JP2003530850A - 生物活性ヒスチジンアンモニアリアーゼのクローニング、過剰発現および治療用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 コリネバクテリアから単離されたヒスチジンアンモニアリアーゼ(HAL)は血清ヒスチジンレベルを低下させ、ウロカニン酸の蓄積を生じさせ、しかもL-ヒスチジノールによっては阻害されない。その結果、コリネバクテリアから単離されたものと同様のヒスチジンアンモニアリアーゼは、ヒスチジンおよび／またはヒスタミンに依存する病理、例えばヒトRSウイルス(RSV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)などの感染性ウイルス、並びに癌を治療するための、L-ヒスチジノールとの併用療法に唯一適している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般には生物学的に活性なアミノ酸分解酵素に関し、より具体的に
はコリネバクテリウム科に属する細菌に由来するヒスチジンアンモニアリアーゼ
およびその保存的変異体に関する。ヒスチジンアンモニアリアーゼの単独でのあ
るいはL-ヒスチジノールと組合せた、種々のウイルス疾患の治療への使用も記載
する。

【０００２】 （発明の背景） ヒスチジンアンモニアリアーゼ(EC 4.3.1.3)は、L-ヒスチジンのウロカニン酸
とアンモニアへの変換を触媒する。これは哺乳動物および細菌の両者におけるヒ
スチジン分解の第一段階である。この酵素の欠損は、高い血清ヒスチジンレベル
を特徴とするヒスチジン血症を生じる。

【０００３】 単離されたヒスチジンアンモニアリアーゼ酵素は増加したヒスチジンレベルの
１つの治療剤である。ヒスチジンアンモニアリアーゼにより血清ヒスチジン濃度
をin vivoで低下させることは、付加的な治療的価値があることが一連の証拠に
より示されている。例えば、ヒスチジンアンモニアリアーゼは動物モデルにおい
てin vivoである種の腫瘍に対して強力な治療的価値を有することが示されてい
る(Roberts et al., Cancer Treat. Rep. 63:1045 (1979); Jack et al., Leuke
mia Res. 7:421 (1983))。

【０００４】 治療上有用な(生物学的に活性な)酵素は一般に、in vivo有用性を予測させる
特徴を示す。これらの要因はHolcenberg and Roberts et al., Ann. Rev. Pharm
acol. Toxicol. 17: 97 (1977)に概説されており、生理学的pHにおける高い活性
と、外来性の補助因子を必要としないことが含まれる。コリネバクテリウム科の
細菌から単離されたヒスチジンアンモニアリアーゼ(本明細書においては「HAL」
という)は、Roberts et al., Cancer Treat. Rep. 63: 1045 (1979)により部分
的に特徴づけられている。HALは広い有効pH範囲を示し、pH 7.2で活性の約75%を
保持する。マウスにおけるHALの血漿半減期は8時間である。この酵素の、in viv
oでのヒスチジン枯渇に対する有用性は、マウスにおいて400 IU/kgの単回腹腔内
注射により24時間以内に血漿ヒスチジンを有効に枯渇させたという観察から明ら
かである。しかしながら、Robertらが記載したコリネバクテリアHALは精製され
た形態のものではなかった。その結果、このHALに関連する治療上有益な特性の
多くは知られていなかった。

【０００５】 ヒスチジンアンモニアリアーゼは、いくつかの細菌、動物、哺乳類および植物
源から単離されている(Shibatani et al., Eur. J. Biochem. 55: 263-269 (197
5))。これらの酵素のKm値は、1〜20 mMの範囲である(Shibatani (1975), 上出;
Wu et al., Gene. 115: 19-25 (1992); Jack et al., Leukemia Research, 7: 4
21-429 (1983); Khanna and Chang. Int’l J. Artificial Organs 13: 189-195
(1990))。ヒスチジンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子はいくつかの生物
からクローン化されている(Consevage, M.W. and A.T. Phillips, 1990, Journa
l of Bacteriology. 172 (5): 2224-2229; Oda, M. Sugishita, A. and K. Furu
kawa, 1988, J. Bacteriology. 170 (7): 3199-3205; Wu, P.C., Kroening, T.A
., White, P.J. and Kendrick, K,E. 1992, J. Bacteriology. 174 (5): 1647-1
655; Taylor, R.G., Lambert, M.A., Sexsmith, E., Sadler, S.J., Ray, P.N.,
Mahuran, D.J. and McInnes, R.R. 1990. J. Biol. Chem. 265 (30): 18192-18
199)。生化学的な特徴づけによれば、ほとんどのヒスチジンアンモニアリアーゼ
がEDTAとチオール試薬によって阻害されることが示されている(Shibatani, T.,
Kakimoto, T. and I. Chibata. 1975. Eur. J. Biochem. 55: 263-269; Okamura
, H., Nishida, T. and H. Nakajawa, 1974, J. Biochem., 75: 139-152)。Kurt
hia種であると同定された細菌からの生物学的に活性なヒスチジンアンモニアリ
アーゼが、1983年にJackらによって記載されている(Jack, G.W., Wiblin, C.N.
and P.C. McMahon, 1983. Leukemia Research, 7 (3): 421-429)。Kurthia種ヒ
スチジンアンモニアリアーゼは1.25 mMのKmを有し、マウスにおいて6〜7時間の
半減期を示すことが報告されている。Kurthiaヒスチジンアンモニアリアーゼは
化学的に修飾してもこの酵素の生物学的半減期は増加しなかった。しかしながら
、コリネバクテリアから単離されたHALは、高い細胞チャレンジ(マウスあたり10⁷ 個の細胞)を受けたマウスにおいて腹水腫瘍を減少させるのに有効である一方、
Kurthiaから単離されたヒスチジンアンモニアリアーゼは低い腫瘍細胞チャレン
ジレベル(マウスあたり10³〜10⁵個の細胞)においてのみ有効なことが報告されて
いる。

【０００６】 L-ヒスチジノールは、ヒスチジン代謝を改変することができるヒスチジンのア
ナログである。L-ヒスチジノールによるヒスチジン代謝の改変は治療的利益をも
たらす。ヒスチジンは、タンパク質の合成とヒスタミンの形成（いずれも腫瘍増
殖に必要）を含めて、いくつかの細胞プロセスに必要である(Watanabe, et al,
1982. Biochem. and Biophys. Res. Comm. 109:478-485; Bartholeyns and Bouc
lier, 1982. Cancer Res. 44:639-645; Hakii, et al, 1986, J. Cancer Res. a
nd Clin. Oncol. 111:177-181)。ヒスチジンはヒスタミンの直接の前駆体であり
、酵素ヒスチジンデカルボキシラーゼ(HDC)によってヒスタミンに変換される。L
-ヒスチジノールはHDCを阻害することによりこの変換を妨害する。したがって、
L-ヒスチジノールは、強い腫瘍促進性のホルボールエステルにより誘導されるHD
Cを阻害することによって治療的に作用することが可能である(Mitra, et al, 19
93, J. Cellular Physiol., 156:348-357)。L-ヒスチジノールは多少の抗腫瘍活
性を有し、いくつかの抗腫瘍性化合物に対する特定の腫瘍細胞系の抵抗性を逆転
させる能力を有する(Stolfi, R.L. and Martin, D.S. 1990. Chemotherapy, 36
(6): 435-440; Warrington, R.C., Fang W.D. and L.U. Zhang, 1996. Anticanc
er Research 16 (6B):3641-3646; Warrington, R.C. and Fang W.D. 1989. Jour
nal of the National Cancer Institute. 81 (10): 798-803)。L-ヒスチジノー
ルはさらに、ある種の抗癌剤とともに同時に患者に投与するとき、その抗癌剤の
効能を増強することができる(Warrington, R.C. and W.D. Fang. 1991. Antican
cer Research, 11 (5): 1869-1874; Warrington, R.C., Chang, I. And W.D. Fa
ng. 1994. Anticancer Research, 14 (2A): 367-372; Warrington, R.C., Chang
. I., Zhang, L. and W.D. Fang. 1993. Anticancer Research, 13 (6A): 2107-
2112; Warrington, R.C. 1992. Biochemistry and Cell Biology, 70 (5): 365-
375; Zaharko, D., Plowman, J., Waud, W., Dykes, D. and L. Malspeis. 1992
. Cancer Research, 52 (13): 3604-3609)。例えば、化学療法剤の治療指数はL-
ヒスチジノールとの併用療法により上昇し、これはL-ヒスチジノールが通常の化
学療法剤の正常細胞に対する毒性を減じるが、癌細胞に対しては減じないことに
よる(Warrington, R. C., Fang. W. D., Zhang, L. Shieh. M. and M.H. Saier,
Jr. 1996. Anticancer Research, 16 (6B): 3635-3639; Warrington, R.C., Fa
ng W. D., Zhang, L., Shieh, M. and M. H. Saier, Jr. 1996. Anticancer Res
earch, 16 (6B): 3629-3633; Badary. O.A., Nagi, M.N., Al-Sawaf, H.A, Al-H
arbi, M., and A.M. Al-Bekairia. 1997. Nephron, 77 (4): 435-439; Al-Shaba
nah, O.A., Badary, O.A., Al-Gharably. N.M. and H.A. Al-Sawaf. 1998. Phar
macological Research, 38 (3): 225-230; Badary. O.A. 1999. Experimental N
ephrology. 7 (4): 323-327)。

【０００７】 理論上、L-ヒスチジノールをヒスチジンアンモニアリアーゼとともに使用する
と、血清ヒスタミンを枯渇させ、ヒスチジンレベルを低下させる治療法が得られ
る。しかしL-ヒスチジノールは、単独の薬剤としてはその短い半減期(Zaharko,
D., Plowman, J., Ward, W., Dykes, D., and L. Malspeis, 1992. Cancer Rese
arch. 52: 3604-3609)と競合阻害剤としてのその作用様式のために有用性が限ら
れている。従ってL-ヒスチジノールは、ヒスチジンが関与する細胞プロセスを競
合的に阻害するためには、非常に高い濃度で存在しなければならない。ヒスチジ
ンレベルが低下すると、細胞にL-ヒスチジノールをより容易に取り込ませること
により、L-ヒスチジノールの有効性が増強されると思われる。

【０００８】 それにもかかわらず、L-ヒスチジノールのようなヒスチジンアナログとの併用
療法に適するヒスチジンアンモニアリアーゼは、L-ヒスチジノールによって阻害
されないという付加的な特性を有していなければならない。すべての公知の単離
されたヒスチジンアンモニアリアーゼの一般的な1つの特性は、ヒスチジノール
のようなヒスチジンアナログの存在下でそれらが阻害されることである。例えば
、Achromobacter liquidumおよびStreptomyces griseusのような細菌から単離さ
れたヒスチジンアンモニアリアーゼは、L-ヒスチジノールおよびL-ヒスチジノー
ルホスフェートによって、それぞれ4.58および0.27 mMのKiで阻害される(Shibat
ani, T. et al. 1975. Eur. J. Biochem. 55: 263-269; Wu, P.C. et al. 1995.
Gene. 115(1-2): 19-25)。

【０００９】 ヒスチジノールによる酵素の阻害により、これまでに記載されたヒスチジンア
ンモニアリアーゼは、癌のような疾患を治療するための上記のようなヒスチジン
アナログとの併用療法に使用するのに適した候補ではなかった。従って、これま
でに単離されたヒスチジンアンモニアリアーゼと同様な適当な特性を有し、さら
にL-ヒスチジノールの存在下でヒスチジンを枯渇させる能力を維持しているヒス
チジンアンモニアリアーゼに対する要求が現在も存在する。

【００１０】 癌に加えて、ヒトRSウイルス(Respiratory Syncytial Virus: RSV)、単純ヘル
ペスウイルス(HSV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のようなウイルス性疾患が世界
的に蔓延しており、健康上の大きな問題となっている。冬に発生する急性呼吸器
疾患によくみられる原因ウイルスであるRSVにより、1998年には90,000人が入院
し、4,500人が死亡しており、合衆国における幼児および若年小児における下気
道疾患の最大の原因となっている(CDC. 1997. MMWR. 46(49); 1163-1165)。単純
ヘルペスウイルスは、人口のさらに大きな部分に感染している。疾病対策センタ
ーは1998年に、12歳以上の4500万人、すなわち青年および成人人口の5人に1人が
単純ヘルペスウイルスに感染していると推定している。HIV/AIDS国連共同プログ
ラム(UNAIDS)は、世界で3360万人がHIV/AIDSに感染し、260万人が1999年にこの
疾病により死亡したと推定している。

【００１１】 ヒトの感染性ウイルスは、それらが細胞に入り、細胞内部で複製し、その後感
染細胞から放出される形態において広範に異なっている。RNAウイルスは、外被
に包まれたまたは包まれていない一本鎖または二本鎖RNAをそのゲノムとして有
する。RNA鎖はポジティブまたはネガティブの形態であり得る。RNAウイルスは細
胞に入り、それらのRNAゲノムのコピーを形成し、構造タンパク質および調節タ
ンパク質をコードするメッセンジャーRNAの合成を指令する。最終的に、ゲノム
は構造タンパク質とともに組み立てられ、ウイルスが放出される。DNAウイルス
は外被に包まれたまたは包まれていない一本鎖または二本鎖DNAゲノムを有する
。レトロウイルスはRNAウイルスでもあるが、その複製過程でDNAを使用する。し
たがって、各ウイルスはその感染および増殖プロセスにおいて独特である。

【００１２】 ウイルスの複製における1つの共通なテーマは、その増殖のためにヒトの細胞
機構を利用するウイルスの能力である。これがウイルスに対する医薬の開発を非
常に困難なものとしている。過去においては、抗ウイルス療法は、適当なワクチ
ンの開発あるいはウイルスの複製におけるユニークなプロセスの阻害に集中され
ていた。これはウイルスのタイプまたはサブタイプに非常に特異的な治療を可能
とすることが多い。現在、ワクチンはウイルス防御の主流となっている。ワクチ
ンは各ウイルスタイプおよびサブタイプについて特異的に開発されており、その
特定のウイルスタイプ/サブタイプに対してのみ有効である。

