。一方、１ｍｇ／ｋｇ５ｍの用量では、腫瘍増殖を有意に抑制することができ、５匹のマウスのうち１匹のみが目に見える腫瘍を有した。２０ｍｇ／ｋｇの化合物１７ｙａでは、２匹のマウスが目に見える腫瘍を有し、腫瘍サイズは５ｍ処置群よりも大きかった。更に、各群の腫瘍重量から、Ａ２７８０／ＴｘＲ卵巣癌モデルに対する５ｍの強い抗腫瘍効果が確認され、５ｍの効力はパクリタキセル及び化合物１７ｙａよりも大きかった（図１９Ｆ）。本明細書では本発明の特定の特徴が図示され、説明されてきたが、多くの修正、置換、変更、及び同等物がここで、当業者に思いつくであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に収まるように、全てのそのような修正及び変更を網羅することを意図することを理解されたい。
化合物１０及び１２ａ～１２ｑの類縁体の黒色腫（Ａ３７５、Ｍ１４）、乳（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３）、膵（Ｍｉａ ＰａＣａ－２、ＰＡＮＣ－１）、及び前立腺（ＰＣ３、ＰＣ３／ＴｘＲ）癌などの癌細胞株のパネルに対する細胞傷害活性を試験した。細胞増殖阻害の最大半量阻害濃度値（ＩＣ５０）を実施例９に要約する。この研究から、ヘテロ原子のサイズが細胞傷害性効力に著しい影響を及ぼし、ヘテロ原子のサイズが減少するとこの効力を増加させる傾向があることが明らかになった。例えば、チオエーテル１０（ＩＣ５０≒３．４±０．５ｎＭ、Ａ３７５細胞株）、エーテル１２ｂ（ＩＣ５０≒３．２±０．５ｎＭ）、及び第二級アミン１２ｋ（ＩＣ５０≒１．２±０．２ｎＭ）は比較的小さく、１桁のｎＭ効力を有した。しかしながら、Ｎ－メチルピペラジン１２ｄ（ＩＣ５０≒５４２．８±１１１．０ｎＭ）、モルホリン１２ｅ（ＩＣ５０≒１３．６±２．０ｎＭ）、ピペリジン１２ｆ（ＩＣ５０≒４３６．１±７６．２ｎＭ）、及びピロリジン１２ｇ（ＩＣ５０≒８２．１±１２．９ｎＭ）などの環状誘導体の置換は、中程度から高い効力を示したモルホリン誘導体を除いて、効力が比較的低いことが分かった。芳香族複素環、すなわち、イミダゾール１２ｈ（ＩＣ５０≒５．７±０．９ｎＭ）は、良好な効力を示した。第三級アミン１２ｉ（ＩＣ５０≒２２．６±４．５ｎＭ）誘導体は中程度の効力を示した。化合物１２ｋで得られた結果は、効力が高かったＮ－エチル５ｖ（ＩＣ５０≒１．６±０．３ｎＭ）及びＮ－シクロプロピル１２ｊ（ＩＣ５０≒１．４±０．３ｎＭ）などの第二級アミンの薬理学的効力を研究する道を開いた。調査した分子のうち、１２ｋが３つの第二級アミンの中で最良だった。１２ｍ（ＩＣ５０≒８．６±０．２ｎＭ）のエタノールアミン部分中の－ＯＨ基などの追加の水素結合供与体を付け加えると、５ｖ（エチルアミン型）と比較した場合に効力がわずかに減少し、イソチオシアネート誘導体１２ｌ（ＩＣ５０≒３．３±０．５ｎＭ）も非常に良好な効力を示した。ピリミジン（２－Ｐｙ）環１２ａ上のＣ２位の保護されていないフェノール性ＯＨ（ＩＣ５０≒６４６．５±１２４．２ｎＭ）は、スルホン誘導体１１（ＩＣ５０≒８４．９±１７ｎＭ）などの他の電子求引基と同様に効力を劇的に低下させた。一方、同じ位置の遊離アミン１２ｃは、効力を改善させた（ＩＣ５０≒２．０１±０．４ｎＭ）。ＯＭｅ基の置換としての化合物１２ｏ～１２ｐすなわち、ＯＣＦ３、ＯＢｎ及びＯＨ）は、十分に許容されず、効力が減少した。アリール置換基による一般的な傾向は、４－ＯＭｅ化合物が最も高い親和性を有し、４－ＯＣＦ３（１２ｏ、ＩＣ５０≒４３．１±６．９）、ＯＨ（１２ｑ、ＩＣ５０≒１９．０±２．９）を有する化合物は効力が中程度であり、ＯＢｎ（１２ｐ）置換を有する化合物は効力が最も低いことだった。
本明細書では本発明の特定の特徴が図示され、説明されてきたが、多くの修正、置換、変更、及び同等物がここで、当業者に思いつくであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に収まるように、全てのそのような修正及び変更を網羅することを意図することを理解されたい。
化学：一般的方法。全ての非水性反応は、乾燥窒素の不活性雰囲気下でオーブンで乾燥したガラス器具中で実施した。全ての試薬及び溶媒は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌｆａ－Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ａｒｋ Ｐｈａｒｍ（Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入し、更に精製することなく使用した。分析用薄層クロマトグラフィーは、シリカゲルＧＨＬＦ １０ｃｍ×２０ｃｍ Ａｎａｌｔｅｃｈ ＴＬＣ Ｕｎｉｐｌａｔｅｓ（Ａｎａｌｔｅｃｈ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）で実施し、ＵＶ光下で蛍光消光によって可視化した。Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＰ１フラッシュクロマトグラフィー精製システム（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）（Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰカートリッジ、シリカ、５０ｇ及び１００ｇ）を使用して化合物を精製した。１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、ＶａｒｉａｎＩｎｏｖａ－５００分光計（５００ＭＨｚ）（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）又はＢｒｕｋｅｒＡｓｃｅｎｄ４００（４００ＭＨｚ）（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）分光計で記録した。化学シフトはδスケールでｐｐｍで報告し、適切な溶媒残留ピークを基準とする（ＣＤＣｌ３、１Ｈでは７．２６ｐｐｍ、１３Ｃでは７７．２３ｐｐｍ、ＤＭＳＯ－ｄ６、１Ｈでは２．５０ｐｐｍ、１３Ｃでは３９．５１ｐｐｍ）。質量スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＥＳＱＵＩＲＥエレクトロスプレー／イオントラップ装置で、ポジティブモード及びネガティブモードで収集した。高分解能質量分析計（ＨＲＭＳ）データは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＩクラスＵＰＬＣシステムを備えたＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ ２－ＳｏＱＴＯＦ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）システムで取得した。ブタ脳チューブリン（カタログ番号Ｔ２３８Ｐ）は、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．から購入した。全ての試験化合物の純度は、１Ｈ ＮＭＲ及びＨＰＬＣによって≧９５％であると決定された。純度を決定するために使用したＨＰＬＣ法は以下の通りである。化合物純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ製のＺｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ１８カラム、粒径３．５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して分析した。移動相は、０．１％ギ酸を含む水（Ａ）及び０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（Ｂ）から成る。流速１ｍＬ／分を使用した。勾配溶出は、５０％Ｂで開始した。０～９分で１００％Ｂに到達し、９～１２分でこれを維持し、次いで１２～１５分で５０％Ｂに減少させ、停止した。化合物純度を、２５４ｎｍに設定したＤＡＤ検出器で監視した。
実施例１：エチル２－（（５－フルオロ－４－メトキシ－２－ニトロフェニル）アミノ）アセテート７ａ又はエチル２－（（４－メトキシ－２－ニトロフェニル）アミノ）アセテート７ｂの合成（図３）。
エチル２－（（５－フルオロ－４－メトキシ－２－ニトロフェニル）アミノ）アセテート７ａ又はエチル２－（（４－メトキシ－２－ニトロフェニル）アミノ）アセテート７ｂの合成。２５ｇの量の市販の５－フルオロ－４－メトキシ－２－ニトロアニリン（１４８．７ｍｍｏｌ）、化合物６ａ、又は２５ｇの４－メトキシ－２－ニトロアニリン、化合物６ｂを１０００ｍＬ三つ口フラスコに入れた。体積１００ｍＬのブロモ酢酸エチル（９０１．８ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下でフラスコにゆっくりと注いだ。１０２．７ｇのＫ２ＣＯ３（７４３．５ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加した。混合物を１２時間にわたり加熱還流した。混合物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）で希釈した。有機層を水で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固蒸発させて粗生成物を得た。次いで、粗生成物を２０％Ｅｔ２Ｏ／ヘキサン中でのカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物７ａ又は７ｂを赤色固体粉末として得た（２０ｇｍ、５３～５５％）。１Ｈ ＮＭＲ（７ａ）（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ８．３１（ｂｓ，１Ｈ），７．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１９Ｈｚ），６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１２Ｈｚ），４．３０（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ），４．１０（ｍ，２Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），１．３３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１９Ｈｚ）。１Ｈ ＮＭＲ（７ｂ）（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ８．３０（ｂｓ，１Ｈ），７．６８（ｍ，１Ｈ），７．１８（ｍ，１Ｈ），６．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２７Ｈｚ），４．３０（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ），４．１０（ｓ，２Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），１．３３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１９Ｈｚ）。
実施例２：６－フルオロ－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ－オン８ａ又は７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（８ｂ）の合成。
６－フルオロ－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ－オン８ａ又は７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン８ｂの合成：１９ｇの量の化合物７ａ（６９．７ｍｍｏｌ）又は７ｂ（７４．７ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ中３％ＣＨ２Ｃｌ２１５０ｍＬに溶解した。２ｇｍの量の１０％Ｐｄ－Ｃを溶液に注意深く添加した。次いで、反応をＨ２雰囲気下で５時間継続し、その時点で、ＴＬＣにより反応が完了したと結論付けた。反応物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）床を通して濾過し、濾液を蒸発乾固させて、純粋な化合物８ａ（８．８８ｇｍ、４５．３ｍｍｏｌ、６５％）又は８ｂ（１２．４７ｇｍ、７１．７ｍｍｏｌ、９６％）を淡褐色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（８ａ）（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ１０．１６（ｂｓ，１Ｈ），６．６０（ｍ，２Ｈ），５．８（ｓ，１Ｈ），３．６３（ｍ，５Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（８ｂ）（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ１０．１６（ｂｓ，１Ｈ），６．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．３８（ｍ，２Ｈ），３．６３（ｓ，６Ｈ）。次いで、化合物８ａ及び８ｂを、更に精製することなく最終カップリング工程に用いた。
実施例３：ジヒドロキノキサリノン－ピリミジン／ピリジン類縁体（５ｉ～５ｓ）の調製のための一般的手順（図３）。
以下の手順Ａ又は手順Ｂに従って、化合物５ｉ～５ｓを調製した。
手順Ａ。市販の２，４－ジクロロピリミジン／ピリジン類縁体、３ｂ～３ｌ、（１当量）の溶液を１０ｍＬの乾燥イソプロパノールに入れ、続けて固体頭部基８ａ又は８ｂ（１当量）を添加した。触媒量の濃ＨＣｌ（３～４滴）をこの溶液に添加し、溶液をアルゴン雰囲気下で１２時間撹拌した。反応物を水で希釈し、塩化メチレン（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液で中和し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させた。有機層を濃縮し、次いで、得られた粗物質をシリカカラム（ＣＨ２Ｃｌ２中２０％～３０％ＥｔＯＡｃ）を使用して精製して、純粋な生成物を固体として得た。
手順Ｂ。市販のピリミジン／ピリジン類縁体、３ｂ～３ｌ（１当量）を１０ｍＬの乾燥エタノールに入れ、続けて固体頭部基８ａ又は８ｂ（１当量）を添加した。炭酸ナトリウム（２当量）を溶液に加え、この溶液をアルゴン雰囲気下で１２時間還流させた。反応物を水で希釈し、塩化メチレンで抽出し（３Ｘ３０ｍＬ）、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させた。有機層を濃縮し、次いで、得られた粗生成物をシリカカラム（ＣＨ２Ｃｌ２中２０％～３０％ＥｔＯＡｃ）を使用して精製し、純粋な生成物を固体として得た。
４－（２－クロロピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）－６－フルオロ－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（５ｉ）（図３）の合成：化合物５ｉを、５ｉ～５ｓの調製用の一般的手順の手順Ａに従って調製した。２００ｍｇの量の３ｂ（１ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの無水イソプロパノール中の２１６ｍｇの化合物８ａ（１．１ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続けて触媒量のＨＣｌ（３～４滴）を添加した。次いで、粗生成物をフラッシュシリカ（３０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を淡黄色固体として得た（２５２ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ、７０％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．７２（ｓ，１Ｈ），８．８１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄｄ，Ｊ＝８．６，４．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），５．０３（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６７．１３，１６０．５２，１５５．６４，１４９．３６，１４９．０２，１４５．８０，１４５．６８，１４５．３０，１３５．７７，１３２．８６，１２９．４２，１２８．５９，１２０．９７，１１２．４４，１１２．２１，５６．５２，５１．８４。ＨＲＭＳ［Ｃ１６Ｈ１２ＣｌＦＮ５Ｏ２ ＋］計算値３６０．０６６４、実測値３６０．０６５０。ＨＰＬＣ純度９６．２０％（ｔＲ＝２．６０分）。
４－（２－クロロフロ［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ－オン（５ｊ）（図３）の合成：化合物５ｊを、５ｉ～５ｓの調製用の一般的手順の手順Ａに従って調製した。１８８ｍｇの量の３ｃ（１ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの無水イソプロパノール中の１９６ｍｇの化合物８ｂ（１．１ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続けて触媒量のＨＣｌ（３～４滴）を添加した。次いで、粗生成物をフラッシュシリカ（３０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を淡黄色固体として得た（２３５ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、７１％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．７５（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７２－６．４９（ｍ，２Ｈ），４．６７（ｓ，２Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６７．２８，１５７．９８，１５５．１１，１５３．１６，１５２．５０，１４６．５０，１３３．８５，１３３．２６，１２４．４６，１１９．６６，１０７．８１，１０７．５２，１０１．８９，５５．８４，３１．１７。ＨＲＭＳ［Ｃ１５Ｈ１２ＣｌＮ４Ｏ３ ＋］計算値３３１．０５９８，実測値３３１．０５８４。ＨＰＬＣ純度９６．２７％（ｔＲ＝２．５３分）。
４－（３，６－ジメチルイソキサゾロ［５，４－ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ－オン（５ｋ）（（図３；ＲはＨである）：化合物５ｋを、５ｉ～５ｓの調製用の一般的手順の手順Ｂに従って調製した。１８４ｍｇの量の３ｄ（１ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの無水ＥｔＯＨ中の１９６ｍｇの化合物８ｂ（１．１ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続けてＫ２ＣＯ３（２７６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を添加した。粗生成物をフラッシュシリカ（３０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を白色固体として得た（２２１ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ、６８％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．７９（ｓ，１Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８０－６．４４（ｍ，２Ｈ），４．５１（ｓ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），１．６５（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７７．０３，１６８．１９，１６７．８０，１５７．８６，１５６．９７，１５４．５２，１３３．６３，１２２．７７，１２１．１７，１０８．５５，１０２．８０，９７．９７，５５．９１，５０．３５，２６．１６，１２．６９。ＨＲＭＳ［Ｃ１６Ｈ１６Ｎ５Ｏ３ ＋］計算値３２６．１２５３，実測値３２６．１２９４。ＨＰＬＣ純度９９．６％（ｔＲ＝２．３７分）。
４－（２－クロロ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（５ｌ）の合成：化合物５ｌを、５ｉ～５ｓの調製用の一般的手順の手順Ａに従って調製した。１８８ｍｇの量の３ｅ（１ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの無水イソプロパノール中の１９６ｍｇの化合物８ｂ（１．１ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続けて触媒量のＨＣｌ（３～４滴）を添加した。次いで、粗生成物をフラッシュシリカ（３０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を白色固体として得た（２０５ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ、６２％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．７２（ｓ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ），４．４４（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），２．７８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．１８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９７－１．７３（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）１７７．９０，１６７．３４，１５７．６１，１５７．２８，１５６．９４，１３２．６４，１２２．８０，１１９．８７，１１８．４６，１０６．８０，１０１．６３，５５．３２，４９．２５，３３．３３，３０．３２，２１．９８。ＨＲＭＳ［Ｃ１６Ｈ１６ＣｌＮ４Ｏ２ ＋］計算値３３１．０９６２、実測値３３１．０９７４。ＨＰＬＣ純度９９．４％（ｔＲ＝２．５９分）。
７－メトキシ－４－（２－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（５ｍ）の合成：化合物５ｍを、５ｉ～５ｓの調製のための一般的手順の手順Ａに従って調製した。２２０ｍｇの量の３ｆ（１．３ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの無水イソプロパノール中の２５６ｍｇの化合物８ｂ（１．４ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続けて触媒量のＨＣｌ（３～４滴）を添加した。次いで、粗生成物をフラッシュシリカ（３０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を赤みがかった固体として得た（３２３ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、８０％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６６（ｓ，１Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｓ，２Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４７（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．９２－１．７４（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７５．１６，１６７．８１，１６５．０９，１５６．３３，１５６．２２，１３２．２３，１２１．８４，１２１．０７，１１６．３４，１０６．７９，１０１．６４，５５．２７，４９．０９，３３．５１，３０．４２，２５．３０，２１．８８。ＨＲＭＳ［Ｃ１７Ｈ１９Ｎ４Ｏ２ ＋］計算値３１１．１５０８、実測値３３１．１５２５。ＨＰＬＣ純度９９．９％（ｔＲ＝１．９４分）。
４－（６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（５ｎ）の合成：化合物５ｎを、５ｉ～５ｓの調製用の一般的手順の手順Ａに従って調製した。２００ｍｇの量の３ｇ（１．３ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの無水イソプロパノール中の２４９ｍｇ化合物８ｂ（１．４ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続けて触媒量のＨＣｌ（３～４滴）を添加した。次いで、粗生成物をフラッシュシリカ（３０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物をオフホワイトの固体（３００ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ、７８％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６８（ｓ，１Ｈ），８．５９（ｓ，１Ｈ），６．９５－６．７１（ｍ，１Ｈ），６．６６－６．３５（ｍ，２Ｈ），４．４４（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９４－１．６９（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７４．６９，１６７．６９，１５６．４８，１５６．３７，１５６．３５，１３２．３１，１２１．８８，１２０．９１，１１９．６９，１０６．７８，１０１．６７，５５．２８，４９．２１，３３．５９，３０．７３，２１．８０。ＨＲＭＳ［Ｃ１６Ｈ１７Ｎ４Ｏ２ ＋］計算値２９７．１３５２、実測値２９７．１３４６。ＨＰＬＣ純度９７．９％（ｔＲ＝１．６６分）。
４－（２－クロロ－５，６，７，８－テトラヒドロキナゾリン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（５ｏ）の合成：化合物５ｏを、５ｉ～５ｓの調製用の一般的手順の手順Ａに従って調製した。２０３ｍｇの量の３ｈ（１ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの無水イソプロパノール中の１９６ｍｇの化合物８ｂ（１．１ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続けて触媒量のＨＣｌ（３～４滴）を添加した。次いで、粗生成物をフラッシュシリカ（３０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を白色固体として得た（２２４ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、６５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．５９（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８８－６．２０（ｍ，２Ｈ），４．５７（ｓ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），２．８３（ｓ，１Ｈ），２．６８（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，２Ｈ），２．５７（ｓ，１Ｈ），１．７９（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，６．９Ｈｚ，４Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６９．３８，１６７．８１，１６０．５６，１５７．０３，１３２．５５，１２５．４０，１２０．９６，１１９．０７，１０７．７５，１０１．８４，５５．５２，４７．７６，３２．７０，２４．９８，２２．２７，２１．９２。ＨＲＭＳ［Ｃ１７Ｈ１８ＣｌＮ４Ｏ２ ＋］計算値３４５．１１１８、実測値３４５．１１３３。ＨＰＬＣ純度９５．４０％（ｔＲ＝３．３３分）。
４－（２－クロロ－５，７－ジヒドロフロ［３，４－ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（５ｐ）の合成：化合物５ｐを、５ｉ～５ｓの調製用の一般的手順の手順Ｂに従って調製した。２００ｍｇの量の３ｉ（１．０４ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの無水ＥｔＯＨ中の２０５ｍｇの化合物８ｂ（１．１５ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続けてＮａ２ＣＯ３（２４４ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、粗生成物をフラッシュシリカ（２５％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物をオフホワイトの固体（２０１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、５８％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．７５（ｓ，１Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），４．７９（ｓ，２Ｈ），４．５３（ｓ，２Ｈ），４．３４（ｓ，２Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ２０７．０３，１７３．０２，１６７．６５，１５８．３６，１５６．９３，１３４．１６，１２３．９１，１１９．１９，１１３．７３，１０７．３０，１０２．２２，７１．６８，５５．８８，４９．２３，３１．１７。ＨＲＭＳ［Ｃ１５Ｈ１４ＣｌＮ４Ｏ３ ＋］計算値３３３．０７５４、実測値３３３．０７５４。ＨＰＬＣ純度９９．０８％（ｔＲ＝２．３７分）。
４－（２－クロロ－５，６－ジメチルピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ－オン５ｑの合成：化合物５ｑを、５ｉ～５ｓの調製用の一般的手順の手順Ａに従って調製した。２００ｍｇの量の３ｊ（１．１ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの無水イソプロパノール中の２２１ｍｇの化合物８ｂ（１．２ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続けて触媒量の濃塩酸を添加した。ＨＣｌ（３～４滴）。次いで、粗生成物をフラッシュシリカ（３０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を白色固体として得た（２１７ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ、６２％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６０（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．５５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．５６（ｓ，２Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６９．０８，１６７．８２，１５９．９５，１５６．９５，１５６．８５，１３２．７８，１２５．５５，１２０．８５，１１７．９７，１０７．７８，１０１．７９，５５．７５，４７．７７，２３．５５，１４．３０。ＨＲＭＳ［Ｃ１５Ｈ１６ＣｌＮ４Ｏ２ ＋］計算値３１９．０９６２、実測値３１９．０９６２。ＨＰＬＣ純度９５．９％（ｔＲ＝３．００分）。
