ES2303113T3 - El uso de acido urocanico para acidificar el citoplasma de la celula y para prevenir o parar la proliferacion celular en una persona. - Google Patents

Abstract

El uso de ácido cis-urocánico para la fabricación de una composición farmacéutica útil para prevenir o tratar: a) cáncer, o b) una enfermedad hiperproliferativa no cancerosa seleccionada a partir del grupo que consiste en hiperplasia benigna de piel o próstata, tal como hipertrofia prostática benigna; hiperplasia sinovial en artritis reumatoide; enfermedad inflamatoria del intestino; reestenosis; aterosclerosis; trombosis; esclerodermia y fibrosis, en una persona o un animal, en el que una cantidad eficaz de dicho ácido cis-urocánico es administrada en una forma esencialmente no disociada a la persona o al animal.

Description

El uso de ácido urocánico para acidificar el citoplasma de la célula y para prevenir o parar la proliferación celular en una persona.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de ácido urocánico para acidificar el citoplasma de la célula y consecuentemente prevenir o parar la proliferación de células, especialmente células tumorales u otras transformadas o no transformadas que hiperproliferan en una persona o un animal, y al tratamiento o la prevención del cáncer y ciertas enfermedades hiperproliferativas curables deteniendo el crecimiento y la proliferación celular.

Antecedentes de la invención

Las publicaciones y otros materiales usados en este documento para ilustrar los antecedentes de la invención, y en particular, los casos para proporcionar detalles adicionales respetando la práctica, son incorporados como referen-
cia.

Muchas funciones celulares tanto en células normales como en transformadas están asociadas al mantenimiento del pH intracelular. Varios investigadores han demostrado recientemente que la actividad de proliferación de las células cancerígenas puede ser modulada por agentes que son capaces de acidificar el citosol de la célula (Cosentini et al., 2001, Wahl et al. 2002, Thangaraju et al. 1999). Análogamente, la acidificación intracelular activa la apoptosis o las cascadas de muerte celular programada (Gottlieb et al. 1996, Matsuyama et al. 2000). La acidificación se postula que afecta a enzimas apoptóticas claves tales como la endonucleasa ácida que causa la fragmentación del ADN y la esfingomielinasa ácida que produce ceramida (Gottlieb et al. 1996). El control de la actividad de proliferación de células y de la apoptosis ha sido identificado por consiguiente como un enfoque prometedor para la intervención farmacológica en el cáncer (revisado en Los et al. 2003). En el lecho tumoral, el pH citosólico de las células tumorales viables típicamente se mantiene cerca del neutro para facilitar la proliferación, mientras que el microambiente extracelular se acidifica mediante metabolitos celulares (Yamagata y Tannock, 1996).

Sumario de la invención

Los inventores de la presente invención han demostrado una propiedad hasta ahora desconocida del ácido urocánico (AUC). Sorprendentemente han demostrado que el AUC emigra en el citosol de células malignas y benignas en una forma que es capaz de liberar un protón en el citosol. Consecuentemente, el citoplasma es acidificado (el pH es disminuido), y como un resultado más de ello, la actividad de proliferación de células normales o anormales es prevenida.

Así, de acuerdo con un aspecto, esta invención se refiere al uso del ácido cis-urocánico para la fabricación de una composición farmacéutica útil para prevenir o tratar a) el cáncer, o b) una enfermedad hiperproliferativa no cancerosa seleccionada a partir del grupo que consiste en hiperplasia benigna de la piel o próstata, tal como hipertrofia prostática benigna; hiperplasia sinovial en artritis reumatoide; enfermedad inflamatoria del intestino; reestenosis; aterosclerosis; trombosis; esclerodermia y fibrosis, en una persona o un animal, en el que una cantidad eficaz de dicho ácido cis-urocánico es administrada en una forma esencialmente no disociada a la persona o al animal.

De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere al uso de ácido urocánico y otro agente terapéuticamente activo para la fabricación de una composición farmacéutica útil para prevenir o tratar un cáncer o una enfermedad proliferativa, en el que:

-

dicho agente terapéuticamente activo es un fármaco anticáncer o un fármaco antiproliferativo, y

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el ácido urocánico es un potenciador para dicho agente terapéuticamente activo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el efecto antiproliferativo de camptotecina en líneas celulares. Las células fueron cultivadas durante 44 h con o sin camptotecina 2 \muM (CPT) en condiciones de pH de 6,5 ó 7,4. Después de una incubación de 2 h con el reactivo de ensayo de proliferación, fue registrada la absorbancia a 490 nm. Las células fueron cultivadas a una densidad de 15.000 células (K562, HT-1080, HK293) o 75.000 células (las otras células) en un volumen de 150 \mul.

