JP5347494B2 - 細胞穿孔装置及び細胞穿孔形成方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞に穿孔を形成する細胞穿孔装置に関し、より詳しくは、細胞にレーザ光を照射することで、細胞に穿孔を形成する細胞穿孔装置及び細胞穿孔形成方法に関するものである。

バイオテクノロジの分野では、微小な対象物に微細な操作を行う、体外で卵細胞を受精させる体外授精、体細胞に他の細胞の核を移植する体細胞核移植、細胞の内部細胞塊を取り出す内部細胞塊単離などがある。これら体外授精、体細胞核移植、内部細胞塊単離では、細胞の内部に物質を混入させたり、細胞の内部の物体を取り出したりするために、細胞の膜に穿孔を形成する。

細胞の膜に穿孔を形成する方法としては、例えば、特許文献１に、哺乳動物から採取された未受精卵の周囲を覆う透明帯であって、前記未受精卵の細胞収縮処理により、該細胞質と透明帯との間の囲卵腔の容積が最大となる透明帯部位に対し、レーザ光線を所定波長、所定出力および所定パルス幅の穿孔条件下において照射し、該透明帯を貫通するほぼ円形状の穿孔を形成させることを特徴とする哺乳動物の透明帯穿孔卵の作製方法が記載されている。

また、生試料に穿孔を形成する装置としては、特許文献２に、穿孔用レーザ光と参照用レーザ光とを同軸にして顕微鏡に導き、顕微鏡の対物レンズを介してステージ上の生試料に参照用レーザ光を照射した状態における生試料増を撮像してモニタ上に画像表示し、モニタ上の画像の任意の位置をライトペンで指示した位置と画像における参照用レーザ光の照射位置とを合致させるべく光路偏光を行い、合致後において穿孔用レーザを生試料に照射して穿孔を行うレーザ穿孔方法が記載されている。

また、特許文献３には、対象細胞に穿孔を形成する装置ではないが、微細な対象物質を観察、加工するための種々の装置が記載されている。また、特許文献３には、入力手段から入力された動作指令信号に応じてアクチュエータを駆動させるマイクロマニピュレータが記載されている。

特許第４１３８４５３号公報 特開昭６３−２０２３６９号公報 特開平０６−３４２１２１号公報

ここで、特許文献１及び特許文献２に記載されている方法及び装置は、操作者がモニタを見ながらまたは顕微鏡を覗き込みながら試料、卵細胞（以下「対象細胞」という。）を探し、操作者がレーザの照射位置を調整した後、レーザを照射し、対象細胞に穿孔を形成する。そのため、操作者は、視野内にある対象細胞を自ら発見し、所定位置まで移動させる必要があるため、操作する者の熟練度によっては、操作に時間がかかったり、対象細胞の所望の位置に穿孔を形成できなかったりするという問題がある。

また、シャーレ上に複数の対象細胞を配置している場合は、既に穿孔を形成した対象細胞と、まだ穿孔を形成していない対象細胞とが混在するため、それらの細胞を判断する必要もあり、操作者の操作が煩雑になるという問題もある。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、操作者の熟練度、技術によらず、対象細胞に効率よくかつ好適に穿孔を形成することが出来る細胞穿孔装置および細胞穿孔形成方法を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明は、対象細胞を含有する試料を保持する試料保持部材と、前記試料保持部材に保持された前記対象細胞に穿孔を形成する穿孔形成手段と、前記対象細胞と前記穿孔形成手段とを相対的に移動させる移動手段と、
対象領域の画像を取得する画像取得手段と、取得した画像に撮影された対象細胞の位置を検出する位置検出手段と、検出された前記対象細胞の位置に基づいて、前記対象細胞と前記穿孔形成手段とを相対的に移動させる経路を設定する移動経路設定手段と、前記移動経路設定手段の設定に基づいて前記移動手段を操作し、前記対象細胞に穿孔を形成する動作制御手段と、を有し、前記画像取得手段は、撮影対象領域を複数に分割して撮影し、複数の画像を取得したのち、取得した複数の画像を合成して撮影対象領域全体の画像を取得することを特徴とする。