【００１３】 ウイルスの複製においてユニークなプロセスを利用する治療も開発されている
。例えば、逆転写酵素はレトロウイルスに特有である。他のポリメラーゼに影響
を及ぼさずに、逆転写酵素を阻害するヌクレオチドアノログおよび非ヌクレオチ
ド逆転写酵素阻害剤が開発されている。しかしながら、そのような治療はレトロ
ウイルスの撲滅のみに制限されている。ユニークなウイルスの複製プロセスを標
的とするさらに別のアプローチはHIVに対するプロテアーゼ阻害剤の使用である
。しかしこれらの阻害剤は特定の酵素、すなわちHIVプロテアーゼを標的とする
ので、広範なウイルスに対して有効なものとはなりえない。ウイルス特異的な治
療のさらに別の例は、抗ウイルス性化合物ガンシクロビルの使用であり、これは
単純ヘルペスウイルスに対して有効である。ガンシクロビルはヘルペスに感染し
た細胞に特異的に細胞毒性を示す。ガンシクロビル療法は単純ヘルペスウイルス
の撲滅には有益であり得るが、他のウイルスの治療には限定的な適用しかされな
いか、あるいはまったく適用されない。

【００１４】 従って、広範なスペクトルのウイルスに対して有効であり得る治療剤の大きな
必要性がある。これまでヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を有するペプチドが
有効に伝染性ウイルスを治療できるという開示はない。したがって、伝染性ウイ
ルスに対して有効なヒスチジンアンモニアリアーゼについて、大きな治療的およ
び市場的可能性が存在する。

【００１５】 （発明の概要） 従って、本発明の目的は、ヒスチジノールのようなヒスチジンアナログによっ
て実質的に阻害されないヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を有する精製された
ポリペプチドを提供することである。

【００１６】 本発明の別の目的は、ヒスチジノールのようなヒスチジンアナログとそのよう
な化合物によって実質的に阻害されないヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を有
する精製されたポリペプチドとを使用する、癌の治療方法を提供することである
。

【００１７】 さらに別の本発明の目的は、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を有する精製
されたポリペプチドを使用してウイルス感染を治療する方法を提供することであ
る。

【００１８】 これらの本発明の目的およびその他の目的は、本出願を読むことにより当業者
には明らかになるであろう。

【００１９】 1つの態様においては、本発明は、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を有す
る単離されたポリペプチドであって、該ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性がヒ
スチジノールのようなヒスチジンアナログの存在下において実質的に低下しない
単離されたポリペプチドを提供する。本発明はさらに、前記の特性を有し、配列
番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5および配列番号6からなる
群から選択されるペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。本発明はまた、
前記特性を有するポリペプチドであって、配列番号8、配列番号9、配列番号10、
および配列番号11からなる群から選択されるペプチド配列を含むポリペプチドを
提供する。本発明はさらに、前記特性を有する単離されたポリペプチドをPEG化
する方法であって、PEGを前記ポリペプチドと反応させることを含む前記方法を
提供する。

【００２０】 方法論の態様においては、本発明は、ウイルス感染患者を治療する方法であっ
て、ウイルス感染患者に治療量のヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を有するポ
リペプチドを投与することを含む前記方法を提供する。

【００２１】 本発明はさらに、癌患者を治療する方法であって、癌患者に、1)治療量のヒス
チジンアンモニアリアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドであって、該ヒ
スチジンアンモニアリアーゼ活性がヒスチジノールのようなヒスチジンアナログ
の存在下において実質的に低下しないものである前記単離されたポリペプチド、
および2)治療量のヒスチジンアナログを投与することを含む前記方法を提供する
。

【００２２】 さらに別の方法論のアプローチにおいては、本発明は、疾患を治療する方法で
あって、患者に1)治療上有効な量のヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を有する
単離されたポリペプチドを投与し、2)該患者に治療上有効な量の化学療法剤また
はレトロウイルスベクターを投与することを含む前記方法を提供する。この方法
論に合致するものとして、本発明は、前記方法による疾患の治療方法であって、
ポリペプチドが投与されると、患者の罹患してない細胞が可逆的な静止状態に入
る前記方法を提供する。

【００２３】 本発明はさらに、患者に免疫抑制剤を送達する方法であって、1)患者に治療上
有効な量の、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドであって
、in vivoでトランス-ウロカニン酸(t-UA)を生成するポリペプチドを投与し、2)
該患者を照射に付す、ことを含み、照射がt-UAのそのシス異性体(c-UA)への光異
性化を引き起こし、該シス異性体が免疫抑制特性を有するものである前記方法を
提供する。

【００２４】 本発明はさらに、配列番号7を含む単離されたDNA配列、並びに配列番号7を含
むベクターを包含する。さらに本発明は、患者を治療する方法であって、配列番
号7を含む発現ベクターを構築し、患者に該発現ベクターを導入することを含む
前記方法を提供する。

【００２５】 本発明はさらに、配列番号12を含む単離されたDNA配列、並びに配列番号12を
含むベクターを包含する。さらに本発明は、患者を治療する方法であって、配列
番号12を含む発現ベクターを構築し、患者に該発現ベクターを導入することを含
む前記方法を提供する。

【００２６】 （好適な実施形態の詳細な説明） 本発明者らは、ヒスチダーゼあるいはヒスチジンアンモニアリアーゼとして知
られている特定のポリペプチドが、血清ヒスチジンレベルを低下させ、ウロカニ
ン酸の蓄積を引き起こすが、ヒスチジノールのようなヒスチジンアナログによっ
て阻害されないことを発見した。この発見のために、本発明の生物学的に活性な
ヒスチジンアンモニアリアーゼは、ヒスチジンおよび/またはヒスタミンの増加
したレベルあるいはヒスチジンおよび/またはヒスタミンの必要性を特徴とする
アレルギー反応および病理、例えば癌、感染性ウイルス等の治療に使用すること
ができる。

【００２７】本発明のポリペプチドおよび核酸 1つの態様において、本発明は、L-ヒスチジン血清レベルを低下させ、そして
ヒスチジン分解の有益な副産物であるウロカニン酸を生成する、一般に「ヒスチ
ダーゼ」あるいは「ヒスチジンアンモニアリアーゼ」として知られるポリペプチ
ドを提供する。ヒスチジンアンモニアリアーゼ(EC 4.3.1.3)は、ヒスチジンのα
アミノ基の非酸化的除去を触媒する。L-ヒスチジノールはヒスチジン代謝を改変
することができるが、ヒスチジンアンモニアリアーゼによるヒスチジンの枯渇を
介したヒスチジン代謝の改変は、同様な治療的利点をもたらし、L-ヒスチジノー
ルよりさらに有効で、潜在的に毒性の低いやり方でそのような効果を発揮する。
ヒスチジンアンモニアリアーゼによる治療の別の利点は、Noonan et al., Immun
ol. Today 13: 250-254 (1992)によって報告されているように、その作用の産物
の1つであるウロカニン酸が免疫系に対して防御的で有益な効果を奏する見込み
があるということである。

【００２８】 別の態様においては、本発明は、ヒスチジノールのようなヒスチジンアナログ
の存在下でそのヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を保持することができるポリ
ペプチドを提供する。ここで定義するように、「ヒスチジンアナログ」とはヒス
チジノールのようなヒスチジン変異体をいうものであり、その治療上許容される
塩を含む。代表的なヒスチジンアナログとしてのヒスチジノールには、多数の有
益な治療用途があり、ヒスチジンからのヒスタミンの生産を阻害する能力が含ま
れる。またヒスチジノールは、ヒスチジルtRNAの脱アシル化を起こすことにより
タンパク質合成経路を改変することができる。本発明のポリペプチドのヒスチジ
ンアンモニアリアーゼ活性は、ヒスチジノールのようなヒスチジンアナログの存
在下で実質的に低下しないので、すべての既知のヒスチジンアンモニアリアーゼ
と異なり、上記のような化合物との併用療法において唯一適している。

【００２９】 本発明のペプチドをコードする核酸、及び下記の「配列同一性」の説明による
その保存的変異体も提供される。当然、本発明の核酸は組換え技術による本発明
のペプチドの調製に有用であり、下記に説明するタンパク質に基づいた治療に類
似する遺伝子治療を可能とするものである。

【００３０】 本発明のヒスチジンアナログは下記の構造の化合物を含む。

【化１】 式中、各Rは独立して炭素数1、2または3のアルキル、炭素数2または3のアルケン
、または炭素数2または3のアルキンであり、各Rは独立して-OH、-SHおよび=Oか
らなる群の1以上により任意に置換されていてもよく、Yは5または6員の複素環で
ありN、SおよびOからなる群から選択される1または2個のヘテロ原子を有し、前
記化合物はエステルおよびそれらの治療上有効な塩を含む。ある好ましいアナロ
グにおいては、Yは5員環であり、1または2個のNヘテロ原子を含み、より好まし
い化合物においては、Yはイミダゾール部分である。ある好ましい化合物では、N
は1個である。Rは具体的には炭素数1のアルキルでありうる。代表的なエステル
としてはリン酸エステルおよびカルボン酸エステル(特にC1-3)が挙げられる。ア
ナログとして、ヒスチジノール、ヒスチジナール、イミダゾールグリセロールリ
ン酸、イミダゾールアセトールリン酸、ヒスチジノールリン酸が挙げられる。ヒ
スチジノールは下記の構造を有する。

【化２】

【００３１】 本発明のポリペプチドは、本明細書に記載する機能的な特徴を与える分子構造
を有する。好ましい実施形態においては、配列番号1により示される活性部位に
相当する領域が保存されている。従って配列番号2、3、4および5によって示され
るペプチド配列は、前記の新規なポリペプチドの活性部位を保存しているので、
本発明の範囲に包含されるものである。同様に、配列番号8、9および10も前記の
新規なポリペプチドの活性部位を保存しているので、本発明の範囲に包含される
ものである。

【００３２】 本発明はさらに、活性部位を含んでいないが、ヒスチジンアナログの存在下で
ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を維持する1以上の保存的置換、例えばいず
れも硫黄含有アミノ酸であるセリンからシステインへの置換、による前記ペプチ
ドの変異体も包含する。「保存的置換」は、例えば含まれる残基の極性、電荷、
溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性に基づいて行い得る。

【００３３】 したがって、本発明のポリペプチドの全体的な構造および組成は、それらが適
当な機能的な特性、すなわちヒスチジン枯渇およびヒスチジノールのようなヒス
チジンアナログに対する相対的耐性を与えることの範囲においてのみ重要である
。開示されるタンパク質産物を構成する個々のアミノ酸の特性を考慮すれば、合
理的な置換は当業者には理解されるであろう。例えば、(a)非極性(疎水性)アミ
ノ酸としてはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニル
アラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ、(b)極性的に中性のア
ミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパ
ラギンおよびグルタミンが挙げられ、(c)正に荷電した(塩基性)アミノ酸として
はアルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ、(d)負に荷電した(酸性)ア
ミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。通常、置換は
(a)〜(d)のグループ内で行われる。さらに、グリシンとプロリンは、α-ヘリッ
クスを分断するそれらの能力に基づいて互いに置換し得る。同様に、ある種のア
ミノ酸、例えばアラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、
グルタミン、ヒスチジン、リジン等はα-ヘリックス中により一般的に見られる
のに対して、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトフ
ァンおよびスレオニンはひだ状β-シートにおいてより一般的に見られる。グリ
シン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびプロリンはターン部分で一
般的に見られる。好ましい置換は、次のグループ(i)SおよびT、(ii)PおよびG、(
iii)A、V、LおよびIの間で行われる。既知の遺伝子コードおよび組換えDNAおよ
びDNA合成技術により、当業者は保存的アミノ酸変異体をコードするDNAを容易に
構築することができる。

【００３４】 一般に、本発明のDNAおよびタンパク質の分子は「配列同一性」により定義す
ることができる。いくつかの分子は少なくとも60%の同一性を有する。好ましい
分子は少なくとも約65%の配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも65%ある
いは70%の配列同一性を有する。その他の好ましい分子は、少なくとも80%、より
好ましくは少なくとも80%あるいは85%の配列同一性を有する。特に好ましい分子
は少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する。最も
好ましい分子は少なくとも約95%、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を
有する。本明細書において使用するように、2つの核酸分子あるいはタンパク質
は、それらが85%を越える配列(アミノ酸または核酸)同一性を有する領域を含ん
でいる場合に、「有意な配列同一性を互いに有する」ものとする。

【００３５】 「配列同一性」は、本明細書においてはBlast 2アルゴリズムによりデフォル
トパラメーターを使用して定義するものであり、これはNCBI(http://www.ncbi.n
lm.nih.gov/BLAST)で入手することができる。このアルゴリズムに関連する参考
文献としては、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_references.htmlで
見られるもの; Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman
, D.J. 1990. J. Mot. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993. Na
ture Genet. 3:266-272; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. 1996. Met
h Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaeffer, A.A., Z
hang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. 1997. Nucleic Acids Res.
25:3389-3402; および Zhang, J. & Madden, T.L. 1997. Genome Res. 7:649-65
6が挙げられる。

【００３６】 この目的には、例えば配列番号6は、本発明により提供される配列変異を表し
ている。「X」によって表わされていないアミノ酸位置は、1)既知のヒスチジン
アンモニアリアーゼ中の高度に保存された領域(例えば図15を参照)、並びに2)コ
リネバクテリアから単離されたポリペプチドに特有のアミノ酸を表わす。アミノ
酸が存在しない領域は、図14のように「-」で示す。「X」で表されるアミノ酸位
置は、本発明を逸脱しない範囲でアミノ酸を変化させることができる領域を示す
。配列番号6によれば、「X」によって表わされるアミノ酸は、他のいずれかのヒ
スチジンアンモニアリアーゼの対応する位置にあるアミノ酸であり得る。例えば
図14は、コリネバクテリアから単離されたHALの位置14にアラニンを示す。図14
に示した種から単離されたヒスチジンアンモニアリアーゼにおいては、コリネバ
クテリアにおける位置14に対応する位置のアミノ酸は、図14に示すように、スレ
オニン、アラニン、バリン、ロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸およびプ
ロリンである。従って、本発明により提供されるポリペプチドの位置14は、これ
らのアミノ酸のいずれか1つにより表すことができる。さらに意図される変異の
例としては、位置241に対応するアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、チ
ロシン、アラニンあるいはシステインであり得る。