７－メトキシ－４－（２，５，６－トリメチルピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ－オン５ｒの合成：化合物５ｒを、５ｉ～５ｓの調製用の一般的手順の手順Ｂに従って調製した。２００ｍｇの量の３ｋ（１．３ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの無水ＥｔＯＨ中の２５０ｍｇの化合物８ｂ（１．４ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続けてＮａ２ＣＯ３を添加した。次いで、粗生成物をフラッシュシリカ（３０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を白色固体として得た（２８０ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ、７２％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６５（ｓ，１Ｈ），６．８９－６．２２（ｍ，３Ｈ），４．１８（ｓ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），１．７２（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６７．７２，１６６．２４，１６３．５３，１５８．９０，１５５．０４，１３０．４２，１２３．６５，１１７．６５，１１５．２６，１０７．０４，１０２．０７，５５．２０，５０．７９，２５．１６，２２．０８，１４．１５。ＨＲＭＳ［Ｃ１６Ｈ１９Ｎ４Ｏ２ ＋］計算値２９９．１５０８、実測値２９９．１５１７。ＨＰＬＣ純度９９．６％（ｔＲ＝１．７４分）。
７－メトキシ－４－（２－メチル－１，５－ナフチリジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン５ｓ（図３）の合成：化合物５ｓを、５ｉ～５ｓの調製用の一般的手順の手順Ａに従って調製した。２００ｍｇの量の３１（１．１ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬの無水イソプロパノール中の２１９ｍｇの化合物８ｂ（１．２ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続けて触媒量の濃ＨＣｌ（３～４滴）を添加した。次いで、粗生成物をフラッシュシリカ（３０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を黄色がかった赤色の固体（２４７ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ、７０％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６５（ｓ，１Ｈ），８．７５（ｄｄ，Ｊ＝４．０，１．６Ｈｚ，１Ｈ），８．２４（ｄｄ，Ｊ＝８．５，１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｄｄ，Ｊ＝８．５，４．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｓ，１Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６１（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），２．５２（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６７．６０，１６０．２８，１５６．３３，１５０．４７，１４７．８８，１４４．７５，１３７．２０，１３７．１２，１３２．４９，１２５．１２，１２５．０６，１２２．１３，１１４．５１，１０８．５５，１０２．３７，５５．７３，５４．１０，２５．３６。ＨＲＭＳ［Ｃ１８Ｈ１７Ｎ４Ｏ２ ＋］計算値３２１．１３５２、実測値３２１．１３５３。ＨＰＬＣ純度９８．６％（ｔＲ＝１．７０分）。
実施例４：５ｔ～５ｖの調製手順（図４）。
化合物２ａ又は２ｂ（１当量）をマイクロ波管中の３ｍＬのイソプロパノールに溶解し、これにエチルアミン（５当量）を添加した。マイクロ波条件下（１５０ワット、８０°Ｃで３０分間反応を行った。１０％ＨＣｌを用いて反応混合物をｐＨ７にした。沈殿物を濾過し、空気下で乾燥させて純粋な生成物を固体として得た。次いで、粗生成物を、５０％～６０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２を使用するフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製して、純粋な生成物を茶色がかった黄色固体として得た。
４－（２－（エチルアミノ）ピリド［３，２－ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（５ｔ）の合成：化合物５ｔを、３４５ｍｇの２ａ（１ｍｍｏｌ）及び３３１ｍＬのエチルアミン（５ｍｍｏｌ）から出発して、５ｔ～５ｕの調製用の一般的手順に従って調製した。粗生成物をフラッシュシリカ（５５％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を褐色がかった黄色の固体（２６３ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、７５％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．８３（ｓ，１Ｈ），８．３６（ｄｄ，Ｊ＝４．１，１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｄｄ，Ｊ＝８．６，４．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．４９（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．７Ｈｚ，１Ｈ），６．３９（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），４．９７（ｓ，２Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．５７－３．３６（ｍ，２Ｈ），１．２４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６８．５１，１５９．９８，１５８．６０，１５７．０３，１５０．１７，１４３．０７，１３３．６０，１３０．８４，１２７．６０，１２４．２４，１２３．３２，１０８．４８，１０１．６４，５５．５８，５１．６３，３６．４５，１５．０８。ＨＲＭＳ［Ｃ１８Ｈ１９Ｎ６Ｏ２ ＋］計算値３５１．１５６９、実測値３５１．１５６８。ＨＰＬＣ純度９６．７４％（ｔＲ＝２．４１分）。
４－（２－（エチルアミノ）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ－オン（５ｕ）の合成：化合物５ｕを、３４５ｍｇの２ｂ（１ｍｍｏｌ）及び３３１ｍＬのエチルアミン（５ｍｍｏｌ）から出発して、５ｔ～５ｕの調製用の一般的手順に従って調製した。粗生成物をフラッシュシリカ（５５％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を黄色がかった固体として得た（２８４ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ、８１％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．７９（ｓ，１Ｈ），８．６５（ｓ，１Ｈ），７．６６－７．２５（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．７８－６．５３（ｍ，２Ｈ），６．４３（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３８（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．４０（ｄｔ，Ｊ＝１３．７，７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．１８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６８．１８，１６２．４１，１６１．０１，１５６．７６，１５６．００，１３５．０４，１３２．００，１２４．１０，１２１．２３，１１６．３３，１０８．０９，１０２．５７，５５．７５，５１．３２，３５．８８，１５．０５，０．５６。ＨＲＭＳ［Ｃ１８Ｈ１９Ｎ６Ｏ２ ＋］計算値３５１．１５６９、実測値３５１．１５７２。ＨＰＬＣ純度９５．０１％（ｔＲ＝２．４１分）。
４－（２－（エチルアミノ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（５ｖ）の合成。化合物５ｖを、３４５ｍｇの５ｌ（１ｍｍｏｌ）及び３３１ｍＬのエチルアミン（５ｍｍｏｌ）から出発して、５ｔの調製用の一般的手順に従って調製した。粗生成物をフラッシュシリカ（５５％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、純粋な生成物を黄色がかった固体として得た（２８４ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ、８１％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６０（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），６．５７（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），４．３５（ｓ，１Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｓ，２Ｈ），３．３１－３．２０（ｍ，２Ｈ），２．５９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．１２－２．００（ｍ，２Ｈ），１．８３－１．６８（ｍ，２Ｈ），１．１１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）。ＨＲＭＳ［Ｃ１８Ｈ２２Ｎ５Ｏ２］＋、正確な質量３４０．１７７３、実測値３４０．１７６８。
実施例５：生物学
細胞培養及び試薬。ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５、ＲＰＭＩ－７９５１、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８及びヒト肺癌細胞株Ａ５４９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。Ｍ１４及びＭ１４多剤耐性娘株Ｍ１４／ＬＣＣ６ＭＤＲ１は、Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＲｏｂｅｒｔ Ｃｌａｒｋｅ博士から贈与された。黒色腫細胞及び乳癌細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ、ＧＡ）及び１％抗生物質／抗真菌剤溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で培養した。Ａ５４９細胞を、１０％ウシ胎児血清及び１％抗生物質／抗真菌剤混合物を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で培養した。パクリタキセル耐性Ａ３７５／ＴｘＲ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＴｘＲ及びＡ５４９／ＴｘＲ細胞を、パクリタキセルでの連続処理によって開発し、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で１００ｎＭパクリタキセルを含む培地で維持した。タキサンは、実際の実験の１週間前に培地から除去した。化合物１７ｙａ耐性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ細胞株を、化合物１７ｙａでの連続処理によって開発し、細胞培養インキュベーター中１００ｎＭの化合物１７ｙａを含む培地で維持した。化合物１７ｙａは、実際の実験の２週間前に培地から除去した。生物学的研究のために、ジヒドロキノキサリノンピリミジン類縁体を、ＤＭＳＯ（ＡＴＣＣ）中２０ｍＭのストック濃度で調製し、冷蔵庫内で－２０℃で保存した。実験の前に、ストックを適切な培養培地で希釈した。
細胞傷害性アッセイ（例えば、表１及び２）。
癌細胞の増殖速度に応じて、癌細胞を、９６ウェルプレートにウェルあたり３，５００～５，０００細胞の濃度で播種した。翌日、培養培地を、０．１ｎＭ～３μＭの範囲の濃度の試験化合物を含有する新鮮な培地と４回繰り返して交換した。７２時間のインキュベーション後、ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を暗所で各ウェルに添加し、細胞の種類に応じて３７℃で１～２時間インキュベートした。吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて４９０ｎｍで記録した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって計算した。
ミクロソーム安定性アッセイ（表３）。
ＮＡＤＰＨ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）（１ｍＭ）の存在下で、化合物５ｍ又は本発明の他の化合物及びベラパミル（１μｇ／ｍＬ）についてヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｎｅｏｎｔａ，ＮＹ）、ラット、及びマウスミクロソーム（Ｓｅｋｉｓｕｉ ＸｅｎｏＴｅｃｈ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＫＳ）との肝ミクロソームインキュベーション（１ｍｇミクロソームタンパク質／ｍＬ）を評価した。所定の時間（０，５，１０、３０、４５、及び６０分）に、アリコート（５０μＬ）を取り出し、内部標準を含有する２００μＬの氷冷メタノールの添加によって反応を停止させた。試料を短時間ボルテックスし、３，２００×ｇで５分間、４℃で遠心分離した。上清を回収し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。インビトロ半減期及び固有クリアランスを標準的な手順に従って評価した。Ｏｂａｃｈ，Ｒ．Ｓ．，「Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｅｚｌｏｐｉｔａｎｔ ａｌｋｅｎｅ（ＣＪ－１２，４５８），ａ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｏｆ ｅｚｌｏｐｉｔａｎｔ：ｅｎｚｙｍｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎ ａｌｋｅｎｅ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ」Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．，２００１，２９（７），１０５７－６７を参照する。
ラットにおけるインビボ薬物動態（表４）。
全ての動物試験は、ＮＩＨ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅに従って実施され、テネシー大学ヘルスサイエンスセンターのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる事前承認後にのみ開始された。カテーテルを挿入した雄及び雌のスプラーグドーリーラット（２２５～２５０ｇ；Ｈａｒｌａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を１２時間の光／カードサイクルで維持し、食物及び水を自由に利用させた。４匹のラットの群（雄２匹及び雌２匹）に、大腿静脈カテーテルを介した注射による２ｍｇ／ｋｇの化合物５ｍの単回静脈内（ＩＶ）投与、又は強制経口投与による５ｍｇ／ｋｇの化合物５ｍの単回経口投与のいずれかを行った。化合物をＰＥＧ３００（４０％）及び水（６０％）に製剤化した。薬物投与後、血液試料（２００μＬ）を、頸静脈カテーテルを介して、２４時間にわたって最大１０個の所定の時点で収集した。血漿を直ちに遠心分離（６，０００×ｇ、４℃で１０分間）によって分離し、分析まで－７０℃で保存した。尿中排泄については、静脈内投与後に尿を累積的に採取し、尿量を記録し、検体を分析まで－７０℃で保存した。
化合物濃度の定量
血漿及び尿中の化合物５ｍ濃度の定量のために、試料を４倍量のメタノールを用いたタンパク質沈殿によって処理し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。クロマトグラフィー分離は、Ｎｅｘｅｒａ ＸＲ液体クロマトグラフ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８、２．６μｍ、１００×４．６ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ ＣＡ）で行った。移動相は、ａ）２ｍＭギ酸アンモニウム及び０．１％ギ酸を含む９５％水及び５％アセトニトリル、並びにｂ）２ｍＭギ酸アンモニウム及び０．１％ギ酸を含む９５％アセトニトリル及び５％水から成った。化合物５ｍ及び内部標準［（２－（１Ｈ－インドリル－３－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）（３，４，５－トリメトキシフェニル）］メタノンを、０．５ｍＬ／分の勾配で溶出した。溶出液を、４５００ｋＶのキャピラリー電圧を用いて５００℃のイオン源温度で陽イオンモードで操作する、ターボスプレーイオン源を備えたＡＰＩ ４５００トリプル四重極質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に直接流した。イオン源ガス、カーテンガス、及び衝突ガスとして窒素を用いた。監視した特徴的な物質移動は、化合物５ｍについてはｍ／ｘ ３１１．１／２９６．０であり、内部標準についてはｍ／ｚ ３７８．４／２１０．１だった。濃度は、２．９３～３０００ｎｇ／ｍＬの範囲の５ｍの較正標準並びに２０、２００、及び２０００ｎｇ／ｍＬの濃度での品質管理を使用して、加重最小二乗回帰（１／ｘ２）によって計算した。得られた血漿濃度－時間プロファイルを、ソフトウェアパッケージＷｉｎＮｏｎＬｉｎ ８．０（Ｅｔｃ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を使用して標準的な非コンパートメント薬物動態解析によって分析した。
チューブリン重合アッセイ（図５Ａ）。
製造業者のプロトコルに従って、ウシ脳由来の１００μＬのチューブリンタンパク質（３ｍｇ／ｍＬ、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を、一般的なチューブリン緩衝液（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、及び１ｍＭ ＧＴＰ）中の１０μＭの試験化合物に添加することによって、チューブリン重合反応を開始した。反応速度を３７℃で１時間、３０秒毎に記録し、波長３４０ｎｍの吸光度設定を備えたマイクロプレートリーダーをこの目的のために使用した。実験は２連で実施した。
コロニー形成アッセイ（図７）。
コロニー形成アッセイの場合、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞を非常に低濃度（１０００細胞／ウェル）で６ウェルプレートに播種した。各単一細胞が各ウェルで４個の細胞に分割したとき、細胞を、様々な濃度（０．５ｎＭ、１ｎＭ及び２ｎＭ）の５ｍ若しくは５ｔ又は培地のみで処理し、７日間インキュベートした。処理中に１回、培地を新鮮な薬物と交換した。次いで、細胞を冷メタノールで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色した。コロニー面積密度を、Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔモジュールを使用して定量した。
創傷治癒アッセイ（図８）。
スクラッチアッセイは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３生細胞撮像装置を使用して、５ｍ又は５ｔ処理（１ｎＭ、２ｎＭ及び５ｎＭ）で実施した。簡潔には、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞（５００００細胞／ウェル）を９６ウェルＩｍａｇｅＬｏｃｋプレート（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）に播種し、一晩付着させた。次いで、ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（商標）（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を使用して、全てのウェルに均一なひっかき傷を作製し、細胞片を成長培地で３回洗い流した。成長培地又は５ｍ若しくは５ｔを含有する培地を各ウェルに添加し、最大２日間２時間毎にＩｎｃｕＣｙｔｅによってプレートを監視した。代表的な画像及び相対創傷密度計算を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｓｃｒａｔｃｈ Ｗｏｕｎｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｍｏｄｕｌｅを使用して処理した。
細胞周期及び細胞アポトーシス解析（図９）。
Ａ３７５／ＴｘＲ細胞を１０ｍｍ皿に播種して（２×１０６／ウェル）、１ｎＭ、２ｎＭ及び５ｎＭの濃度の５ｍ又は５ｔで２４時間処理した。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、氷冷７０％エタノール中で一晩固定した。次に、細胞を１００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａと共に１時間インキュベートし、続けてヨウ化プロピジウムで染色した。５分間のインキュベーション後、試料をテネシー大学ヘルスサイエンスセンター（ＵＴＨＳＣ）のＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｃｏｒｅのＢｉｏ－Ｒａｄ ＺＥ５装置によって分析した。データをＭｏｄＦｉｔ ＬＴ（商標）ソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｔｏｐｓｈａｍ，ＭＥ）によって処理した。細胞アポトーシス解析については、細胞周期解析と同じ処理の後、１０５個の細胞を回収し、洗浄し、アネキシン－Ｖ－ＦＩＴＣ結合緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に再懸濁し、キットの説明書に基づいてアネキシン－Ｖ－ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びヨウ化プロピジウムで染色した。次いで、試料を暗所で１０分間インキュベートし、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＺＥ５を使用して分析した。
免疫蛍光染色（図５Ｂ）。
Ａ３７５／ＴｘＲ細胞（１０００００細胞）を、各ウェルにカバーガラスを入れた６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。２ｎＭのコルヒチン、パクリタキセル、５ｍ又は５ｔを細胞に添加し、２４時間処理した。免疫蛍光染色を、α－チューブリン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を４℃で一晩インキュベートし、その後、二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を室温で１時間インキュベートすることによって、実施した。カバーガラスをＰＢＳで３回洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含有するＤＡＰＩを有するガラススライドに載せた。写真を取得し、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡（Ｉｔａｓｃａ，ＩＬ）で処理した。
インビボＡ３７５／ＴｘＲ黒色腫異種移植モデル（図１０及び１１）。
全ての動物試験は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）及びテネシー大学ヘルスサイエンスセンター（ＵＴＨＳＣ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って実施した。６～８週齢の同数の雄及び雌の病原体フリーＮｏｄ－Ｓｋｉｄ－Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウス（１群当たりｎ＝８マウス）を、動物施設において１２：１２時間の明暗サイクルで制御された環境条件下で維持した。Ａ３７５／ＴｘＲ黒色腫細胞を、ＦＢＳ及びフェノールレッドを含まない培地に懸濁し、接種前にマトリゲル溶液で希釈した。１００μＬ溶液中合計２×１０６個のＡ３７５／ＴｘＲ細胞を、インスリンシリンジを使用して各マウスの右側腹部に接種した。腫瘍細胞接種前に、マウスを２～４％イソフルラン吸入で麻酔した。腫瘍増殖を注意深く監視し、腫瘍体積を、ノギスを使用してａ×ｂ２×０．５として計算し、式中ａ及びｂは、それぞれ、大径及び小径を表す。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したとき、ビヒクル又は薬物処置を開始した。パクリタキセルをエタノールに溶解し、１：１：１８の割合のエタノール：クレモフォールＥＬ：ＰＢＳ溶液で希釈した。５ｍをＰＥＧ３００溶液に製剤化し、等張生理食塩水で更に希釈した（比率１：４）。パクリタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ）及び５ｍ（２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇ）の両方を、合計３週間の期間で週２回（２ｘ／Ｗｋ）、尾静脈注射によりマウスに静脈内（ＩＶ）投与した。別の異なる研究において、Ａ３７５／ＴｘＲ腫瘍異種移植モデルも又、上記のプロトコルに従うことによって、ＮＳＧマウス（５０％雄及び５０％雌）において確立した（１群あたりｎ＝７～８匹のマウス）。水浴超音波処理を使用して化合物５ｔをＰＥＧ３００溶液に溶解し、滅菌生理食塩水で更に希釈した（ＰＥＧ３００：生理食塩水＝３：７の比）。腫瘍担持マウス（平均９０～１００ｍｍ３の腫瘍体積）を、２４日間以内に合計７用量の静脈内注射によって、２個の異なる投与量の化合物５ｔで処置した。試験の終わりに、マウスをイソフルランの過剰投与によって安楽死させ、腫瘍試料をマウスから得て、腫瘍サイズ及び様々な組織学的因子も分析した。
組織学的及び抗ミトコンドリアＩＨＣ染色（図１２～１８）。
固定した肺、肝臓及び腫瘍組織をパラフィン包埋し、４μｍ厚の切片に切断した。標本の組織学的処理は、脱脂、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）による染色、再水和、並びにスライドガラスへの付着のための密封によって行った。転移を可視化するための抗ミトコンドリアＩＨＣ染色は、以前に公開されたプロトコールに従って実施した。「Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ａｎ ｏｒａｌｌｙ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｕｂｕｌｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １７ｙａ，Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｂｙｐａｓｓｅｓ Ｔａｘａｎｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，」Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２０２０，１９（２），１６１４６－１６１５４」を参照する。簡潔には、肺及び肝臓スライドを、１０％のウマ血清でブロッキングした後、１：１０００希釈の抗ヒトミトコンドリア抗体（ＡｂＣａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，Ｃａｔ＃ａｂ９２８２４）で一晩染色した。翌日、スライドを二次抗マウス抗体とインキュベートし、ＤＡＢ剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ５６３７）で可視化し、ギルのヘマトキシリン中で対比染色し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ商標封入剤で載せた。代表的な組織画像を、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡によって撮像した。代表的な全肺又は肝臓画像を、Ｐａｎｏｒａｍｉｃ ＦＬＡＳＨ ＩＩＩシステム（３Ｄ Ｈｉｓｔｅｃｈ）によってデジタルスキャンした。Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔモジュールを用いて、Ｈ＆Ｅ染色組織あたり３～４個の代表的な視野における転移面積の割合を測定することによって、各マウスの肺又は肝臓の転移負荷を定量した。
タキサン耐性及び／又は化合物１７ｙａ耐性のインビボ異種移植モデル（図１９Ａ～１９Ｃ、１９Ｅ及び１９Ｆ）。
図１９Ａ（Ａ３７５／ＴｘＲ）：全ての動物試験は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）及びＵＴＨＳＣ（Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って実施した。６～８週齢の同数の雄及び雌の病原体フリーＮＳＧマウス（１群あたりｎ＝８マウス）を、動物施設において１２：１２時間の明暗サイクルで制御された環境条件下で維持した。Ａ３７５／ＴｘＲ黒色腫細胞を、ＦＢＳ及びフェノールレッドを含まない培地に懸濁し、接種前にマトリゲル溶液で希釈した。１００μＬの溶液中の合計２×１０６個のＡ３７５／ＴｘＲ細胞を、インスリンシリンジを使用して各マウスの右側腹部に接種した。腫瘍細胞接種前に、マウスを２～４％イソフルラン吸入で麻酔した。腫瘍増殖を注意深く監視し、腫瘍体積を、ノギスを使用してａ×ｂ２×０．５として計算し、式中ａ及びｂは、それぞれ、大径及び小径を表す。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したとき、ビヒクル又は薬物処置を開始した。パクリタキセルをエタノールに溶解し、１：１：１８の割合のエタノール：クレモフォールＥＬ：ＰＢＳ溶液で希釈した。５ｍをＰＥＧ３００溶液に製剤化し、等張生理食塩水で更に希釈した（１：４比）。パクリタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ）及び５ｍ（２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇ）の両方を、合計３週間の期間で週２回（２回／週）、尾静脈注射によりマウスに静脈内投与し、各マウスの腫瘍体積を、研究エンドポイントに達するまでの治療中に測定した。