ここで、前記対象細胞は、前記試料に複数個分散されていることが好ましい。

また、前記移動経路設定手段は、前記対象細胞と他の前記対象細胞とを結ぶ最短距離を移動経路として設定することが好ましい。

また、前記動作制御手段は、前記対象細胞の端部に穿孔を形成することが好ましい。

また、前記移動手段は、前記試料保持部材を水平方向及び垂直方向の少なくとも一方に移動させる移動機構であることが好ましい。

また、前記穿孔形成手段は、前記試料の前記対象細胞にレーザ光を照射し、前記対象細胞に穿孔を形成することが好ましい。

また、前記動作制御手段は、前記穿孔形成手段の動作を許可する信号を検出した後、前記穿孔形成手段からレーザ光を照射させることが好ましい。

また、前記画像取得手段は、画像を取得する際に焦点合わせを電動で行う電動焦点合わせ機構を有することが好ましい。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明は、対象細胞を含有する試料を保持する試料保持部材と、穿孔位置に配置されている物体に穿孔を形成する穿孔形成手段とを有し、穿孔形成手段により前記対象細胞に穿孔を形成する細胞穿孔形成方法であって、前記試料を撮影し、前記試料全体の画像を取得する画像取得ステップと、取得した画像から前記試料に含有される対象細胞の位置及び大きさを検出する対象細胞検出ステップと、前記検出した対象細胞の位置及び大きさから、前記穿孔形成手段と前記試料保持部材とを相対的に移動させて、前記対象細胞を前記穿孔位置に搬送する経路を算出し、設定する経路設定ステップと、前記経路設定ステップで設定した経路で前記穿孔形成手段と前記試料保持部材とを相対的に移動させ、前記相対移動の際に、前記穿孔位置に前記対象細胞が搬送されたら前記対象細胞に穿孔を形成する穿孔形成ステップと、を有し、前記画像取得ステップは、撮影対象領域を複数に分割して撮影し、複数の画像を取得したのち、取得した複数の画像を合成して撮影対象領域全体の画像を取得することを特徴とする。

また、前記対象細胞は、前記試料中に複数個含有されており、前記経路設定ステップは、複数の前記対象細胞が順次、前記穿孔位置に搬送されるように前記経路を設定することが好ましい。また、前記穿孔形成手段は、前記穿孔位置である照射位置にレーザ光を照射し、前記物体に穿孔を形成することが好ましい。

本発明にかかる細胞穿孔装置および細胞穿孔方法は、操作者の熟練度、技術によらず、対象細胞を効率よく短時間で検出することができ、かつ対象細胞に好適に穿孔を形成することができるという効果を奏する。

以下に、本発明にかかる細胞穿孔装置および細胞穿孔形成方法の一実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施形態によりこの発明が限定されるものではない。例えば、以下の実施形態では、細胞穿孔装置が単独の装置として構成された例としているが、複数の機能の中の１つの機能として、細胞穿孔装置の各構成を有するマニピュレーションシステムとしても用いることができる。つまり、細胞穿孔装置としての機能に加え、他の機能も有するマニピュレーションシステムとしても用いることができる。また、マニピュレーションシステムとして用いる場合は細胞穿孔装置を構成する各部が着脱可能な状態となっていてもよい。

図１は、本発明の細胞穿孔装置の一実施形態の概略構成を示すブロック図であり、図２は、図１に示す細胞穿孔装置の概略構成を示す斜視図である。また、図３−１は、図１に示す細胞穿孔装置の試料保持部材の概略構成を示す斜視図であり、図３−２は、図３−１に示す試料保持部材１１に保持される試料及び対象細胞の概略構成を示す上面図である。図１及び図２に示す細胞穿孔装置１０は、試料保持部材１１と、画像取得手段１２と、穿孔形成手段１４と、移動手段１６と、制御ユニット１８と、これらの各手段を支持する支持体２０とを有する。