【００３７】 下記の凡例は、図14に示すペプチドに関連する種を記載したものである。 983831: HAL CAC21618: Streptomyces coelicolor HUTH_STRGR: Streptomyces griseus HUTH_DEIRA: Deinococcus radiodurans 4 BAB16159: Agrobacterium rhizogenes 5 Q9KWE4: Agrobacterium rhizogenes HUTH_BACSU: Bacillus subtilis 7 Q9KSQ4: Vibrio cholerae 8 Q9HU85: Pseudomonas aeruginosa 9 Q9KBE6: Bacillus halodurans HUTH_PSEPU: Pseudomonas putida HUTH_RHIME: Rhizobium meliloti 12 Q9HU90: Pseudomonas aeruginosa HUTH_HUMAN: ヒト HUTH_CAEEL: Caenorhabditis elegans 15 Q9HLI6: Thermoplasma acidophilum HUTH_MOUSE: マウス 17 BAB29407: Mus musculus (マウス) 18 HUTH_RAT: ラット 18 AAG53586: 非培養細菌pCosAS1 20 Q9KKEO: Rhizobium meliloti 21 Q9HQD5: Halobacterium sp

【００３８】 配列番号11に示す別の例はその他の意図されるペプチドを示し、図13に記載し
たヒスチジンアンモニアリアーゼを参照することにより調製することができる。
配列番号6におけるのと同様に、「X」によって表わされていないアミノ酸位置は
、1)既知のヒスチジンアンモニアリアーゼ中の高度に保存された領域、並びに2)
コリネバクテリアから単離されたポリペプチドに特有のアミノ酸を表す。アミノ
酸の不存在に対応する領域は、図13に示すように「-」で示す。「X」で表される
アミノ酸位置は、本発明から逸脱しない範囲でアミノ酸を変更し得る領域を表す
。「X」で表されるアミノ酸は、他の任意のヒスチジンアンモニアリアーゼの対
応する位置に存在するアミノ酸であり得る。例えば図13は、コリネバクテリアか
ら単離されたHALの位置8にスレオニンを示す。その他の種から単離されたヒスチ
ジンアンモニアリアーゼにおいては、コリネバクテリアにおける位置8に対応す
る位置のアミノ酸は、同様に図13に示すように、スレオニン、イソロイシン、ア
ラニン、グルタミン酸およびバリンである。従って、本発明により提供されるポ
リペプチドの位置8は、これらのアミノ酸のいずれか1つにより表すことができる
。さらに意図される変異の例としては、位置307に対応するアミノ酸が、アラニ
ン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸あるいはアルギニンであり得る。

【００３９】 本発明により提供されるポリペプチドは、種々のペプチド配列を有することに
加えて、種々の分子量をもつことができ、これは本明細書に記載する新規な特性
の1以上が維持される限り本発明の範囲を逸脱するものではない。すなわち、ポ
リペプチドは、約30,000〜67,000ダルトンのモノマーとしての分子量を有し得る
。より好ましくは、モノマーとしての分子量は約45,000〜60,000ダルトンの間で
ある。モノマーとしての分子量が約56,000ダルトンであることが最も好ましい。

【００４０】治療用組成物 本発明のタンパク質を公知の方法により配合して薬学的に有用な組成物を調製
することができ、本発明の分子またはその機能的な誘導体を薬学的に許容され得
る担体ビヒクルと混合物として合わせる。例えばヒト血清アルブミンのような他
のヒトタンパク質を含め、適当なビヒクルおよびその配合は、例えばRemington
’s Pharmaceutical Sciences (16th ed., Osol, A., Ed., Mack, Easton PA (1
980))に記載されている。効果的な投与に適する薬学的に許容される組成物を形
成するためには、そのような組成物は、有効な量の1種以上の本発明のタンパク
質と適当な量の担体ビヒクルを含む。

【００４１】 本発明による使用のための医薬組成物は、1種以上の生理学的に許容される担
体または賦形剤を使用して、慣用の方法により配合し得る。すなわち、本発明の
ポリペプチドならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入もし
くは吸引(経口もしくは経鼻のいずれか)または経口、口内、非経口もしくは経直
腸投与による投与用に配合することができる。

【００４２】 経口投与用には、前記医薬組成物は、例えば、結合剤(例えばα化トウモロコ
シ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、
充填剤(例えばラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム)、滑
沢剤(例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)、崩壊剤(例えば
ポテトスターチあるいはナトリウムスターチグリコレート)、あるいは湿潤剤(例
えばラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に許容される賦形剤とともに慣用の
手段により錠剤またはカプセルの形態とすることができる。錠剤は当技術分野に
おいて周知の方法により被覆してもよい。経口投与用の液剤は、例えば、溶液、
シロップもしくは懸濁液の形態とすることができ、または使用の際に水もしくは
その他の適当なビヒクルにより構成される乾燥製品として提供することもできる
。そのような液剤は、例えば、懸濁剤(例えばソルビトールシロップ、セルロー
ス誘導体または水素添加食用油脂)、乳化剤(例えばレシチンもしくはアカシア)
、非水性ビヒクル(例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコールもし
くは分画化植物油)、および保存剤(例えばp-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくは
p-ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸)のような薬学的に許容される
添加剤とともに、慣用の手段により調製することができる。製剤はさらにバッフ
ァー塩、香味剤、着色剤および甘味料を適宜含んでもよい。

【００４３】 経口投与用の製剤を適当に配合することにより活性化合物の制御された放出を
得ることができる。口腔内投与用には、前記組成物は慣用の方法により配合した
錠剤あるいはロゼンジの形態とすることができる。

【００４４】 吸入による投与のためには、本発明に使用する新規ポリペプチドは、適当な噴
射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ
テトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくはその他の適当な気体を使用した加圧
パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー形態により好便に提供され
る。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブ
を備えることにより決定することができる。吸入器または吸引器に使用するため
の、前記化合物と、ラクトースもしくは澱粉のような適当な粉末基剤とを含む粉
末混合物を含む、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを作製すること
ができる。

【００４５】 前記の新規ポリペプチドは、例えばボーラス注射もしくは連続点滴などの注射
による非経口投与用に配合することができる。注射用の配合物は、例えばアンプ
ルまたは複数回投与容器中に、保存料を添加した単位投与形態とすることができ
る。前記組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液もしくは乳液の
形態とすることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような配合剤を
含んでもよい。あるいは、活性成分は、例えば滅菌済発熱物質不含水のような適
当なビヒクルにより用時調製する粉末の形態とすることができる。

【００４６】 前記化合物はさらに、例えばカカオバターもしくはその他のグリセリドのよう
な慣用の座薬用基剤を含む、座薬もしくは保持型浣腸のような直腸用組成物に配
合することもできる。

【００４７】 これまでに記載した配合物に加え、前記の新規ポリペプチドはさらに、デポー
製剤として配合してもよい。そのような長期作用型配合物は移植(例えば皮下も
しくは筋肉内)によってまたは筋肉内注射によって投与することができる。すな
わち、前記化合物は、適当なポリマーもしくは疎水性物質(例えば許容される油
中のエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂とともに、あるいは低溶解性誘
導体、例えば低溶解性塩として配合することができる。

【００４８】 所望により、前記組成物は、活性成分を含む1以上の単位投与形態を含むパッ
クもしくはディスペンサー装置中のものとしてもよい。パックは例えば、ブリス
ターパックのような、金属ホイルもしくはプラスチックホイルを含むものとする
ことができる。パックもしくはディスペンサー装置には投与説明書を添付するこ
とができる。

【００４９】本発明の方法 治療原理 ウイルス撃退特性 ある実施形態においては、本発明のポリペプチドは、DNAウイルスおよびRNAウ
イルスを含むヒト感染性ウイルスを治療するためのこれまで知られていなかった
用途を有する。本発明者らは、前記の新規ポリペプチドがRNAウイルス、DNAウイ
ルスおよびレトロウイルスの非常に強力な阻害剤であることを見出した。ヒスチ
ジンアンモニアリアーゼ療法それ自体、およびヒスチジノールとの組合せは、こ
れらの3種のウイルスの主要なグループに対して有効である。HALの独特な広域ス
ペクトル抗ウイルス活性は、抗ウイルス剤に非常に望ましい特徴である。

【００５０】 本発明により治療することができる具体的なウイルスとしては、限定するもの
ではないが、ヒトRSウイルス(RSV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)およびヒト免疫
不全ウイルス(HIV)が挙げられる。HIVのモデルウイルスであるラウシャーマウス
白血病ウイルス(Rauscher Murine Leukemia Virus)においてウイルス複製を本発
明のポリペプチドが抑制できることが観察されたことから、最後に挙げたウイル
スを本発明により治療することができる。他の治療可能なウイルスとしては、下
記の密接に関連するウイルスが挙げられる。

【００５１】 RSウイルスはパラミクソウイルス科に属する。その他のパラミクソウイルス科
に属するヒト感染性ウイルスとしては、上部呼吸器疾患、気管支炎/毛細気管支
炎、肺炎を引き起こすパラインフルエンザ1、2、3、4ウイルス、流行性耳下腺炎
ウイルスおよび麻疹ウイルスが挙げられる。パラミクソウイルス科は、ラブドウ
イルスおよびフィロウイルスと密接な関係を有し、これはこれらの科に属するウ
イルスが一本鎖RNA(ネガティブセンス)ゲノムを含み、これはセグメント化され
ておらず、エンベロープを有しないことによる。ラブドウイルスに属するヒト感
染性ウイルスは、疱性口内炎-インディアナ、ニュージャージー、球菌ウイルス
、チャンディプラウイルス、ピリウイルス、イスファハンウイルス、狂犬病ウイ
ルス、モコラ(Mokola)ウイルスおよびドウベンハーゲ(Duvenhage)ウイルスであ
る。フィロウイルス科に属するヒト感染性ウイルスはマールブルクおよびエボラ
ウイルスを含む。より広くは、RSウイルスはRNAウイルスである。

【００５２】 ヒト感染症を引き起こすその他のRNAウイルスとしては、ポリオウイルス1、2
および3、コクサッキーウイルスB1〜B6、ヒトエコーウイルス1〜9、11〜27およ
び29〜34、ヒト腸内ウイルス1〜113、ノーウォークウイルスおよびヒトにおいて
胃腸炎を引き起こすカリシウイルス科に属する同様のウイルス、東部ウマ脳炎ウ
イルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、チクングニアウ
イルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、マヤロウイルス、風疹
ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、セントルイ
ス型脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、マレーヴァリー脳炎ウイルス、ロッコウ
イルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、ヒトコロナウイルス229-EおよびOC43、上気道
感染症(多くは肺炎、稀に胃腸炎)、インフルエンザA、BおよびCウイルス、ブン
ヤンベラウイルス、ブワンバウイルス、オリボカウイルス、オロポーシェウイル
ス、グァマ(Gwama)ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクロスウイルス
、タヒナウイルス、ナポリサシチョウバエウイルス、クリミア-コンゴ出血熱ウ
イルス、ハンタンウイルス(韓国型出血熱、腎臓症候群をともなう出血熱、流行
性ネフロパシー)、リンパ球性脈絡髄膜炎(LCM)ウイルス、ラッサウイルス、マチ
ャパ(Machupa)ウイルス(ボリビア出血熱)、フニンウイルス(アルゼンチン出血熱
)、レオウイルス1、2および3、オランゴ(Orungo)ウイルス(ナイジェリアおよび
ウガンダの発熱病)、ケメロボウイルス(ロシアおよびエジプトの発熱病)、ヒト
ロータウイルス、コロラドダニ熱ウイルスが挙げられる。

【００５３】 ラウシャーマウス白血病ウイルスはレトロウイルス科に属する。この科に属す
るウイルスは、エンベロープに包まれた一本鎖(ポジティブセンス)非セグメント
化ゲノムを有するが、それらは複製にDNAによるステップを含む。この科に属す
るヒト感染性ウイルスとしては、C型オンコウイルス、例えばヒトT-リンパ球向
性ウイルス1(HTLV-I、成人T細胞白血病)、ヒトT-リンパ球向性ウイルス2(HTLV-I
I、ヘアリー細胞白血病と関連している可能性が高い)、後天性免疫不全症候群(A
IDS)を起こすヒト免疫不全ウイルス1および2(HIV 1およびHIV 2)、およびAIDS様
疾患を引き起こすHIV 1およびHIV 2に関連するその他のウイルスが挙げられる。

【００５４】 単純ヘルペスウイルスはヘルペスウイルス科に属する。ヘルペスウイルス科に
属するウイルスは、エンベロープに包まれた二本鎖ゲノムを有し、ポックスウイ
ルスおよびイリドウイルス科に属するウイルスと共通の性質を有する。ヘルペス
ウイルス科に属するヒト感染性ウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス1およ
び2、セルコピルセシン(cercopilthecine)、ヘルペスウイルス1(B-ウイルス))、
水痘-帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、EBウイルスおよびヒトヘ
ルペスウイルス6が挙げられる。ポックスウイルスに属するヒト感染性ウイルス
としては、痘瘡ウイルス(天然痘、アラストリム)、ワクシニアウイルス、サルポ
ックスウイルス、牛痘ウイルス、orfウイルス(感染性膿疱性皮膚炎)、偽牛痘(搾
乳者小結節)ウイルス、ヤナ痘ウイルス、タナ痘ウイルスおよび伝染性軟属腫ウ
イルスが挙げられる。より広くは、単純ヘルペスウイルスはDNAウイルスであり
、このカテゴリーの他のヒト感染性ウイルスは、B型肝炎ウイルス、ヒトパルボ
ウイルスB-19、パルボウイルスRA-1および胃腸炎を引き起こすその他のパルボウ
イルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)1〜48、JC、SV40およびBKのようなポリオ
ーマウイルス、ならびにマストアデノウイルスh1〜h49のようなアデノウイルス
である。

【００５５】 ヒスチダーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、ヒスチジンアナログが存
在しない状態で、ウイルスの複製を阻害することによりウイルスを撲滅すること
ができる。しかし、実施例11において示すように、ウイルスを処理する際、ヒス
チジノールのようなヒスチジンアナログと本発明のポリペプチドを併用すると、
より大きな治療上の効果が得られる。実際に、実施例11において示すようにHAL
およびヒスチジンアナログによる治療を組合せると、相乗効果が認められる。従
って本発明は、単独であるいはヒスチジンアナログと組合せて、ポリペプチドの
ヒスチジン枯渇活性により感染性ウイルスを治療するために使用することができ
るポリペプチドを提供する。

【００５６】癌撃退特性 別の態様においては、本発明のポリペプチドは抗癌剤として機能することがで
きる。in vitroにおいて、本発明のポリペプチドは種々のヒト腫瘍の増殖をコン
トロールするのに有効である。例えば、実施例12において示されるように、種々
の前立腺癌細胞系および卵巣癌細胞系の増殖が、本発明のポリペプチドにより阻
害された。