図１９Ｂ：ＤＵ－１４５／ＶｘＲ（化合物１７ｙａ耐性；化合物１７ｙａは、（２－（１Ｈ－インドール－３－イル）イミダゾール－４－イル）（３，４，５－トリメトキシフェニル）メタノンである）異種移植モデルでは、５～６週齢の雄のＮＳＧマウス２１匹を使用した。次いで、５０％のＦＢＳ及びフェノールレッドを含まない培地並びに５０％のＭａｔｒｉｇｅｌからなる１００μＬの溶液に懸濁した２．５×１０６個のＤＵ－１４５／ＶｘＲ細胞を、各ＮＳＧマウスの右側腹部に接種した。約１６日後、マウスを３個の群に無作為化し［未処置対照；２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａ（ＰＯ、３回／週）；１ｍｇ／ｋｇ５ｍ（ＩＶ、２回／週）］、処置を開始した。処置の間、腫瘍体積を週に３回測定することによって腫瘍増殖を監視した。薬物処置の２２日後に研究を終了した。
図１９Ｃ：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ（化合物１７ｙａ耐性）異種移植モデルでは、１０μＬのＨＢＳＳ溶液中に懸濁した２．５×１０５個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲ細胞を、乳房脂肪体の左右部位に同所的に注射した。腫瘍増殖は、ノギスを用いて外部から監視した。各マウスの平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したとき、マウスを、ビヒクル（エタノール：クレモフォールＥＬ：ＰＢＳ溶液＝１：１：１８、ＩＰ、３回／週）、１０ｍｇ／ｋｇパクリタキセル（エタノール：クレモフォールＥＬ：ＰＢＳ溶液＝１：１：１８、ＩＰ、３回／週）、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａ（ＰＥＧ３００：水＝３：７、ＰＯ、３回／週）及び２ｍｇ／ｋｇ５ｍ（ＰＥＧ３００：生理食塩水＝１：４、ＩＶ、１回／週）を含む４個の群に無作為化した。マウスに２０日間投与した後、試験を終了した。図１９Ｅ及び図１９Ｆ：卵巣癌異種移植モデルは、５×１０５個のＡ２７８０／ＴｘＲ細胞を左卵巣の嚢に腹腔内注射することによって構築し、右の未変化の卵巣を対照とした。麻酔及び鎮痛剤を使用して動物の苦痛を最小限にした。１週間後、２０匹全ての雌マウスを、体重に基づいて４個の群に無作為化した。４群には、未処置対照、５ｍｇ／ｋｇパクリタキセル（ＩＶ、２回／週）、２０ｍｇ／ｋｇ化合物１７ｙａ（ＰＯ、２回／週）及び１ｍｇ／ｋｇ５ｍ（ＩＶ、２回／週）が含まれる。腫瘍進行を、Ｄ－ルシフェリンをマウスに腹腔内注射することによる生物発光イメージングを使用して監視した。マウスに３週間投与した後、全てのマウスを安楽死させ、卵巣を収集し、秤量し、画像化した。
インビボ去勢抵抗性異種移植モデル（２２ＲＶ）
図１９Ｄ：同様に、２２ＲＶ１前立腺癌異種移植片モデルでは、２．５×１０６個の２２ＲＶ１細胞を各マウスの右側腹部に皮下接種した。細胞を、ＦＢＳ及びフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地並びにＭａｔｒｉｇｅｌの混合物（１：１比）中で調製した。平均腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達したとき、これには１１日間使用し、１４匹全ての雄マウスを２個の群、すなわち未処置対照群及び１ｍｇ／ｋｇ５ｍ群に無作為に分けた。１ｍｇ／ｋｇ５ｍを週に２回の投与頻度でＩＶ注射により投与した。試験エンドポイントに達するまで週に２回腫瘍体積を測定した。
統計解析。
全ての定量的データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して解析した。一元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネットの多重比較検定を、全てのインビトロ実験並びに肺及び肝転移の定量化に適用した。有意水準を、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として定義する。
実施例６：Ｘ線結晶構造解析（図６）。
特殊試薬。ブタ脳チューブリン（カタログ番号Ｔ－２３８Ｐ）をＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎから入手した。ビス－トリスプロパン、チロシン、ＤＴＴ、ＭＥＳ及びＡＭＰＰＣＰは、Ｓｉｇｍａから購入した。グリセロール及び抗プロテアーゼカクテルはＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。β－メルカプトエタノールはＸｉＹａ Ｒｅａｇｅｎｔから入手した。
タンパク質発現及び精製。ＲＢ３のスタスミン様ドメイン（ＲＢ３－ＳＬＤ）遺伝子を、Ｄｒ．Ｂｅｎｏｉｔ Ｇｉｇａｎｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｐａｒｉｓ－Ｓａｃｌａｙ、フランス）のグループによってクローニングした。精製では、公開されたプロトコル、Ｃｈａｒｂａｕｔ，ら、「Ｆａｍｉｌｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｔｕｂｕｌｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６ （１９），１６１４６－１６１５４；Ｄｏｒｌｅａｎｓ，ｅｔ ａｌ．，「Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｗｉｔｃｈ ｏｆ ｔｕｂｕｌｉｎ，」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００９，１０６（３３），１３７７５－１３７７９にしたがった。簡潔には、遺伝子を大腸菌に形質転換し、過剰発現させ、細菌細胞を遠心分離によって収集し、溶解緩衝液で再懸濁した。上清を遠心分離により回収し、ＲＢ３－ＳＬＤを陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。標的タンパク質のピーク画分を最終的に１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、－８０Ｃで保存した。ＴＴＬのプラスミドは、Ｄｒ Ｍｉｃｈｅｌ Ｏ．Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ （Ｐａｕｌ Ｓｃｈｅｒｒｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ，ＰＳＩ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からの親切な贈り物であり、それを前述のように発現及び精製した。Ｐｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ，」Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０３，３３９（６１１９），５８７－５９０。簡潔には、形質転換した大腸菌を、ＩＰＴＧを含むＬＢ培地中、２５℃で一晩誘導した。次いで、細胞を収集し、溶解緩衝液中で超音波処理によって溶解した。続いて、溶解物を遠心分離によって清澄化し、ＴＬＬをＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーによって精製して精製した。精製したタンパク質を最終的に２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、使用するまで－８０℃で保存した。ＲＢ３及びＴＴＬの純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって調べた。ブタ脳チューブリン（カタログ番号Ｔ－２３８Ｐ、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．）に、凍結液としてＧ－ＰＥＭ（一般的なチューブリン緩衝液：８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ ６．９、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ及び１ｍＭ ＧＴＰ）を１０ｍｇ／ｍＬで供給し、－８０℃で保存した。
結晶化及び結晶浸漬。結晶をシッティングドロップ蒸気拡散法によって成長させた。Ｔ２Ｒ－ＴＴＬの結晶の詳細な工程は、前に記載した。Ｐｒｏｔａ，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｔａｃｃａｌｏｎｏｌｉｄｅ ＡＪ，」Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１７，８，１５７８７を参照する。簡潔には、チューブリン（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＴＴＬ（２０ｍｇ／ｍＬ）及びＲＢ３（１０ｍｇ／ｍＬ）をモル比２：１．３：１．２（チューブリン：ＲＢ３：ＴＴＬ）で含有するタンパク質混合物を、１ｍＭ ＡＭＰＰＣＰ、５ｍＭチロシン及び１０ｍＭ ＤＴＴを補充した氷上でインキュベートした。次いで、これを４℃で２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、１．０μＬのタンパク質を使用して、１．０μＬの結晶化緩衝液（４～８％ＰＥＧ４Ｋ、５％グリセロール、０．１Ｍ ＭＥＳ、３０ｍＭ ＣａＣｌ２、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２ｐＨ ６．７）と混合して結晶を成長させた。最初の結晶が２日後に観察され、次いで、この結晶は３～５日以内に約２００～３００μｍの長さの最終サイズに達することができた。この後、５ｊ、５ｋ、５ｌ、５ｍ、及び５ｔの化合物を１０ｍＭ濃度でＤＭＳＯに溶解し、次いで結晶に２０℃で１２時間浸漬した。浸漬した結晶を急速に凍結保護剤（３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ ６．７で２０％グリセロールを含有する）に移し、シンクロトロンＸ線データ収集のために１００Ｋで瞬間凍結した。
Ｘ線データ収集及び構造決定。Ｔ２Ｒ－ＴＴＬ－化合物複合体の結晶をナイロンループにマウントし、１００Ｋの冷窒素流中で瞬間冷却した。回折データは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＳＳＲＦ）（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）のビームラインＢＬ１９Ｕ１で収集した。データセットは最初にＨＫＬ２０００プログラムパッケージによって処理した。分子置換によって構造を決定するための出発モデルとして、以前に公開されたＴ２Ｒ－ＴＴＬ構造（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｉ５５）を使用した。Ｃｏｏｔ及びＰＨＥＮＩＸを使用して構造を構築し、最適化し、精密化した。Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｏｏｔ：ｍｏｄｅｌ－ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｐｈｉｃｓ，」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．，２００４，６０（１２ Ｐａｒｔ １），２１２６－２１３２；Ｔｅｒｖｉｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，「ＰＨＥＮＩＸ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｎｅｗ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．，２００２，５８（１１），１９４８－１９５４を参照する。精密化された構造は、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを使用して検証した。データパラメータ及び精密化の統計値を表５に要約する。
Figure 2024515727000032
実施例７：膵臓癌の処理。
細胞培養：
ヒト膵臓癌細胞株Ｍｉａ ＰａＣａ－２及びＰＡＮＣ－１細胞株をＡＴＣＣから入手し、１０％ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及び１％抗生物質／抗真菌剤溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で日常的に培養した。Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞株を培養する場合、追加の２．５％ウマ血清を補充した。Ｍｉａ ＰａＣａ－２－Ｌｕｃ細胞株を、Ｊｕｎｍｉｎｇ Ｙｕｅ博士の研究室から贈与されたレンチウイルスを使用して研究室で遺伝子導入し、１０％ＦＢＳ、２．５％ウマ血清及び０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＤＭＥＭで培養した。培地を週に２回リフレッシュし、細胞を８０～９０％コンフルエントに維持した。２０ｍｍｏｌ／Ｌの化合物ストックをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ＡＴＣＣ）に溶解し、使用前に新たに細胞培養培地で指定濃度に更に希釈した。
細胞傷害性試験（図２０）：
Ｍｉａ ＰａＣａ－２及びＰＡＮＣ－１細胞を、それぞれ４０００及び５０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、細胞を１ｎｍｏｌ／Ｌ～１．２５μｍｏｌ／Ｌの範囲で濃度を増加させた試験化合物で、４連で７２時間処理した。ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした後、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）で４９０ｎＭの吸光度で測定した。ＩＣ５０値を、対数スケールでビヒクル対照に対する正規化値に基づいて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を使用する非線形回帰分析によって計算した。
コロニー形成アッセイ（図２１Ａ）：
細胞を、１０００細胞／ウェルで６ウェルプレートに３連で播種し、ビヒクル対照又は１～５ｎｍｏｌ／Ｌの試験化合物で１１～１４日間処理した。コロニーを１００％メタノールで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色した。コロニー面積をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアで定量した。
スクラッチ遊走アッセイ（図２１Ｂ）：
Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞（２５，０００細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。８０～９０％のコンフルエンスで、ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒで引っ掻いた。細胞片を洗い流した後、培地を交換し、試験化合物を添加した。細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅでライブモニタリングし、写真を２時間毎に取得した。対照と比較して、異なる処理条件下での細胞の創傷幅を、開始点からエンドポイントまでの幅に従って定量した。
細胞周期解析（図２２Ａ）：
細胞を１００ｍｍディッシュに、血清を含まないＤＭＥＭ中１～２×１０６細胞／ディッシュの濃度で播種した。２４時間の血清飢餓後、培地を、試験化合物を含有する完全培養培地と交換した。細胞周期解析のために、細胞をトリプシン処理し、７０％エタノールで－２０℃で一晩固定した。固定した細胞を、１００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ及び５０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムと共に室温で３０分間インキュベートした。染色した細胞を、テネシー大学ヘルスサイエンスセンター（ＵＴＨＳＣ）のＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｃｏｒｅでＢｉｏ－Ｒａｄ ＺＥ５及びＭｏｄＦｉｔ ＬＴ ５．０．９ソフトウェアを使用して分析し、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ期の割合を決定した。
ウェスタンブロット解析（図２２Ｂ）：
細胞（１×１０６細胞／ウェル）を６ウェルプレートに一晩播種し、濃度が増加した５ｍ及びＰＴＸで２４時間処理した。全細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中に３０分間収集し、１３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。総タンパク質濃度をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量した。２０μｇのタンパク質試料をロードし、ＴＧＸ ４～１５％グラジエントゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって分離し、活性化ＰＶＤＦ膜に転写した。膜を５％脱脂乳で１時間ブロッキングした後、一次抗体（ＰＡＲＰ＃９５４２（１：５００））、β－アクチン＃４９７０（１：１０００）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を４℃で一晩インキュベートし、二次抗体を用いて室温で１時間ブロットした。タンパク質をＢｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｅｒによって検出し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって分析した。
インビボ皮下Ｍｉａ ＰａＣａ－２－Ｌｕｃ及びＰＡＮＣ－１－Ｌｕｃ異種移植片モデル（図２３及び２４）
全ての動物手順は、ＵＴＨＳＣの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って実施した。２種類の膵臓癌細胞株、Ｍｉａ ＰａＣａ－２－Ｌｕｃ及びＰＡＮＣ－１－Ｌｕｃを、この研究で使用した。５０μＬのＭｉａ ＰａＣａ－２－Ｌｕｃ（ＨＢＳＳ中５×１０６細胞）又はＰＡＮＣ－１－Ｌｕｃ（ＨＢＳＳ中３×１０６細胞）細胞懸濁液を、使用直前に同体積のＭａｔｒｉｇｅｌ（１：１混合物）と混合した。細胞混合物を各ＮＳＧマウス（雄、６～８週齢）の右側腹部に皮下注射した。５ｍをＰＥＧ３００：生理食塩水（１：４ ｖ／ｖ）に溶解した。対照群は処置を受けなかった。平均腫瘍サイズが７０～１００ｍｍ３に達したときに処置を開始した。Ｍｉａ ＰａＣａ－２－Ｌｕｃ腫瘍担持マウスでは、５ｍを静脈内（ｉ．ｖ．）注射により２ｍｇ／ｋｇの用量で、１用量／週で６週間投与した。ＰＡＮＣ－１－Ｌｕｃ腫瘍担持マウスでは又、５ｍをｉ．ｖ．注射により１ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇの用量で、１用量／週で７週間投与した。腫瘍体積及び体重を週に２回測定した。腫瘍体積は、式：体積（ｍｍ３）＝０．５×（長さ×幅２）によって計算した。全ての動物を研究の最後に安楽死させた。腫瘍を切除し、エクスビボ重量及びサイズを記録し、画像化した。
結果：
化合物５ｍは、図２０に示すように、パクリタキセル（ＰＴＸ）と比較して、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞株Ｍｉａ ＰａＣａ－２及びＰＡＮＣ－１において同等の細胞傷害性効力を示す。計算されたＩＣ５０値から、Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞においては化合物５ｍ（１．４ｎＭ）がＰＴＸ（２．５ｎＭ）よりもわずかに強力である一方、ＰＡＮＣ－１細胞においてはＰＴＸ（１．１ｎＭ）が化合物５ｍ（２．７ｎＭ）よりもわずかに強力であることが示唆された。化合物５ｍは、図２１Ａ及び２１Ｂに示すように、インビボでコロニー形成及び細胞遊走を阻害した。図２１Ａは、Ｍｉａ ＰａＣａ－２及びＰａｎｃ－１細胞株におけるコロニー形成及び細胞遊走に対する化合物５ｍの効果を示し、化合物５ｍを、１ｎＭ、２．５ｎＭ、及び５ｎＭでパクリタキセル（ＰＴＸ）と比較した。示される代表的なコロニー形成画像から、化合物５ｍが、ＰＤＡＣ細胞株、Ｍｉａ ＰａＣａ－２及びＰＡＮＣ－１の両方においてパクリタキセル（ＰＴＸ）よりも強力なコロニー形成阻害を実証したことが分かる。棒グラフは、Ｍｉａ ＰａＣａ－２については、コロニー形成が最低用量（１ｎＭ）の化合物５ｍによって完全に阻害されたが、ＰＴＸでは完全な阻害は５ｎＭでしか見られなかったことを示している。一方、ＰＡＮＣ－１細胞については、コロニー形成の阻害効力は、５ｍ及びＰＴＸで同等であり、５ｎＭ用量のみがコロニー形成のほぼ完全な阻害を示した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図２１Ｂは、Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞における細胞遊走に対する化合物５ｍの効果をグラフで示し、化合物５ｍ（２ｎＭ）をＰＴＸ（４ｎＭ）と比較した。代表的な画像は、ＩｎｃｕＣｙｔｅによって撮像された創傷治癒を示す。細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅでライブモニタリングし、写真を２時間毎に取得した。対照と比較して、創傷閉鎖は、棒グラフに要約されるように、各時点での創傷幅（ミクロン（μｍ））として示される。５ｍ（２ｎＭ）及びＰＴＸ（４ｎＭ）は両方とも、対照と比較して、Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞培養において４８時間にわたって細胞遊走を阻害した。棒グラフが示すように、５ｍ（２ｎＭ）は、各時点でＰＴＸ（４ｎＭ）と比較して、創傷治癒をより効果的に阻害した。＊＊＊ｐ＜０．００１、及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
化合物５ｍは、図２２Ａ及び２２Ｂに示すように、ＰＤＡＣ細胞株Ｍｉａ ＰａＣａ－２及びＰＡＮＣ－１において、Ｇ２／Ｍ期での細胞周期停止及び細胞アポトーシスを用量依存的に誘導した。図２２Ａは、化合物５ｍがＰＡＮＣ－１及びＭｉａ ＰａＣａ－２細胞株においてＧ２／Ｍ期（Ｇ１又はＳ期と比較して）の細胞の割合を用量依存的に増加させる能力を示し、これらのＰＤＡＣ細胞株における有糸分裂停止を示唆する。図２２Ｂは、化合物５ｍ及びＰＴＸがＭｉａ ＰａＣａ－２細胞においてウェスタンブロットによって測定されるアポトーシスを誘導したことを示し、切断型ＰＡＲＰ対ＰＡＲＰ比の増加が示された。β－アクチンを、ロードした総タンパク質を補正するための内部標準として使用した。棒グラフ（図２２Ｂ）に示すように、Ｍｉａ ＰａＣａ－２細胞株における化合物５ｍによるアポトーシスの誘導は用量依存的であり、ＰＴＸと比較して強力だった。例えば、この比は、２０ｎＭのＰＴＸと比較すると、１０ｎＭの５ｍで同等だった。
化合物５ｍは、図２３Ａ～２３Ｅに示すように、Ｍｉａ ＰａＣａ－２－Ｌｕｃ皮下異種移植モデルにおけるＰＤＡＣ腫瘍増殖を阻害し、毒性の徴候は最小限だった。化合物５ｍは、図２３Ａ～２３Ｅに示すように、Ｍｉａ ＰａＣａ－２－Ｌｕｃ皮下異種移植モデルにおけるＰＤＡＣ腫瘍増殖を阻害し、毒性の徴候は最小限だった。分かるように、化合物５ｍ（２ｍｇ／ｋｇ）は、対照（未処置）に対して腫瘍増殖を約７０～８０％有意に減少させた。図２３Ｂは、対照と比較した、４２日間にわたる体重に対する化合物５ｍの効果を示す。体重は体重変化％で表した。分かるように、対照と比較して体重がわずかに減少した値に向かう傾向があったので、化合物５ｍでは限られた全体的毒性が観察された。図２３Ｃは、対照と比較した、４２日間にわたって測定したエクスビボ腫瘍体積に対する、化合物５ｍ（２ｍｇ／ｋｇ）の効果をグラフで示す。図２３Ｄは、対照と比較した、４２日間にわたるエクスビボ腫瘍重量に対する化合物５ｍ（２ｍｇ／ｋｇ）の効果をグラフで示す。図２３Ｅの撮像された画像は、化合物５ｍでの処置後に切除された腫瘍サイズが対照処置腫瘍と比較して小さかったことを示す。図２３Ａ及び２３Ｅと一致して、腫瘍体積（図２３Ｃ）及び腫瘍重量（図２３Ｄ）は、４２日間にわたる対照よりも化合物５ｍ（２ｍｇ／ｋｇ）の処置によって有意に減少し、このことは切除された腫瘍の写真においても理解することができる。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。対照群に関連する有意差は、両側独立ウェルチｔ検定又は二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、続けてシダック又はダネット多重比較によって測定されるＰ値＜０．０５（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１）によって示される。ＩＣ５０を非線形回帰によって計算した。全てのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を用いて分析した。
図２４Ａ～２４Ｅは、化合物５ｍが、ＰＡＮＣ－１－Ｌｕｃ皮下異種移植モデルにおいて毒性の徴候無しにＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害したことを示す。化合物５ｍ（１ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇ；１用量／週で７週間）を、各ＮＳＧマウス（雄、６～８週齢）の右側腹部にｉ．ｖ．注射によって投与した。腫瘍体積及び体重を週に２回測定した。図２４Ａは、腫瘍体積に対して対照（未処置）と比較した化合物５ｍの効果を示す。化合物５ｍは、対照と比較して、異種移植腫瘍増殖の用量依存的及び有意な阻害を示した。図２４Ｂは、対照と比較した、体重（体重変化％）に対する化合物５ｍの効果を示す。２用量の化合物５ｍでの処置の４９日後、対照と比較して処置した動物の体重に差は見られず、化合物５ｍが有意な全体的毒性を示さないことが示された。図２４Ｃ及び２４Ｄは、それぞれエクスビボ腫瘍体積（ｍｍ３）及びエクスビボ腫瘍重量（ｇ）に対する、対照と比較した化合物５ｍの効果をグラフで示す。腫瘍体積についての結果と一致して、化合物５ｍは、エクスビボ腫瘍体積及びエクスビボ腫瘍重量によって測定した異種移植片腫瘍増殖を、対照と比較して用量依存的に阻害した。図２４Ｅは、対照と比較した、化合物５ｍ処置後の切除された腫瘍サイズの比較を写真で示す。腫瘍体積は、式：体積（ｍｍ３）＝０．５×（長さ×幅２）によって計算した。全ての動物を研究の最後に安楽死させた。腫瘍を切除し、エクスビボ重量及びサイズで記録し、画像化した。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。対照群に関連する有意差は、両側独立ウェルチｔ検定、又は一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネット多重比較、又は二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とそれに続くシダック又はダネット多重比較で測定したＰ値＜０．０５（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．００１）によって示される。ＩＣ５０を非線形回帰によって計算した。全てのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
実施例８：ジヒドロキノキサリノン－ピリミジン／ピリジン類縁体（１２ａ～１２ｍ及び５ｖ）の調製並びに１２ｏ～１２ｑの調製用の一般的手順。
一般的方法
全ての非水性反応は、乾燥窒素の不活性雰囲気下でオーブンで乾燥したガラス器具中で実施した。全ての試薬及び溶媒は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌｆａ－Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ａｒｋ Ｐｈａｒｍ（Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入し、更に精製することなく使用した。分析用薄層クロマトグラフィーは、シリカゲルＧＨＬＦ １０ｃｍ×２０ｃｍ Ａｎａｌｔｅｃｈ ＴＬＣ Ｕｎｉｐｌａｔｅｓ（Ａｎａｌｔｅｃｈ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）で実施し、ＵＶ光下で蛍光消光によって可視化した。シリカゲル（６０～１２０又は１００～２００メッシュ）を使用して化合物を精製した。１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ－５００分光計（４００ＭＨｚ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）又はＢｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ ４００（４００ＭＨｚ）（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）分光計で記録した。化学シフトはδスケールでｐｐｍで報告し、適切な溶媒残留ピーク（ＣＤＣｌ３、１Ｈでは７．２７ｐｐｍ及び１３Ｃでは７７．２３ｐｐｍ並びにＤＭＳＯ－ｄ６、１Ｈでは２．５０ｐｐｍ及び１３Ｃでは３９．５１ｐｐｍ）を参照し、全てのカップリング定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）で与えられる。質量スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ａｍａｚｏｎ ＳＬエレクトロスプレー／イオントラップ装置で、ポジティブモード及びネガティブモードで収集した。高分解能質量分析計（ＨＲＭＳ）データは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＩクラスＵＰＬＣシステムを備えたＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ ２－ＳｏＱＴＯＦ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）システムで取得した。ブタ脳チューブリン（カタログ番号Ｔ－２３８Ｐ）は、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．から購入した。全ての試験化合物の純度は、１Ｈ ＮＭＲ及びＨＰＬＣによって≧９５％であると決定された。純度を決定するために使用したＨＰＬＣ法は以下の通りである。化合物純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ製のＺｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ１８カラム、粒径３．５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して分析した。移動相は、０．１％ギ酸を含む水（Ａ）及び０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（Ｂ）から成る。流速１ｍＬ／分を使用した。勾配溶出は、５０％Ｂで開始した。０～９分で１００％Ｂに到達し、９～１２分でこれを維持し、次いで１２～１５分で５０％Ｂに減少させ、停止した。化合物純度を、２５４ｎｍに設定したＤＡＤ検出器で監視した。図２５は、以下の化合物の合成スキームを示す。