試料保持部材１１は、図３−１に示すように、試料５２を保持する皿状の部材である。試料保持部材１１は、保持している試料５２にレーザ光を照射でき、かつ、試料５２の状態を撮影できるように、透明の部材で構成されている。ここで、試料保持部材１１としては、シャーレを用いることができる。また、試料（ドロップ）５２は、図３−２に示すように内部に対象細胞Ｃが分散された液体、またはゲル状の物質である。ここで、対象細胞Ｃとしては、卵細胞、体細胞等が例示される。

画像取得手段１２は、撮影手段３４と、接眼レンズ３６と、モニタ３８とを有し、視野内の状態を拡大して観察することができる顕微鏡システムであり、試料保持部材１１に保持された試料５２の画像を取得する。撮影手段３４は、一定の視野を有するカメラであり、試料保持部材１１の視野内に配置された部分を撮影し画像として取得する。また、撮影手段３４は、操作者からの入力、予め決められた設定等に応じて、撮影した画像をモニタ３８に表示させたり、撮影した画像を制御ユニット１８に送ったりする。また、画像取得手段１２は、撮影手段３４に加え、試料を観察できる接眼レンズ３６を有しているが、接眼レンズ３６は、必ずしも設けなくてもよい。また、撮影手段３４及び／または接眼レンズ３６は、アクチュエータにより電動で焦点合わせを行うことができる機構である。また、撮影手段３４及び／または接眼レンズ３６は、試料保持部材１１に保持された試料５２を観察する際の倍率を複数の倍率の中から選択することができる。

穿孔形成手段１４は、レーザ光発射機構を有し、試料保持部材１１が設置される領域の所定位置（以下「照射位置」という。）にレーザ光を発射する。穿孔形成手段１４は、照射位置に配置された対象細胞に向けてレーザ光を発射することで、対象細胞に穿孔を形成する。レーザ光発射機構としては、ＸＹＣｌｏｎｅ（商品名、株式会社メトラン製）を用いることができる。

移動手段１６は、試料台４０と、ステージ移動機構４２とを有し、試料保持部材１１を水平方向に移動させる。なお、移動手段１６は、電動で試料保持部材１１を移動させる手段である。

試料台４０は、中心部近傍には開口が形成されている。

ステージ移動機構４２は試料台４０を水平方向に移動させるＸＹステージである。ステージ移動機構４２は、試料台４０を支持し、試料台４０を水平方向において所定の１方向（以下「Ｙ軸方向」とする。）に移動させるＹ軸移動機構と、Ｙ軸移動機構を介して試料台４０を支持し、試料台４０及びＹ軸移動機構を水平方向においてＹ軸方向に直交する方向（以下「Ｘ軸方向」とする）に移動させるＸ軸移動機構とで構成されている。なお、移動機構としては、ステージに固定されたナット、ナットと螺合したボールねじ、ボールねじを回転させる回転モータ、ステージの移動方向に延びて配置されたレール上の部材でありステージを案内する案内部材とを有し、回転モータによりボールねじを回転させてナット及びステージを案内部材に沿って移動させる機構を用いることができる。また、移動機構としては、この他、種々の移動機構を用いることができ、例えば、超音波リニアモータを用いる移動機構、静電アクチュエータを用いる移動機構等も用いることができる。

制御ユニット１８は、位置検出手段４４と、移動経路設定手段４６と、動作制御手段４８とを有するＣＰＵ等の処理装置であり、細胞穿孔装置１０の各部を制御する。位置検出手段４４は、画像合成部５０を有し、撮影手段３４により撮影した画像から、対象細胞Ｃの試料台４０上における位置および各対象細胞Ｃの大きさ、形状、重心等を検出する。画像合成部５０は、撮影手段３４により撮影された試料５２の各位置の画像を合成し、試料５２の全体が撮影された１枚の画像を作成する。