【００５７】 さらに本発明のポリペプチドは、in vitroにおけるその抗発癌活性により、悪
性腫瘍の増殖をin vivoで阻害するために使用することができる。さらに、以下
に記載するように、本発明の新規ポリペプチドはいずれも他の抗癌剤との併用療
法において使用することができる抗癌剤の適当な候補である。特に、本発明のポ
リペプチドは、ヒスチジノールのようなヒスチジンアナログの存在下でヒスチジ
ンアンモニアリアーゼ活性を保持する新規ポリペプチドの能力により、そのよう
な化合物の存在下で患者に投与することができる。

【００５８】 本発明によって治療することができる癌の種類は多数あり、前立腺癌および卵
巣癌のほか、膠芽腫が含まれる。治療することができるその他の種類の癌として
は、慢性および急性白血病、骨、脳、胸軟骨、子宮頚部、食道、腎臓、喉頭、肝
臓、肺、膵臓および子宮の癌が挙げられる。さらに本発明のポリペプチドは、ホ
ジキン病、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、大腸癌、睾丸癌の治療に使用し得
る。

【００５９】静止期誘導特性 ヒスチジン欠損培地中におけるインキュベーションにより非形質転換哺乳類細
胞を、「制限時点」と呼ばれる細胞周期中の特定の時点において、可逆的な不活
性状態すなわち「静止」状態にすることができることが発見されている(Newman
et al. 1983. Anticancer Research 43:4703)。この静止状態は、DNA合成の欠如
とリボソームRNAおよびタンパク質合成の速度の低下を特徴とする。増殖静止に
関連するこれら代謝作用の事象および一連のその他の代謝作用の事象は可逆的で
、「ネガティブ多面的レスポンス」と名付けられている。栄養上の操作による正
常細胞の可逆的な停止とは異なり、Pardee et al. Annual Rev. Biochem. 47:71
5-750 (1974);およびPardee, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71:1286-1290 (1
974)およびNewman et al., (1983), 前掲、により報告されるように、形質転換
細胞系は制限時点で増殖を停止する能力を喪失しているようである。

【００６０】 正常細胞および悪性細胞間のこの基本的な相違により、正常細胞をそのままに
する条件下で形質転換細胞を選択的に死滅させることができる。例えば、化学療
法剤は増殖する細胞に対して優先的に機能し、細胞周期中の正常組織と細胞周期
中の腫瘍組織を区別する有意な能力はない。以前に、Newman et al., Anticance
r Res. 43: 4703 (1983)は、ヒスチジン欠損培地中で細胞系(BALB/3T3)をインキ
ュベートすることにより該細胞系を静止した状態にすることに成功している。こ
の方法は、メトトレキセートの致死効果から細胞を保護したものである。Warrin
gton, Anticancer Res. 6:451 (1986)およびBiochem. Cell Biol. 70:365 (1992
)は同様な知見を報告しているが、ヒスチジン欠損培地の代わりにヒスチジンア
ナログを用いている。これらの知見は、Warrington (1986、前掲)の、腫瘍細胞
集団が正常細胞より高い増殖部分を有する場合、化学療法剤は選択的なものとな
るという結論を導いた。したがって、腫瘍細胞の増殖に影響を与えずに正常な細
胞の増殖を停止させることは、癌化学療法において一般に使用される抗増殖剤に
選択性を与えるものとなり得る。

【００６１】 この点において、ヒスチジンアンモニアリアーゼのヒスチジン枯渇活性は、腫
瘍細胞の増殖に影響せずに正常な細胞の増殖停止を引き起こすことから、ヒスチ
ジンアンモニアリアーゼは、循環するヒスチジンを選択的に枯渇させるための適
当な候補である。L-ヒスチジノールのようなヒスチジンアナログの存在下でヒス
チジンアンモニアリアーゼ活性が実質的に低下しない場合、ヒスチジンアンモニ
アリアーゼはヒスチジンアナログと組合せて使用することができる。従って、化
学療法剤は静止細胞とは反応しにくくなり、患者に対する毒性がより低いものと
なり、それにより癌化学療法の治療指数が上昇する。

【００６２】 ある実施形態においては、癌化学療法を最初に受ける患者に、有効量のヒスチ
ジンアンモニアリアーゼを注射(例えば体重kg当たり1μg〜1gの間、静脈内投与)
することができる。その後、ヒスチジンアンモニアリアーゼ注射の約24時間後に
、例えば本明細書に記載したもののいずれかのような慣用の化学療法剤を患者に
投与することができる。しかし本発明はさらに、ヒスチジンアンモニアリアーゼ
の注射の約24時間後に患者に慣用の化学療法剤を数回投与する方法も提供する。
化学療法の種類は癌の種類によって変わり、また特定の患者に対する化学療法剤
の適合性によっても変わる。

【００６３】 さらに別の本発明の態様においては、ヒスチジンアンモニアリアーゼを癌遺伝
子治療の特異性を増強するために使用することができる。レトロウイルスベクタ
ーは、選択的に腫瘍細胞を死滅させるための治療用遺伝子を送達するために一般
に用いられている運搬体の1つである。しかしレトロウイルスには、細胞周期中
の正常および腫瘍組織を区別する有意な能力はなく、増殖する細胞へDNAを送達
する。従って、レトロウイルス療法も、人体において所定の時間に増殖している
非標的の健常(すなわち非腫瘍)細胞を多数死滅させるという問題を抱えている。
このような問題を解決するために、ヒスチジンアンモニアリアーゼを患者に最初
に投与し、それにより正常(すなわち非腫瘍)細胞を可逆的な静止状態とすること
ができる。例えば、ポリエチレングリコールと反応させたHAL(PEG化HAL)を1μg
〜1g/体重kg、レトロウイルスベクターの注射の24時間前に患者に静脈注射する
ことができる。この処理により、癌細胞の増殖に影響を与えずに正常な細胞の増
殖が停止される。その結果、レトロウイルスベクターは増殖する癌細胞を選択的
に標的とすることになる。

【００６４】免疫抑制剤特性 別の実施形態においては、本発明は、患者に免疫抑制剤を送達するための方法
を提供する。ヒスチジンアンモニアリアーゼの酵素作用の産物はトランス-ウロ
カニン酸(t-UA)およびアンモニアである。Hanson et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A, 95:10576-10578 (1998)によって指摘されているように、約310 nmに
おける照射によりt-UAがそのシス異性体(c-UA)に光異性化する。シス-ウロカニ
ン酸はUVB誘導免疫抑制性のメディエーターの1つの役割を果たすと考えられてい
る(Kripke, Cancer Res. 54: 6102-6105 (1994);およびNorval et al., Photoch
em. Photobiol. 62: 209-217 (1995))。このウロカニン酸の免疫抑制特性は、例
えば、免疫系疾患の治療、および移植臓器の拒絶を防ぐために使用することがで
きる。

【００６５】 理論的にはそのようなアプローチは治療上の利益を与えるものであるが、ウロ
カニン酸のような小さな分子は迅速に循環系から消失し、長時間にわたり有効な
免疫抑制剤としてのそれらの使用は限られたものとなる。しかし、PEG化HALはマ
ウスにおいて長い循環半減期(48時間以上)を有することが見出された。したがっ
て、ヒスチジンアンモニアリアーゼの有効な投与量(体重kg当たり1μg〜1g)を使
用して長時間にわたり循環するウロカニン酸を生成することができる。一方、UV
B照射のようなシス異性化剤は、局所的免疫抑制作用(乾癬のような症状のために
)を生じさせるために使用することができ、あるいは全身的な免疫抑制のために
使用することができ、この場合は患者は全身に照射される。例えば、移植後の臓
器拒絶を治療するために本発明に従って全身照射を使用することができる。

【００６６】 別の実施形態では、標的に対してUVB照射を行うことにより選択的な免疫抑制
を達成することができる。例えば、ヒスチジンアンモニアリアーゼを注射し、そ
の後罹患部位を選択的に照射することにより乾癬を治療し得る。ヒスチジンアン
モニアリアーゼの患者への注射後の選択的なUVB照射は、関節炎のような症状を
治療するためにも使用することができる。

【００６７】 さらに別の実施形態においては、ヒスチジンアンモニアリアーゼを特定の臓器
に向かわせることにより免疫抑制の局所化および／または特異性を達成し得る。
この目的のために、本発明は、選択されたヒスチジンアンモニアリアーゼのコー
ド領域に加えて1以上の標的に向かわせるペプチド配列を含む融合タンパク質を
提供する。Pasqualini et al. Nature 380: 364-366 (1996)は、この方法によっ
て特定の臓器へ様々なタンパク質を向かわせることに成功したことを報告してい
る。

【００６８】治療方法 治療方法は、治療上有効な量の本発明により提供されるポリペプチドを、治療
を必要とする対象に投与することを含む。本明細書で使用する「治療上有効な」
とは、癌増殖を阻害または後退させる(例えばアポトーシスを誘導する)のに十分
な量のペプチドの量を示すために使用する。いくつかの方法では、既知の抗癌剤
または療法、例えば化学療法(好ましくは上記した種類の化合物を使用した)もし
くは放射線照射との併用療法を使用する。患者はヒトもしくは非ヒト動物であっ
てもよい。患者は通常、癌のような疾患に罹患しもしくは上記のウイルスに感染
した場合に治療を要する。

【００６９】 先に示したように、本発明の新規ポリペプチドのヒスチジンアンモニアリアー
ゼ活性は、ヒスチジノールのようなヒスチジンアナログの存在下で実質的に減少
しない。従って典型的な方法は、本明細書に記載した方法により患者に新規なポ
リペプチドおよび選択されたヒスチジノールの両方を投与することを含む。ある
実施形態においては、選択されたヒスチジノールと同時に本発明の新規ポリペプ
チドを投与することができる。別の実施形態においては、新規なポリペプチドを
最初に患者に投与し、その後選択されたヒスチジノールを投与する。さらに別の
実施形態においては、ヒスチジノールのようなヒスチジンアナログを最初に患者
に投与し、その後新規なポリペプチドを投与する。本発明はさらに、本明細書に
記載された方法によって、本発明の新規ポリペプチドを複数回投与し、選択され
たヒスチジノールを投与することも意図する(すなわち新規なポリペプチドを複
数回投与し、その後ヒスチジノールのようなヒスチジンアナログを少なくとも1
回投与する)。

【００７０】 in vivo治療の間の投与は、非経口、経口などの経路をいくつ使用してもよい
が、好ましくは非経口投与である。カプセル内、静脈内、髄腔内および腹腔内の
投与経路を使用することができ、一般に静脈内が好ましい。当業者であれば、治
療するべき疾患の種類により投与経路が変わることは理解し得るであろう。

【００７１】 本発明に従い、新規なポリペプチドの治療上有効な量を決定することは、特定
の患者の特徴、投与経路、および治療されている疾患の性質に大きく依存する。
一般的な指標としては、例えばInternational Conference on Harmonisationの
出版物およびREMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, chapters 27 and 28, pp
. 484-528 (Mack Publishing Company 1990)に記載されている。

【００７２】 治療上有効な量の決定は、医薬の毒性および効能のような要因に特異的に依存
する。毒性は、当分野において周知であり前記参考文献に見られるような方法を
用いて決定することができる。効能は、実施例において後記する方法により、同
様の指標を使用して決定することができる。従って、薬学的に有効な量は、毒物
学上許容できるが、有効であると臨床医によって認められる量である。効能は、
例えば、標的組織におけるTリンパ球細胞毒性の誘導あるいは実質的な誘導、ま
たは標的組織量の減少によって測定することができる。

【００７３】 適当な投与量は、好ましくは体重kg当たり1μg〜1g、より好ましくは体重kg当
たり2mg〜10mgである。

【００７４】 前記組成物は癌治療において有用であるので、他の慣用の治療方法と併用する
ことができる。慣用の方法としては、ヒスチジノールのようなヒスチジンアナロ
グを投与することが挙げられる。そのような治療の形態はさらに慣用の化学療法
剤を含む。慣用の化学療法剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、種々の天然
物(例えばビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質およびアミ
ノ酸消費酵素)、ホルモンおよびホルモン拮抗剤が挙げられる。特定の薬剤の群
としては、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア
、トリアゼン、葉酸アナログ、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、プラチナ
錯体、副腎皮質反応阻害薬、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン
、抗エストロゲンおよびアンドロゲンが挙げられる。化合物の例としては、シク
ロフォスファミド、クロラムブチル、メトトレキセート、フルオロウラシル、シ
タラビン、チオグアニン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、
ダウノルビシン、マイトマイシン、シスプラチン、ヒドロキシウレア、プレドニ
ゾン、ヒドロキシロゲステロンカプロエート、メドロキシプロゲステロン、メゲ
ストロールアセテート、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオー
ル、タモキシフェン、テストステロンプロピオネートおよびフルオキシメステロ
ンが挙げられる。乳癌の治療においては、例えば、タモキシフェンが特に好まし
い。

【００７５】 本発明はさらに、本発明のペプチドをアルキル化剤、代謝拮抗剤、種々の天然
製品(例えばビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質あるいは
アミノ酸消費酵素)、ホルモンおよびホルモン拮抗剤と共に患者に投与すること
を提供する。特定の薬剤の群としては、ナイトロジェンマスタード、アルキルス
ルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸アナログ、ピリミジンアナログ
、プリンアナログ、プラチナ錯体、副腎皮質反応阻害薬、副腎皮質ステロイド、
プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲンおよびアンドロゲンが挙げられる
。典型的な化合物としては、シクロフォスファミド、クロラムブチル、メトトレ
キセート、フルオロウラシル、シタラビン、チオグアニン、ビンブラスチン、ビ
ンクリスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、シスプラチ
ン、ヒドロキシウレア、プレドニゾン、ヒドロキシロゲステロンカプロエート、
メドロキシプロゲステロン、メゲストロールアセテート、ジエチルスチルベスト
ロール、エチニルエストラジオール、タモキシフェン、テストステロンプロピオ
ネートおよびフルオキシメステロンが挙げられる。

【００７６】本発明のポリペプチドの構築 本発明のポリペプチドは慣用の手段により単離することができ、本発明は本発
明により提供される所望のポリペプチドを製造する特定の方法のいずれにも限定
されない。しかし、提供される組換え法による製造方法によれば、本発明は、本
発明に記載するドメインの1以上のヌクレオチド配列を含む組換えDNA構築物を提
供する。本発明の組換え構築物は、通常はオープンリーディングフレームを有す
るDNAまたはDNA断片をいずれかの方向に挿入した、プラスミドもしくはウイルス
ベクターのようなベクターを含む。本発明はさらに、このようなベクターを含む
細胞を提供する。