Ｎ－（４－メトキシ－２－ニトロフェニル）－２－（メチルチオ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－アミン７の合成。触媒量のＨＣｌ（濃塩酸、１０滴）を含む無水ＩＰＡ（５０ｍＬ）中の化合物５（１０ｇ、０．０５ｍｏｌ）及び４－メトキシ－２－ニトロアニリン６（９．２ｇ、０．０５５ｍｏｌ）の混合物を、５０℃で８時間撹拌し、反応が完了するまでＴＬＣによって監視した。反応塊を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（ｐＨ＝７）で希釈し、濾過し、水で洗浄し、乾燥させて、７を橙色固体として得た１５．０ｇ、収率９０．３％、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．９１（ｓ，１Ｈ），８．９９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｓ，１Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．５７（ｓ，３Ｈ），２．２２（ｄｄ，Ｊ＝１６．０，９．１Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５５．６５，１５４．３０，１３６．９４，１２８．５９，１２４．０６，１２３．６８，１２１．９７，１１５．４３，１０９．６２，１０８．２３，５５．９５，３３．８１，２６．４５，２１．７０，１４．４５；実測値ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］３３３．２。
２－クロロ－Ｎ－（５－メトキシ－２－（（２－（メチルチオ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）フェニル）アセトアミド（９）の合成。１．５ｍＬのＡｃＯＨの存在下、１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の７（１５．０ｇ、０．０４５ｍｏｌ）及び亜鉛粉末（６．０ｇ、０．０９ｍｏｌ）の混合物を０℃で０．５時間撹拌した。出発物質を収集した後、これをセライト（登録商標）床を通して濾過し、濾液を濃縮してアニリン誘導体８を得た。これを直ちにアセトン（１００ｍＬ）に溶解し、粉末状のＫ２ＣＯ３（２０．５ｇ、０．１５ｍｏｌ）を添加し、混合物を０℃に冷却した。クロロアセチルクロリド（５ｍＬ、過剰）を混合物にゆっくり滴下し、これを０℃で更に２時間撹拌した。次いで、混合物を水で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ブライン溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、９を明るいピンク色の固体として得た（１２ｇ、収率６３．８％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ９．６４（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ），７．３４－７．３１（ｍ，２Ｈ），６．８０－６．７７（ｍ，１Ｈ），４．３０（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６４（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ），２．０１－１．９７（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６５．２３，１５８．２０，１５７．３０，１３２．７１，１２７．６７，１２２．８３，１１３．２１，１１２．０２，１０８．９１，５５．６３，４３．０３，３３．３２，２６．８５，２１．７０，１４．０５；実測値ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］３７９．８１。
７－メトキシ－４－（２－（メチルチオ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン１０の合成。６０％水素化ナトリウム（１．２５８ｇ、０．０３９ｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の９の化合物（１０．０ｇ、０．０２６ｍｏｌ）に０℃で少量ずつ添加し、ゆっくりと室温にし、これを、ＴＬＣ監視によって完了と判断するまで撹拌した。混合物を氷水に注ぎ、固体生成物１０を濾過によって除去し、水で洗浄し、乾燥させて、６．０ｇを収率６６．６％で灰色固体として得た、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．６２（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），６．７８（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２５（ｓ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），２．９４（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），２．７３（ｓ，２Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｄｄ，Ｊ＝１７．０，９．６Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６８．４０，１５６．７３，１３１．１７，１２２．９６，１１５．７４，１０８．１６，１０２．３６，５５．７８，４９．６４，３０．９９，２２．６０，１４．２１；ＨＲＭＳ［Ｃ１７Ｈ１８Ｎ４Ｏ２Ｓ＋］計算値３４３．１２２９、実測値３４３．１２３３；ＨＰＬＣ純度９９．７％、Ｍｐ＝１７０～１７１℃。
７－メトキシ－４－（２－（メチルスルホニル）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）オン（１１）の合成。水／ＭｅＯＨ（１：１体積）中の１０（５ｇ、０．０１４ｍｏｌ）及びペルオキシ一硫酸カリウム（オキソンとしても知られる）（１１．１ｇ、０．０７３ｍｏｌ）の混合物を室温で５時間撹拌し、次いで反応混合物を水で希釈し、濾過し、真空下で乾燥させて、更に精製することなく５．０ｇ、９２．６％の表題化合物１１を得た、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．７４（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），６．６２－６．５９（ｍ，２Ｈ），４．５３（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），２．８６（ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，２Ｈ），２．２５（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９３－１．９１（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７６．７９，１６７．８７，１６３．９１，１５７．５７，１５７．１０，１３３．１６，１２３．２５，１２２．８９，１２０．２５，１０７．３２，１０２．１５，５５．８２，４９．７８，３３．９７，３１．４４，２２．４６；ＨＲＭＳ［Ｃ１７Ｈ１９Ｎ４Ｏ４Ｓ＋］計算値３７５．１１２７、実測値３７５．１１３０；ＨＰＬＣ純度９５．６％、Ｍｐ＝１５６～１５７℃。
４－（２－ヒドロキシ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ａ）の合成。１，４－ジオキサン中の１１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及び１Ｎ ＮａＯＨ（５ｍＬ）の混合物を６時間９０℃に加熱した。変換の完了後、混合物を氷水に注ぎ、固体を収集し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な１２ａを明褐色の固体として得た（８０ｍｇ、収率９６．３％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６７（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．６０－６．５７（ｍ，２Ｈ），４．４０（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．９９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．８０（ｄｄ，Ｊ＝１４．３，７．１Ｈｚ，２Ｈ）：１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６８．４４，１６３．５２，１６０．９９，１５７．４２，１３３．１８，１２４．１８，１２０．８０，１０７．４４，１０５．４９，１０２．０４，７２．６３，６６．７７，６０．６６，５５．７９，４９．３０，３０．８３，２２．４４；ＨＲＭＳ［Ｃ１６Ｈ１７Ｎ４Ｏ３ ＋］計算値３１３．１３１０、実測値３１３．１３０６；ＨＰＬＣ純度９８．７％、Ｍｐ＝１９８～１９９℃。
７－メトキシ－４－（２－メトキシ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｂ）の合成。ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の１１（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）及び０．５Ｍ ＣＨ３ＯＮａの混合物を、封管中で６時間９０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を分離し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な１２ｂを暗赤色固体として得た（７９ｍｇ、収率９０．７％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６６（ｓ，８Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，７Ｈ），６．５８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），４．４４（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．１４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．８６（ｄｄ，Ｊ＝１４．６，７．２Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７７．０４，１６８．２０，１６４．３３，１５８．０９，１５７．０７，１３２．８８，１２３．１４，１２１．００，１１３．２１，１０７．４１，１０２．０９，５５．７８，５４．７７，４９．５７，３３．７９，３０．５１，２２．６８；ＨＲＭＳ［Ｃ１７Ｈ１９Ｎ４Ｏ３ ＋］計算値３２７．１４５７、実測値３２７．１４５９；ＨＰＬＣ純度９５．０２％。Ｍｐ＝１６３～１６４℃。
４－（２－アミノ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｃ）の合成。１，４－ジオキサン（５ｍＬ）中の１１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及び０．５Ｍアンモニアの混合物を、封管中で８時間９０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過によって収集し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な１２ｃを淡褐色固体として得た（７０ｍｇ、収率８４．２％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６１（ｓ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５９－６．５４（ｍ，２Ｈ），６．２３（ｓ，２Ｈ），４．３４（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），２．５８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．０８－２．０４（ｍ，２Ｈ），１．７９－１．７５（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６７．７８，１５７．８３，１５６．７３，１５６．３０，１５５．５８，１５０．４０，１３３．０５，１２２．９７，１２０．４４，１１９．０８，１０７．３６，１０２．３０，５５．８５，５０．５１，３２．３５，２９．７４，２３．０９，２１．２２，１４．５４；ＨＲＭＳ［Ｃ１６Ｈ１８Ｎ５Ｏ２ ＋］計算値３１２．１４６０、実測値３１２．１４６１；ＨＰＬＣ純度９５．２６％。Ｍｐ＝２０８～２０９℃。
７－メトキシ－４－（２－（４－メチルピペラジン－１－イル）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｄ）の合成。１，４－ジオキサン中の１１（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）及びメチルピペラジン（８０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）の混合物を、封管中で１０時間１１０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過によって収集し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な１２ｄを淡黄色固体として得た（６８ｍｇ、収率６４．５％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６１（ｓ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），４．３７（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．６８（ｓ，４Ｈ），２．６３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．３５－２．３２（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．８７－１．７１（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７９．４９，１７６．５１，１６９．６０，１６８．５１，１６１．５３，１５７．１３，１５６．４２，１５６．２９，１５２．２８，１５１．７３，１３２．４１，１３０．５０，１２４．２２，１２２．４９，１２１．８７，１１２．３９，１０８．４７，１０７．３９，１０７．２４，１０２．０６，９６．２４，５５．９６，５５．７３，５４．９２，４９．４０，４６．２８，３４．４０，３４．３０，３０．４１，２９．２２，２２．５２，２２．３６；ＨＲＭＳ［Ｃ２１Ｈ２７Ｎ６Ｏ２ ＋］計算値３９５．２１９５、実測値３９５．２２０９；Ｍｐ＝１８７～１８８℃。
７－メトキシ－４－（２－モルホリノ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｅ）の合成。１，４－ジオキサン中の１１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びモルホリン（６９．８ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）の混合物を、封管中で１０時間１１０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過によって収集し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な１２ｅを淡黄色固体として得た（１０１ｍｇ、収率７９．２％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６０（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６０－６．５３（ｍ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．６４（ｓ，８Ｈ），２．６３（ｄｄ，Ｊ＝１６．６，９．１Ｈｚ，２Ｈ），２．１０（ｄｄ，Ｊ＝１８．６，１１．６Ｈｚ，２Ｈ），１．８４－１．７１（ｍ，２Ｈ）：１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７５．４９，１６７．３９，１６０．５４，１５６．０８，１５５．４０，１３１．４２，１２１．４１，１２０．７６，１０７．８１，１０６．２８，１０１．００，６５．４７，５４．６７，４８．３５，４３．６４，３３．２６，２９．３７，２１．５８；ＨＲＭＳ［Ｃ２０Ｈ２４Ｎ５Ｏ３ ＋］計算値３８２．１８７９、実測値３８２．１８８３；＝２６６℃で分解する。
７－メトキシ－４－（２－（ピペリジン－１－イル）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｆ）の合成。１，４－ジオキサン中の１１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びピペリジン（６８ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）の混合物を、封管中で９時間１１０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過によって収集し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な１２ｆをオフホワイトの固体として得た（８０ｍｇ、収率７８．９％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１２（ｓ，１Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４４（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．５６（ｓ，２Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，４Ｈ），２．７５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．１８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９４－１．８３（ｍ，２Ｈ），１．６３（ｂｓ，６Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７６．４９，１６８．５３，１６１．４３，１５７．１７，１５６．３５，１２２．４６，１２１．９７，１０７．７７，１０７．３９，１０２．０５，６６．７８，５５．７２，４９．４０，４４．８９，３４．３４，３０．３７，２５．７５，２４．９０，２２．５２；ＨＲＭＳ［Ｃ２１Ｈ２６Ｎ５Ｏ２ ＋］計算値３８０．２０８７、実測値３８０．２０９６；ＨＰＬＣ純度９５．８８％。Ｍｐ＝２４８～２４９℃。
７－メトキシ－４－（２－（ピロリジン－１－イル）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｇ）の合成。１，４－ジオキサン中の１１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びピロリジン（５７ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）の混合物を、封管中で１０時間１１０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過によって収集し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な１２ｇを明黄色固体として得た（８２ｍｇ、収率８４％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２０（ｓ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．６Ｈｚ，１Ｈ），６．４４（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｓ，２Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．５９（ｂｓ，４Ｈ），２．７７－２．７１（ｍ，２Ｈ），２．１８（ｔ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，２Ｈ），１．９８－１．９５（ｍ，４Ｈ），１．８９－１．８３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７５．２２，１６７．４８，１５９．３２，１５６．０４，１５５．２２，１４１．６７，１３１．３５，１２２．５３，１２１．１３，１０６．３１１００．９９，５４．６５，５４．３９，４８．３３，４５．６７，３３．２４，２９．３１，２４．４３，２１．５２；ＨＲＭＳ［Ｃ２０Ｈ２４Ｎ５Ｏ２ ＋］計算値３６６．１９３０、実測値３６６．１９３０；Ｍｐ＝１４４～１４５℃。
４－（２－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｈ）の合成。１，４－ジオキサン中の１１（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、イミダゾール（５４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＡ（７１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の混合物を、封管中で１２時間１１０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を収集し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な１２ｈを淡黄色固体として得た（７８ｍｇ、収率８０．６％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６９（ｓ，１Ｈ），８．５４（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），７．０８（ｓ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），４．５５（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），２．８３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９２－１．８８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７７．３８（ｓ），１６８．１３，１５７．６２，１５７．２８，１５３．１３，１３６．０８，１３３．０９，１３０．３４，１２３．２５，１２０．７４，１１７．５７，１１７．２２，１０７．３０，１０２．１１，６６．７９，５５．７９，４９．７４，３４．１２，３１．００，２２．５２；ＨＲＭＳ［Ｃ１９Ｈ１９Ｎ６Ｏ２ ＋］計算値３６３．１５６９、実測値３６３．１５７７；Ｍｐ＝２４２～２４３℃。
４－（２－（ジメチルアミノ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｉ）の合成。１，４－ジオキサン中の１１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ジメチルアミン塩（６５ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＡ（２ｍＬ）の混合物を、封管中で１０時間１１０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過によって収集し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な１２ｉを薄黄色固体として得た（７０ｍｇ、収率７７．２％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．５９（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５９－６．５６（ｍ，２Ｈ），４．３８（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．０８（ｓ，６Ｈ），２．６３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．０９（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．８０－１．７７（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７６．３５，１６８．５１，１６２．２２，１５７．０７，１５６．３２，１３２．４３，１２２．３６，１２２．０４，１０７．４４，１０７．３１，１０２．０５，５５．７１，４９．４１，３７．２０，３４．３６，３０．３４，２２．５６；ＨＲＭＳ［Ｃ１８Ｈ２２Ｎ５Ｏ２ ＋］計算値３４０．１７７３、実測値３４０．１７８７；ＨＰＬＣ純度９６．９２％、Ｍｐ＝１９８～１９９℃。
４－（２－（シクロプロピルアミノ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｊ）の合成。１，４－ジオキサン中の１１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びシクロプロピルアミン（４５ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）の混合物を、封管中で１０時間８０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過によって収集除去し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な１２ｊを淡黄色固体として得た（６２ｍｇ、収率６１％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６０（ｂｓ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．５９－６．５５（ｍ，２Ｈ），４．３８（ｓ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），２．６９（ｄｑ，Ｊ＝１０．６，３．６Ｈｚ，１Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．０８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．７９（ｄｄ，Ｊ＝１４．５，７．３Ｈｚ，２Ｈ），０．６２（ｄｔ，Ｊ＝６．５，３．１Ｈｚ，２Ｈ），０．４４－０．４３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７６．３１，１６８．５４，１６３．２７，１５７．２３，１５６．３５，１３２．４９，１２２．５０，１２２．０８，１０７．３１，１０２．０３，６６．７９，５５．７２，４９．４３，３４．１２，３０．４５，２４．３８，２２．５５，６．８９；ＨＲＭＳ［Ｃ１９Ｈ２２Ｎ５Ｏ２ ＋］計算値３５２．１７７３、実測値３５２．１７８２；ＨＰＬＣ純度９５．９％、Ｍｐ＝１７１～１７２℃。
７－メトキシ－４－（２－（メチルアミノ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｋ）の合成。１，４－ジオキサン中の１１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ中の２Ｍメチルアミン（０．４ｍＬ、８ｍｍｏｌ）の混合物を、封管中で７時間１１０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過によって収集し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な１２ｋをオフホワイトの固体として得た（７０ｍｇ、収率８０．６％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．５８（ｓ，１Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｑ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄｄ，Ｊ＝１２．２，２．７Ｈｚ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），２．７７（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，３Ｈ），２．５９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．０６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．７８－１．７５（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７６．３６，１６８．５３，１６２．９４，１５７．２９，１５６．３０，１３２．４３，１２２．３９，１２２．１１，１０７．３２，１０２．０５，５５．７２，４９．４０，３０．４０，２８．４９，２２．５４；ＨＲＭＳ［Ｃ１７Ｈ２０Ｎ５Ｏ２ ＋］計算値３２６．１６１７、実測値３２６．１６２４；ＨＰＬＣ純度９６．７％。Ｍｐ＝２０１～２０２℃。
４－（２－イソチオシアナト－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｌ）の合成。無水ＣＨ２Ｃｌ２中のチオホスゲン０．５５ｍＬ、０．４ｍｍｏｌの０．５０Ｍ溶液をアルゴン下で０℃に冷却した。無水ＣＨ２Ｃｌ２及びＤＩＰＡ（０．７ｍＬ）中の１２ｃ（１００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。得られた溶液を８時間にわたり周囲温度に加温した。反応塊を１ＮＨＣｌ（５ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、イソチオシアネートを淡黄色固体として得た（５０ｍｇ、収率４４．２％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．７２（ｓ，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），２．７８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９０－１．８６（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１８２．６６，１６６．１２，１５６．４４，１５４．３６，１５３．２９，１５３．２６，１２７．１１，１２６．４８，１１９．８０，１１６．９０，１０９．８１，５５．９０，５５．５４，３４．４５，２６．８９，２２．３２；ＨＲＭＳ［Ｃ１７Ｈ１６Ｎ５Ｏ２Ｓ＋］計算値３５４．１０２５、実測値３５４．１０３１；ＨＰＬＣ純度９６．４％、１３９℃で分解する。