移動経路設定手段４６は、位置検出手段４４で検出した各対象細胞Ｃの位置と大きさとに基づいて、各対象細胞の穿孔を形成する部分、つまり、試料台４０に支持された試料保持部材１１上の座標を特定し、対象細胞の穿孔を形成する部分をレーザの照射位置に移動させるための移動量と移動経路を算出する。ここで、移動経路設定手段４６は、対象細胞の穿孔を形成する部分と、他の対象細胞の穿孔を形成する部分とを結んで経路を設定する。

動作制御手段４８は、画像取得手段１２による画像の取得動作や、穿孔形成手段１４による細胞への穿孔動作や、移動手段１６による試料保持部材１１の移動動作を制御する。具体的には、動作制御手段４８は、移動手段１６により試料保持部材１１を所定量移動させて、所定量移動させる毎に画像取得手段１２により試料保持部材１１の画像を取得する。このように、試料保持部材１１を一定量移動させつつ画像を撮影させることで、試料保持部材１１の試料５２全体の画像を取得することができる。また、動作制御手段４８は、移動経路設定手段４６により設定された移動経路に従って、試料保持部材１１を移動させ、対象細胞の穿孔を形成する部分をレーザの照射位置に移動させたら、穿孔形成手段１４からレーザ光を照射させることで、対象細胞の所定位置に穿孔を形成する。細胞穿孔装置１０は、基本的に以上のような構成である。

次に、図４及び図５−１から図５−９を用いて、細胞穿孔装置１０の動作、つまり細胞穿孔装置１０の作用について説明する。ここで、図４は、細胞穿孔装置１０の動作の一例を示すフロー図であり、図５−１から図５−９は、それぞれ細胞穿孔装置１０の動作を説明するための説明図である。

まず、準備として、試料保持部材１１に、対象細胞Ｃを含有する試料５２を滴下し、試料保持部材１１上に試料５２が載置された状態とする。その後、試料保持部材１１を試料台４０の所定位置に設置する。なお、試料５２の載置と、試料台４０への設置との順序は逆でもよい。

細胞穿孔装置１０は、試料５２が載置された試料保持部材１１が試料台４０に設置されたら、ステップＳ１２として、試料５２の中心位置を検出し、撮影手段１２の視野の中心と試料５２の中心とが重なるように試料保持部材１１を移動させる。具体的には、撮影手段１２により試料保持部材１１の画像を撮影し、撮影した画像から試料５２の中心を検出し、図５−１に示すように、検出した中心位置が、視野５６の中心と重なるように、移動手段１６により試料保持部材１１の位置を移動させる。ここで、試料５２の中心を検出するための画像は、一度の撮影で試料５２の全体が撮影できるように、倍率の低い状態、つまり視野が広い状態で撮影することが好ましい。ここで、ステップＳ１２で撮影する画像は、試料５２の縁が検出できればよく、試料５２に含まれる対象細胞Ｃが確認できる画像である必要がないため、倍率の低い状態で撮影した画像を用いることができる。なお、この撮影手段１２の視野の中心と試料５２の中心とが重なるように試料保持部材１１を移動させる動作は、操作者がモニタ３８の画像を確認しつつ、手動で行うようにしてもよい。また、細胞穿孔装置１０は、処理スタートの支持が操作者から入力されることを検出したら処理（ステップＳ１２）を開始するようにしても、試料台４０に試料保持部材１１が設置されたか否かを検出するセンサを設け、このセンサにより試料保持部材１１が設置されたことを検出したら処理を開示するようにしてもよい。

次に、動作制御手段４８は、ステップＳ１４として、試料５２全体の画像を取得する。ここで、ステップＳ１４の画像は、試料５２内の対象細胞Ｃの細胞の膜（例えば、透明膜）と、対象細胞の内部とを画像上認識することができる倍率で撮影する。このとき、図５−２に示すように、視野５６が試料５２の全体よりも小さい場合は、試料５２を複数の領域に分割して、分割した領域が視野５６に入るように試料保持部材１１を移動させて、視野に入った領域の画像を取得することを、順次全ての領域で行い、各領域の画像を取得する。なお、図５−２は、領域を領域Ｐ１〜Ｐ９までの９つの領域に分割する例である。この例では、各領域が領域Ｐ１から領域Ｐ９の順番で視野５６に入るように、移動手段１６により細胞保持部材１１の位置を移動させ、各領域の全体が視野５６に入ったら画像撮影手段１２で領域の画像を撮影する。このように、領域Ｐ１から領域Ｐ９までの画像を順番に取得することで、試料５２全体の画像を取得する。その後、各領域の画像を画像合成部５０で合成し、図５−３に示すように、対象細胞Ｃが認識できる状態の倍率で撮影された試料５２全体の一枚の画像を作成する。