【００７７】 この目的のために、新規なポリペプチドをコードするDNAをまず周知の技術を
使用して単離する。例えば実施例1は、そのような標的ゲノムDNAを単離するため
の非限定的な一方法を示すものである。この方法は選択された細胞を培養し、培
養物からゲノムDNAを抽出し、その後DNAを一連の制限酵素で処理することを含み
、これにより生成されたDNA断片を研究し、例えばアガロースゲル電気泳動のよ
うな慣用の技術により単離することができる。

【００７８】 次に、ベクターを選択し、ゲノムDNAを単離するのに使用した手順に適合する
方法により制限酵素で切断してベクター断片を生成させることができる。以下に
記載するように、適当なベクターとしては細菌および哺乳類の発現系が挙げられ
る。適当なベクターを選択した後、実施例1において示すように、DNA断片（挿入
物）の濃度を変えてベクターと接触させ、DNA断片の形質転換のための最適な挿
入物：ベクター比を決定することができる。その後形質転換体を培養してDNA断
片のコピーを生成することができる。

【００７９】 生成されたDNA断片から新規なポリペプチドのドメインを単離するために、公
知のヒスチジンアンモニアリアーゼにおいて高度に保存されている配列を選択す
ることによりDNAプローブを設計することができる。実施例1において示すように
、Wisconsin Graphics GCGパッケージパイルアッププログラムにより、高度に保
存された領域を決定する1つの方法が提供される。選択したプローブを使用し、
例えばAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, (John Wile
y & Sons, 1994)に記載された技術を用いて、標的とするゲノムDNAライブラリー
をスクリーニングすることができる。実施例1は適当なプローブを使用してゲノ
ムライブラリーをスクリーニングし、その後ゲノムクローンを精製する一連のス
テップを行うための非限定的な実施形態を示すものである。

【００８０】細菌による発現 細菌に使用するのに有用な発現ベクターは、機能するプロモーターを有する制
御可能なリーディングフェイズ中に適当な翻訳開始および終結シグナルとともに
所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。
ベクターは1以上の表現型として選択マーカーと複製開始点を含み、ベクターを
維持するとともに、所望の場合は宿主中での増幅を与えるものとする。形質転換
のための適当な原核生物の宿主としては、大腸菌、Bacillus subtilis、Salmone
lla typhimuriumおよびシュードモナス、ストレプトマイセスおよびストレプト
コッカス属の種々の種を含むが、その他のものも選択して使用され得る。好まし
い実施形態においては、実施例3に示すように原核生物宿主は大腸菌である。

【００８１】 細菌用のベクターは、例えばバクテリオファージ、プラスミドあるいはコスミ
ドに基づくものとすることができる。これらのベクターは、選択マーカーと、典
型的には周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)のエレメントを含む市
販品として入手可能なプラスミドの、細菌用複製開始点を含む。そのような市販
のベクターとしては、例えば、GEM 1 (Promega Biotic, Madison, WI, USA)、pB
S、Phagescript、PsiX74、pBluescript SK、pBS KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、p
NH46a (Stratagene)、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pKK232-8、pDR540およびp
RIT5 (Pharmacia)が挙げられる。本発明の好ましいベクターは、Bluescriptベク
ター(pBSSK、Stratagene)である。

【００８２】 これらの「骨格」部分を、適当なプロモーターおよび発現させようとする構造
配列と組合せる。細菌用のプロモーターとしては、lac、T3、T7、ラムダP_Rまた
はP_L、trpおよびaraが挙げられる。T7プロモーターが好ましい。

【００８３】 適当な宿主株を形質転換し、適当な細胞密度まで宿主株を増殖させた後、選択
されたプロモーターを適当な手段(例えば温度変化あるいは化学的誘導)により脱
抑制および誘導し、その後さらに細胞を培養する。細胞は通常は遠心分離により
回収し、物理的あるいは化学的手段によって破砕し、得られた粗抽出物をその後
の精製のために確保する。

【００８４】真核生物における発現 種々の哺乳動物細胞培養系も組換えタンパク質発現のために使用することがで
きる。哺乳動物発現系の例としては、選択されたマウスL細胞、例えばチミジン
キナーゼ陰性(TK)、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ陰性 (APRT)細
胞が挙げられる。その他の例としては、Gruzman, Cell 23:175 (1981)に記載さ
れたサル腎臓繊維芽細胞のCOS-7細胞系、および互換性ベクターを発現できるそ
の他の細胞系、例えばC127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞系が挙げられる。
哺乳動物の発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー
、並びに必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシン
グドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列および5'隣接非転写配列を含む
。例えばSV40ウイルスゲノムに由来するDNA配列、SV40の複製起点、初期プロモ
ーター、エンハンサー、スプライシングおよびポリアデニル化部位を使用して必
要な非転写遺伝子エレメントを得ることができる。

【００８５】 哺乳動物プロモーターとしては、CMV即時初期、HSVチミジンキナーゼ、初期お
よび後期SV40、レトロウイルスからのLTRおよびマウスメタロチオネイン-Iが挙
げられる。哺乳動物用ベクターの例としてはpWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pS
G(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL(Pharmacia)が挙げられる。

【００８６】 哺乳動物宿主細胞では、ウイルスに基づいた多くの発現系を利用することがで
きる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、対象のコード配列を
アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび3分割リー
ダー配列に結合することができる。その後、このキメラ遺伝子はin vitroあるい
はin vivoでの組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。
ウイルスゲノムの非必須領域(例えばE1あるいはE3領域)に挿入することにより、
感染宿主中で生存可能で標的タンパク質を発現することができる組換えウイルス
が得られる(例えばLogan et al., 1984, Proc. Nail. Acad. Sci. USA 81:3655-
3659参照)。

【００８７】半減期の延長および本発明のペプチドに対する抗体形成の阻止(PEG化) 本発明はさらに、延長された半減期を有するように誘導したポリペプチドを提
供する。この目的のために、前記ポリペプチドをポリエチレングリコールによる
修飾(PEG化)のような従来の技術によって操作する。この方法によれば、標的の
細胞培養物または組織に本発明のポリペプチドを導入する前に、適当な量のPEG
化剤をポリペプチドと反応させる。ある実施形態においては、PEG化剤はBTC-PEG
5000 (Shearwater Polymers Inc.)であるが、本発明においては他のPEG化剤も
使用し得る。実施例10に、本発明によるPEG化ペプチドを構築するための非限定
的な方法を示す。

【００８８】 PEG化ポリペプチドはin vitroおよびin vivoのいずれにおいても実用的な用途
を有する。例えば、より長期間その酵素化学的性質を維持しうるポリペプチドの
性能により、目的の疾患に関連する1以上の症状を改善するために必要な投与量
を減少させることができる。さらにPEG化ポリペプチドは、宿主中での抗体を介
した消費に対するより高い抵抗性を有し得る。この実施形態によれば、PEG化剤
は、該ポリペプチドに対する宿主の抗体媒介反応を阻害すると考えられる。

【００８９】遺伝子治療への使用 本明細書に開示する新規なポリペプチドをコードするDNA配列の発見により、
本発明はこれらの配列の遺伝子治療方法における使用を提供する。この目的のた
めに、プロモーターおよび本発明のポリペプチドをコードするDNAをベクターに
挿入し、これを癌や感染性ウイルスなどの疾患に罹患する被験者に導入する。

【００９０】 適当なベクターは、外来DNAのベクターへの挿入のための当分野で周知の方法
のいずれかを用いて構築することができる。例えば、Sambrook et al., Molecul
ar Cloning (Cold Spring Harbor Press 2d ed. 1989)を参照。この文献は引用
により本明細書の一部とする。さらに、先行技術により外来遺伝子をin vivoで
細胞に導入する種々の方法が示されている。Rosenberg et al., Science 242:15
75-1578 (1988)およびWolff et al., PNAS 86:9011-9014 (1989)を参照。これら
の文献は引用により本明細書の一部とする。送達の経路としては、全身投与およ
びin situ投与が挙げられる。周知の技術としては、カチオン性リポソームの全
身投与、ウイルスベクターのin situ投与が挙げられる。先行技術に記載された
遺伝子送達方法はいずれも、MTX耐性で輸送不全の癌細胞に本発明の遺伝子を含
む組換えベクターを導入にするのに適している。本発明のこの目的に適当な現在
利用可能なベクターのリストはHodgson, Bio/Technology 13: 222 (1995)に記載
されている。この文献は引用により本明細書の一部とする。

【００９１】 例えば、リポソームが介在する遺伝子導入は、MTX耐性で輸送不全の癌細胞に
本発明の遺伝子を含む組換えベクターを導入するために適当な方法である。カチ
オン性リポソーム、例えばDC-Chol/DOPEの使用は、DNA/カチオン性リポソーム複
合体の静脈内注射により広範な組織にDNAを送達するための適当なビヒクルとし
て広く文献に記載されている。Caplen et al., Nature Med. 1:39-46 (1995)お
よびZhu et al., Science 261:209-211 (1993)を参照。これらの文献は引用によ
り本明細書の一部とする。リポソームは、原形質膜と融合することにより遺伝子
を標的細胞中に導入する。侵入プロセスは比較的効率的であるが、一旦細胞の内
側に入ると、リポソームDNA複合体は核にDNAを送達するための固有のメカニズム
を有していない。そのままでは、脂質およびDNAの大部分が細胞質の廃棄系に入
り、破壊される。遺伝子治療用ベクターとしてのリポソームの明らかな利点は、
リポソームがタンパク質を含まず、そのため宿主の免疫応答の可能性を最小限に
するということである。

【００９２】 別の例として、ウイルスベクターを介する遺伝子導入も標的細胞中へのベクタ
ーの導入のための適当な方法である。適当なウイルスベクターとしては、アデノ
ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよ
びヘルペスウイルスベクターが挙げられる。

【００９３】 アデノウイルスはコアタンパク質と複合化した直鎖状の二本鎖DNAウイルスで
あり、カプシドタンパク質で包まれている。通常、ヒトの悪性腫瘍のいずれにも
関連していない共通の血清型2および5を基本ベクターとする。ウイルスゲノムの
一部を欠失させ、構成的なウイルスプロモーターの制御下に所望の遺伝子を挿入
することにより、ウイルスは、外来DNAを分化した非増殖性の細胞に導入するこ
とができる複製欠損ベクターとなる。細胞中に入るために、アデノウイルス繊維
は細胞表面上の特定のレセプターと相互作用し、かつアデノウイルス表面タンパ
ク質は細胞表面インテグリンと相互作用する。ウイルスペントン-細胞インテグ
リンの相互作用により、外来遺伝子含有ウイルスを細胞質エンドソームに運ぶシ
グナルが与えられる。アデノウイルスはエンドソームから出て核中に移動し、ウ
イルスカプシドは離脱し、外来DNAが細胞核中に入り、そこで染色体外で機能し
て外来遺伝子を発現する。遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの使用に
ついての詳細な説明は、Berkner, Biotechniques 6:616-629 (1988)およびTrapn
ell, Advanced Drug Delivery Rev. 12:185-199 (1993)に見られる。これらの文
献は引用により本明細書の一部とする。アデノウイルスから誘導されたベクター
、特に複製不能アデノウイルスベクターは、7.5 kBの外来DNAを収容する能力が
あること、比較的安定であること、宿主範囲が広いこと、ヒトにおける低い病原
性および高い力価(細胞あたり10⁴〜10⁵のプラーク形成単位)を有することを特徴
とする。Stratford-Perricaudet et al., PNAS 89:2581 (1992)参照。

【００９４】 さらにアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターも本発明に使用することができる。A
AVは多くの哺乳動物種に内在する直鎖状の一本鎖DNAパルボウイルスである。AAV
は、AAVがin vivoにおけるその複製についてアデノウイルスまたはヘルペスウイ
ルスに完全に依存する欠陥パルボウイルスであるという制限にもかかわらず、広
い宿主範囲を有している。外来DNAを標的細胞中へ導入するためのベクターとし
てのAAVの使用は、当分野において周知である。例えばLebkowski et al., Mole.
& Cell. Biol. 8:3988 (1988)を参照。この文献は引用により本明細書の一部と
する。これらのベクターにおいては、AAVのカプシド遺伝子を所望のDNA断片によ
り置換し、欠失したカプシド機能の相互相補性を用いて組換えウイルスストック
を作製する。感染後、組換えウイルスは核においてコートを脱落させ、宿主ゲノ
ム中に組み込まれる。

【００９５】 別の適当なウイルスに基づいた遺伝子送達メカニズムはレトロウイルスベクタ
ーを介した遺伝子導入である。一般に、レトロウイルスは当分野において周知で
ある。Breakfield et al., Mole. Neuro. Biol. 1:339 (1987)およびShih et al
., in Vaccines 85: 177 (Cold Spring Harbor Press 1935)を参照。種々のレト
ロウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターを産生する細胞系を本発明に
使用することができる。適当なレトロウイルスベクターとしては、モロニーマウ
ス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ハーヴィー
肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脊髄増殖性肉腫ウ
イルスおよび乳癌ウイルスのようなレトロウイルスから誘導されたベクターが挙
げられる。これらのベクターは、複製可能および複製欠損レトロウイルスベクタ
ーを含む。さらに、両種指向性および他種指向性レトロウイルスベクターを使用
することができる。本発明を実施する際には、レトロウイルスベクターを腫瘍に
直接あるいは遊離レトロウイルスベクター産生細胞系の形で導入することができ
る。適当な産生細胞としては、繊維芽細胞、ニューロン、膠細胞、ケラチノサイ
ト、肝細胞、結合組織細胞、上衣細胞、クロム親和性細胞が挙げられる。Wolff
et al., PNAS 84:3344 (1989)参照。

【００９６】 レトロウイルスベクターは一般に、構造遺伝子の大部分が欠失されて、対象の
外来DNAで置換され、ウイルスタンパク質が発現される可能性が低下するように
構築される。Bender et el., J. Virol. 61:1639 (1987)およびArmento et al.,
J. Virol. 61:1647 (1987)参照。これらの文献は引用により本明細書の一部と
する。新規なタンパク質の発現を促すために、本発明において使用するレトロウ
イルスベクターは宿主細胞ゲノムのゲノムに組み込まれなければならないが、こ
れは有糸分裂活性を有する細胞においてのみ起こる事象である。宿主細胞複製の
必要性は、レトロウイルス遺伝子発現を、非常に複製活性が高い腫瘍細胞と少数
の正常組織に効率よく限定する。したがって、理論上最もレトロウイルスベクタ
ーによって形質導入されやすい正常組織細胞は、腫瘍に血液を供給している血管
の内側を覆う内皮細胞である。さらに、レトロウイルスベクターは腫瘍または腫
瘍の中を循環する血液中の白血球に組み込まれることもあり得る。