La figura 2 muestra el efecto antiproliferativo de cis-AUC en combinación con camptotecina y la adaptación a bajo pH en dos líneas celulares de melanoma de piel de ser humano. Las células fueron cultivadas por triplicado con o sin camptotecina (CPT) 2 \muM o cis-AUC 10 mM a una densidad de 15.000 células por 150 \mul durante 92 h. A, Células tomadas a partir de cultivos a pH 7,4 normal para analizar las condiciones a pH 6,5. B, Células cultivadas en un medio de adaptación a pH bajo de 6,7 durante 3 días, luego fueron analizadas a pH 6,5. C, Células cultivadas y analizadas a pH 7,4.

La figura 3 muestra la respuesta de la concentración de cis-AUC frente a la proliferación de células de melanoma A2058. La proliferación fue medida en un ensayo de 44 h a pH 6,5 con de 30 \muM a 30 mM de cis-AUC y camptotecina 2 \muM. Se presentan tanto los datos de proliferación (A) como los de inhibición en porcentaje calculados (B).

La figura 4 muestra el efecto antiproliferativo aditivo de cis-AUC. Tres líneas celulares fueron cultivadas con cis-AUC y/o camptotecina 1 \muM a una densidad de 30.000 células por pocillo (100 \mul) durante 44 h en un medio a pH 6,5. Fueron incluidos pocillos en blanco con todas las concentraciones de cis-AUC pero sin células y su absorbancia fue restada de las de los pocillos del ensayo correspondiente.

La figura 5 muestra la medida del pH intracelular en células tumorales tratadas con AUC in situ. Las células fueron marcadas con BCECF y colocadas en soluciones tampón con el pH ajustado con o sin varias concentraciones de cis-AUC. Paneles izquierdos, calibración de la intensidad de fluorescencia de BCECF de células tratadas con nigericina en tampón de potasio alto como una función del pH del tampón. Paneles derechos, valores de pH intracelulares en tampones con o sin varias concentraciones de cis-AUC. Todos los tampones de ensayo fueron ajustados a pH 7,4 (%) o pH 6,5 (%) después de la adición de cis-AUC. Los resultados fueron calculados usando la curva de calibración correspondiente a la izquierda.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con una realización preferible, el compuesto farmacéuticamente aceptable es el ácido urocánico (AUC).

El compuesto farmacéuticamente aceptable se mezcla con un vehículo, que puede ser de un componente solo, o más preferiblemente, una mezcla de dos o más componentes. Uno de los componentes es adecuadamente un agente tampón, que ajusta el pH de la composición al valor deseado. Especialmente cuando el isómero trans de AUC, trans-AUC, es el agente activo, es preferible ajustar el pH de la composición de 4,0 a 6,1, más preferiblemente de 5,0 a 6,1. En este intervalo de pH, todavía no se disocia trans-AUC. Cuando el isómero cis de AUC, cis-AUC, es el agente activo, es preferible ajustar el pH de la composición de 5,0 a 7,0, más preferiblemente de 6,0 a 7,0. En este intervalo de pH, cis-AUC todavía no disocia.

De acuerdo con una realización, la composición farmacéutica también puede comprender otro agente terapéuticamente activo, cuyo efecto es realzado por AUC. Preferiblemente, un tal agente terapéuticamente activo es, pero no se limita a, un antiproliferativo o fármaco anticáncer.

Como ejemplos de agentes tampón adecuados para ajustar el pH a 4,0-7,0 pueden ser mencionados, pero no restringidos a estos, fosfato de sodio 50 mM suplementado con cloruro de sodio 55 mM, medio de cultivo celular con HEPES 25 mM, y PIPES 10 mM suplementados con cloruro de sodio 133 mM.

El método y la composición de acuerdo con esta invención son útiles para el tratamiento o la prevención de cáncer, o ciertas enfermedades hiperproliferativas curables por acidificación intracelular y se mencionan más abajo. La expresión acidificación intracelular usada en este documento se refiere a la elevación de la concentración del ión hidrógeno en los compartimentos citosólicos o subcelulares en la célula eucariota.