次に、位置検出手段４４は、ステップＳ１６として、ステップＳ１４で作成した画像から、対象細胞Ｃを検出する。ここで、対象細胞Ｃは、作成した画像に対し画像処理を行うことで検出することができる。例えば、画像を２値化し、閾値の設定により、試料の溶媒と対象細胞Ｃとを分離し、対象細胞Ｃを検出する。このとき、対象物質Ｃとして検出する大きさや形状の基準を設定しておくことで、試料中に混入している対象細胞Ｃ以外の物質は、対象細胞Ｃとして検出しないようにすることができる。

次に、位置検出手段４４は、ステップＳ１８として、検出した各対象細胞Ｃの画像上つまり試料保持部材１１上での位置（座標）と、各対象細胞Ｃの大きさを検出する。ここで、各対象細胞Ｃの座標は、座標上の一点、例えば、画像の中心を基準とし、ステージ移動機構４２のＸ軸移動機構により移動される方向をＸ軸とし、Ｙ軸移動機構により移動される方向をＹ軸とした座標軸を用いて設定する。この座標軸を用いて、画像上の各対象細胞Ｃの位置を検出することで、図５−５に示すように、画像上に確認される対象細胞Ｃ１から対象細胞Ｃ１１の位置を検出する。具体的には、対象細胞Ｃ１の位置は、座標（ｘ１、ｙ１）と検出され、対象細胞Ｃ２の位置は、座標（ｘ２、ｙ２）と検出され、以下同様に対象細胞Ｃ１１までの位置が検出される。また、対象細胞Ｃの大きさは、画像処理によって特定された各対象細胞の外形線から算出することができる。また、位置検出手段４４は、対象細胞Ｃの大きさとともに形状、重心等も検出する。

次に、移動経路設定手段４６は、ステップＳ２０として、ステップＳ１８で検出した対象細胞Ｃの位置、大きさに基づいて、移動手段１６により試料保持部材１１を移動させる経路を設定する。ここで、移動経路設定手段４６は、対象細胞Ｃ１、対象細胞Ｃ２、対象細胞Ｃ３と、対象細胞Ｃ１から対象細胞Ｃ１１まで番号の小さい対象細胞から順番に対象細胞が、穿孔形成手段１４のレーザ光の照射位置５８と重なるように、試料保持部材１１を移動させる経路を設定する。ここで、対象細胞Ｃに形成する穿孔は、対象細胞Ｃの端部に形成する。また、対象細胞Ｃが卵細胞の場合は、卵細胞の端部の透明膜に穿孔を形成する。したがって、移動経路設定手段４６は、検出した対象細胞Ｃの位置、大きさに基づいて、各対象細胞Ｃの穿孔を形成する部分、つまり対象細胞Ｃの端部が穿孔形成手段１４のレーザ光の照射位置５８と重なるように、試料保持部材１１を移動させる経路を設定する。

具体的には、移動経路設定手段４８は、図５−６に示すように、設定時の焦点位置と対象細胞Ｃ１の穿孔形成予定位置との距離を算出し、算出結果から、Ｘ軸方向の移動距離Ｘ１、Ｙ軸方向の移動距離Ｙ１を移動経路として設定する。次に、対象細胞Ｃ１の穿孔形成予定位置と対象細胞Ｃ２の穿孔形成予定位置との距離を算出し、算出結果から、Ｘ軸方向の移動距離Ｘ２、Ｙ軸方向の移動距離Ｙ２を移動経路として設定する。次に、対象細胞Ｃ２の穿孔形成予定位置と対象細胞Ｃ３の穿孔形成予定位置との距離を算出し、算出結果から、Ｘ軸方向の移動距離Ｘ３、Ｙ軸方向の移動距離Ｙ３を移動経路として設定する。以下、同様にして、対象細胞の穿孔形成予定位置から他の対象細胞の穿孔形成予定位置までの距離を算出し、算出した距離分を移動経路と設定することで、各対象細胞の穿孔形成予定位置が順次照射位置５８と重なるように、試料保持部材１１の移動経路を設定することができる。