４－（２－（（２－ヒドロキシエチル）アミノ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｍ）の合成。１，４－ジオキサン中の１１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、２－アミノエタノール（５００ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＡ（２ｍＬ）の混合物を、封管中で１２時間１１０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、次いでＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３０ｍＬ×２）。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋な１２ｍを白色固体として得た（７５ｍｇ、収率７９％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６０（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｄｔ，Ｊ＝１１．６，４．１Ｈｚ，２Ｈ），４．６８（ｂｓ，１Ｈ），４．３５（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．５１－３．４８（ｍ，２Ｈ），３．３５－３．３０（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．０７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．７９１．７６（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６８．５１，１６２．３９，１５７．３１，１５６．３４，１３２．４５，１２２．４３，１２２．０４，１０７．３２，１０２．０５，６０．５６，５５．７２，５５．３７，４９．４１，３４．１３，３０．４３，２２．５３；ＨＲＭＳ［Ｃ１８Ｈ２２Ｎ５Ｏ３ ＋］計算値３４０．１７７３、実測値３４０．１７８９；ＨＰＬＣ純度９９．７３％、Ｍｐ＝１４３～１４４℃。
４－（２－（エチルアミノ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（５ｖ）の合成（実施例４に列挙した代替方法）。１，４－ジオキサン中の１１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、エチルアミン（３６ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）の混合物を、封管中で６時間１１０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過により収集し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な塩を含まない５ｖをオフホワイトの固体として得た（５０ｍｇ、収率５０％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．８４（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｂｓ，２Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６５－６．６３（ｍ，２Ｈ），３．８８（ｂｓ，１Ｈ），３．７６－３．７２（ｍ，４Ｈ），３．４４－３．４１（ｍ，２Ｈ），２．８３（ｂｓ，１Ｈ），２．０８（ｂｓ，１Ｈ），１．８８（ｂｓ，２Ｈ），１．１８（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６７．５６，１５８．４８，１３３．９２，１２５．１８，１１９．２９，１０７．３８，１０２．１１，５５．９０，４９．７０，３６．５０，３１．１８，２２．４４，１４．７５；ＨＲＭＳ［Ｃ１８Ｈ２２Ｎ５Ｏ２ ＋］計算値３４０．１７７３、実測値３４０．１７８９；ＨＰＬＣ純度９７．３％、２１０～２１１℃で分解する。
４－（２－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－（トリフルオロメトキシ）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｏ）の合成。水素化ナトリウム（１５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中の２－クロロ－Ｎ－（２－（（２－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）アミン）－２－（（４－トリフルオロメトキシ）フェニル）アセトアミド（１００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）に０℃で添加し、混合物を、ＴＬＣ監視によって完了と判断するまで室温で撹拌した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過によって除去し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、１２ｏをオフホワイトの固体として得た（５０ｍｇ、収率５５％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．８７（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），４．４４（ｓ，２Ｈ），２．７９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．４９（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．８９－１．８６（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７６．３０，１６７．８３，１６５．８１，１５６．４１，１４４．２８，１３２．３１，１２７．４４，１２１．４４，１１８．１３，１１４．６２，１０８．８８，４９．３６，３４．０６，３０．７３，２５．７７，２２．４８；ＨＲＭＳ［Ｃ１７Ｈ１５Ｆ３Ｎ４Ｏ２ ＋］計算値３６５．１２２５、実測値３６５．１２３６；ＨＰＬＣ純度９８．７％、Ｍｐ＝１８８～１８９℃。
７－（ベンジルオキシ）－４－（２－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｐ）の合成。水素化ナトリウム（７１ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＮ－（５－（ベンジルオキシ）－２－（（２－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）フェニル）－２－クロロアセトアミド（５００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）に０℃で少量ずつ添加し、混合物を、ＴＬＣ監視によって完了と媒介されるまで室温で撹拌した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過によって除去し、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、１２ｐを褐色固体として得た（３００ｍｇ、収率６５．６％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．６９（ｓ，１Ｈ），７．４６－７．３４（ｍ，５Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６７－６．６５（ｍ，２Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），２．７５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．４７（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．８５－１．８２（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７５．５８，１６８．２６，１６５．５３，１５６．８１，１５５．７９，１３７．３３，１３２．７１，１２８．９０，１２８．３６，１２８．２５，１２２．２７，１２１．７５，１１６．８８，１０８．０９，１０３．１０，６９．９８，４９．５７，３３．９８，３０．９２，２５．７６，２２．３７；ＨＲＭＳ［Ｃ２３Ｈ２３Ｎ４Ｏ２ ＋］計算値３８７．１８２１、実測値３８７．１８３３；ＨＰＬＣ純度９９．４％、Ｍｐ＝１５０～１５１℃。
７－ヒドロキシ－４－（２－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（１２ｑ）の合成。１２ｐ（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素下で乾燥ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（１：１体積）の混合物中で調製し、５％Ｐｄ／Ｃ（１０重量％）を添加した。次いで、窒素雰囲気を真空下で除去し、出発物質の完全な消費がＴＬＣによって示されるまで、塊を室温で２時間、１気圧のＨ２（水素バルーン）下で撹拌した。次いで、水素雰囲気を真空下で除去し、反応混合物を窒素で十分にフラッシュした。懸濁したＰｄ／Ｃを、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通した濾過によって除去し、溶媒を蒸発させ、カラムクロマトグラフィーによって精製して、白色固体１２ｑを得た（１００ｍｇ、収率６５．３％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．５８（ｓ，１Ｈ），９．４７（ｓ，１Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．４７（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），６．４０（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．６Ｈｚ，１Ｈ），４．４２（ｓ，２Ｈ），２．７３（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．１６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．８４－１．８０（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７５．４５，１６８．３８，１６５．４８，１５６．９５，１５５．０４，１３２．８０，１２２．６５，１２０．０６，１１６．４９，１０８．９３，１０３．２５，４９．６３，３３．９７，３０．９１，２５．７８，２２．３３；ＨＲＭＳ［Ｃ１６Ｈ１７Ｎ４Ｏ２ ＋］計算値２９７．１３５２、実測値２９７．１３５３；ＨＰＬＣ純度９６．９％、Ｍｐ＝１６１～１６２℃。
エチル２－（（５－メトキシ－２－（（２－（メチルチオ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）フェニル）アミノ）－２－オキソアセテート（１３）の合成。アニリン誘導体８（
Figure 2024515727000033
）（３ｇ、９ｍｍｏｌ）をアセトン（４０ｍＬ）に溶解し、粉末状のＫ２ＣＯ３（５．４ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を０℃に冷却した。エチルオキサリルクロリド（２ｍＬ、過剰）を混合物にゆっくり添加し、これを０℃で更に１時間撹拌した。次いで、混合物を水で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ブライン溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な明褐色固体（２．５０ｇ、収率６２．６％）を得た、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ９．９９（ｓ，１Ｈ），８．５３（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），２．７５（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．０７－１．９６（ｍ，２Ｈ），１．２３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７７．４１，１７３．７２，１６５．１８，１６２．２０，１６２．０２，１５９．８６，１３７．４３，１３３．１３，１２８．９０，１１７．７１，１１６．２０，１１４．１９，６７．８６，６０．５６，３８．７７，３２．０１，２６．３５，１８．８６，１８．４７；実測値ＬＣＭＳ［Ｍ＋Ｈ］４０３。
６－メトキシ－１－（２－（メチルチオ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）キノキサリン－２，３（１Ｈ，４Ｈ）－ジオン（１４）の合成。ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の化合物１３（１ｇ、２．４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、６０％水素化ナトリウム（０．８６ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で１２時間撹拌し、ＴＬＣによって監視した。反応の完了後、混合物を水で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ×２）で抽出し、合わせた有機層を０．５Ｎ ＨＣｌ（２×５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、純粋な明褐色固体１４を得た（０．７５ｇ、収率７９％）：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１２．１８（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．５４（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．０５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．６８－２．６６（ｍ，２Ｈ），２．４９（ｓ，３Ｈ），２．０８－２．０５（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１８０．８０，１７１．２７，１５６．４６，１５４．３３，１５３．３５，１５２．５７，１２８．９５，１２７．１６，１１９．８０，１１６．８７，１０９．７８，０１．１７，５５．９１，３４．３９，２７．３２，２１．９９，１４．２２；ＨＲＭＳ［Ｃ１７Ｈ１７Ｎ４Ｏ３Ｓ＋］計算値３５７．１０２１、実測値３５７．１０３４；ＨＰＬＣ純度９７．６％、Ｍｐ＝２１０～２１１℃。
６－メトキシ－１－（２－（メチルスルホン）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）キノキサリン－２，３（１Ｈ，４Ｈ）－ジオン（１５）の合成。水／ＭｅＯＨ（１：１体積）中の１４（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）及びペルオキシ一硫酸カリウム（０．６５ｇ、４．２ｍｍｏｌ）の混合物を室温で１２時間撹拌し、次いで反応混合物を水で希釈し、濾過し、真空下で乾燥させて、更に精製することなく表題化合物１５を得た（０．５ｇ、９２．５％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１２．１９（ｓ，１Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６５－６．６３（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ），３．２２（ｓ，２Ｈ），２．８４（ｓ，２Ｈ），２．１７（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１８２．８５，１６５．１７，１５６．６５，１５４．１５，１５３．５５，１５２．８０，１３８．２１，１２７．３６，１１９．８１，１１７．２１，１０９．５７，１０１．２３，５５．９４，３４．５４，２８．３１，２２．２５；ＨＲＭＳ［Ｃ１７Ｈ１７Ｎ４Ｏ５Ｓ＋］計算値３８９．０９２０、実測値３８９．０９２７；Ｍｐ＝１７８～１７９℃。
６－メトキシ－１－（２－メトキシ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）キノキサリン－２，３（１Ｈ，４Ｈ）－ジオン（１６）の合成。メタノール（２．２ｍＬ）中の１５（１００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）及び５Ｎナトリウムメトキシドの混合物を、封管中、室温で４８時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を水で希釈し、濾過し、真空下で乾燥させて、オフホワイトの固体１６（５０ｍｇ、５７．４％）を得た、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１２．１６（ｓ，１Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５７（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．０２（ｄｄ，Ｊ＝１３．６，６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．６３－２．５７（ｍ，２Ｈ），２．０７－２．０３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１８２．８７，１６６．１２，１５６．４４，１５４．３６，１５３．２９，１５３．２７，１２７．１１，１２６．４８，１１９．８０，１１６．９８，１０９．８１，１０１．１１，５５．９０，５５．５４，３４．４４，２６．８９，２２．３１；ＨＲＭＳ［Ｃ１７Ｈ１７Ｎ４Ｏ４ ＋］計算値３４１．１２５０、実測値３４１．１２５７；ＨＰＬＣ純度９８．３％、Ｍｐ＝１２６～１２７℃。
５－メトキシ－１－（２－（メチルチオ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２（３Ｈ）－オン（１８）の合成。化合物８（
Figure 2024515727000034
）（２００ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）をアセトン（２５ｍＬ）に溶解し、粉末状Ｋ２ＣＯ３（０．４５ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を０℃に冷却した。クロロギ酸エチル（０．４ｍＬ、過剰）を混合物にゆっくり滴下し、これを０℃で更に２時間撹拌した。次いで、混合物を水で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬｘ２）で抽出し、ブライン溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、粗生成物１７を無水ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、水素化ナトリウム（４１ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を添加し、完了するまで室温にした。混合物を氷水に注ぎ、固体生成物を濾過によって除去し、水で洗浄し、乾燥させて、オフホワイトの固体１８として得た（９８ｍｇ、５６％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．９６（ｂｓ，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６９－６．６６（ｍ，２Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．０６（ｔｄ，Ｊ＝７．５，４．１Ｈｚ，４Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），２．２１－２．０９（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７８．４１，１６９．４９，１５６．７１，１５３．０４，１５１．８４，１２９．４９，１２４．５１，１２２．２５，１１２．６７，１０７．７９，９６．４２，５５．９１，３４．２３，２９．５０，２２．５７，１４．３４；ＨＲＭＳ［Ｃ１６Ｈ１７Ｎ４Ｏ２Ｓ＋］計算値３２９．１０７２、実測値３２９．１０７６；ＨＰＬＣ純度９５％、Ｍｐ＝１６７～１６８℃。
１－（２－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－５－（トリフルオロメトキシ）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－オン（１８ａ）の合成。アセトン（２０ｍＬ）に溶解したＮ１－（２－メチル－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－４－（トリフルオロメトキシ）ベンゼン－１，２－ジアミンの化合物（５００ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）に、粉末状Ｋ２ＣＯ３（８５０ｍｇ、６．１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を０℃に冷却した。クロロギ酸エチル（１．０ｍＬ、過剰）を混合物にゆっくり滴下し、これを０℃で更に２時間撹拌した。次いで、混合物を水で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ×２）で抽出し、ブライン溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、粗生成物を無水ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、６０％水素化ナトリウム（７１ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を添加し、完了するまで室温にした。混合物を氷水に注ぎ、固体生成物を濾過によって除去し、水で洗浄し、乾燥させて、オフホワイト色の固体１８ａとして得た（１８０ｍｇ、４３．６％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１１．５５（ｓ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１５－６．９７（ｍ，２Ｈ），３．０３－２．８９（ｍ，４Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），２．０９－１．９８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７９．１９，１６６．２５，１５２．２６，１５１．００，１４４．１５，１３０．３５，１２７．７７，１２６．１９，１２１．９３，１１９．３９，１１４．３７，１１２．３２，１０３．５３，３４．４１，２９．１５，２５．５４，２２．３２；ＨＲＭＳ［Ｃ１６Ｈ１４Ｆ３Ｎ４Ｏ２ ＋］計算値３５１．１０６９、実測値３５１．１０８０；ＨＰＬＣ純度９５．２％、Ｍｐ＝１３６～１３７℃。
５－メトキシ－１－（２－（メチルチオ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－２－（２，３，４－トリメトキシフェニル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール１９の合成。ＥｔＯＨ（６ｍＬ）中の化合物８（
Figure 2024515727000035
）（２００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）及び対応する２，３，４－トリメトキシベンズアルデヒド（１４２ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）の混合物を１時間還流した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させて粗イミンを得て、これをＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ）に再溶解し、続けてヨウ素（７５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１１５ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を順次添加した。反応が完了したら反応混合物を室温で撹拌し、これを５％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１５ｍＬ）でクエンチし、次いでＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、次いでシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、オフホワイトの固体１９として得た（９９ｍｇ、４９．７％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３。９０（ｓ，３Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），２．９５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），２．０９－１．９７（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７９．８８，１７１．５７，１５１．４２，１４１．６６，１２７．１４，１２３．４５，１１２．６７，１０７．８５，７７．３５，７７．０４，７６．７２，６１．１９，６１．１１，５６．２２，５６．０６，３４．４６，２８．４５，２３．０１，１４．１６；ＨＲＭＳ［Ｃ２５Ｈ２７Ｎ４Ｏ４Ｓ＋］計算値４７９．１７５３、実測値４７９．１７５５；ＨＰＬＣ純度９５．８％、Ｍｐ＝１２７～１２８℃。
４－メトキシ－Ｎ１－（２－メトキシ－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）ベンゼン－１，２－ジアミン（２０）の合成。メタノール（３．０ｍＬ）中の１５（
Figure 2024515727000036
）（１００ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）及び５Ｎナトリウムメトキシドの混合物を密封管中で７０℃で２時間撹拌した。反応の完了後、混合物を水で希釈し、濾過し、真空下で乾燥させて、白色固体２０を得た（６０ｍｇ、８１％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．９８（ｂｓ，１Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），６．１２（ｄｄ，Ｊ＝９．２，２．５Ｈｚ，１Ｈ），４．８５（ｂｓ，２Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），２．６６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．５５－２．５０（ｂｓ，２Ｈ），１．９７－１．９３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６５．２９，１６０．１３，１５８．６１，１４６．０６，１２９．３７，１１７．５４，１１０．３１，１０１．９３，１００．５９，５５．２４，５３．９７，３３．９６，２７．０６，２１．９２；ＨＲＭＳ［Ｃ１５Ｈ１９Ｎ４Ｏ２ ＋］計算値２８７．１５０８、実測値２８７．１５１９；ＨＰＬＣ純度９８．２％、Ｍｐ＝１８９～１９０℃。
Ｎ１－（５－メトキシ－２－（（２－（メチルチオ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）アミノ）フェニル）－Ｎ２－メチルオキサルアミド（２１）の合成。化合物１７（
Figure 2024515727000037
）（０．２ｇ、０．４９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＴＨＦ中のメチルアミン（２ｍＬ、過剰）を０°Ｃで添加した。混合物を封管中、室温で１２時間撹拌し、ＴＬＣで監視した。反応の完了後、混合物を水で希釈し、濾過し、真空下で乾燥させて、オフホワイトの固体２１を得たて（１００ｍｇ、５２％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ９．９６（ｓ，１Ｈ），９．０２（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），８．５９（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），２．７７－２．７３（ｍ，２Ｈ），２．６９－２．６６（ｍ，５Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），２．０３－１．９９（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１７２．７５，１６９．０，１６０．４４，１５８．１１，１５７。７７，１５７．５６，１３３．５１，１２８．７７，１２３．４６，１１２．７４，１１０．７２，１０８．３１，５５．７７，３３．９８，２７．２８，２６．５９，２１．６１，１３．７０；ＨＲＭＳ［Ｃ１８Ｈ２２Ｎ５Ｏ３Ｓ＋］計算値３８８．１４４３、実測値３８８．１４５７；ＨＰＬＣ純度９９．２％、Ｍｐ＝１６５～１６６℃。
実施例９：シクロペンタノ－ピリミジンジヒドロキノキサリノン（１２ａ～１２ｍ、１２ｏ～１２ｑ、５ｖなど）の生物学的特徴付け。
生物学。細胞培養及び試薬。ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５及びＭ１４；ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３；ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡ Ｐａｃａ－２及びＰＡＮＣ－１；並びに前立腺癌細胞株ＰＣ－３は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。Ａ３７５、Ｍ１４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、及びＭＩＡ Ｐａｃａ－２を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ、ＧＡ）及び１％抗生物質／抗真菌剤溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で培養した。ＭＩＡ Ｐａｃａ－２膵臓癌細胞を、２．５％ウマ血清も補充した培地中で培養した。ＰＡＮＣ－１及びＰＣ－３を、１０％ＦＢＳ及び１％抗生物質／抗真菌剤混合物を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。パクリタキセル耐性ＰＣ－３細胞（ＰＣ３／ＴｘＲ）細胞を、パクリタキセルでの連続処理によって開発し、５％ ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７°Ｃで１０ｎＭパクリタキセルを含む培地中で維持した。生物学的実験のために、ピリミジンジヒドロキノキサリノン誘導体をＤＭＳＯに溶解して２０ｍＭストック溶液を作製し、使用するまで－２０℃で保存した。
実施例８で合成した化合物の細胞傷害活性を、黒色腫（Ａ３７５、Ｍ１４）、乳（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３）、膵臓（Ｍｉａ ＰａＣａ－２、ＰＡＮＣ－１）、及び前立腺（ＰＣ３、ＰＣ３／ＴｘＲ）癌などの癌細胞株のパネルに対して試験した。細胞増殖阻害の最大半量阻害濃度値（ＩＣ５０）を表６に要約する。
Figure 2024515727000038