Los cánceres que pueden ser tratados o prevenidos de acuerdo con la presente invención son cualquier forma de cáncer, tales como, pero no limitados con, cáncer de cerebro, piel (tal como el melanoma), vejiga, gástrico, pancreático, de pecho, cabeza, cuello, esofágico, de próstata, colorectal, pulmonar, renal, ginecológico (tal como ovárico) o tiroides; otro epiteliomas; quistes en varios órganos; verrugas y tumores del tipo verruga inducidos por la infección de virus; fibrosarcoma y su metástasis. En otra realización, la presente invención se refiere al tratamiento de un trastorno hiperproliferativo no canceroso, es decir, hiperplasia benigno de piel o próstata (por ejemplo, hipertrofia prostática benigna), hiperplasia sinovial en artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, reestenosis, aterosclerosis, trombosis, esclerodermia o fibrosis. Más preferiblemente, las células diana del método y las composiciones de la presente invención son células que comprenden tumores sólidos en la piel.

Para el objetivo de esta invención, el agente farmacéuticamente aceptable puede ser administrado por varias rutas, sistémicamente o localmente. Las formas de administración adecuadas incluyen, por ejemplo, formulaciones cutáneas; inyecciones intratumourales, incluyendo inyecciones intravenosas, intramusculares, intradérmicas y subcutáneas; inyecciones intrasinoviales; y formulaciones mucosas, tópicas, transdérmicas, nasales, por inhalación o rectales. Formulaciones particularmente adecuadas son formulaciones para la administración local tales como formulaciones tópicas en forma de ungüentos, geles, cremas, pastas, soluciones, suspensiones, lociones y emulsiones. También los sistemas de administración farmacéutica dirigidos, tales como liposomas y nanopartículas, en combinación con las formas de administración anteriormente mencionadas, pueden ser usados para la administración del agente farmacéuticamente aceptable.

La dosificación requerida del compuesto farmacéuticamente aceptable variará con la condición particular que se trate, la severidad de la condición, la duración del tratamiento, la ruta de administración y el compuesto específico que se emplee. En una formulación tópica, la cantidad del compuesto farmacéuticamente aceptable típicamente puede estar en el intervalo de 0,01% a 50%, preferiblemente en el intervalo de 0,1% a 10%.

La invención será ilustrada mediante la siguiente Sección Experimental no limitante.

Sección experimental

El objetivo del presente estudio era investigar la hipótesis de que AUC entra en los tipos de células transformadas en un ambiente extracelular apropiado, acidifica su citoplasma y posteriormente inhibe la proliferación de las células.

En una publicación anterior (documento WO 2004/080456), los inventores han demostrado que tanto cis-AUC como trans-AUC se acumula rápidamente e irreversiblemente en el citosol en neutrófilos polimorfonucleares humanos vivos. No hubo tampoco ninguna indicación de que AUC se uniría a orgánulos intracelulares, ni que sería metabolizado en el citosol. El cis-AUC pero no el trans-AUC afectaba al pH intracelular de neutrófilos cuando el pH extracelular estaba en el intervalo de pH de 6,1 a 7,0. En estas condiciones, el cis-AUC todavía no se disocia mientras que el trans-AUC, con un pK_{a} de 6,1, se disocia totalmente o completamente y así no fue capaz de transportar protones en el citosol. Sin embargo, cuando el pH extracelular está por debajo de 6,1, por ejemplo, en el intervalo de 5,0 a 6,0, también trans-AUC es capaz de actuar como vehículo de protones y esto induce la acidificación intracelular. Por claridad, los resultados experimentales en este documento muestran sólo los efectos de cis-AUC, aunque puedan ser obtenidos resultados similares con trans-AUC en el intervalo de pH apropiado.

Se sabe que la acidificación intracelular se establece como un requisito previo para los cambios de muchas funciones de la célula tales como la detención del crecimiento. También se sabe que el crecimiento (la proliferación) de tipos de células transformadas, tales como líneas celulares del cáncer, puede ser inhibido por agentes que sean capaces de causar la acidificación intracelular. El uso de tales compuestos (por lo general ácidos orgánicos) en el tratamiento clínico del cáncer puede ser dificultado por sus efectos secundarios adversos o toxicidad.