【００９７】 しかし、正常な組織へのレトロウイルスベクターの拡散は限定的なものである
。レトロウイルスベクターあるいはレトロウイルスベクター産生細胞の局所的な
投与では、ベクターの伝搬が腫瘍の局所的領域に限定され、形質導入、組込み、
発現、それに続く有糸分裂活性を有する周囲細胞に対する細胞毒性が最小限のも
のとなる。

【００９８】 複製欠損レトロウイルスベクターおよび複製可能レトロウイルスベクターのい
ずれも本発明に使用することができるが、それぞれの利点と欠点がある。例えば
、肺癌のような、より広範囲の腫瘍には、複製欠損ベクターを産生する細胞系を
直接注射しても、完全に腫瘍を根絶するのに十分な領域にベクターが送達されな
い可能性があり、これはベクターがもとの産生細胞およびその子孫のみから放出
され、拡散が制限されるからである。同様の制限はゆっくりと増殖する腫瘍に複
製欠損ベクターを適用する場合にもあてはまり、そのような腫瘍としてはヒト乳
癌が挙げられ、これはヒト神経膠腫が通常24時間で2倍になるのに対し30日を要
する。産生細胞の生存期間は非常に短いため（おそらく免疫抑制の非存在下で7
〜14日未満）、腫瘍細胞がレトロウイルスベクターに暴露されるのがその複製サ
イクルのほんの一部に限定される。

【００９９】 腫瘍を治療するための複製欠損レトロウイルスの使用は、産生細胞を必要とし
、また、各複製欠損レトロウイルス粒子は単一の細胞のみに入り、その後その他
の細胞に感染することができないので限定される。このような複製欠損レトロウ
イルスは他の腫瘍細胞に複製伝播することができないので、それらはin vivoに
おいて深い多層状の腫瘍に完全に浸透することはできないと考えられる。Marker
t et al., Neurosurg. 77: 590 (1992)を参照。複製可能なレトロウイルスベク
ターウイルス粒子または複製可能なレトロウイルスベクターウイルスを産生する
細胞系の注射が治療上より効果的であるかもしれない。なぜなら、複製可能なレ
トロウイルスベクターは、それが持続する限り、細胞を形質導入する増殖性感染
を確立すると考えられるからである。さらに、複製可能なレトロウイルスベクタ
ーは、腫瘍が転移すると、それに従って運ばれ、形質導入腫瘍細胞により増える
可能性がある。しかし、複製可能なベクターでは合併症の危険はより大きくなる
。そのようなベクターは、例えば、正常な組織を形質導入するという、複製欠損
ベクターよりも大きい危険をもたらすかもしれない。癌のそれぞれのタイプおよ
び影響される身体領域に対する望ましくないベクター増殖の危険を、複製欠損レ
トロウイルスベクターに対する複製可能レトロウイルスベクターの場合の利点と
比較して操作し、最適な治療を決定することができる。

【０１００】 両種指向性および他種指向性レトロウイルスベクターの両者を本発明において
使用し得る。両種指向性ウイルスは、当分野で周知のように、殆どあるいはすべ
ての哺乳動物細胞を含めて、非常に広い宿主域を有する。他種指向性ウイルスは
マウス細胞以外のすべての哺乳動物細胞に感染し得る。したがって、ベクターが
増殖性ヒト細胞に遺伝子をin vivoで導入できる限り、特にウシ、ヒツジ、ブタ
、イヌ、ネコ、ラット、マウス等を含む多くの種から得られた両種指向性および
他種指向性レトロウイルスを使用して本発明のレトロウイルスベクターを提供す
ることができる。

【０１０１】 癌のレトロウイルスベクター治療を使用する臨床試験は米国で承認されている
。Culver, Clin. Chem. 40: 510 (1994)を参照。レトロウイルスベクター含有細
胞がヒト患者の増殖する脳腫瘍に移植されている。Oldfield et al., Hum. Gene
Ther. 4:39 (1993)参照。これらのレトロウイルスベクターは、HSV-1チミジン
キナーゼ(HSV-tk)遺伝子を周辺脳腫瘍細胞に運ぶものであり、これにより腫瘍細
胞に抗ウイルス薬ガンシクロビルに対する感受性が賦与される。現在のレトロウ
イルスに基づく癌治療の制限としては、Oldfieldによって記載されるように、(1
)産生されたウイルスの力価が低いこと、(2)ウイルスの伝播が産生細胞移植物の
周辺の領域に限定されること、(3)産生細胞系に対する免疫応答が起こり得るこ
と、(4)レトロウイルス感染細胞の挿入突然変異誘発および形質転換が起こり得
ること、(5)「自殺」産物がレトロウイルスに感染した細胞および産生細胞を死
滅させるため、プロドラッグのガンシクロビルの単一治療計画しか可能でないこ
と、(6)バイスタンダー効果がレトロウイルスで形質転換された細胞と直接接触
している細胞に限定されること、などが挙げられる。Bi et al., Human Gene Th
erapy 4:725 (1993)参照。

【０１０２】 さらに別の適当なウイルスに基づく遺伝子送達メカニズムはヘルペスウイルス
ベクターを介する遺伝子導入である。ヘルペスウイルスベクターの使用に関して
の知見はさらに少ないが、複製可能なHSV-lウイルスベクターが抗腫瘍治療に関
連して記載されている。Martuza et al., Science 252: 854 (1991)参照。この
文献は引用により本明細書の一部とする。

【０１０３】 （実施例） 下記の実施例は、例示を意図するもので限定的なものではない。

【０１０４】実施例1: HALをコードするDNAの単離 コリネバクテリウム科からの生物学的に活性なヒスチジンアンモニアリアーゼ
(HAL)を産生する細菌を100 mlのLuria液体培地中30℃で一晩増殖させた。菌体を
回収し、10 mM EDTAを含有する50 mM トリス(pH 7.5) 10 mlに再懸濁した。固体
リゾチームを0.2 mg/mlで加え、懸濁物を4℃で30分間インキュベートした。この
インキュベーションの後、懸濁物を-70℃で数時間凍結させた。解凍時に、SDSを
0.1%となるように加え、プロテイナーゼKを0.2 mg/mlで加え、37℃で一晩インキ
ュベートした。次に、RNアーゼを0.1 mg/mlで加え、この混合物を55℃で30分間
インキュベートした。得られたDNAを等量のフェノール/クロロホルム(1:1)で5回
抽出し、2倍容量の無水エタノールで沈殿させた。DNAをガラスパスツールピペッ
トで巻取り、70%の氷冷エタノールで洗浄し、最小量のTEバッファー中に再懸濁
した。

【０１０５】 ゲノムDNAを1時間にわたりSau3AIで制限酵素処理した。10分ごとにアリコート
を採取し、10 mM EDTAにとり、アガロースゲル電気泳動により分析した。1〜5 k
bの平均断片サイズを示す時点で全体をロードし、アガロースゲル上で分離した
。1〜5 kbの断片をDEAEフィルターペーパーで単離し、フェノールで抽出し、エ
タノールで沈殿させた。

【０１０６】 BluescriptベクターpBSSK-(Stratagene)をBamHIで制限酵素処理し、北極小エ
ビアルカリホスファターゼ(USB)で処理した。処理して線状化されたベクターを
アガロースゲル電気泳動にかけ、線状物をDEAEフィルターペーパーで上記のよう
に単離した。

【０１０７】 得られたベクターおよびゲノムDNA断片の濃度を測定し、連結反応を行った。
これらの操作は150 ngのベクターを使用して10μlの反応容量で行った。ベクタ
ー濃度を一定に保ち、挿入物は0X、0.5X、1X、2Xおよび5Xベクター濃度の化学量
論で変化させた。連結反応は4℃で一晩行った。連結後、反応液を水で30μlに希
釈し、10分間65℃に加熱した。

【０１０８】 希釈した連結反応物を使用して新たに調製したエレクトロコンピテントXL-1Bl
ue MRF’(Stratagene)細胞を形質転換した。形質転換した連結物をMacConkey寒
天培地上にプレートして試験することにより最良の挿入物：ベクター比を決定し
た。決定した最適比をいずれの形質転換にも使用した。

【０１０９】 形質転換体を50μg/mlアンピシリンを含むLB寒天培地の150 mmプレート上にナ
イロンフィルターあたり3000〜10000 cfuの細胞密度で平板培養した。各2枚の複
製フィルターを作製し、コロニーハイブリダイゼーション用に処理した。

【０１１０】 DNAプローブは、HALに保存されている可能性が非常に高い公知のヒスチジンア
ンモニアリアーゼの領域を使用して設計した。Wisconsin Graphics GCGパッケー
ジパイルアッププログラムを使用して、B. subtilis、S. griseus、P. putidaお
よびラットからの公知のヒスチジンアンモニアリアーゼのペプチド配列について
アラインメントを行い、高度に保存された領域について調べた。これらのうちい
くつかのものをプローブ設計のための候補として選択した。コリネバクテリアか
らのクローン化遺伝子のDNA配列を使用して、コドン優先度の表を作成した。こ
れから逆に翻訳し、対象のタンパク質領域のものとして最も可能性の高いDNA配
列を得た。

【０１１１】 下記表1に示す、得られたプローブのうちの2つ(TM63およびTM74)を標識し、混
合し、上記のゲノムライブラリーをスクリーニングするために使用した。文献記
載のように(Ausubel, et al, eds, 1994. “Current Protocols in Molecular B
iology”, John Wiley and Sons, Inc.,)、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用
してγ³²PATPでオリゴを標識し、Elutips (Schleicher & Schuell))を使用して
洗浄した。文献記載のように(Ausubel, et al, eds, “Current Protocols in M
olecular Biology”, John Wiley and Sons, Inc., 1994)、SSPEプロトコルを使
用して37℃のBellcoハイブリダイゼーションオーブン中で各2枚のフィルターの
ハイブリダイゼーションを行った。0.5% SDSを含む6X SSC(Ausubel, et al, eds
, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Inc.,
1994)でフィルターを37℃で洗浄した。その後、フィルターを順次高くなる温度
において3 M TMAC(Ausubel, et al, eds, “Current Protocols in Molecular B
iology”, John Wiley and Sons, Inc., 1994)中で、サーベイメーターで放射能
が殆ど検出できなくなるまで洗浄した(一般に45〜55℃)。X線フィルム(Kodak X-
Omat)に露光し、両方の複製フィルターにおいて明らかに認められたコロニーを
木製の楊枝で採取し、LB/アンピシリンプレート上に重層した新しいナイロンフ
ィルターに移した。均質な集団が得られるまでこの手順を繰り返した。

【０１１２】

【表１】 オリゴヌクレオチドとそのDNA配列およびATG開始コドンに対する近似の位置

【０１１３】 精製したクローンは、DNAの配列を決定し、公知のペプチド配列および文献か
ら公知のヒスチジンアンモニアリアーゼ並びにコリネバクテリウム科に属する細
菌からの確実なヒスチジンアンモニアリアーゼからのペプチド配列と比較して確
認した。このプロトールを使用して、主要なクローンpHUT23を単離し、このクロ
ーンがHALコード配列を含むことを確認した。

【０１１４】 pHUT23の最もN-末端側の領域に対してオリゴTM85を合成し、前記ゲノムライブ
ラリーをさらにスクリーニングするのに使用した。これにより2つのクローン、p
HUT26およびpHUT28が得られ、これらは該遺伝子のよりN-末端に向かう配列を含
む。これらのクローンは、該遺伝子のC-末端2/3に相当する。別のオリゴTM91を
最もN-末端側の配列に基づいて合成した。このオリゴを使用して既存のライブラ
リープレートの再スクリーニングを行った。これによりpHUT30が単離され、これ
は該遺伝子のN-末端1/3を含む。この遺伝子の確実性は、コリネバクテリウム科
からの細菌から単離されたオリジナルの酵素から得られたペプチド配列と比較す
ることにより確認した。

【０１１５】 完全長遺伝子およびゲノムサブクローンの両方を使用して、Sangerのチェーン
ターミネーションDNA配列決定法(USB)により、ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺
伝子を両方向について配列決定した。使用したプライマーとともに表1に示した
、精製された二本鎖テンプレートを標準的なアルカリ変性法により変性させた。

【０１１６】 配列データにより、完全な遺伝子は1533塩基対(配列番号12参照)を含み、511
アミノ酸からなるタンパク質(配列番号10参照)をコードすることが明らかになっ
た。このオープンリーディングフレームの大腸菌での発現により、変性ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により検出して(図5参照)、単一の約55kDaのポリペプチ
ドが得られる。この55 kDaのペプチドの出現は、完全長HAL遺伝子を含むプラス
ミドを保持する大腸菌においてのみこれらの条件下で本発明者らが検出した活性
であるヒスチジンアンモニアリアーゼ活性(L-ヒスチジンのウロカニン酸への変
換)の誘導と一致する。

【０１１７】実施例2: HALのペプチド配列決定 硫酸アンモニウムおよびDEAE-Sephadexを使用して部分的に精製したコリネバ
クテリウム科の細菌からのHALをSDS-PAGEによって分離した。単離された物質をI
mmobilon-Pに電気泳動により移し、クーマシーブリリアントブルーにより染色し
た。55000ダルトンの主要なバンドを切り出し、N-末端配列決定にかけた。この
フラクションをCommonwealth Biotechnologies, Inc. (Richmond, VA)に送り、B
rCNで切断し、HPLC精製し、フラクションの配列決定を行った。データを図2に示
す。

【０１１８】実施例3: 高効率原核生物発現系を使用したコリネバクテリウム科細菌由来のヒ
スチジンアンモニアリアーゼの発現 図4に示す大腸菌発現プラスミドpHUT102は、T7 RNAポリメラーゼを使用して、
強力なファージT7遺伝子10プロモーターからHAL DNA配列を発現するように設計
した。このベクターpSN75は、T7プロモーターの上流に挿入された追加の転写タ
ーミネーターを有するpET11b(Novagen)の誘導体である。これにより可能な限り
転写的にサイレントな標的カセットが得られる。