ステップＳ２０で移動経路を算出、設定したら、動作制御手段４８は、ステップＳ２２として、設定した移動経路に従って、移動手段１６により試料保持部材１１を移動させる。具体的には、試料保持部材１１を保持する試料台４０を、移動手段１６のステージ移動機構４２によりＸ軸方向にＸ１移動させ、Ｙ軸方向にＹ１移動させる。これにより、試料保持部材に保持された試料５２は、照射位置を基準として、図５−６に示す位置から図５−７に示す位置に移動される。また、対象細胞Ｃ１は、図５−７に示すように点線の位置から実線の位置まで移動され、対象細胞Ｃ１の端部が照射位置５８と重なる。なお、移動経路には、対象細胞の位置も設定されており、動作制御手段４８は、移動経路上の対象細胞の位置が照射位置５８に重なる位置まで移動させたら、移動を停止させる。

動作制御手段４８は、ステップＳ２２で試料保持部材１１を設定された位置まで移動させたら、ステップＳ２４として、焦点合わせを行う。ここで、焦点合わせは、撮影手段３４により撮影され表示されるモニタ上及び／または接眼レンズ３６で、対象細胞Ｃ、この場合は対象細胞Ｃ１が、鮮明に表示されるように、画像取得手段１２の光学系を調整する。ここで、本実施形態では、動作制御手段４８は、電動かつ自動で焦点合わせを行う。

動作制御手段４８は、ステップＳ２４で焦点合わせが完了したら、ステップＳ２６として、穿孔形成手段１４から照射位置にレーザ光を照射させ、対象細胞Ｃに穿孔を形成する。

ここで、動作制御手段４８は、焦点合わせが完了したら、そのままの位置で照射位置にレーザ光を照射させるようにしてもよいが、対象細胞にレーザ光を照射する前に、試料保持部材１１の位置を再調整するようにすることもできる。ここで、再調整の方法としては、操作者がモニタ３８で画像を確認しながら、ステージ移動機構４２をコントローラ等で操作する方法がある。なお、操作者により再調整を行う場合は、動作制御手段４８は、再調整の有無の指示、再調整の終了の指示等が入力されたことを検出したら次のステップに進むようにすればよい。また、再調整の方法としては、画像取得手段１２により視野５６内の画像を取得し、対象細胞Ｃの位置を検出し、対象細胞Ｃの所望位置（本実施形態では、端部）が照射位置５８と重なっているかを検出し、所望位置と照射位置５８とが離れている場合は、離れている距離分、移動手段１６で移動させるようにする。このように、試料保持部材１１の位置を再調整することで、対象細胞Ｃの所望位置に適切に穿孔を形成することができる。また、対象細胞Ｃの適切な位置に穿孔を形成できることで、対象細胞Ｃが使用不可能になることを抑制することができる。