Métodos Ácido urocánico

El ácido trans-urocánico [trans-AUC, ácido 3-(1H-imidazol-4-il)-2-propenoico, PM 138,14] fue comprado en Sigma (San Louis, MO, EE.UU.). El cis-AUC fue preparado a partir de trans-AUC con fotoisomerización UV como sigue. El trans-AUC (138 mg, 1 mmol) fue disuelto en agua (500 ml). La solución fue llevada a pH 9 con hidróxido de potasio sólido y luego fue irradiada bajo una atmósfera de nitrógeno a 10ºC durante 4 h.

La fotoisomerización fue realizada en un reactor fotoquímico de flujo descendente Normag con una lámpara Hanau de cuarzo de mercurio a alta presión (500 W, 270-350 nm). La mezcla resultante (trans/cis aproximadamente 30/70 por HPLC) fue evaporada hasta sequedad y el residuo fue disuelto en ácido acético 12,5 mM. Esta solución fue ajustada a pH 9 y fue sometida a cromatografía en una columna de intercambio iónico (25 x 2,3 cm, malla 200-400, forma de acetato, Bio-Rad 1-x8) usando ácido acético 12,5 mM (500 ml), 25 mM (500 ml) y 100 mM (1000 ml) como eluyentes sucesivos. El cis-AUC apareció después de aprox. 1100 ml y trans-AUC principalmente después de 1300 ml de volúmenes de eluyente. La eliminación del disolvente de las fracciones, seguido por el lavado con dietil-éter y el secado in vacuo a 65ºC en pentóxido de fósforo, proporcionó los isómeros trans y cis puros. El rendimiento de cis-AUC fue 85 mg (58%), p.f. 176-178ºC, con una pureza química de más del 99,5% por análisis HPLC. Una columna de fase estacionaria de aminopropil Lichrosorb NH_{2}, Hibar RT, 250 x 4 mm, 5 \mum (Merck, Darmstadt, Alemania) fue usada para el análisis HPLC. El eluente era una mezcla de acetonitrilo 50% (v/v) y una solución del 2% (v/v) de ácido acético y 0,5% (p/v) de acetato de amonio en agua (pH aprox. 5). Los isómeros fueron detectados a 268 nm, y los tiempos de retención fueron T_{r} (cis) 3,7 minutos y T_{r} (trans 5,4) minutos.

El cis-AUC fue disuelto directamente en el tampón de incubación o medio de cultivo hasta una concentración de 30 mM, estéril filtrado (0,2 \mum), y fue diluido a las concentraciones deseadas inmediatamente antes del principio de cada experimento.

Camptotecina

Fue preparada una solución madre de camptotecina (Sigma, PM 348,4) disolviendo el reactivo (de 1,4 a 2,1 mg/ml) en agua desionizada. La solución fue alcalinizada con NAOH 1N, y además se ayudó a la disolución calentando en un baño maría hirviendo. Las diluciones de la solución madre fueron hechas en solución salina fisiológica. Las concentraciones finales en los experimentos fueron de 20 a 2000 nmol/l.

Líneas celulares

Líneas celulares tumorales transformadas WM 266-4 y A2058 (melanoma cutáneo), HT-1080 (fibrosarcoma epitelial), HeLa (adenocarcinoma epitelial de cerviz), HK293 (células epiteliales de riñón) y la línea celular HSF no transformada (fibroblasto de la piel de un donante voluntario varón sano) de origen humano han sido descritas anteriormente (Li et al. 2003). Las células K562 (leucemia mielógeno crónico) fueron compradas en la Colección Americana de Cultivos Tipo.

Las células fueron mantenidas en una fase de crecimiento logarítmico en medio IMDM (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) suplementado con suero de becerro fetal del 10% y antibióticos en una incubadora humedecida a +37ºC, 5% CO_{2}. Las líneas celulares adherentes fueron recolectadas para experimentos con tripsina-EDTA del 0.25% en PBS durante 5 minutos y luego fueron resuspendidas y lavadas en el medio. Después de contar las células viables, de 15.000 a 75.000 células fueron transferidas a placas de cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano en un volumen de 100 ó 150 \mul.