【０１１９】 2種の変異誘発性オリゴヌクレオチド、TM96およびTM97(表1参照)は、ヒスチジ
ンアンモニアリアーゼ配列に基づいて合成した。N-末端オリゴはATG開始コドン
にNdeI部位を付加し、C-末端オリゴはC-末端の直後にBamHI部位を付加する。こ
れらを使用して、コリネバクテリウム科の細菌のゲノムからのHAL遺伝子を温度
サイクルにより増幅した。得られた断片をNdeIおよびBamHIで制限酵素処理し、p
SN75へクローン化してpHUT102を得た。これにより、読み過し(readthrough)転写
を防止するフランキング転写ターミネーターを含む、T7プロモーターの制御下に
あるヒスチジンアンモニアリアーゼが得られる。

【０１２０】 選択マーカーとしてカナマイシンを含むT7発現系は、pUC4Kから切り出した1 k
bのカナマイシン耐性PstIカセットを、pSN75の唯一のPstI部位にクローン化する
ことにより構築した。新規ベクターpSN75Kはアンピシリン感受性で、カナマイシ
ン耐性である。HALコード領域を含むNdeI-BamHI断片をpHUT102から切り出し、Nd
eIおよびBamHIで切断したpSN75Kにクローン化した。この発現構築物pHUT200は、
製造においてペニシリン抗生物質を使用する必要がないので、HALの臨床的製造
のために容易に使用し得る。

【０１２１】 発現を目的として、pHUT200を、pLysSを保持するBL21(λDE3)に形質転換し、T
errific液体培地中でOD600が0.6になるまで28℃で増殖させた。培養物を0.4 mM
IPTGで4時間誘導し、回収した。細胞を溶解し、SDS-PAGEおよび酵素アッセイに
よって分析した。これらのアッセイによって測定したところ、全細胞タンパク質
の約30%(図5参照)および可溶性タンパク質の8%までHALが製造され、培養物1リッ
トル当たり約0.2gとなることが判った。

【０１２２】実施例4: ペリプラズム（周辺細胞質）局在化を指令するベクターでのHALの発現 NdeI/BamHI断片をpHUT102から切り出し、精製した。ベクターpET12c(Novagen)
をNdeI/BamHIで同様に切断し、精製した。これらの断片を連結し、XL-1 Blue MR
F’に形質転換した。クローンpHUT114は、HAL遺伝子をT7ファージペリプラズム
局在化シグナルとの融合物としてT7プロモーターの制御下に含む。

【０１２３】 発現を目的として、pHUT114をBL21(λDE3)に形質転換し、抗生物質選択下に75
mM NaClを加えたTerrific液体培地中で28℃でOD600が0.6になるまで増殖させた
。培養物を0.4 mM IPTGで4時間誘導し、回収した。スフェロプラストを調製し(A
usubel, et al, eds, “Current Protocols in Molecular Biology,” John Wil
ey and Sons, Inc., 1994)、上清を酵素について分析した。

【０１２４】 この方法により、活性なペリプラズムHALが得られた。しかし、顕微鏡観察に
より封入体の形成が観察された。これにより、容量あたりの収率は比較的低くな
り、比活性は細胞局在化物質と同等であった。この時点では、この方法は明らか
な利点を提供するものではない。しかし、増殖および誘導条件を変更することに
より封入体形成を最小化し得るならば、培地から酵素を直接精製し得る可能性も
ある。

【０１２５】実施例5: コリネバクテリウム科細菌由来のHALの生産のための流加バッチ発酵 BL21λ21(DE3)pLysS中のpHUT200の発酵を下記培地中30℃で行った。基本培地:
17.2 mlの1M KH₂P0₄、36.7 mlの1M K₂HP0₄、1 ml/Lの2% CaCl₂・H₂O、1 ml/L
の10%チアミン-HCl、10 ml/Lの微量金属溶液(6 g/Lクエン酸Fe(III)、1.5 g/L M
nCl₂・H₂O、0.8 g/L Zn(CH₃COO)₂・2H₂O、0.3 g/L H₃BO₃、0.25 g/L Na₂MoO₄・2
H₂O、0.25 g/L CoCl₂・6H₂O、0.15 g/L CuCl₂・2H₂O、0.84 g/L EDTA)、10 ml/L
の20% MgSO₄・7H₂Oおよび10 ml/Lの50%グルコースを補充した20 g/L酵母エキス
および1.67 g/L (NH₄)₂SO₄。ddH₂Oで1リットルの最終容量とした。pHが0.01上昇
したときに培地補充を開始した。補充培地は以下のとおりである：1.5 g/L (NH₄ )₂SO₄、274 g/L酵母エキス、7.5 ml/L MgSO₄・7H₂O、400 mlの50%グルコース。p
Hが0.01低下したときに補充を停止した。このように補充コントロールループに
よりpHを維持した。OD₆₀₀ = 5.0の時点で1 mM IPTGにより発酵物を誘導した。溶
存酸素は20%に維持し、誘導は4時間継続した。最終OD₆₀₀は32であり、収率は1リ
ットル当たり約1グラムのHALであった。異なる誘導期間後のタンパク質量を図5
のSDS-PAGEゲルに示す。

【０１２６】実施例6: 大腸菌からのHALの精製 2回のアセトン沈澱ステップおよび1回のQ-Sepharoseカラムを使用する簡易精
製法とした。細胞ペーストを1/10容量の50 mMトリス、pH 8.0に再懸濁した後、
ペレットを4回超音波破砕し、遠心分離した。等容量のアセトンを上清に加えた
。その後溶液を14,000 rpmで15分間遠心分離した。上清を取り、等容量のアセト
ンを再度加え、再度遠心分離した。2回目のアセトン沈澱の後、ペレットを50 mM
トリス、pH 8.0に再懸濁した。再懸濁物を20 mMトリス、pH 8.0中のQ-Sepharose
カラム(5 mg タンパク質/Q-Sepharoseのml)にロードした。その後、カラムを0.1
M KClを含む20 mMトリス、pH 8.0で洗浄した。溶出は0.1 Mから0.6 MのKClの20
0 mlの勾配で1 ml/分の流量で行った。その後、Phenyl Sepharoseを使用してさ
らに酵素を精製することができる。このスキームによる精製の例を図6に示す。

【０１２７】 いくつかの可能性のある精製のための代替方法もうまく使用できた。HALは70
℃での加熱に耐性を有する。したがって、加熱と遠心分離を使用して、沈澱した
混入タンパク質を除去することができる。さらに、HALは30%飽和まで硫酸アンモ
ニウムを添加しても沈澱しない。したがって、30%の硫酸アンモニウムの添加お
よび遠心分離を使用して混入タンパク質を除去することもできる。その後、この
沈澱はPhenyl Sepharoseカラムを使用してさらに精製することができる。

【０１２８】実施例7: 封入体からのHALの回収 実施例6の超音波処理から得られたペレットを、0.5% Triton X-100を含む100
mMリン酸ナトリウム、pH 6中で細かくすりつぶすことにより洗浄した。洗浄した
封入体を、SS34ローター中、40℃、10000 rpmで10分間遠心分離することにより
回収した。この操作をさらに2回繰り返して精製封入体を得た。

【０１２９】 この物質の少量を8 M尿素を含む50 mMトリス(pH 8)により可溶化した。この物
質の200μgを、同じバッファーで平衡化した0.5 mlのDEAE-Sephadexに結合させ
た。この樹脂を遠心分離によって回収し、0.5 M NaClを含む50 mMトリス、pH 8
、1 mlで溶出した。この物質をヒスチジンアンモニアリアーゼ活性について直接
分析した。典型的な回収操作によれば、活性形態の全ヒスチジンアンモニアリア
ーゼの約1〜5%が得られた。

【０１３０】実施例8: HALの特性決定 精製したHALは37℃で約40 I.U./mgの活性を有することが判明した。至適温度
は45℃であった(図7)。グラフは、該酵素が生理的温度条件下で有意な活性のレ
ベルを維持することを示している。その次のグラフはpHのHAL活性に対する影響
を示すグラフである。種々のpHにおけるHALの活性プロフィールを図8に示す。該
酵素は広いpH範囲で活性であり、pH 8.2付近で最も高い活性を示し、生理的条件
において高い活性を示す。

【０１３１】 還元型グルタチオンおよびDTTはいずれもHALを阻害するが、完全な阻害ではな
かった。活性を半減するのにこれらの化合物はいずれも15 mMの濃度を要した。E
DTAは、1 mMの低い濃度で反応を完全に阻害することが判明した。この阻害は、1
x 10^-5 Mの濃度のMn²⁺の存在下において可逆的なものであった。

【０１３２】 大腸菌中で産生されたヒスチジンアンモニアリアーゼは、上記に詳述したよう
にほぼ均質になるまで精製した。体重18〜22 gの雌性マウスに1500 IU/kg体重を
腹腔内注射した。注射後2時間および10時間で眼窩後採血により得た血漿をアッ
セイすることによりHAL活性をモニターした。組換え酵素を使用したこれらの実
験により、約3時間のin vivo半減期が示された。

【０１３３】実施例9: HALと他のヒスチジンアンモニアリアーゼとの比較 HALは、L-ヒスチジノールによる阻害に比較的抵抗性を有する点において、他
のヒスチジンアンモニアリアーゼと比較して顕著な利点を有する。L-ヒスチジノ
ールはヒスチジンアナログである。L-ヒスチジノールは競合阻害剤として作用す
るので、ヒスチジン依存性の反応に影響を及ぼすためには高濃度で存在しなけれ
ばならない。したがって全ヒスチジンプールを減少させるためにHALを使用する
ことは、L-ヒスチジノールの有効性を大幅に増加させると考えられる。しかし、
他のヒスチジンアンモニアリアーゼ酵素はL-ヒスチジノールによって強く阻害さ
れることが示された。コリネバクテリアのヒスチジンアンモニアリアーゼ(HAL)
は、治療的なL-ヒスチジノールレベルのL-ヒスチジノールにより阻害されないの
で、他のヒスチジンアンモニアリアーゼと比較して大きな利点を有する。Achrom
obacter liquidumおよびStreptomyces griseusから単離されたヒスチジンアンモ
ニアリアーゼは、LヒスチジノールおよびL-ヒスチジノールホスフェートによっ
てそれぞれ4.58および0.27 mMのKiで阻害されることが示されている(Shibatani,
T. et al. 1975.; Wu, P.C. et al. 1995)。Strepromyces griseusのヒスチジ
ンアンモニアリアーゼを使用した本発明者らの研究室の酵素動力学的研究によれ
ば、L-ヒスチジノールはヒスチジンに対して等モル濃度でも前記酵素を完全に阻
害し得ることが示されている。しかし、HALでは、L-ヒスチジノールがL-ヒスチ
ジンの10倍の濃度で存在する場合でも、活性の20%が保持される。本発明者らは
、HALに対するL-ヒスチジノールのKiが24.3〜33.4 mMであることを実証した。

【０１３４】実施例10: PEG化を使用した半減期の延長とHALに対する抗体形成の防止 PEG化法はBTC-PEG 5000(Shearwater Polymers, Inc.)を使用して開発された。
HALを50 mMリン酸ナトリウムバッファー、pH 8.0中で再構成し、同じバッファー
に対して透析した。透析は3時間行った。透析後、タンパク質濃度を5 mg/mlに調
整した。BTC-PEGを1:10の比で添加し、BTC-PEGを溶解させた後に室温で1時間イ
ンキュベートした。その後溶液を50 mMリン酸ナトリウム、pH 7.5に対して透析
し、未結合PEGを除去した。その後、フルオレサミンアッセイを使用してPEG化の
程度を決定した。酵素に対して異なるPEGの比率で試験を行い、各比率で得られ
るPEG化％を決定した。フルオレサミンアッセイを繰り返すことにより、BTC-PEG
による1:10のPEG化は、酵素の約40〜45%のPEG化保護をもたらすことが示された
。

【０１３５】 HALをマウスに注射した場合、生物学的活性の半減期は4時間未満であることが
判明した。酵素の半減期を決定するために、既知の酵素単位量を数匹のマウスに
腹腔内注射した。4時間の間隔で異なるマウスの眼窩後から採血した。その後血
液を遠心分離し、血清を使用して上記のようにヒスチジンアンモニアリアーゼア
ッセイを行った。そして最初の4時間の後、血漿中の単位/mlが半分になる時点を
比較することにより半減期を決定した。

【０１３６】 30単位のHALを腹腔内注射すると、4時間後血液中の活性HALは3単位しかなく、
半減期は1時間未満であることが分かった。その後、HALをBTC-PEGを使用してPEG
化した。これにより血液中の酵素の半減期が48時間以上に増加した。酵素のPEG
化により、宿主中での抗体を介した枯渇からの保護も得られる。非PEG化タンパ
ク質は抗体反応を誘発し、それにより処理後1週間で酵素が血液から消失する。
抗体反応はPEG化HALを投与したマウスにおいて非常に遅延された。5匹中3匹のマ
ウスでは、処理の79日後でも活性酵素が回収され、5匹中2匹のマウスでは119日
後でも回収された。

【０１３７】 本発明者らは、より高分子量のPEG、BTC 20,000並びにその他のPEGを使用して
、HALを修飾することにも成功した。

【０１３８】実施例11: HALの抗ウイルス活性 種々の感染性ウイルスに対する抗ウイルス活性について、HALをin vitroにお
いて試験した。下記の方法を使用して単純ヘルペスウイルス(HSV)に対する有効
性を分析した。T-l75フラスコ中の集密状態のVERO細胞をトリプシン処理し、実
験に必要な数のT-25フラスコに分けた。細胞を、10%ウシ新生児熱不活性化血清
およびL-グルタミンを含むRPMI-1640中で増殖させた。細胞が集密状態まで増殖
した後、培地を除去し、0.5 mlのウイルス希釈物(1:5の連続稀釈物とした)を加
えた。ウイルスの稀釈物は、2% NCSを含むRPMI-1640で調製した。その後、細胞
を37℃で1時間インキュベートし、さらに、試験化合物を含むかまたは含まない2
% NCS含有RPMI-1640を5 ml加え、1日間インキュベートを継続した。24時間後、
フラスコをパラフィルムで密閉し、-70℃で凍結させた。その後細胞を室温で融
解して、死滅したインタクト細胞を溶解し、ウイルスを放出させた。その後ウイ
ルス懸濁物を遠心分離して細胞砕片を除去した。完全に溶解したウイルス希釈物
をプラークアッセイに使用する。プラークアッセイは、T-75からの細胞をトリプ
シン処理し、10% NCS含有RPMI-1640中に細胞を再懸濁し、6-ウェルプレートにウ
ェルあたり2 mlずつ分注することにより行った。細胞を37℃で一晩インキュベー
トした。その後培地を吸引により除去し、0.2 mlのウイルス希釈物を加え、1時
間インキュベートした。この間に寒天培地を調製し、41℃で固化しないように保
存した。寒天培地濃度は、1/2容量の2 X BME(Gibco)、2% Pen/Strep、2% NCSお
よび1%寒天であった。1時間のインキュベーションの後、2 mlのBME/寒天培地を
、細胞単層を乱さないように注意深くウェルに加えた。プレートを室温で20〜30
分放置して寒天を固化させ、その後細胞を37℃で48時間インキュベートした。そ
の後細胞を、ニュートラルレッドを含むBME/寒天培地を使用して染色した。ニュ
ートラルレッドステイン(Gibco)を5%の最終濃度で添加して、前と同じようにし
てBME/寒天培地を調製した。2 mlのこの寒天培地を加え、固化させ、37℃で24時
間インキュベートした。その後プラークをカウントし、細胞を長期記録のために
固定した。