この研究から、ヘテロ原子のサイズが細胞傷害性効力に著しい影響を及ぼし、ヘテロ原子のサイズが減少とこの効力を増加させる傾向があることが明らかになった。例えば、チオエーテル１０（ＩＣ５０≒３．４±０．５ｎＭ、Ａ３７５細胞株、表６）、エーテル１２ｂ（ＩＣ５０≒３．２±０．５ｎＭ）、及び第二級アミン１２ｋ（ＩＣ５０≒１．２±０．２ｎＭ）は比較的小さく、１桁のｎＭ効力を有した。Ｎ－メチルピペラジン１２ｄ（ＩＣ５０≒５４２．８±１１１．０ｎＭ）、モルホリン１２ｅ（ＩＣ５０≒１３．６±２．０ｎＭ、表６）、ピペリジン１２ｆ（ＩＣ５０≒４３６．１±７６．２ｎＭ）、及びピロリジン１２ｇ（ＩＣ５０≒８２．１±１２．９ｎＭ）などの環状誘導体の置換は、中程度から高い効力を示したモルホリン誘導体を除いて、効力が比較的低かった。芳香族複素環すなわちイミダゾール１２ｈ（ＩＣ５０≒５．７±０．９ｎＭ）は、良好な効力を示した。第三級アミン１２ｉ（ＩＣ５０≒２２．６±４．５ｎＭ）誘導体は中程度の効力を示した。化合物１２ｋで得られた結果は、効力が高かったＮ－エチル５ｖ（ＩＣ５０≒１．６±０．３ｎＭ）及びＮ－シクロプロピル１２ｊ（ＩＣ５０≒１．４±０．３ｎＭ）などの第二級アミンの薬理学的効力を研究する道を開いた。１２ｍ（ＩＣ５０≒８．６±０．２ｎＭ）のエタノールアミン部分における－ＯＨ基などの余分な水素結合供与体を付け加えると、５ｖ（エチルアミン型）と比較した場合に効力がわずかに減少し、イソチオシアネート誘導体１２ｌ（ＩＣ５０≒３．３±０．５ｎＭ）も非常に良好な効力を示した。ピリミジン（２－Ｐｙ）環１２ａ（ＩＣ５０≒６４６．５±１２４．２ｎＭ）上のＣ２位の保護されていないフェノール性ＯＨは、スルホン誘導体１１（ＩＣ５０≒８４．９±１７ｎＭ）などの他の電子求引基と同様に、効力を劇的に低下させた。一方、同じ位置の遊離アミン１２ｃは、効力を改善させた（ＩＣ５０≒２．０１±０．４ｎＭ）。
ＯＭｅ基の置換としての化合物１２ｏ～ｐ（すなわち、ＯＣＦ３、ＯＢｎ及びＯＨ）は、効力が低下していた。アリール置換基による一般的な傾向は、４－ＯＭｅ化合物が最も高い親和性を有し、４－ＯＣＦ３（１２ｏ、ＩＣ５０≒４３．１±６．９）、ＯＨ（１２ｑ、ＩＣ５０≒１９．０±２．９、表６）を有する化合物は、効力が中程度であり、ＯＢｎを有する化合物（１２ｐ）置換は、効力が最も低いことだった。更に、Ｃ環構造を修飾しても、効力は改善しなかった。それぞれ、ベンズイミダゾール１９（ＩＣ５０＞３μＭ）及び２－イミダゾロン誘導体１８ａ～ｂ（ＩＣ５０≒１１８２±３３９、２３８．１±１２６．５ｎＭ）などの閉環系、種々のキノキサリンジオン誘導体１４、１５、１６（ＩＣ５０＞３μＭ）、並びにアミン２０（表６）及びアミド２１などの開放系は両方とも、負の影響を受け、細胞傷害活性はほとんど又は全くなかった。
薬物動態評価。
７～９週齢の雌ＮＳＧマウスを薬物動態試験に使用した。マウスは、単回用量の４ｍｇ／ｋｇ１２ｋを静脈内に（５０％ＰＥＧ３００：５０％生理食塩水）又は１０ｍｇ／ｋｇを経口で（９０％ＰＥＧ３００：１０％生理食塩水）受けた。動物の血液（ｎ＝３）を、所定の時点（０．０８、０．２５、０．５、１、３、６、１２、２４時間）で最終心臓内採血を介してヘパリン処理チューブに採取し、血漿を直ちに遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間）によって分離し、分析まで－８０℃で保存した。この実験の濃度－時間曲線を図２７に示す。
ヒト及びマウス肝ミクロソーム中での化合物１２ｊ、１２ｋ、及び５ｖの代謝安定性。ＮＡＤＰＨ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）（１ｍＭ）の存在下で、化合物１２ｊ、１２ｋ、５ｖ、及びベラパミル（１μｇ／ｍＬ）についてヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｎｅｏｎｔａ，ＮＹ）及びマウスミクロソーム（Ｓｅｋｉｓｕｉ ＸｅｎｏＴｅｃｈ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＫＳ）との肝ミクロソームインキュベーション（１ｍｇミクロソームタンパク質／ｍＬ）を評価した。所定の時間（０、５、１５、及び６０分）に、アリコート（５０μＬ）を取り出し、内部標準を含有する２００μＬの氷冷メタノールの添加によって反応を停止させた。試料を短時間ボルテックスし、３２００×ｇで５分間、４℃で遠心分離した。上清を回収し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。インビトロ半減期（ｔ１／２）及び固有クリアランス（ＣＬｉｎｔ）を標準的な手順に従って評価した。Ｏｂａｃｈ，Ｒ．Ｓ．，Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｅｚｌｏｐｉｔａｎｔ ａｌｋｅｎｅ （ＣＪ－１２，４５８），ａ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｏｆ ｅｚｌｏｐｉｔａｎｔ：ｅｎｚｙｍｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎ ａｌｋｅｎｅ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２００１，２９（７），１０５７－１０６７。
ヒト及びマウス肝ミクロソーム中での化合物１２ｊ、１２ｋ及び５ｖのインビトロミクロソーム安定性を決定し、結果を表７に要約する。化合物１２ｊ及び５ｖは限られた安定性を示し、マウスミクロソーム調製物では、化合物１２ｋは両方の種において良好な安定性を示し、半減期は３００分を超えた。
Figure 2024515727000039
ａ本研究ではベラパミルをアッセイ対照として使用した。データは平均（％ＣＶ）として表す。
＊ｔ１／２及びＣＬｉｎｔの検出限界に基づく。
化合物１２ｋを、図２８にグラフで示すインビボ試験に進めた。静脈内４ｍｇ／ｋｇ（図２７）又は経口投与１０ｍｇ／ｋｇ後のＮＳＧマウスにおける化合物１２ｋのインビボ薬物動態試験。インビボ半減期は２３８分（３．９７時間）だった。経口バイオアベイラビリティは、表８に示すように、２．０２％に制限されたままだった。
Figure 2024515727000040
ａデータは、平均（％ＣＶ）として示す。
細胞傷害性試験。癌細胞を、９６ウェルプレートにウェルあたり３，５００～５，０００細胞の濃度で播種した。２４時間後、Ａ３７５、Ｍ１４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３癌細胞の培地を０．１ｎｍｏｌ／Ｌ～３μｍｏｌ／Ｌの範囲の濃度の新鮮な培地中の試験化合物と交換した。Ｍｉａ Ｐａｃａ－２、ＰＡＮＣ－１、ＰＣ３、及びＰＣ３／ＴｘＲ癌細胞では、１ｎｍｏｌ／Ｌ～１．２５μｍｏｌ／Ｌの濃度範囲を使用した。各実験は、４連から成った。癌細胞を７２時間処理した後、ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を各ウェルに添加し、細胞型に応じて３７℃で１～２時間暗所でインキュベートした。マイクロプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍでの吸光度を記録した（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって計算した。
インビボ皮下ＰＣ－３／ＴｘＲ異種移植モデル。マウスの皮下ヒト前立腺癌薬剤耐性細胞株ＰＣ－３／ＴｘＲ異種移植モデルにおけるインビボでの化合物１２ｋの抗腫瘍効果を評価した。全ての動物手順は、ＵＴＨＳＣの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコル（プロトコル＃２０－０１６６）に従って実施した。７～１０週齢の雄Ｎｏｄ－Ｓｋｉｄ－Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウス（１群あたりｎ＝８）を、１２／１２照明下で動物施設に収容した。ＰＣ－３／ＴｘＲ前立腺癌腫瘍がマイコプラズマを含まないことを調べ、試験前にパクリタキセルに対するインビボ耐性について検証した。３ｘ１０６個の細胞を７５μＬのＨＢＳＳ及びＭａｔｒｉｇｅｌ混合物（２：１）に懸濁し、２８Ｇ １／２インスリンシリンジを使用して各マウスの右側腹部に皮下注射した。マウスを５％イソフルランで麻酔し、細胞注射を実施する間、２％イソフルラン下で維持した。接種の約２週間後に平均腫瘍サイズが７０～１００ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に対照、パクリタキセル処置、及び１２ｋ処置群に分けた。パクリタキセルを最初にエタノールに溶解し、クレモフォールＥＬ／生理食塩水溶液（１：１：１８比）で希釈した。化合物１２ｋをＰＥＧ ３００に溶解し、使用前に生理食塩水溶液で希釈した（１：４の割合）。パクリタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ １用量／週）及び化合物１２ｋ（２．５ｍｇ／ｋｇ、２用量／週）の両方を、エンドポイントまで静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。腫瘍体積をノギスで週２回測定し、式：体積＝０．５×（長さ×幅２）によって計算した。全ての動物を、処置の２週間後のエンドポイントで安楽死させた。腫瘍を切除し、重量及びサイズをエクスビボで記録し、サイズ基準としてペトリ皿中で画像化した。
図２８Ａ～Ｅに示すように、化合物１２ｋは、パクリタキセル処置群及び対照群と比較して、この処置群の腫瘍増殖を有意に阻害した。図２８Ａは、対照、パクリタキセル、及び化合物１２ｋ処置群の腫瘍増殖曲線を示す（二元配置ＡＮＯＶＡ、続けて多重比較検定）。図２８Ｂに示すように、全てのマウスは安定であり、化合物１２ｋ処置では有意な体重減少はなく、週２回の２．５ｍｇ／ｋｇの処置用量は耐用性が良好であることが示され、一方対照群及びパクリタキセル処置群の両方は、試験終了まで一様な体重減少を経験した。試験のエンドポイントで、全てのマウスを安楽死させ、腫瘍及び主要臓器を採取した。腫瘍を秤量し、腫瘍体積をエクスビボで測定した。対照と比較して、化合物１２ｋによる処置は、それぞれ、体積に関して腫瘍増殖を約８５．６％阻害し（図２８Ｃ）、腫瘍重量は８４．５％減少した（図２８Ｄ）。より高用量のパクリタキセルでは、それほど腫瘍重量の減少を示さなかった。結果から、化合物１２ｋは、低用量で安全であるが強力なインビボ用量で、前立腺癌腫瘍の進行を減弱させ、タキサン耐性を克服することができることが実証された。図２８Ｅは、対照、パクリタキセル、及び化合物１２ｋ処置群についての、３５ｍｍペトリ皿中の単離腫瘍の比較である。データを平均＋／－ＳＥＭとして表した。（図２８Ｃ～Ｄ）群間の有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネットの多重比較検定によって決定した（＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
実施例１０：５ｖはチューブリン重合、タキソール耐性黒色腫増殖及び自然転移を阻害する。
Ｘ線結晶構造及びチューブリン重合アッセイにより、５ｖは、微小管動態を破壊し、微小管集合体に干渉することもあるコルヒチン結合部位阻害剤（ＣＢＳＩ）であることが確認された。インビトロ試験から、５ｖは癌細胞株のパネル及び癌癌細胞株のパクリタキセル耐性細胞株（ＴｘＲ）のいくつかに対してナノモル以下の抗増殖活性を有することが示された。５ｖは、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞のコロニー形成及び遊走を阻害し、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞のアポトーシス及びＧ２／Ｍ期停止を誘導した。以下のインビボ研究から、５ｖはＡ３７５／ＴｘＲ黒色腫異種移植片の腫瘍増殖を強力に阻害し、腫瘍の壊死、抗血管新生、及びアポトーシスを誘導することが確認された。更に、５ｖ処置は、皮下腫瘍に由来する自然発生的な腋窩リンパ節、肺、及び肝転移を有意に阻害し、マウスの主要臓器に対する明らかな毒性を有さず、癌治療のための新規抗癌剤としての５ｖの治療可能性を実証した。
微小管は、頭－尾様式で配置された重合したαα－及びββチューブリンヘテロ二量体の重要な要素であり、一方の二量体のααサブユニットが次の二量体のββサブユニットと結合している。これらのサブユニットの非共有結合は、プロトフィラメントを形成する。プロトフィラメントは、円筒状構造へと長手方向に組み立てられ、通常、１３個の断片があり、２２ｎｍの微小管を構成する。微小管は、動的不安定性と呼ばれる挙動である、伸長及び収縮の２種類の交互の段階を経る。遅い重合及び速い脱重合ダイナミクスの連続的な変化により、微小管は、細胞分裂、細胞構造維持、細胞内輸送、及び運動調節を含む多くの細胞プロセスにおいて基本的及び不可欠な役割を果たす。
微小管標的剤（ＭＴＡ）は、様々な機構を介して微小管に結合することによって微小管ダイナミクスに影響を及ぼす。細胞間相において、ＭＴＡは、タンパク質、小胞及び細胞小器官の細胞内輸送、並びに間期細胞骨格に関与する微小管に対して大きな影響を及ぼす。有糸分裂において、複製された染色体を分離するために必要とされる構造、すなわち、再配置された微小管の細胞骨格から構成される有糸分裂紡錘体も又、ＭＴＡによって大きく影響される。微小管ダイナミクスが破壊されると、細胞周期をＧ２／Ｍ期に停滞させ、有糸分裂が停止する。細胞増殖における微小管の重要な役割を考慮すると、微小管は、抗癌剤の開発にとって魅力的な標的となってきている。
コルヒチン結合部位阻害剤（ＣＢＳＩ）は、チューブリンヘテロ二量体のαα及びββサブユニット間の境界面に位置する微小管の結合ドメインを標的とする。他のＭＴＡ又はコルヒチン自体と比較して、ＣＢＳＩは、ＡＢＣトランスポーター媒介性多剤耐性、及びββ３－チューブリン過剰発現、及び血管破壊活性を克服することを含む、いくつかの利点を有する。ＣＡ－４Ｐ、ＯＸｉ４５０３、ＡＢＴ－７５１、及び１７ｙａなど、ＣＢＳＩのいくつかは現在臨床試験中であるが、主に望ましくない有害事象（例えば、血液毒性、神経毒性）、バイオアベイラビリティの欠如又は低い水溶性のために、現在、癌治療に利用可能なＦＤＡ承認ＣＢＳＩはない。したがって、多剤耐性（ＭＤＲ）を回避することができる、又は非ＭＤＲ基質である、より多くのＣＢＳＩを見出すための多大な努力が依然として必要とされており、これらの有望なＣＢＳＩは、より広い治療濃度域、優れた薬物動態学的／薬力学的特性、及びより良好な有効性を有するはずである。
本発明者らが作製した全てのＣＢＳＩは、様々な化学構造を有していたが、ＣＢＳＩは強力であり、ＭＤＲを克服することができ、ＣＢＳＩのうちのいくつかは、良好なバイオアベイラビリティさえ有していた。それらの中で、５ｍ及び５ｔによって表されるピリドピリミジン及びジヒドロキノキサリノン構造を有する本発明のＣＢＳＩは、メラノーマ、肺、及び乳癌を含むヒト癌細胞株のパネルに対して、一桁のＩＣ５０値で最も強力な抗増殖活性を示した（実施例９）。インビボ研究により、パクリタキセル耐性Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植モデルを使用して、皮下黒色腫の腫瘍増殖並びに肺及び肝臓への自然転移に対する５ｍ（４ｍｇ／ｋｇ）及び５ｔ（５ｍｇ／ｋｇ）の強力な有効性が確認された（例えば、図１０及び１１）。本発明者らは、５ｍ及び５ｔの構造を組み合わせることによって、５ｍ又は５ｔのいずれかよりも有効である新規ジヒドロキノキサリノン類縁体を得ることができると仮定した。ここでで、本報告では、本発明者らは、新しい類縁体５ｖを設計及び合成し、インビトロ及びインビボでの効力を評価した。Ｘ線結晶構造研究及び一団のインビトロ技術を通して、本発明者らは、５ｖが、ナノモル以下の濃度範囲で癌細胞増殖を阻害することができる強力なＣＢＳＩであることを確認した。本発明者らは又、Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植モデルを使用して、マウスの主要な臓器に毒性を引き起こすことなく、腫瘍増殖及び自然転移を阻害する５ｖのインビボ有効性も確認した。まとめると、本明細書で報告する結果は、５ｖがパクリタキセルに匹敵する抗増殖活性を有する有望なＣＢＳＩであり、パクリタキセル感受性又はパクリタキセル耐性癌の治療に使用できることを実証している。更に、５ｖは、１７ｙａ耐性を克服することができる本発明の他のＣＢＳＩと同じ生物学的プロファイルを有する。したがって、５ｖも１７ｙａ耐性を克服することができると予想することは妥当である。
細胞培養：コルヒチン、パクリタキセル、及びＡｚｉｘａ（
Figure 2024515727000041
）は、それぞれＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、及びＡＰＥｘＢＩＯ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬＬＣから購入した。ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５及びＲＰＭＩ－７９５１、並びにヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。黒色腫細胞株Ｍ１４及びＭ１４多剤耐性娘株Ｍ１４／ＬＣＣ６ＭＤＲ１は、Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＲｏｂｅｒｔ Ｃｌａｒｋｅ博士から贈与された。前立腺癌細胞株ＰＣ－３、ＰＣ－３／ＴｘＲ、ＤＵ－１４５、及びＤＵ１４５／ＴｘＲは、ミシガン大学のＤｒ．Ｅｖａｎ Ｋｅｌｌｅｒから贈与された。黒色腫及び乳癌細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及び１％抗生物質－抗真菌剤溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養した。パクリタキセル耐性Ａ３７５／ＴｘＲ及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＴｘＲ細胞を、パクリタキセルを含有する培地中で徐々にかつ連続的に培養することによって作製した。全ての細胞を５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。Ａ３７５／ＴｘＲ及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＴｘＲ細胞を、１００ｎＭパクリタキセルを含有する培地中で維持した。ＰＣ－３／ＴｘＲ及びＤＵ－１４５／ＴｘＲ細胞を、それぞれ１０ｎＭパクリタキセル又はドセタキセルを含有する培地中で保存した。タキサンは、実験の１週間前に培養培地から除去した。
細胞増殖阻害アッセイ：試験化合物の細胞増殖阻害効果を、前述したようにＭＴＳアッセイによって最初に決定した。手短に言えば、３０００～７５００個の細胞を９６ウェル細胞培養プレートに添加し、続けて播種及び一晩のインキュベーション後に試験化合物を４連で処理した（０．１ｎＭ～３μμＭ）。処理の７２時間後、ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、１．５～２時間インキュベートした後、吸光度を５９０ｎｍで測定した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって計算した。５ｖのコロニー形成阻害を、前述のようにＡ３７５／ＴｘＲ細胞でアッセイした。簡潔には、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞（１０００細胞／ウェル）を、０．５ｎＭ、１ｎＭ、又は２ｎＭの５ｖを含有する増殖培地で処理し、７日間にわたってインキュベートした（インキュベーション培地を３日毎に交換した）。固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色した後、細胞コロニーを、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡のＨｙｂｒｉｄ Ｃｏｕｎｔｉｎｇモジュールによって定量した。アッセイは３連で実施した。
チューブリン重合阻害アッセイ：インビトロチューブリン重合アッセイを、製造業者の説明書（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）に従って行った。簡潔には、１０μＭの５ｖをチューブリンタンパク質（３ｍｇ／ｍＬ、純度＞９９％）に添加し、混合物をマイクロプレートリーダーに移し、３７℃でインキュベートした。混合物の吸光度を３５０ｎｍで３０秒毎に１時間記録した。コルヒチン及びパクリタキセルを陽性対照として使用した。５ｖ処理Ａ３７５／ＴｘＲ細胞におけるαα－チューブリンの免疫蛍光染色を、前述したように実施した。簡潔には、カバーガラス上に播種したＡ３７５／ＴｘＲ細胞を、２ｎＭのコルヒチン、２ｎＭのパクリタキセル、１ｎＭの５ｖ、又は２ｎＭの５ｖで２４時間処理した。次いで、細胞をα－チューブリン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃６２２４０）と共にインキュベートし、続けて固定及び透過処理後にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートした。染色された微小管を観察し、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡で画像化した。アッセイは２連で行った。
Ｘ線結晶構造解析：を実施例５に記載されるように実施して、図２６に示されるように、５ｍ、１２ｅ、１２ｊ、１２ｋ、及び５ｖの結晶構造を決定した。
スクラッチ創傷アッセイ：５ｖの抗遊走効果は、以前に報告されたように、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３生細胞撮像装置を使用するスクラッチ創傷アッセイによって決定した。一晩インキュベートした後、単層のＡ３７５／ＴｘＲ細胞を、ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）によって引っ掻いて、細胞を５ｖ（０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、及び５ｎＭで４８時間処理した。創傷をＩｎｃｕＣｙｔｅによって２時間毎に画像化し、相対創傷密度をＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓｃｒａｔｃｈ Ｗｏｕｎｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｍｏｄｕｌｅによって計算した。アッセイは４連で実施した。
細胞周期分布及び細胞アポトーシスのフローサイトメトリー分析：１ｎＭ、２ｎＭ、及び５ｎＭ５ｖで２４時間処理したＡ３７５／ＴｘＲの細胞周期分布を、氷冷７０％エタノール中で一晩固定し、１００μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａと共に１時間インキュベートした後、ヨウ化プロピジウム染色によって決定した。次いで、細胞周期分布を、テネシー大学ヘルスサイエンスセンター（ＵＴＨＳＣ）のＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｃｏｒｅでＺＥ５ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって分析し、結果をＭｏｄＦｉｔ ＬＴソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ）によって処理した。細胞周期分析の同じ処理によるＡ３７５／ＴｘＲ細胞の細胞アポトーシスを、前述のＦＩＴＣアネキシンＶアポトーシス検出キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって決定した。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ａｎｄ Ｃｏ．）によって分析した。
インビボ抗腫瘍性試験：全ての動物試験は、ＵＴＨＳＣ動物実験委員会（ＡＣＵＣ）によって承認され、プロトコル（プロトコル番号１７－０５６）の下でＮＩＨ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの規則に従って実施した。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したＮｏｄ－Ｓｋｉｄ－Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウス（５～６週齢）を、１２：１２時間の明暗サイクルで制御された動物施設で飼育した。５ｖの耐用性を、少なくとも５日間連続して毎日、ＮＳＧマウスにおいて５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇを使用する腹腔内注射（ＩＰ）又は静脈内注射（ＩＶ）によって試験した。ＩＰ群では、各群に３匹のＮＳＧマウスを使用した。ＩＶ群では、４匹のＮＳＧマウスを各群に含めた。マウスの身体活動、呼吸、摂食、毛皮の状態、及び体重を毎日観察し、毒性の可能性のある徴候を監視した。異種移植モデルについては、ＦＢＳ及びフェノールレッドを含まない培地並びにＭａｔｒｉｇｅｌ（５０％／５０％）中に懸濁した２×１０６個のＡ３７５／ＴｘＲ細胞を、ＮＳＧマウスの右側腹部に皮下接種した。腫瘍が１００ｍｍ３に増殖したとき、マウスを無作為に４つの群に分けた（各群６匹のマウス）：ビヒクル（ＤＭＳＯ：ＰＥＧ３００：Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０：生理食塩水＝２：２０：５：７３）、５ｖ（２ｍｇ／ｋｇ）、５ｖ（４ｍｇ／ｋｇ）及びパクリタキセル（４ｍｇ／ｋｇ）処置群。５ｖ及びパクリタキセルをマウスに週２回、３週間連続して静脈内投与した。マウスの式体積＝（幅２×長さ）／２によって計算した腫瘍体積及び体重を週２回測定した。ビヒクル群の腫瘍体積が１５００ｍｍ３を超えたときに試験を終了した。マウスを安楽死させ、腫瘍及び主要臓器を迅速に切開し、更なる実験のために１０％緩衝ホルマリンで固定した。
組織学及び免疫組織化学（ＩＨＣ）分析：固定した腫瘍組織及び主要臓器（肺、肝臓、腎臓、心臓、及び膵臓）を、ＵＴＨＳＣ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅによってパラフィンに包埋し、４μμｍの厚さで切片化した。組織学的検査のために全ての腫瘍及び主要臓器に対してヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。代表的な画像を、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡によって取得した。前述したように、ＩＨＣ染色及び抗ヒトミトコンドリア染色を、ウサギ抗Ｋｉ６７（１：４００、＃９０２７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗ＣＤ ３１（１：１００、＃７７６９９、ＣＳＴ）、ウサギ抗切断型カスパーゼ－３（１：２００、＃９６６１、ＣＳＴ）及びマウス抗ヒト特異的ミトコンドリア（１：１０００、＃ａｂ９２８２４、Ａｂｃａｍ）を含む一次抗体を用いて実施した。ＩＨＣスライドをＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡によって画像化し、Ｋｉ６７、ＣＤ３１、切断型カスパーゼ－３、及びヒトミトコンドリア染色面積の定量化を、ＩｍａｇｅＪのＩＨＣ Ｐｒｏｆｉｌｅｒモジュールにより群あたり７個又は８個の代表的な視野によって定量化した。
統計解析：インビトロアッセイの独立群の解析のために、一元配置ＡＮＯＶＡ、続けて一対両側スチューデントｔ検定又はダネット多重比較検定を使用した。二元配置ＡＮＯＶＡ、続けてダネット多重比較検定を使用して、インビボ異種移植モデルの処置群を対照群と比較した。有意水準を＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。
５ｖ（実施例４に記載のように合成した）は、コルヒチン結合部位を標的とし、チューブリン重合を阻害した：５ｍ及び５ｔのＸ線結晶構造に基づいて（図６Ｅ～６Ｇ）、ピリミジンＢ環付近の大きなポケットがエチルアミン部分及び飽和シクロアルカンの両方を収容できることを見出した。したがって、５ｍ及び５ｔについての実施例４の手順に従って、５ｖを合成し、これらの化合物は、コルヒチン結合部位を標的とする強力なチューブリン重合阻害剤であることが照明されている。微小管に対する５ｖの効果を決定するために、まず、５ｖとコルヒチン結合部位との間の分子相互作用を特徴付けた図２６Ｅ）。
微小管ネットワークに対する５ｖのチューブリン重合阻害効果を確認するために、チューブリン重合アッセイをインビトロで実施した。３７℃でＤＭＳＯをチューブリン混合物に添加した後、対照群は、４０分以内にチューブリン集合体による３４０ｎｍでの吸光度の増加を示し、０．３のＡ３４０で安定化した（図２９Ａ）。パクリタキセルは、予想通り２０分以内に迅速なチューブリン重合を誘導し、約０．４のＡ３４０でチューブリン集合体を安定化した。既知のチューブリン重合阻害剤であるコルヒチンの効果と同様に、５ｖは、約０．０５のＡ３４０でインビトロでチューブリン集合体を阻害及び安定化させ、５ｖがチューブリン重合阻害剤であることが示唆された。又、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞を使用して、微小管系に対する５ｖの効果も特徴付けた。Ａ３７５／ＴｘＲ細胞は、Ａ３７５細胞のパクリタキセル耐性亜株であり、ｐ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）の過剰発現を有することが報告されており、コルヒチン及びパクリタキセルはＰ－ｇｐの基質であり、２ｎＭのコルヒチン又はパクリタキセルで処理したＡ３７５／ＴｘＲ細胞は、間期又は有糸分裂期のいずれかにおいて、未処理対照群と同様のインタクトな微小管ネットワークを示した図２９Ｂ。しかし、１桁のナノモル濃度では、５ｖはインタクトな微小管の組織化を破壊し、無秩序で拡散した微小管を誘導した。濃度１ｎＭでさえ、５ｖは、多極紡錘体の形成を誘導することができた（図２９Ｂ）。２ｎＭ５ｖは、有糸分裂期に入る全てのＡ３７５／ＴｘＲ細胞を阻害するようだったが、顕微鏡下で有糸分裂細胞を見つけることができなかった（図２９Ｂ）。
パクリタキセル感受性及びパクリタキセル耐性癌細胞株に対する５ｖの抗増殖効果：５ｖの増殖阻害効果を、図３０Ａに示すように、黒色腫細胞株Ａ３７５、Ｍ１４及びＲＰＭＩ－７９５１、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８、並びに前立腺癌細胞株ＰＣ３及びＤＵ１４５を含むヒト癌細胞株のパネルに対して最初に評価した。コルヒチン、パクリタキセル、及び現在臨床試験中であるＡｚｉｘａ（Ｎ－（４－メトキシフェニル）－Ｎ，２－ジメチルキナゾリン－４－アミン）を対照として使用した。５ｖは、試験した全ての癌細胞株に対して平均ＩＣ５０値が０．５ｎＭの非常に高い抗増殖効力を示した。５ｖの細胞毒性効果は、コルヒチン及びＡｚｉｘａよりも強く、固形腫瘍を治療するために使用される細胞傷害性抗癌剤であるパクリタキセルに匹敵した。次いで、パクリタキセル耐性癌細胞株（Ａ３７５／ＴｘＲ、Ｍ１４／ＬＣＣ６ＭＤＲ１、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＴｘＲ、ＰＣ３／ＴｘＲ、及びＤＵ１４５／ＴｘＲ）に対する５ｖの有効性を更に決定した。コルヒチン又はパクリタキセルの効力は限られている一方、５ｖは、試験された全てのパクリタキセル耐性癌細胞の増殖を阻害するのに、ＩＣ５０値がナノモルレベル以下で非常に有効な細胞傷害性を依然として維持し、Ａｚｉｘａよりも強力だった（図３０Ｂ）。全体として、本発明者らの結果から、５ｖが試験した全てのパクリタキセル感受性及びパクリタキセル耐性癌細胞の増殖を阻害することができ、パクリタキセル感受性細胞に対する５ｖの細胞傷害性がパクリタキセルと同様であることが示された。又、１つのパクリタキセル耐性細胞株Ａ３７５／ＴｘＲを使用して、５ｖの抗コロニー形成効果も決定した。図３０Ｃに示すように、５ｖ処理したＡ３７５／ＴｘＲ細胞におけるコロニーの数及びサイズは、対照細胞のものよりも有意に小さかった。５ｖは、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞コロニーの増殖を濃度依存的に阻害することができた。