Ensayo de proliferación

La actividad de proliferación de las líneas celulares cultivadas fue cuantificada en placas de 96 pocillos de fondo plano con ensayo colorimétrico modificado basado en un derivado de tetrazolio (Ensayo de Proliferación Celular de Solución Única 96 Acuoso CellTiter, Promega). Las células fueron cultivadas en presencia de camptotecina y/o cis-AUC durante 20 a 92 h, entonces fue añadido el reactivo de proliferación durante 2 h y fue medida la absorbancia a 490 nm en un lector de placas. Los valores de absorción en blanco en pocillos que contienen medio sin células fueron restados antes del análisis de comparación.

Control del pH intracelular

El pH intracelular en las líneas celulares en presencia de cis-AUC fue medido con el tinte fluorescente sensible al pH 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-(y 6)-carboxifluoresceina (BCECF, éster de acetoximetilo; Molecular Probes, Leiden, Países Bajos) por citometría de flujo. Dos millones de células fueron incubadas en 5 ml de medio DMEM (Invitrogen), pH 7,4, conteniendo BCECF 0,35 \muM a 37ºC durante 30 minutos, fueron lavadas una vez en tampón fosfato de sodio (NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 50 mM, NaCl 43 mM), pH 7,4, y fueron resuspendidas en 0,3 ml de solución salina. Veinte \mul de la suspensión celular fueron pipeteados en tubos de citometría de flujo. Las soluciones de tampón fosfato de sodio con o sin cis-AUC fueron ajustadas (con HCl/NaOH 0,1 N) a pH 6,5 ó 7,4 después de la adición de cis-AUC y fueron añadidas en los tubos para proporcionar un volumen final de 500 \mul. El análisis de citometría de flujo fue realizado en una hora.

La calibración del pH intracelular in situ fue realizada usando el ionóforo K^{+}/H^{+} nigericina (Molecular Probes) en tampones de potasio alto. Las células marcadas con BCECF (20 \mul en solución salina) fueron resuspendidas en tampones de calibración ajustados el pH (480 \mul de KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 50 mM, KCI 43 mM, pH 6,2, 6,5, 6,8, 7,2, y 7,5) en tubos de citometría de flujo. La solución madre de nigericina (10 mM en metanol) fue diluida 1:10 en solución salina y fueron añadidos 5 \mul a la suspensión de la célula de calibración poco (de 10 a 15 minutos) antes del análisis. Las células fueron mantenidas a temperatura ambiente durante el experimento. Fueron calculados los valores de pH intracelular exactos a partir de las intensidades de fluorescencia medias de BCECF por referencia con células de calibración atrapadas con nigericina. La calibración fue realizada separadamente y simultáneamente para cada línea celular.

Resultados

La camptotecina muestra que la acción antiproliferativa es realzada a un pH más bajo.

La proliferación de línea base en la mayor parte de líneas celulares era más alta en cultivos a pH 7,4 que a pH 6,5. La camptotecina (2 \muM) inhibió la proliferación en todos los cultivos de la línea celular y mostró una inhibición más eficiente a pH 6,5 (figura 1).

El cis-AUC inhibe la proliferación de las células de cáncer y aumenta la acción antiproliferativa de camptotecina a pH 6,5.

Basado en las observaciones anteriores de los inventores con neutrófilos de sangre periférica, que cis-AUC ejerce efectos inhibitorios en su forma molecular no disociada, es decir, en el intervalo de pH extracelular de 6,1 a 7,0, los inventores investigaron la acción de cis-AUC en líneas celulares de melanoma A2058 y WM266-4 a dos niveles de pH, pH 6,5 y pH 7,4. El cis-AUC 10 mM inhibió considerablemente la proliferación de células tanto por sí mismo como realzó también la inhibición con camptotecina cuando fueron analizadas células cultivadas normalmente (a pH 7,4) en medio de cultivo con pH 6,5 (figura 2A). La inhibición en porcentaje por cis-AUC 10 mM solo fue del 83% (p=0,0028) en células A2058 y del 36% (p=0,0020) en células WM266-4. La proliferación de células primero ajustadas a condiciones de cultivo de pH 6,7 durante 3 días antes del principio del período de cultivo de ensayo a pH 6,5 era del mismo orden (para cis-AUC, 87%, p=0,0056 y 28%, p = 0,090, respectivamente) (figura 2B). La inhibición a pH 7,4 fue del 2 al 3% sólo (figura 2C). Asimismo el efecto de camptotecina fue de nuevo mejor a un pH más bajo (figura 2). Estos experimentos mostraron que cis-AUC actúa sobre células tumorales como un agente antiproliferativo cuando el pH extracelular < pK_{a} o cuando el resto de imidazolilo de la molécula está en una forma no disociada.