【０１３９】 HSVに対して1つの陽性の実験結果が見られた。単純ヘルペスウイルスはヘルペ
スウイルス科に属する二本鎖DNAウイルスである。単純ヘルペスウイルス1型、単
純ヘルペスウイルス2型、水痘‐帯状疱疹ウイルス、エプスタイン-バーウイルス
、サイトメガロウイルスなどのこのグループに属するいくつかの種類のウイルス
は重大で致命的な感染症をしばしばヒトに引き起こす。HSVを使用した実験の結
果、HALがHSV複製を阻害し、L-ヒスチジノールと共に投与すると、より顕著な阻
害が観察されることが示された。0.005 U/mlの濃度でのHAL単独の使用で、プラ
ーク形成単位はコントロールの約200分の1に減少した。0.01 U/mlのHALを使用す
ると、プラーク形成単位/mlは約1000分の1に減少した。しかし、L-ヒスチジノー
ルと共に投与すると、効果は著しく増強され、阻害を増加させながら両化合物の
濃度を有意に低下させることができた。L-ヒスチジノールを0.1および0.5 mMの
濃度で投与した場合、阻害は観察されず、1 mMではわずか5倍の阻害しか観察さ
れなかった。しかし、0.5 mMのL-ヒスチジノールを0.003 U/mlのHALと併用投与
すると、阻害はほぼ100%となった(コントロールの1.25 x 10⁸に対して500 PFU未
満)。これらの結果は図9に示す。

【０１４０】 別の成功した試験はRSウイルス(RSV)を使用したものであった。RSVは高度に感
染性の疾患を起こす別のウイルスである。これは幼時および若年小児の気管支炎
および肺炎のような下気道感染症を起こし、約50%の幼児が最初の冬にRSVに感染
する。実験はRSVプラークアッセイを使用して組織培養で行った。RSVプラークア
ッセイはHSVアッセイと同様に行った。RSVアッセイを行う場合、Hep2細胞を使用
してRSVを増殖させ、2% FBS、L-グルタミンおよび抗生物質-抗真菌薬を含むEMEM
培地で細胞を増殖させた。ウイルスストックを前記培地中に希釈し、所望の試験
化合物とともにあるいはそれなしで各ウェルに加えた。プレートを37℃で2時間
インキュベートし、ウイルスを除去した。0.5%のアガロースを培地に加え、37℃
で5日間インキュベートした。その後、プレートを10%ホルマリンで固定し、クリ
スタルバイオレットで染色した。HALとL-ヒスチジノールがそれぞれ0.005 U/ml
および3 mMで存在する場合、図11に示すようにRSVプラーク数の阻害は見られな
かった。しかし、これらと同じ濃度を組合せて使用すると、プラークアッセイの
結果はプラークのバックグラウンドレベルより低かった。これらの結果は、これ
ら2つの薬剤による強力な相乗効果が存在し、HALが有効な抗ウイルス治療薬とし
て有望であることを示している。

【０１４１】 L-ヒスチジノールと組合せたHALの使用は、このように両薬剤の治療指数を顕
著に減少させることが示された。これにより、これらの高度に感染性の疾患の低
い毒性での有効な治療が可能性あるものとなる。

【０１４２】 ラウシャーマウス白血病ウイルス(RMuLV)はレトロウイルス科に属し、このウ
イルスのグループはさらにヒト免疫不全ウイルス(HIV)を含む。RMuLVをHIVに対
する薬剤開発のモデルとして使用した。これらの研究において、RMuLVを持続感
染させたマウスSC-l細胞を使用して、ウイルス複製に対するHALの効果を試験し
た。簡単に述べると、細胞を96-ウェルプレート中の10%胎児ウシ血清およびグル
タミンを含むRPMI培地上で平板培養した。24時間の増殖の後、細胞を種々の試験
化合物で24時間処理した。その後、Roberts, J. and W.G. McGregor (Roberts,
J. and W. G. McGregor. 1991. J. General Virology. 72: 299-305)に記載され
たようにして、上清の逆転写酵素活性を試験した。図12に示した結果により、0.
004 U/mlで投与されたHALにより逆転写が70%以上阻害されたことが示された。

【０１４３】実施例12: 抗癌剤としてのHALの有効性 感受性in vitro抗癌剤スクリーニングアッセイを使用して種々の腫瘍細胞系に
対するHALの効果を試験した。簡単に述べると、各細胞系をマイクロタイタープ
レート上に播種し、37℃で24時間プレインキュベートした。その後、試験薬を加
え、培養物を37℃でさらに48時間インキュベートした。細胞増殖の終点決定は、
細胞のin situ固定と続くタンパク質結合色素、スルホローダミンB(SRB)による
染色により行った(Monks, A., Scudiero, D. Skehan, P., Shoemaker, R., Paul
l, L, Vistica, D., Hose, C., Langley, J., Cronise, P., Vaigro-Wolff, A.
et al. 1991. Journal of National Cancer Institute. 83(11): 757-766)。2種
のヒト前立腺癌細胞系、LNCaPおよびPC-3をこのアッセイに使用して試験した。
ヒト前立腺癌細胞系LNCaPの増殖は0.005 U/mlのHALによって69%阻害され、また
、PC-3は0.01 U/mlのHALによって81%阻害されることが判った。前立腺癌に加え
、ヒト卵巣癌の3種の細胞系を試験した。卵巣癌細胞系SKOV-3およびMA148は、0.
01 U/mlのHALによりそれぞれ78%および95%阻害され、また、OVCA3は0.005 U/ml
のHALにより53%阻害された。前立腺および卵巣癌細胞系に加えて、C6膠芽腫細胞
を試験したところ、HALは0.01 U/mlの濃度で増殖を95%阻害することが判った。

【０１４４】 この広く認められている分析の結果は非常に心強いものである。明らかに、HA
Lはin vitroにおいて種々のヒト腫瘍の増殖を防止するのに非常に有効であり、
有効な抗癌治療薬であり得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図1は、選択された酵素で切断されたHALコード領域の制限酵素パターンを示す
。

【図２】 図2は、実験的に誘導されたHALのペプチド配列のリストを示す。

【図３】 図3は、オリゴヌクレオチドおよびサブクローンについてのHAL遺伝子のSphI消
化パターンを示す。

【図４】 図4は、ヒスチジンアンモニアリアーゼ過剰発現プラスミドを示す。

【図５】 図5は、大腸菌中のHALの発現を示すSDS-PAGEの図である。30μgのサンプルを1
0% SDS-PAGEゲル上にロードした。レーン1: 誘導1時間後に得たサンプル。レー
ン2: 誘導後2時間に得たサンプル。レーン3: 誘導後3時間に得られたサンプル。
レーン4: 誘導後4時間に得たサンプル。

【図６】 図6は、大腸菌からのHALの精製を示すSDS-PAGEの写真である。レーン1および4
は、それぞれ粗抽出物を10μgおよび20μg含む。レーン2および5は、それぞれフ
ェニルセファロースプールした分画を5μgおよび10μg含む。レーン3および6は
、それぞれQ-セファロースプールした分画を5μgおよび10μg含む。

【図７】 図7は、HALに対する温度の影響を示すグラフである。

【図８】 図8は、HALに対するpHの影響を示すグラフである。

【図９】 図9は、HSVに対するHALおよびヒスチジノールの効果を示す図である。レーン1
: コントロール。レーン2: HALのみ(0.003 U/ml)。レーン3: L-ヒスチジノール
のみ(0.5 mM)。レーン4: HALおよびL-ヒスチジノール(それぞれ0.003 U/mlおよ
び0.5 mM)。

【図１０】 図10は、単剤としておよびHALとの組合せとしてのL-ヒスチジノールの有効性
を示す。レーン1: コントロール。レーン2: L-ヒスチジノール(0.1 mM)。レーン
3: L-ヒスチジノール(0.5 mM)。レーン4: L-ヒスチジノール(1.0 mM)。レーン5: L-ヒスチジノール(1.5 mM)。レーン6: L-ヒスチジノール(3.0 mM)。

【図１１】 図11は、RSVに対するHALおよびヒスチジノールの効果を示す。レーン1: コン
トロール。レーン2: HALのみ(0.005 U/ml)。レーン3: L-ヒスチジノールのみ(3.
0 mM)。レーン4: HALおよびL-ヒスチジノール(それぞれ0.005 U/mlおよび3.0 mM
)。

【図１２】 図12は、RMuLVに対するHALの効果を示す。レーン1: コントロール。レーン2:
HAL(0.001 U/ml)。レーン3: HAL(0.002 U/ml)。レーン4: HAL(0.004 U/ml)。

【図１３】 図13は、コリネバクテリア、B. subtilis、S. griseus、P. putidaなどの種々
の細菌からのHALの最初のペプチド配列の群を示す。

【図１４】 図14は、コリネバクテリア、S. griseus、D. radioduransなどの種々の細菌か
らのHALの第2のペプチド配列の群を示す。

【図１５】 図15は、S. griseus(STRG)、コリネバクテリア(HAL)のアミノ酸配列間の比較
である。アミノ酸同一の位置は「*」により示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/14 Ａ６１Ｐ 31/12 31/18 31/14 31/20 31/18 31/22 31/20 35/00 31/22 37/06 35/00 Ｃ１２Ｎ 9/88 37/06 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 9/88 Ａ６１Ｋ 37/56 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ロバーツ，ジョセフ アメリカ合衆国 29223 サウスカロライ ナ州，コロンビア，サンターフ サークル ６ (72)発明者 マカリスター，トーマス アメリカ合衆国 22101 ヴァージニア州， マクリーン，ハイウッド ドライブ 1466 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA03 DA03 DA06 EA04 GA11 HA17 4B050 CC04 DD02 EE10 LL01 4C084 AA02 AA07 BA35 DC26 NA05 NA14 ZB08 ZB26 ZB33 4C086 AA01 AA02 BC38 MA02 NA05 NA14 ZB26 ZB33 4C087 AA01 AA02 BC83 NA13 NA20 ZB08 ZB26 ZB33

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を有する単離されたポリ
   ペプチドであって、前記ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性がヒスチジンアナロ
   グの存在下において実質的に低下しないことを特徴とする、上記ポリペプチド。
2. 【請求項２】 ヒスチジンアナログがヒスチジノールである、請求項1に記
   載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5
   および配列番号6からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載の単離さ
   れたポリペプチド。
4. 【請求項４】 前記ポリペプチドが約30,000〜70,000ダルトンのモノマー分
   子量を有する、請求項3に記載の単離されたポリペプチド。
5. 【請求項５】 前記ポリペプチドが約56,000のダルトンのモノマー分子量を
   有する、請求項4に記載の単離されたポリペプチド。
6. 【請求項６】 PEGを請求項1に記載のポリペプチドと反応させることを含む
   、ポリペプチドをPEG化する方法。
7. 【請求項７】 ウイルス感染患者に治療量のヒスチジンアンモニアリアーゼ
   活性を有するポリペプチドを投与することを含む治療方法。
8. 【請求項８】 ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性がヒスチジンアナログの
   存在下において実質的に低下しない、請求項7に記載の方法。
9. 【請求項９】 ヒスチジンアナログがヒスチジノールである、請求項8に記
   載の方法。
10. 【請求項１０】 治療を必要とする患者に治療量のヒスチジンアナログを投
    与することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
11. 【請求項１１】 ウイルスが、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウ
    イルス2型、水痘‐帯状疱疹ウイルス、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガ
    ロウイルス、RSウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスからなる群から選択される
    、請求項8に記載の方法。
12. 【請求項１２】 癌患者に治療量の請求項1に記載のポリペプチドおよび治
    療量のヒスチジンアナログを投与することを含む、癌患者の治療方法。
13. 【請求項１３】 治療上有効な量のヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を有
    するポリペプチドを患者に投与し、治療上有効な量の化学療法剤またはレトロウ
    イルスベクターを該患者に投与することを含む、疾患の治療方法。
14. 【請求項１４】 前記ポリペプチドを投与すると、患者の罹患してない細胞
    が可逆的な静止状態に入る、請求項13に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記ポリペプチドがPEG化ポリペプチドである、請求項13
    に記載の方法。
16. 【請求項１６】 患者に免疫抑制剤を送達する方法であって、治療上有効な
    量のヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドを患者に投与し、
    該患者を照射にかけることを含み、前記ポリペプチドがin vivoでトランス-ウロ
    カニン酸(t-UA)を生成し、照射はt-UAのそのシス異性体(c-UA)への光異性化を引
    き起こし、そのシス異性体が免疫抑制性を有するものである、上記方法。
17. 【請求項１７】 照射がUVB照射であり、前記ポリペプチドがPEG化ポリペプ
    チドである、請求項16に記載の方法。
18. 【請求項１８】 患者が免疫系の障害を有する、請求項17に記載の方法。
19. 【請求項１９】 UVB照射が局所に行われる、請求項18に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記患者に臓器を移植することをさらに含む、請求項16に
    記載の方法。
21. 【請求項２１】 配列番号7を含む、単離されたDNA配列。
22. 【請求項２２】 請求項21に記載のDNA配列を含む発現ベクター。
23. 【請求項２３】 請求項22に記載の発現ベクターを構築し、該発現ベクター
    を患者に導入することを含む患者の治療方法。