動作制御手段４８は、ステップＳ２６で対象細胞Ｃに穿孔を形成したら、ステップＳ２８として、検出した対象細胞の全てに穿孔を形成したかを判定する。動作制御手段４８は、ステップＳ２８で、穿孔を形成していない対象細胞があると（つまり、Ｎｏ）判定したら、ステップＳ３０として、設定した移動経路に従って、移動手段１６により試料保持部材１１を移動させる。具体的には、試料保持部材１１が図５−７の位置にある場合は、試料保持部材１１を保持する試料台４０を、移動手段１６のステージ移動機構４２によりＸ軸方向にＸ２移動させ、Ｙ軸方向にＹ２移動させる。これにより、試料保持部材１１に保持された試料５２は、照射位置を基準として、図５−７に示す位置から図５−８に示す位置に移動される。また、対象細胞Ｃ２は、図５−８に示すように点線の位置から実線の位置まで移動され、対象細胞Ｃ２の端部が照射位置５８と重なる。動作制御手段４８は、ステップＳ３０で試料保持部材１１を移動させたら、ステップＳ２４に進み、焦点合わせを行う。このように、動作制御手段４８は、試料５２の対象細胞Ｃの全てに穿孔を形成するまで、ステップＳ３０、ステップＳ２４、ステップＳ２６、ステップＳ２８の動作を繰り返す。つまり、対象細胞Ｃ２に穿孔を形成したら、動作制御手段４８は、移動手段１６により、試料保持部材１１を、照射位置を基準として、図５−８に示す位置から図５−９に示す位置まで移動させ、焦点を合わせた後、レーザ光を照射し、対象細胞Ｃ３に穿孔を形成する。その後、対象細胞Ｃ４、対象細胞Ｃ５、対象細胞Ｃ６、対象細胞Ｃ７、対象細胞Ｃ８、対象細胞Ｃ９、対象細胞Ｃ１０、対象細胞Ｃ１１の順で照射位置に移動させ、それぞれの対象細胞に穿孔を形成する。

動作制御手段４８は、全ての対象細胞に穿孔を形成したら、ステップＳ２８で、対象細胞の全てに穿孔を形成した（つまり、Ｙｅｓ）と判定し、処理を終了する。

細胞穿孔装置１０は、以上のようにして、試料５２に分散された対象細胞Ｃに穿孔を形成する。細胞穿孔装置１０は、試料５２上の対象細胞の位置を検出し、検出結果から試料保持部材１１の移動経路を設定することで、操作者が移動手段１６により試料保持部材１１を移動させつつ、試料５２内の対象細胞Ｃを探す必要がなくなる。これにより、熟練度の低い操作者が操作した場合でも、短時間で対象細胞に穿孔を形成することができ、作業効率を高くすることができる。

また、位置検出手段４４により画像上の対象細胞Ｃを検出することで、対象細胞Ｃの検出もれを抑制でき、対象細胞Ｃを無駄なく使用することができる。また、操作者の操作で対象細胞Ｃを検出する場合は、既に穿孔を形成した細胞を再び発見し、穿孔が形成されているか否かを判定したりする必要がある。これに対して、細胞穿孔装置１０は、位置検出手段４４により対象細胞Ｃを検出し、かつ、移動経路設定手段４６により、設定した経路で、一つずつの対象細胞Ｃをレーザ光の照射位置５８まで移動させるようにするため、対象細胞Ｃに穿孔が形成されているか否かを判定する必要がなくなる。このため、作業効率を高くすることができる。また、各対象細胞Ｃを１度ずつレーザ光の照射位置５８に移動させるようにできるため、１つの対象細胞Ｃに２つの穿孔を形成してしまうことも抑制することができる。

ここで、本実施形態では、ステップＳ１４で、試料の画像を複数の領域に分割して取得した後、各領域の画像を合成することで、試料全体を示す１枚の画像を作成したが本発明はこれに限定されない。対象細胞Ｃが認識できる状態の倍率でも試料全体が視野内に収まる場合は、試料全体を分割せずに、１度の撮影で取得した１枚の画像を用いればよい。また、本実施形態では、試料全体を９分割したが、分割数は特に限定されず、２分割でも、４分割でも、１６分割でもよい。

また、ステップＳ２４の焦点合わせは、本実施形態のように、電動かつ自動で焦点合わせを行うようにすることが好ましいが、操作者がアクチュエータを操作し焦点合わせを行うようにしてもよい。この場合は、動作制御手段４８は、操作者により焦点合わせが完了したという指示の入力を確認したら、ステップＳ２６に進むようにすればよい。なお、操作者による指示は、キーボードや専用のスイッチ等の入力手段を設け、これらの手段から入力するようにすればよい。また、焦点合わせは、基本的に自動で行うようにし、操作者により焦点が合っているかを確認するようにしてもよい。この場合は、操作者の確認完了の入力後、次のステップに進むようにすればよい。また、この場合は、焦点がずれている場合は操作者により微調整できるようにすることで、より的確に焦点を合わせることができる。