Fueron analizadas líneas celulares en un cultivo de 44 h a pH 6,5 con o sin camptotecina 2 \muM y cis-AUC 10 mM en 15.000 células por 100 \mul de volumen total. En estas condiciones, cis-AUC solo inhibió considerablemente la proliferación de células (del 20% al 50%) y realzó el efecto inhibitorio de camptotecina en la mayor parte de las líneas celulares (Tabla 1). Para caracterizar además el intervalo de concentración antiproliferativo eficaz de cis-AUC, la proliferación fue medida en un ensayo de 44 h a pH 6,5 con una concentración de cis-AUC en el intervalo de 30 \muM a 30 mM. Los resultados para células de melanoma A2058 muestran que se requiere a cis-AUC en una concentración de al menos 3 mM para producir una inhibición mensurable (figura 3).

TABLA 1 Inhibición de la proliferación por cis-AUC (10 mM) y camptotecina (CPT, 2 \muM) en líneas celulares a pH 6,5

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En un experimento más, una concentración inferior de camptotecina (1 \muM) fue usada para caracterizar el efecto antiproliferativo aditivo de cis-AUC. En las tres líneas celulares estudiadas transformadas, cis-AUC inhibió la proliferación a 3 mM o una concentración más alta (figura 4). El efecto aditivo de cis-AUC frente a camptotecina fue evidente en el intervalo de 1 a 10 mM dependiendo de la línea celular. A la concentración de cis-AUC más grande estudiada (30 mM), la proliferación con cis-AUC solo estaba siempre en el mismo nivel que en la combinación con camptotecina y era más baja que con camptotecina 1 \muM sola (figura 4).

El cis-AUC disminuye el pH intracelular en células transformadas

Como cis-AUC mostraba efectos antiproliferativos en las líneas celulares, después los investigadores investigaron si cis-AUC produce la acidificación intracelular en estas células. Antes los investigadores habían demostrado que cis-AUC se acumulaba a altas concentraciones en el citosol de neutrófilos de sangre periférica y baja el pH del citosol cuando el pH extracelular se ajusta por debajo 7,0. Se marcaron las líneas celulares transformadas seleccionadas con el tinte fluorescente sensible al pH BCECF y se colocaron en soluciones tampón con el pH ajustado con o sin varias concentraciones de cis-AUC. El análisis por citometría de flujo mostró que el pH intracelular en células A2058 y HeLa permaneció casi constante con concentraciones de cis-AUC en aumento hasta 30 mM cuando el pH extracelular era mantenido en 7,4. Cuando fue ajustado el tampón extracelular a pH 6,5, sin embargo, el pH intracelular disminuyó en una manera de dependiente de la concentración de cis-AUC en el intervalo de 0,3 a 30 mM. La disminución fue de aproximadamente 0,25 unidades de pH con la concentración de cis-AUC más alta (figura. 5). Estos datos con células A2058 y HeLa muestran que cis-AUC es capaz de acidificar el citosol de células transformadas. La acidificación observada es probablemente un acontecimiento de iniciación en el efecto antiproliferativo de cis-AUC.