５ｖは、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞の細胞遊走、細胞周期停止、及び最終的に細胞死を阻害した：細胞運動性は微小管構造に依存し、微小管標的剤は常に癌細胞のＧ２／Ｍ周期停止及び最終的に細胞死を引き起こすことが報告されており、５ｖはＡ３７５／ＴｘＲ細胞のコロニー形成の阻害において非常に強い細胞傷害性を示したので、本発明者らは、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞を使用して、細胞遊走、細胞周期分布、及び細胞アポトーシス誘導に対する５ｖの効果を評価し続けた。図３１Ａに示すように、５ｖは、一桁のナノモル範囲でＡ３７５／ＴｘＲ細胞の細胞遊走を阻害する顕著な効力を示した。５ｖは、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞の創傷治癒を濃度依存的に遅延させ、４８時間の５ｖ処理後に最大阻害効果を示した。更に、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ染色を使用したフローサイトメトリー分析から、未処理対照群と比較して、５ｖインキュベーション群は、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞のアポトーシス率の数を有意に増加させ、２ｎＭの濃度から開始して用量依存的に２８％から４２％に増加させたことが示された（図３１Ｂ）。更に、単一ＰＩ染色による細胞周期分析から、血清飢餓がなくても、５ｖ処理により、Ｇ２／Ｍ期で停止したＡ３７５／ＴｘＲ細胞の数を、５ｎＭの濃度で最大強度で劇的に増加することが示された（図３１Ｃ）。合わせると、５ｖは、１桁のナノモル濃度で、Ａ３７５／ＴｘＲ細胞に対して強力な抗遊走、アポトーシス促進、及びＧ２／Ｍ期停止効果を示した。
５ｖは、インビボでメラノーマ腫瘍増殖を強く抑制した：異種移植モデルにおける５ｖの効力を評価する前に、インビボ試験のための５ｖの安全な用量を見出すために簡単な耐用性試験を行った。健康なＮＳＧマウスを週５回の投与頻度で腹腔内処置する際に、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量を最初に使用した（図３６Ａ～３６Ｂ）。処置中、５ｍｇ／ｋｇ５ｖ処置群のマウスは依然として健康だったが、１０ｍｇ／ｋｇ５ｖ処置群のマウスは、毛がけばだち、体重が減少した。５日目に、１０ｍｇ／ｋｇ５ｖ処置群のマウスは死亡したか、又は不調のために安楽死させられたかのいずれかだったので、週５回のＩＰ注射による１０ｍｇ／ｋｇの５ｖ処置はマウスに毒性である。次いで、ＩＶ注射の潜在的毒性を決定するための用量として５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの５ｖを選択し、投与頻度として週２回を選択した。結果から、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの両方は週２回のＩＶ注射経由で安全であることが分かった（図３６Ｃ～３６Ｄ）。以前の研究から、５ｖ、５ｍ及び５ｔの親化合物は、パクリタキセル耐性Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植片の増殖を阻害するのに非常に強力であることが示された。５ｖの効果を５ｍ及び５ｔと比較するために、Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植モデルも使用して、５ｖの抗腫瘍効果を評価した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したとき、マウスを腫瘍体積及び体重に従って無作為化し、ビヒクル、２ｍｇ／ｋｇ５ｖ、４ｍｇ／ｋｇ５ｖ、又は参照化合物パクリタキセル（４ｍｇ／ｋｇ）を３週間の処置まで週２回静脈内投与した。図３２Ａに示すように、パクリタキセル処置群では有意な腫瘍抑制効果を有さなかった一方、５ｖ処置では、特に４ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍体積を有意に減少させた。２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇ５ｖ処置の腫瘍増殖阻害値は、それぞれ６２．３％及び７６．６％に達した。全ての処置群で体重減少は観察されず、このＡ２７５／ＴｘＲ異種移植モデルのマウスに対して、２種類の用量の５ｖが耐容性であることが示唆された（図３２Ｂ）。更に、ビヒクル群と比較して、２ｍｇ／ｋｇ５ｖで処置したマウスは腫瘍重量が４７．４％減少し、一方４ｍｇ／ｋｇ５ｖで処置したマウスは腫瘍重量が５９．９％減少し、高用量の５ｖの方が腫瘍増殖に対して良好な阻害効果を有することが示された（図３２Ｃ～３２Ｄ）。
更に、Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植試験の腫瘍を切除し、腫瘍壊死の程度を調べるためにＨ＆Ｅ染色を実施した。図３３Ａに示すように、Ｈ＆Ｅ染色組織の画像から、ビヒクル処置又はパクリタキセル処置腫瘍と比較して、５ｖ処置腫瘍の方が壊死細胞が多いことが示され、５ｖはＡ３７５／ＴｘＲ腫瘍壊死を誘導することができることが示唆された。腫瘍細胞増殖、血管新生、及びアポトーシスに対する５ｖのインビボでの効果を更に確認するために、Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植モデルにおいて獲得された腫瘍のＫｉ６７、ＣＤ３１、及び切断型カスパーゼ－３の発現を検出するためＩＨＣ染色を実施した。Ｋｉ６７及びＣＤ３１発現は、ビヒクル又はパクリタキセルで処置したものと比較して、５ｖ処置腫瘍において有意に減少し、５ｖがマウス担持腫瘍において腫瘍増殖及び血管新生を有意に阻害したことが示された（図３３Ａ～Ｂ）。しかしながら、パクリタキセル処置腫瘍では、ビヒクル群と比較してＫｉ６７発現がわずかに上昇し、一方ＣＤ３１発現には有意な変化がなかった（図３３Ｂ）。更に、切断型カスパーゼ－３のＩＨＣ染色結果は、５ｖ（２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ）が５ｖ処置腫瘍における切断型カスパーゼ－３陽性細胞の割合を用量依存的に有意に増加させたことを示し、５ｖがインビボでアポトーシス促進効果を有することが示唆された（図３３Ａ～Ｂ）。まとめると、これらのデータから、５ｖは、微小管重合阻害剤として、腫瘍増殖を阻害し、腫瘍血管新生を標的とし、アポトーシスを誘導することによって腫瘍増殖を阻害することが実証される。
５ｖは、腫瘍臓器に対する明らかな毒性無しに、Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植／ＴｘＲ異種移植片の自然転移を阻害した：本発明者らが新たに確立したＡ３７５／ＴｘＲ異種移植モデルは、肺及び肝臓への自然転移を有することが示された。したがって、本研究では、自然転移の阻害における５ｖの有効性も調べた。マウスを解剖したとき、ほとんど全てのマウスの腋窩リンパ節が増殖しているのを見出した。そこで、全ての腋窩リンパ節を収集し、画像化した（図３４Ａ）。視覚的には、５ｖは腋窩リンパ節への腫瘍転移を潜在的に阻害することができた。更に、転移は、ビヒクル又はパクリタキセル処置群の全肺において広く検出され、一方５ｖ（２ｍｇ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇ）処置群では、肺における腫瘍結節の数及びサイズが有意に減少した（図３７）。更に、マウス肺又は肝臓のＨ＆Ｅ染色から、代表的な画像の黄色矢印によって示されるように、５ｖは自然肺転移又は肝転移を有意に阻害することが示された（図３７）。図３４Ｂ～３４Ｃ及び代表的な抗ミトコンドリア染色された肺又は肝臓画像（図３４Ｄ）に示すように、２ｍｇ／ｋｇ５ｖ及び４ｍｇ／ｋｇ５ｖの両方が、ビヒクルと比較して肺又は肝転移を有意に阻害し、５ｖがＡ３７５／ＴｘＲ腫瘍の増殖に対して有効であるだけでなく、リンパ節、肺、及び肝臓への腫瘍転移も有意に阻害することが示された。
２ｍｇ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇの用量の５ｖが急性毒性を有さないことを示した（図３２Ｂ）。５ｖが主要臓器に対して毒性を有するかどうかを決定するために、主要臓器（心臓、腎臓、及び脾臓）をＨ＆Ｅで染色することによって５ｖの毒性を更に調査したのは、本試験のマウスの肺及び肝臓の両方がＡ３７５／ＴｘＲ腫瘍塊を有し、臓器の損傷に対する転移の影響を排除することが困難であるためである。結果から、５ｖ（２ｍｇ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇ）処置の３週間後、マウスの主要臓器に明らかな損傷はなく、５ｖによって処置された臓器は、ビヒクル及びパクリタキセル処置臓器のＨ＆Ｅ染色結果と同様であることが示された（図３５）。結論として、５ｖは、インビトロ及びインビボの両方で強力な抗腫瘍有効性、抗自然転移活性、及び低い毒性を示し、更なる研究に値する。
考察：新規ＣＢＳＩを発見する本発明者らの努力において、新規チューブリン重合阻害剤として５ｖを同定した。以前の研究（実施例５）において、５ｍ及び５ｔの両方が、インビトロ及びインビボで非常に強い抗増殖有効性を有することを報告した。したがって、５ｍのメチル部分を５ｔのエチルアミン部分で置換することによって設計された５ｍ及び５ｔの新しい類縁体が、５ｍ又は５ｔよりも高い細胞傷害性及び効力を得ることができると仮定した。全てのインビトロ又はインビボ実験を実施する前に、Ｘ線結晶構造解析、チューブリン重合アッセイ、及び免疫蛍光アッセイを使用した、新たに合成された５ｖがＣＢＳＩであるかどうかを検証した。予想通り、５ｖはコルヒチン結合部位を標的とし、チューブリン重合を阻害することができた（図２９Ａ）。以下のＭＴＳ及びコロニー形成アッセイから、５ｖが５ｍ又は５ｔよりも細胞傷害性抗増殖活性が高く、本発明者らが仮定したように、癌細胞及びパクリタキセル耐性亜株のパネルに対してナノモル濃度以下のＩＣ５０値を有することが実証され（図３０）、５ｖの効力は、臨床において固形腫瘍を処置するために使用される抗癌剤であるパクリタキセルと同様だった。次いで、スクラッチアッセイ、アネキシンＶ／ＰＩ染色、及び細胞周期分析実験を実施して、細胞遊走、細胞アポトーシス、及び細胞周期停止などの細胞増殖阻害の他の態様に対するＣＢＳＩとしての５ｖの効果を更に確認した。実際に、５ｖは、タクサン耐性Ａ３７５／ＴｘＲ細胞において遊走阻害、細胞周期停止、及びアポトーシスを誘導した（図３１）。
更なるインビボ試験から、５ｖが、急性毒性を引き起こすことなくＡ３７５／ＴｘＲ異種移植片の増殖を用量依存的に阻害することができたことた示され、本試験における腫瘍のＨ＆Ｅ染色から、５ｖ（２ｍｇ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇ）はインビボで腫瘍壊死を誘導することが実証された（図３２及び図３３Ａ）。更に、細胞増殖マーカーＫｉ６７、予後血管新生マーカーＣＤ３１、及びアポトーシスマーカー切断型カスパーゼ－３を使用するＩＨＣ染色は、ビヒクル又はパクリタキセル処置腫瘍と比較して、５ｖ処置腫瘍において全ての用量の５ｖ処置が、Ｋｉ６７陽性面積及びＣＤ３１陽性面積の割合を有意に減少させ、切断型カスパーゼ－３陽性面積の割合を用量依存的に増加させたことを示した（図３３）。しかしながら、５ｖのインビトロ細胞傷害性とは異なり、５ｖは、５ｍよりも弱いインビボ有効性を示し（２ｍｇ／ｋｇ：５ｍの７０．５％に対して６２．３％の腫瘍増殖阻害；４ｍｇ／ｋｇ：５ｍの８８．２％に対して７６．６％の腫瘍増殖阻害）、５ｔと同様の効力を示し（２ｍｇ／ｋｇ：５ｍの６４．６％に対して６２．３％の腫瘍増殖阻害；４ｍｇ／ｋｇ：５ｔの７８．４％に対して７６．６％の腫瘍増殖阻害）、これは、予想したものとは異なる。インビボで５ｖ効力の低下を引き起こす１つの理由は、低い代謝安定性であってもよい。
表７に示すように、ヒト肝ミクロソームでは５３．６分、ラット肝ミクロソームでは８．０分、及びマウス肝ミクロソームでは１４．４分の半減期を有する５ｍと比較して、５ｖは、代謝安定性の改善は示されず、むしろ、ヒト肝ミクロソーム（２４．７分）、ラット肝ミクロソーム（３．６分、図示せず）及びマウス肝ミクロソーム（６．３３分）の半減期が減少した。
更に、ヒト、ラット、及びマウス肝ミクロソーム中の５ｖのクリアランス速度は、５ｍよりも高く、５ｖの代謝安定性を更に弱めた。インビボでの低い代謝安定性にもかかわらず、５ｖは依然として、５ｖのエチルアミン部分を介して抗体－薬物複合体のペイロード又はナノ粒子の担持薬物として使用することができるナノモル以下の有効性を有する有望なＣＢＳＩである。
同時に、５ｖが、皮下腫瘍に由来する腋窩リンパ節、肺、及び肝臓への自然転移を阻害することができることも証明した（図３４及び図３７）。しかしながら、図３４Ａに示すように、ビヒクル群には、腋窩リンパ節が増殖しなかったマウスが１匹いた。そのマウスの肺及び肝臓を収集したとき、肺又は肝臓に存在する腫瘍結節の数及びサイズがビヒクル群の他のマウスのものよりも大きいことを見出し、この特定のマウスは、腋窩リンパ節に入る自然転移は欠乏している可能性があるが、肺又は肝臓への移動を好むことが示唆される（図３８）。したがって、ビヒクル群の肺又は肝臓に存在する自然転移の面積を評価する場合、このマウスを除外した。したがって、５ｖは、原発腫瘍の増殖を抑制するのに有効であっただけでなく、２又は４ｍｇ／ｋｇの用量で転移を阻害するのにも強力であった。そして５ｖは、前立腺癌、肺癌、及び卵巣癌などの多くの他の固形腫瘍型についての更なる調査に値する。本発明者らの以前の研究により、１７ｙａ、５ｍ及び５ｔ、並びに５ｖによって表されるＣＢＳＩが、肝臓への腫瘍転移を効率的に抑制することができることが分かり、肝転移の阻害におけるＣＢＳＩの潜在的な役割が示唆され、更なる研究に値する。Ｈ＆Ｅ染色を使用した５ｖの毒性の更なる評価により、５ｖは、２回／週の静脈内２ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇの用量で、主要臓器に対する毒性を有さないことが実証された（図３５）。耐用性試験から、５ｖは、１０ｍｇ／ｋｇを週２回静脈内投与した場合に急性毒性を有さないことが示された（図３６）。５ｖは、インビボにおいて同じ用量レベルでは、５ｍほど有効ではなかったが、より高い用量（５ｍｇ／ｋｇ）を適用した場合に毒性を有した５ｍよりも安全であり、５ｖの知見に基づく新たなＣＢＳＩの開発を更に支持した。
結論として、以前に報告したＣＢＳＩ５ｍ及び５ｔの類縁体を合成し、それを５ｖと命名した。次いで、５ｖの高分解能Ｘ線結晶構造を得て、それをチューブリン重合を阻害することができるＣＢＳＩとして同定した。又、５ｖがインビトロで様々な癌細胞株の増殖を効果的に阻害し、パクリタキセル耐性を克服し、癌細胞遊走を阻害し、細胞アポトーシス及びＧ２／Ｍ細胞周期停止を誘導する効果を有することも示した。更に、インビボ試験から、５ｖがマウスの主要臓器に毒性を引き起こすことなく、Ａ３７５／ＴｘＲ異種移植マウスモデルにおいて強い抗腫瘍及び抗自然転移有効性を有することが示された。したがって、５ｖの前臨床評価は、次世代細管阻害剤としての５ｖの開発を強く支持し、更なる調査に値する。
実施例１１：本発明のジヒドロキノキサリノンによる頭頸部癌の処理
ジヒドロキノキサリノンのパネルを、２種類の頭頸部癌細胞株、Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２で試験した。Ａ－２５３細胞はヒト唾液類表皮癌細胞株であり、一方、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２は頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）である。口腔癌は、最も一般的なタイプの頭頸部癌であり、口腔癌の９０％超が、口腔又は中咽頭扁平上皮癌（ＳＣＣ）のいずれかである。主要な臨床的ジレンマは、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を標的とした化学療法効率である。進行期のＨＮＳＣＣ並びに／又は従来の化学療法及び／若しくは放射線療法に対するＳＣＣ細胞の耐性に起因して、標準的な外科的手法を利用して癌治療を首尾よく完了することができないことにより、細胞増殖抑制活性及び軽微な副作用を有する新規化合物の探索が継続される。
本実験では、４個の化合物（ＳＰ－Ｉ－１０４、５ｍ、１２ｋ、及び５ｖ ＨＣｌ）のインビトロ細胞傷害性を、２種類の頭頸部細胞株Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２にわたって試験した。図３９Ａに見られるように、４個の化合物のうちの３個（５ｍ、１２ｋ、及び５ｖ ＨＣｌ）は、低ｎＭから高ｐＭレベルのＩＣ５０細胞傷害性値を生じ、頭頸部癌の増殖を強力に阻害する能力を示唆した。例えば、ＩＣ５０値は、これらの３個の化合物について０．５２ｎＭ～３．２ｎＭの範囲だった。図３９Ｂ及び３９Ｃは、データのグラフ表示を示す。これらの予備スクリーニング実験から、１２ｋを更なる調査のためのリードとして選択し、構造的に関連のないＣＢＳＩ化合物１７ｙａと比較した。これらの実験では、１２ｋは予想外にも、Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞株の両方において、化合物１７ｙａと比較して（図４０Ｃ及び４０Ｄ）、約１０倍優れた効力を有した（図４０Ａ及び４０Ｂ）。例えば、０．５ｎＭという低い処理濃度では、１２ｋは頭頸部癌細胞増殖をほぼ完全に抑制することができ、一方１７ｙａが同様の抗増殖性を達成するためには５ｎＭを必要とした。結果を図４０Ａ～Ｄにグラフで示す。同様に、１２ｋは又、図４１Ａ及び図４１Ｂにそれぞれ示すように、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞では２ｎＭに対してＡ－２５３細胞では１ｎＭで見られるほぼ完全な阻害でコロニー形成を抑制する強力な能力を実証した。
更に、試験した頭頸部癌細胞型においてアポトーシスが経時的に誘導されることを実証したウェスタンブロット分析によって、抗有糸分裂作用機序を確認した。これらの細胞株を１００ｎＭの１２ｋで７２時間処理することにより、ＰＡＲＰ（ｃ－ＰＡＲＰ）及びｃａｓ ３（ｃ－ｃａｓ ３）の切断などのアポトーシスマーカーのレベルが上昇した。図４２Ａ及び図４２Ｂは、それぞれ細胞株Ａ－２５３及びＤｅｔｒｏｉｔ ５６２についてのこれらの結果をグラフで示す。このデータから、頭頸部癌における抗癌活性が、これらの化合物の既知のコルヒチン結合部位阻害剤の作用機序と一致するアポトーシスの誘導を介して作用することが示唆された。
実施例１２：５ｖ及び５ｖ ＨＣｌの合成
化合物５ｖ（４－（２－（エチルアミノ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン）を、図４３に示すスキームによって合成した。
化学：４－クロロ－２－（メチルチオ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン１４（Ａｗａｒｅ，ｅｔ ａｌ．，「Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌ－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｂａｓｅｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔ ＩＧＦ－１Ｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，」Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５，９２，２４６－２５６）は、ヒドロキシピリミジン（３）及びエチル２－オキソシクロペンタンカルボン酸（１）から得て、この化合物（４）を、乾燥ＩＰＡ中、触媒量のＨＣｌ（３～４滴）の存在下で４－メトキシ－２－ニトロアニリン（５）とカップリングさせて、２－メチルチオ４－（４－メトキシ－２－ニトロフェニル）アミノピリミジン（６）を良好な収率で得た。（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ，「Ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｌｅａｄ ７－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－（２－ｍｅｔｈｙｌｑｕｉｎａｚｏｌｉｎ－４－ｙｌ）－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ－２ （１Ｈ）－ｏｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｔｕｂｕｌｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｕｍｏｒ－ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ，」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１７，６０，５５８６－５５９８．）。次いで、０℃の触媒ＡｃＯＨ中の亜鉛粉末を用いてニトロ基をアミン７に還元した。得られたアミンを直ちにクロロアセチルクロリドとカップリングさせて８を生成した。次に、化合物８を無水ＴＨＦ中ＮａＨの存在下で分子内環化させて中間体９を得、これをメタノール及び水中のオキソンの存在下で酸化して１０を得た。最後に、無水１，４－ジオキサンの存在下、１００～１１０℃で、１０のピリミジン環上のスルホン基をエチルアミンで置換して、５ｖを得た。
一般的方法
全ての非水性反応は、乾燥窒素の不活性雰囲気下でオーブンで乾燥したガラス器具中で実施した。全ての試薬及び溶媒は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌｆａ－Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ａｒｋ Ｐｈａｒｍ（Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入し、更に精製することなく使用した。分析用薄層クロマトグラフィーは、シリカゲルＧＨＬＦ １０ｃｍ×２０ｃｍ Ａｎａｌｔｅｃｈ ＴＬＣ Ｕｎｉｐｌａｔｅｓ（Ａｎａｌｔｅｃｈ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）で実施し、ＵＶ光下で蛍光消光によって可視化した。シリカゲル（６０～１２０又は１００～２００メッシュ）を使用して化合物を精製した。１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ－５００分光計（４００ＭＨｚ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）又はＢｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ ４００（４００ＭＨｚ）（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）分光計で記録した。化学シフトはδスケールでｐｐｍで報告され、適切な溶媒残留ピーク（ＣＤＣｌ３、１Ｈでは７．２７ｐｐｍ及び１３Ｃでは７７．２３ｐｐｍ並びにＤＭＳＯ－ｄ６、１Ｈでは２．５０ｐｐｍ及び１３Ｃでは３９．５１ｐｐｍ）を参照し、全てのカップリング定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）で与えられる。質量スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ａｍａｚｏｎ ＳＬエレクトロスプレー／イオントラップ装置で、ポジティブモード及びネガティブモードで収集した。高分解能質量分析計（ＨＲＭＳ）データは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＩクラスＵＰＬＣシステムを備えたＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ ２－ＳｏＱＴＯＦ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）システムで取得した。ブタ脳チューブリン（カタログ番号Ｔ－２３８Ｐ）は、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．から購入した。全ての試験化合物の純度は、１Ｈ ＮＭＲ及びＨＰＬＣによって≧９５％であると決定された。純度を決定するために使用したＨＰＬＣ法は以下の通りである。化合物純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ製のＺｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ１８カラム、粒径３．５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して分析した。移動相は、０．１％ギ酸を含む水（Ａ）及び０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（Ｂ）から成る。流速１ｍＬ／分を使用した。勾配溶出は、５０％Ｂで開始した。０～９分で１００％Ｂに到達し、９～１２分でこれを維持し、次いで１２～１５分で５０％Ｂに減少させ、停止した。化合物純度を、２５４ｎｍに設定したＤＡＤ検出器で監視した。
化学合成：
４－（２－（エチルアミノ）－６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［ｄ］ピリミジン－４－イル）－７－メトキシ－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン（５ｖ－ＨＣｌ）の合成。１，４－ジオキサン中の１０（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、エチルアミン（３６ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）の混合物を、封管中で６時間１１０℃に加熱した。混合物を氷水に注ぎ、固体を濾過によって収集し、水（５×１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、オフホワイトの固体として純粋な塩を含まない５ｖ（８０ｍｇ）を得た。エーテルＨＣｌ（エーテル中０．５Ｍ ＨＣｌ）０．５２ｍＬ（１．１ｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２中の第二級アミン５ｖの溶液に添加し、Ｎ２雰囲気下、室温で５時間撹拌した。次いで、溶媒を除去し、得られたアミンの塩酸塩５ｖ－ＨＣｌを高真空下で乾燥させ（５０ｍｇ、収率５６％）、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１０．８４（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｂｓ，２Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６５－６．６３（ｍ，２Ｈ），３．８８（ｂｓ，１Ｈ），３．７６－３．７２（ｍ，４Ｈ），３．４４－３．４１（ｍ，２Ｈ），２．８３（ｂｓ，１Ｈ），２．０８（ｂｓ，１Ｈ），１．８８（ｂｓ，２Ｈ），１．１８（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１６７．５６，１５８．４８，１３３．９２，１２５．１８，１１９．２９，１０７．３８，１０２．１１，５５．９０，４９．７０，３６．５０，３１．１８，２２．４４，１４．７５；ＨＲＭＳ［Ｃ１８Ｈ２２Ｎ５Ｏ２ ＋］計算値３４０．１７７３、実測値３４０．１７７７；ＨＰＬＣ純度９７．０％、２１０～２１１℃で分解する。
実施例１３：本発明の脳透過性化合物を用いた、脳に転移した（ＢｒｎＭｅｔｓ）転移性乳癌（ＭＢＣ）の治療
ＭＢＣ治療の課題及びＦＤＡ承認チューブリン阻害剤の制限：乳癌療法の著しい進歩にもかかわらず、転移性乳癌（ＭＢＣ）の有効な治療は依然として困難である。ＭＢＣ全体における主要な転移部位には、骨（４１％）、肺（２２％）、肝臓（８％）及び脳（７％）が含まれる。これらの主要な転移部位における正確な分布は、特定の乳癌分子サブタイプに依存するが、最も頻度の高い部位は骨であり、治療が最も困難な部位は脳である。全体として、ＥＲ陰性ＭＢＣ（ＴＮＢＣ又はＨＥＲ２陽性）の女性の約７０％は、任意の他の部位での転移との診断から５年以内に脳転移（ＢｒｎＭｅｔｓ）を発症し、一方ＥＲ陽性ＭＢＣは、転移負荷が最終的にＢｒｎＭｅｔｓを起こすことができるはるかに大きな患者集団である。骨破壊性病変（溶骨性）の患者は、骨折及び慢性疼痛に特になりやすい。外科的切除が標準治療である肝転移を除いて、全身療法は、ステージＩＶ患者の主要な治療選択肢であり、有効性は限られている。したがって、ＭＢＣ転移、特に脳転移（ＢｒｎＭｅｔｓ）及び骨転移の有効な治療のための新しい全身／標的療法を開発することには、重大なアンメットメディカルニーズが存在する。
パクリタキセル（タキソール）及びドセタキセル（タキソテール）などのチューブリン阻害剤は、古典的な全身性薬剤であり、転移性疾患を有する患者を治療するために広く使用されている。チューブリンの３個の最も特徴付けられた結合部位は、タキサン部位、ビンカ部位及びコルヒチン部位である。現在、癌治療のための全てのＦＤＡ承認チューブリン阻害剤は、タキサン部位（例えばタキソール）又はビンカ部位例えばビンブラスチン）のいずれかに結合する。しかしながら、チューブリン阻害剤の臨床的使用にはいくつかの制限が伴う。第１に、チューブリン阻害剤は通常、Ｐ糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）、乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）、又は多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）を含む薬物排出ポンプの良好な基質である。チューブリン阻害剤は又、β３－チューブリン過剰発現媒介耐性になりやすい。従って、多剤耐性（ＭＤＲ）は、長期間の薬物投与時に発現することが多い。より新しいタキサン（例えば、カバジタキセル）は、Ｐ－ｇｐ媒介性薬物流出の影響を受けにくいが、依然としてβ３－チューブリン媒介薬剤耐性の影響を受けやすいままである。第２に、承認されたチューブリン阻害剤は、用量制限造血毒性、及び末梢神経障害を含む累積神経毒性を有し、治療濃度域が狭い。第３に、これらの承認された薬剤は水溶性が低く、製剤中に界面活性剤（例えばクレモフォールＥＬ）の使用を必要とする。界面活性剤は、さらなる副作用をもたらしてもよく、コルチコステロイド／抗ヒスタミン剤による前投薬を必要としてもよい。新たなデータから、コルチコステロイドがトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）において腫瘍促進性ストレス応答経路を活性化し、癌幹細胞様活性を強化することが示唆される。パクリタキセルの経口製剤（Ｏｒａｘｏｌ）及び化学修飾パクリタキセル（テセタキセル）を含む新世代のタキサン薬を開発する努力がなされてきたが、おそらくタキサン骨格固有の制限のために、両方とも２０２１年初期にＦＤＡ承認に失敗した。チューブリン阻害剤はステージＩＶの乳癌に対する第一選択薬であるため、より効果的な治療のための新規チューブリン阻害剤を開発する強い臨床的必要性がある。コルヒチン結合部位阻害剤（ＣＢＳＩ）の本発明の化合物は、タキサン及びビンカ、並びにそれらの変異体の治療上の制限限界を欠く抗チューブリン剤として強力に作用する。