Conclusiones

Las células tumorales adquieren capacidad para evitar una fuerte regulación de la división celular a través de la transformación. En este procedimiento de múltiples etapas, la inactivación de rutas intracelulares que frenan la proliferación y la activación de las que lo promueven es un acontecimientos clave. El estudio del comportamiento del crecimiento anormal resultante de células transformadas es un reto prioritario en medicina. Como las células cancerígenas generalmente no obedecen a los mecanismos celulares normales de progresión del ciclo celular y apoptosis, y los tumores sólidos crean un microambiente ácido e hipóxico anormal, la eficacia de terapias farmacéuticas a menudo son comprometidas, pero también pueden ofrecer una nueva perspectiva para el diseño de fármacos selectivos antitumorales (Kozin et al. 2001). Las células de tejido de tumores sólidos tienden a mantener un gradiente de pH a través de la membrana celular; el pH citosólico está cerca del neutro, mientras que el microambiente extracelular es ácido, por lo general alrededor de un pH 6,7 (Kozin et al., 2001, Yamagata y Tannock, 1996). A un pH extracelular bajo, la respuesta de ciertos fármacos como la camptotecina en células es realzada (Gabr et al., 1997), y se requiere un ambiente intracelular ácido para la actividad antiproliferativa eficiente debido a las transformaciones reversibles en la estructura de las moléculas (Burke y Mi, 1993). Se ha demostrado que la quimiosensivilidad de las células tumorales frente a la camptotecina puede ser realzada mediante el tratamiento simultáneo con ácidos que sean capaces de acidificar el ambiente intracelular (Cosentini et al. 2001, Gabr et al., 1997). La camptotecina por sí misma acidifica el citosol de células de leucemia en un plazo de tiempo de varias horas, conduciendo a la inducción de la apoptosis (Goossens et al., 2000). La acidificación intracelular por un vehículo de protones complementario podría realzar el efecto de la camptotecina y de los fármacos correspondientes. Asimismo, la interacción de fármacos alquilantes y que contienen platino con ADN prefiere un entorno intracelular de bajo pH (Jahde et al. 1989, Atema et al. 1993).

Las concentraciones de cis-AUC eficaces usadas en los presentes experimentos están en la escala milimolar, sobre todo entre 1 y 30 mM. La posición natural de cis-AUC es la capa superficial de la epidermis donde las concentraciones publicadas del total de AUC están en el intervalo de 0,5 a 8,9 mM, considerando el espesor medio de la epidermis (Laihia et al. 1998). Es, por lo tanto, posible que estas concentraciones sean importantes en el mantenimiento del ambiente superficial ácido antinflamatorio, antiproliferativo y antibacteriano innato ("capa ácida", Ohman y Vahlquist, 1994) contra microorganismos patógenos, tumores y acumulación de neutrófilos, respectivamente. Un análisis reciente proporciona pruebas de que AUC es la molécula efectora principal en la homeostasis ácido-básica en la epidermis (Krien y Kermici, 2000). Por otra parte, las concentraciones de otros ácidos orgánicos que aumentan experimentalmente la actividad antiproliferativa de la camptotecina están en el mismo intervalo. Como un ejemplo, los inhibidores de histona desacetilasa fenilbutirato y fenilacetato redujeron la proliferación de células de carcinoma de colon in vitro del 20% al 86% en el intervalo de concentración de 5 a 40 mM, respectivamente (Cosentini et al. 2001).

Aunque aún no ha sido estudiado detalladamente, las características de AUC como potencial sustancia farmacológica en la intervención de cáncer son prometedoras. Primero, el AUC es una molécula natural que es sintetizada en grandes cantidades en la piel, como se explica anteriormente. Se conoce el AUC desde hace más de 120 años y es el tema de unos cientos de publicaciones biomédicas. Estos hechos excluye las sospechas sobre una sorprendente toxicidad farmacológica o posibilidad respecto a la sensibilización alérgica. Segundo, el cis-AUC es soluble en agua y penetra fácilmente en tejidos o el citoplasma de las células. Tercero, no hay ningún catabolismo conocido de cis-AUC en mamíferos, y así no se puede esperar ningún efecto adverso de los metabolitos posibles. En la piel in vivo, el trans-AUC es sintetizado a partir de histidina (Baden y Pathak, 1967). La fotoisomerización inducida por UV produce el isómero cis que entonces es secretado como tal en el sudor y en la orina. Si ocurre la vuelta a la fotoisomerización involuntaria en trans-AUC después de la medicación con cis-AUC, el trans-AUC sistémico es metabolizado vía múltiples intermedios inofensivos a glutamato de un modo natural en el hígado. No existe ningún metabolismo endógeno en la piel. Cuarto, las propiedades de disociación de protones hace de cis-AUC un fármaco anticancerígeno potencial. El AUC es un ácido poliprótico débil, con dos restos donadores protón, el grupo carboxilo y el grupo imidazolilo. El primer pK_{a} que se refiere al grupo carboxilo de cis-AUC es 3,3 (Roberts et al. 1982). Prácticamente todas las moléculas de cis-AUC son, por lo tanto, desprotonadas en el grupo carboxilo a pH > 4. A niveles de pH fisiológicamente relevantes, el estado de protonación del grupo imidazolilo solo determina si la molécula es capaz de donar un protón y así promover la acidificación. El segundo pK_{a}, él del grupo imidazolilo, de cis-AUC es 7,0 (Roberts et al. 1982, Krien y 2000 Kermici). Por consiguiente, el grupo imidazolilo de cis-AUC es protonado a pH < 7,0 sólo y puede actuar como un donador de protones entrando en el citoplasma que tiene pH > 7,0. Se ha publicado que la apoptosis inducida por la acidificación en células cancerígenas es la más eficiente cuando el pH intracelular está cerca de 6,5 (Thangaraju et al. 1999). La activación de caspasas por citocromo C mitocondrial es sensible al pH con un grado óptimo en el intervalo de pH de 6,3 a 6,8 in vitro (Matsuyama et al. 2000). Los datos presentados en este documento indican que cis-AUC tiene una potente actividad antiproliferativa en células cancerígenas viables a un pH extracelular de 6,5, pero la actividad está limitada a pH 7,4. Las propiedades de disociación de protones de fármacos anticancerígenos han sido discutidas, pero desde el punto de vista de la respuesta celular sólo (Kozin et al. 2001). Además de las buenas propiedades en la respuesta, un fármaco óptimo para acidificar células en tumores tendría un valor de pK_{a} más alto que el pH extracelular real y más bajo que el pH del estado estacionario intracelular. En condiciones extracelulares suavemente ácidas, la proliferación de células tumorales debería ser controlada por la acidificación intracelular inducida por cis-AUC. Esta idea también puede aplicarse a otras condiciones de hiperproliferación, tales como la proliferación de fibroblastos sinoviales en la artritis reumatoide. En el contexto del tratamiento farmacológico de tumores sólidos u otras células posibles que hiperproliferan, unas condiciones suavemente ácidas extracelulares pueden ser ideales para el uso de cis-AUC.

Para concluir el presente estudio se muestran los datos que, por primera vez, demuestran sorprendentemente la acción antiproliferativa de AUC sobre células cancerígenas. La modulación se refiere a la propiedad de AUC de acidificar el citosol de la célula. La propiedad de acidificación está basada en un pK_{a} favorable de AUC y así está restringida a la condición en la que un pH citosólico es casi neutro o superior y el ambiente extracelular es suavemente ácido. Estas condiciones de pH generalmente prevalecen en el tejido de tumores sólidos.

La invención además se ilustra en los siguientes Ejemplos no limitantes.

Ejemplos de formulaciones de acuerdo con la invención Composición 1 en gel (% p/p)

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100

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Composición 2 en gel (% p/p)

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Composición 1 en crema (% p/p)

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Composición 2 en crema (% p/p)

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103

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Composición en ungüento (% p/p)

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104

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Será apreciado que los métodos de la presente invención pueden ser incorporados en la forma de una variedad de realizaciones, sólo alguna de las cuales se describen en este documento. Así, las realizaciones descritas son ilustrativas y no deberían ser interpretadas como limitantes.

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Claims (4)

1. El uso de ácido cis-urocánico para la fabricación de una composición farmacéutica útil para prevenir o tratar:

a) cáncer, o

b) una enfermedad hiperproliferativa no cancerosa seleccionada a partir del grupo que consiste en hiperplasia benigna de piel o próstata, tal como hipertrofia prostática benigna; hiperplasia sinovial en artritis reumatoide; enfermedad inflamatoria del intestino; reestenosis; aterosclerosis; trombosis; esclerodermia y fibrosis,

en una persona o un animal, en el que una cantidad eficaz de dicho ácido cis-urocánico es administrada en una forma esencialmente no disociada a la persona o al animal.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cáncer es un cáncer local o sistémico seleccionado a partir de cáncer de cerebro, pulmón, piel, vejiga, gástrico, pancreático, de pecho, cabeza, cuello, riñón, ovárico, próstata, colorectal, esofágico, ginecológico y de tiroides.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido cis-urocánico es administrado sistémicamente o localmente, preferiblemente localmente, más preferiblemente tópicamente.

4. El uso de ácido urocánico y otro agente terapéuticamente activo para la fabricación de una composición farmacéutica útil para prevenir o tratar un cáncer o una enfermedad proliferativa, en el que:

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dicho agente terapéuticamente activo es un fármaco anticáncer o un fármaco antiproliferativo, y

-

el ácido urocánico es un potenciador para dicho agente terapéuticamente activo.