本明細書に提示される研究では、ＭＢＣ脳転移（ＢｒｎＭｅｔｓ）治療のためのタクサン耐性も克服することもできる、強力及び脳透過性が高いチューブリン阻害剤を作製するための構造最適化に焦点を当てた。この能力は、ＭＢＣ患者だけでなく、チューブリン阻害剤が現在使用されている他の癌型の患者についても、生存期間を延長し、ＱＯＬを改善する。タキサン感受性及びタキサン耐性細胞株、並びにタキサン感受性及びタキサン耐性ＰＤＸモデルに由来する初期継代細胞、並びに正常細胞を含む、ＴＮＢＣ及びＨＥＲ２＋従来の細胞株のパネルを使用して、インビトロで新しい類縁体をスクリーニングした。又、下流のインビボ有効性試験のための最良の化合物を選択するために、このシリーズにおける最も活性な化合物についての脳透過性、最大耐用量（示さず）、及び最適な薬物動態（ＰＫ）を決定した。インビボ評価のための全体的に最良の化合物として、他の実施例の化合物から５ｍを選択した。インビボ評価には、処置に応答した転移進行の遅延及び全生存期間（ＯＳ）の増加についてスコア化するために、心臓内注射後にＢｒｎＭｅｔｓを発生させるタクサン感受性の十分に特徴付けられた前臨床モデル（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＢｒＭ２亜系統）を使用することを含めた。ＢｒｎＭｅｔｓ負荷及び進行を低減すると、ＭＢＣ患者のＰＦＳ、ＯＳ及びＱＯＬを有意に改善する可能性が高い。更に、チューブリン阻害剤が現在標準治療（ＳＯＣ）である他の種類の転移性固形腫瘍と診断された患者も又、本発明から利益を得ることもある。
本明細書で提示されるＢｒｎＭｅｔｓデータは、３種類の実験に分けられる：１）脳対血漿中濃度比（Ｂ／Ｐ）によって測定される５ｍの脳透過の決定、２）ビヒクルと比較した５ｍによる転移進行の遅延を測定したもの（全ての動物を同じ時点で安楽死させた）、及び３）ビヒクルと比較した５ｍによるＯＳの比較（転移により瀕死のときに動物を安楽死させた）。
本発明の化合物でのＢ／Ｐ比の増加。血液脳関門透過試験では、雄ＮＳＧマウスに４ｍｇ／ｋｇの５ｍ（マウス４匹）又は１２ｋ（マウス３匹）のいずれかを尾静脈注射により静脈内投与した。１時間後、マウスを麻酔し、心臓穿刺によって血液を採取し、生理食塩水で灌流して脳内の全ての血液を除去した後、脳試料を採取した。血液試料の血漿を遠心分離によって処理した。脳試料を、ホモジナイズ緩衝液（１：２メタノール：ＰＢＳ）を１：９（１ｇの脳組織対９ｍＬの緩衝液）の比で使用してホモジナイズした。確立されたプロトコル［ＰＭＩＤ：２２７６０６５９］に従って、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析まで組織試料を－８０°Ｃに維持した。血漿（Ｐ）に対する脳（Ｂ）中の５ｍ又は１２ｋの濃度（ｎＭ）比を、Ｂ／Ｐ分布が５ｍでは４．５６、１２ｋでは０．４５と決定されたように定義する（図４４）。比較として、化合物１７ｙａ（ヌードマウスで評価した）は、はるかに低い脳透過性を有する（１７ｙａのＢ／Ｐ比は、１時間でわずか０．０５４及び４時間で０．０８９である、［ＰＭＩＤ：２２７６０６５９］）。
ほとんどの乳癌患者は腫瘍転移で死亡し、したがって、転移性乳癌（ＭＢＣ）のための長期的治療は、転移の治療において良好な有効性を有する必要がある。ＭＢＣ転移の４箇所の主要な部位（骨、肺、肝、及び脳）の中でも、脳転移（ＢｒｎＭｅｔｓ）は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する薬物利用可能性の必要性のため、治療が最も困難な部位である。化合物１７ｙａは、限られたＢＢＢ透過性を有し、したがって、ＢｒｎＭｅｔｓの治療に最適である可能性は低い。興味深いことに、強力なＣＢＳＩであるＡｚｉｘａは、脳内に迅速かつ広範囲に分布し、血漿と比較して１４倍高い脳曝露及び血漿と同様の排出半減期を示す［ＰＭＩＤ：１９２９６６５３］。Ａｚｉｘａは、毒性代謝物のために癌治療薬としては失敗したが、炭素－１１で放射標識されたバージョンは、非常に高い脳透過能力のために、神経変性疾患用途のＰＥＴ造影剤として現在臨床試験中である（例えば、ＮＣＴ０４５７５７２７）。１７ｙａ（代謝的に安定であり、良好な安全性プロファイルであるが、脳透過性は低い）及びＡｚｉｘａ（強力で優れた脳透過性であるが、代謝的に不安定であり、心臓及び肝臓に対して高い毒性を有する）との適切なハイブリダイゼーションは、限界を「ダイヤルアウト」し、代謝的に安定であり、毒性が低く、脳透過性のＣＢＳＩを生成すると仮定した。広範な医薬品化学により、実施例全体を通して例示されるジヒドロキノキサリノンの骨格を見出し、５ｍをＢｒｎＭｅｔｓの治療のための現在のリードとした（図４５）。５ｍは、タキサン耐性を克服する能力を維持し（図１０Ａ～１０Ｄ、１３Ａ～１３Ｄ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｅなどを参照する）、４．５６という高い脳対血漿（Ｂ／Ｐ）分布比を有する（ＮＳＧマウス、４ｍｇ／ｋｇ、ＩＶボーラス、ｎ＝４、詳細については前段落を参照する）。更に、図１９Ｃから、５ｍは、ＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＶｘＲにおいて１７ｙａに対する耐性を克服することができることが実証される。
Figure 2024515727000042
これらの結果から、５ｍ及び本発明の他の化合物は、標準治療の化学療法とは異なり、ＭＢＣ ＢｒｎＭｅｔｓを効果的に治療するための必要条件である脳内の作用部位に到達することができることを示された。更に、タキサン／ビンカ耐性機構及び１７ｙａ耐性機構に対する感受性の欠如のため、本発明の化合物は、複数の治療歴を有する患者がタキサン、ビンカ及び／又は１７ｙａ治療にすでに失敗していたとしても、これらの患者のＢｒｎＭｅｔｓを治療することができる。
マウスの脳への乳癌転移の増殖に対する本発明の化合物の効果。
５ｍによる脳透過性の実証の後、ＢｒｎＭｅｔｓを優先的に誘導するための心臓内（ＩＣ）注射後に広く使用されているＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＢｒＭ２（ＢｒＭ２）細胞株を使用して、脳へのＭＢＣ転移を防止し、ＢｒｎＭｅｔｓ進行を治療する能力を試験した（ＰＭＩＤ：１９４２１１９３）。マウスの乳癌ＢｒｎＭｅｔｓを富化するための最も効率的な方法は、重度免疫不全ＮＳＧマウスへの腫瘍細胞の単細胞懸濁液の心臓内（ＩＣ）注射によるものである。実施例を通して示されるように、５ｍ及びその類縁体は、多くのタキサン耐性モデルを含む広範な抗癌活性を有する。例えば、ＴＮＢＣの一般的に使用されるモデルは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株（図３０Ａ参照）及びそのタキサン耐性亜株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＴｘＲ（図３０Ｂ参照）である。
ＢｒｎＭｅｔｓと診断されたＭＢＣ患者の約９５％が、少なくとも１つの他の部位、多くの場合、複数の頭蓋外部位（例えば、骨、肝臓及び肺）に転移を有するという臨床所見と一致して、ＢｒＭ２モデルは迅速にＢｒｎＭｅｔｓを生成するが、経時的に他の転移部位も発症する。死亡率は、ＢｒＭ２モデルのＢｒｎＭｅｔｓによって主に駆動される。重要なことに、ＢｒＭ２モデルは、ルシフェラーゼレポーターを発現して、ＰＭＩＤ：３１６４５４４１の方法を使用して経時的な転移パターンの長期的バイオイメージング及び追跡を可能にする。全てのバイオイメージングデータは、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して計算された総光束（ｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ）（光子／秒）として示される。採取時に、全ての臓器を収集し、エクスビボでバイオイメージングして、インタクトなマウスにおいて観察された転移シグナルの位置を確認し、その臓器に特異的な転移負荷を定量化した。
興味深いことに、パイロット研究において、５ｍは、２３１－ＢｒＭ２ ＢｒｎＭｅｔ負荷を減少させた（示される総光束のバイオイメージング；全てのマウスを処置の２８日後に採取した）（図４６Ａ参照）。
手順：実験１では、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＢｒＭ２（ＢｒＭ２）脳転移濃縮亜系統をＭｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｒｅ（ＭＳＫＣＣ）から入手した。合計２００，０００個の細胞を８～９週齢のＮＳＧ雌マウスにＩＣ注射した。４８時間後に２回／週のＩＶ投与で治療を開始した。初期用量は１．５ｍｇ／ｋｇであったが、マウスの体重が減少し、下痢があったので、用量を１．０ｍｇ／ｋｇに減少させた。全てのマウスを処置の２４日目に同時に採取した。
図４７は、５ｍ処置により、マウスは２４日目まで体重を維持することができたが、ビヒクル処置マウスの体重は１５日目から２４日目まで一様に減少したことを示す。体重の減少は、マウスが転移負荷のため病気になるので一般的である。更に、体重減少は、嗜眠、歩行困難、頭部傾斜などを含む脳転移の徴候及び症状と関連していた。
図４８では、２４日目に採取されたビヒクル処置（上）及び５ｍ処置（下）マウスの切除された脳を、エクスビボバイオイメージング後に示す。定量分析から、５ｍ処置は、ビヒクル処置と比較して、総光束を平均６．４×１０７ｐ／秒～２．２×１０７ｐ／秒に減少させることが実証され、この差は統計的に有意だった（ｐ＝０．０４４）。図４９Ａ及び図４９Ｂでは、ビヒクル及び５ｍ処置動物について、同じ動物の無傷マウスのインビボで画像化された頭部（各図の処置の右側パネル）及び次いでその後エクスビボで画像化された頭部（各図の処置の左側パネル）の比較を示す。同一の撮像時間（１分）を使用して、エクスビボ脳における光束の減少を更に理解することができ、５ｍ処置エクスビボ脳において観察された光束（右端の画像を参照、１．５１×１０７ｐ／秒）は、ビヒクル処置脳（左から２番目のパネル；６．０１×１０７ｐ／秒）と比較して減少している。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＸＭＲＳ装置を用いて動物を画像化した。
図５０Ａ～Ｃのパネルは又、ＢｒＭ２細胞が骨、肺、及び脾臓に転移することを示す。（それぞれ図５０Ａ、５０Ｂ、及び５０Ｃ）。両方の処置群において頭蓋外転移が観察されるが、５ｍでの処置は、ＭＢＣの脳への転移増殖を低減又は遅延させただけでなく（上で実証されたように）、同じ実験でこれらの臓器においてエクスビボで測定された総光束の減少によって決定されるように、骨、肺、及び脾臓への転移も統計的に低減した。
脳への乳癌転移を有するマウスの全生存期間に対する本発明の化合物の効果（瀕死時にのみ動物を安楽死させた）。
生存期間を測定するための独立した研究では、ＢｒＭ２細胞（１００，０００個）を８～９週齢のマウスにＩＣ注射し、２４時間後に治療を開始した。治療を２４時間後に開始し、用量は、１．０ｍｇ／ｋｇをＩＶ経路で週２回投与した。処置期間の延長を試みるために注射される細胞数の減少を選択した。本試験では、カプラン－マイヤー生存曲線を作成する目的で、マウスが安楽死基準を満たした場合にのみマウスを採取した。５ｍは、上記の図４６Ａ～Ｂに示される実験＃１のデータと同様に経時的にインビボ脳シグナルを劇的に減少させただけでなく、図５１に示されるように、印象的なハザード比（ＨＲ＝５．１３）（ｐ＝０．０１８）で全生存期間（ＯＳ）も有意に改善した。
この生存試験（実験＃２）では、５ｍで処置されたマウスは、図５２の経時的な体重変化％によっても明らかなように、より長く生存した。更に、５ｍコホートは投与の２１日目まで体重が増加したが、ビヒクル処置マウスは１１日目までに体重が減少し始めた。両方のコホートにおける体重の％変化は、平均値がその日にまだ生存している動物のみを反映するため、及び極度の体重減少（１５～２０％）が主要な安楽死基準であるため、実験の後期段階で変化するようである。矢印は、５ｍ又はビヒクルが投与された日を示す。
マウスを同じ日に採取した以前の研究と一致して、生存試験におけるマウスは、脳内の総光束の増加として経時的に測定される脳腫瘍を発症した。図５３は、５ｍ処置が、１４日目を超える各時点での平均総光束の減少によって観察される脳内の転移進行を遅延させたことを実証した（図中に追跡されたシグナルは脳のみからのものである）。データのばらつきが高いにもかかわらず、５ｍ処置の効果は、２８日目に統計的に有意だった（ｐ値０．０１４１）。
図５４では、各コホートからの１匹の代表的なマウスのインビボイメージング（ｎ＝１、したがってエラーバー無し）を経時的に追跡した（同一のバイオイメージング撮像時間を使用して）。又、１４日目までに、ビヒクル処置マウスと５ｍ処置マウスとの間の総光束の差は発散し始め、又、各マウスがＢｒｎＭｅｔｓ光量束では同様の開始値を示すにもかかわらず（７．５×１０５対６．３×１０５）、５ｍが転移進行を遅延させ、２８日目に転移が６．７倍増加したことを示した。更に、代表的なビヒクル処置マウスは２８日目に死亡し、一方５ｍ処置マウスは３５日目まで生存した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＸＭＲＳ装置を用いて動物を画像化した。
生存試験では、安楽死基準が罹患率／生存率に基づいており、死因が転移であることから予想されるように、頭蓋外転移の他の部位は５ｍによってそれほど抑制されなかった。表を含む図５５では、各コホートの生存率を経時的に追跡し、カプラン・マイヤー曲線生存曲線上にプロットした。表は、各コホートにおける６匹のマウスの各々の安楽死日を示す。全てのビヒクル処置マウスは３０日までに死亡し、一方全ての５ｍ処置マウスは３０日より長く生存した。５ｍ処置マウスの生存期間中央値は、ビヒクル処置マウスでの２５日に対して３６．５日だった。最後に、カプラン・マイヤー曲線は、５ｍ処置コホートについて罹患まで生存率の統計学的に有意な増加を示し、ハザード比は５．１３で、ｐ値は０．０１８だった。
概観すると、５ｍ及び本発明の化合物は、脳透過性であり、インビボで極めて強力なＣＢＳＩ活性を保持することが示された。更に、乳癌の転移進行を遅延させる能力は、脳、骨、脾臓及び肺への転移を抑制することを含むことが実証された。独立した研究では、これらの化合物は、転移を阻害する能力に起因してＯＳを増加させることが示された。
本明細書では本発明の特定の特徴が図示され、説明されてきたが、多くの修正、置換、変更、及び同等物がここで、当業者に思いつくであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に収まるように、全てのそのような修正及び変更を網羅することを意図することを理解されたい。

Claims (32)

  1. 式Ｉの構造を有する化合物であって、
    Figure 2024515727000043
    式中、
    Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり；
    Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
    Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、前記ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、前記ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、前記ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり、又は
    一緒になった場合、Ｒ４及びＲ５は、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、前記シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、前記フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
    ｎは、１～３である、化合物、
    若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せ。
  2. 式ＩＡの構造を有する化合物であって、
    Figure 2024515727000044
    式中、
    Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり；
    Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
    Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、前記ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、前記ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、前記ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    Ｒ４及びＲ５は一緒になって、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、前記シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、前記フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
    ｎは、１～３である、化合物、
    若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せ。
  3. 式ＩＩの構造を有する化合物であって、
    Figure 2024515727000045
    式中、
    Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
    Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、前記ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、前記ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、前記ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり、又は
    一緒になった場合、Ｒ４及びＲ５は、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、前記シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、前記フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
    ｎは、１～３である、化合物、
    若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せ、及び薬学的に許容される賦形剤。
  4. 以下の化合物５ｊ～５ｒ、５ｔ～５ｖ又は１２ａ～１２ｍ及び１２ｏ～１２ｑ、
    Figure 2024515727000046
    Figure 2024515727000047
    のいずれか１つによって表される式Ｉの化合物、若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せ。
  5. 式ＩＩＩの構造を有する化合物であって、
    Figure 2024515727000048
    式中、
    Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり；
    Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
    Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、前記ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、前記ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、前記ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み、
    ｎは、１～３である、化合物、
    若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せ。
  6. 以下の化合物、
    Figure 2024515727000049
    Figure 2024515727000050
    によって表される式ＩＩＩの化合物、若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せ。
  7. 治療有効量の式Ｉの構造の化合物を対象に投与することによって、それを必要とする対象において癌を治療する方法であって、式Ｉの構造が、
    Figure 2024515727000051
    であり、
    式中、
    Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり；
    Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
    Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、前記ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、前記ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、前記ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり、又は
    一緒になった場合、Ｒ４及びＲ５は、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、前記シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、前記フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
    ｎは、１～３である、化合物、
    若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せである、
    それを必要とする対象において癌を治療する方法。
  8. 前記癌は、薬剤耐性腫瘍、転移性癌、又は薬剤耐性癌の少なくとも１つである、
    請求項７に記載の方法。
  9. 前記癌が脳に転移している、請求項８に記載の方法。
  10. 前記癌は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、頭頚部、膵臓、食道、腎臓癌又はＣＮＳ癌の少なくとも１つである、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記乳癌は、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２陽性乳癌、又は脳（ＢｒｎＭｅｔｓ）に転移したＥＲ陽性乳癌のいずれかである、請求項１０に記載の方法。
  12. 治療有効量の式ＩＡの構造の化合物であって、
    式ＩＡの構造が、
    Figure 2024515727000052
    であり、
    式中、
    Ｒ１は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、Ｐｈ、Ｏ（Ｃ５～Ｃ１０アリール）、ＯＰｈ、（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－Ｏ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）フェニル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり；
    Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
    Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、前記ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、前記ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、前記ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    Ｒ４及びＲ５は一緒になって、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、前記シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、前記フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
    ｎは、１～３である、化合物、
    若しくは立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを、
    対象に投与することによって、それを必要とする対象において癌を治療する方法。
  13. 前記癌は、薬剤耐性腫瘍、転移性癌、又は薬剤耐性癌の少なくとも１つである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記癌が脳に転移している、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記癌が、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、頭頚部、膵臓、食道、腎臓癌又はＣＮＳ癌の少なくとも１つである、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記乳癌が、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２陽性乳癌、又は脳に転移した（ＢｒｎＭｅｔｓ）ＥＲ陽性乳癌のいずれかである、請求項１５に記載の方法。
  17. 治療有効量の式ＩＩの構造の化合物であって、
    式ＩＩの構造が
    Figure 2024515727000053
    であり、
    式中、
    Ｒ２は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり；
    Ｒ３は、水素、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４ヘテロアルキル）、－ＮＨＰｈ、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０アリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロアリール）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル）、－ＮＨ（Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクリル）、ヒドロキシル、シアノ、ＮＣＳ、Ｃ３～Ｃ６ヘテロシクリル、又はＣ２～Ｃ５エーテルであり、前記ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、又はＳの少なくとも１つを有し、前記ヘテロシクリルは、任意選択的に置換されてもよく、前記ヘテロシクリルの置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    Ｒ４及びＲ５は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ２～Ｃ５エーテルの少なくとも１つであり、又は
    一緒になった場合、Ｒ４及びＲ５は、５若しくは６員環シクロアルキル環、又は少なくとも１つのＮ、Ｏ若しくはＳ原子を有する５若しくは６員環複素環を形成し、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に少なくとも１つの不飽和を有してもよく、前記シクロアルキル又は複素環は、任意選択的に置換されてもよく、前記シクロアルキル又は複素環の置換は、ハロゲン化物、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）、－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）２、ヒドロキシル、シアノ、又はＣ２～Ｃ５エーテルを含み；
    ただし、Ｒ４及びＲ５が一緒になってフェニル環を形成する場合、前記フェニル環は置換されており、又はＲ４及びＲ５が一緒になってピリジン環を形成する場合、Ｒ３は塩素ではなく；
    ｎは、１～３である、化合物、
    若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せ、及び薬学的に許容される賦形剤
    を対象に投与することによって、それを必要とする対象において癌を治療する方法。
  18. 前記癌は、薬剤耐性腫瘍、転移性癌、又は薬剤耐性癌の少なくとも１つである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記癌が脳に転移している、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記癌が、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、頭頚部、膵臓、食道、腎臓癌又はＣＮＳ癌の少なくとも１つである、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記乳癌が、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２陽性乳癌、又は脳に転移した（ＢｒｎＭｅｔｓ）ＥＲ陽性乳癌のいずれかである、請求項２０に記載の方法。
  22. 治療有効量の以下の化合物の少なくとも１つ：
    Figure 2024515727000054
    Figure 2024515727000055
    を投与することによる、それを必要とする対象において癌を治療する方法。
  23. 前記癌は、薬剤耐性腫瘍、転移性癌、又は薬剤耐性癌の少なくとも１つである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記癌が脳に転移している、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記癌が、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、頭頸部、膵臓、食道、腎臓癌又はＣＮＳ癌の少なくとも１つである、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記乳癌が、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２陽性乳癌、又は脳に転移した（ＢｒｎＭｅｔｓ）ＥＲ陽性乳癌のいずれかである、請求項２５に記載の方法。
  27. 以下の構造を有する化合物、
    Figure 2024515727000056
    若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せ。
  28. 治療有効量の以下の構造の化合物、
    Figure 2024515727000057
    若しくはその立体異性体、薬学的に許容される塩、水和物、Ｎ－オキシド、又はそれらの組合せを投与することによって、それを必要とする対象において癌を治療する方法。
  29. 前記癌が、薬剤耐性腫瘍、転移性癌、又は薬剤耐性癌の少なくとも１つである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記癌が脳に転移している、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記癌が、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、結腸癌、白血病、リンパ腫、頭頸部、膵臓、食道、腎臓癌又はＣＮＳ癌の少なくとも１つである、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記乳癌が、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２陽性乳癌、又は脳に転移した（ＢｒｎＭｅｔｓ）ＥＲ陽性乳癌のいずれかである、請求項３１に記載の方法。
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