細胞穿孔装置１０は、ステップＳ２６で操作者によりレーザ光照射許可信号が入力されてから、対象細胞にレーザ光を照射するようにしてもよい。ここで、レーザ光照射許可信号を入力する手段は、キーボード、フットスイッチ、ボタン等どのような手段でもよい。

また、上記実施形態では、ステップＳ２８において、対象細胞の全てに穿孔を形成したかを、ステップＳ１６に検出した検出結果に基づいて動作制御手段４８が自動的に判定するようにしたが、本発明はこれに限定されない。例えば、操作者からの入力される操作を繰り返すか終了するかの指示を検出し、その指示に基づいて動作するようにしてもよい。

また、細胞穿孔装置１０の移動手段１６は、上述したように種々の移動機構を用いることができるが、上記移動機構に加え、特開２００８−２３３５４５号公報に記載されているような、圧電素子を使用した微細機構（「ナノポジショナー」ともいう。）を組み合わせることが好ましい。上述した移動機構により、試料保持部材１１の大まかな位置を調整し、微細機構により、試料保持部材１１の微細な位置を調整することで、対象細胞と照射位置との位置合わせをより精密に行うことができる。

また、上記実施形態では、作業効率を高くすることができるという効果をより顕著にえることができるため、試料中に対象細胞が複数個分散された場合を説明したが、本発明はこれに限定されず、試料中に対象細胞が１つの場合にも用いることができる。試料中に対象細胞が一つの場合でも作業者がモニタまたは接眼レンズで観察しつつ、対象細胞を探す必要がなくなり、自動で対象細胞を照射位置まで移動できるため、作業効率を高くすることができる。また、作業者の熟練度によらず、適切に対象細胞に穿孔を形成することができる。

また、動作制御手段４８は、移動手段１６のステージ移動機構４２による試料保持部材１１の移動の制御を、開ループ制御で行っても、閉ループ制御（フィードバック制御）によって行ってもよい。また、開ループ制御を行う場合は、移動時の画像情報を収集し、その情報をフィードバック情報として、位置の調整操作を行ってもよい。

また、上記実施形態では、移動が簡単であり、装置構成が簡単になるため、試料保持部材を移動させて、対象細胞と穿孔形成手段のレーザ照射位置とを相対的に移動させたが、本発明はこれに限定されず、穿孔形成手段を移動させ、レーザ照射位置を移動させることで、対象細胞と穿孔形成手段のレーザ照射位置とを相対的に移動させるようにしてもよい。なお、この場合は、穿孔形成手段と共に画像取得手段を移動させることが好ましい。また、上記実施形態では、ステージ移動機構として、試料台４０及び試料保持部材を水平方向のみに移動させる移動機構としたが、水平方向に加え、垂直方向にも移動させる移動機構としてもよい。また、レーザ照射位置および画像取得手段を移動できる場合は、試料台及び試料保持部材を垂直方向のみに移動させる移動機構としてもよい。

以上のように、本発明にかかる細胞穿孔装置は、卵細胞や体細胞等の種々の細胞に穿孔を形成するのに有用であり、特に、複数の細胞に連続して穿孔を形成するのに適している。

本発明の細胞穿孔装置の一実施形態の概略構成を示すブロック図である。 図１に示す細胞穿孔装置の概略構成を示す斜視図である。 図１に示す細胞穿孔装置の試料保持部材の概略構成を示す斜視図である。 図３−１に示す試料保持部材に保持される試料及び対象細胞の概略構成を示す上面図である。 細胞穿孔装置の動作の一例を示すフロー図である。 細胞穿孔装置の動作を説明するための説明図である。 細胞穿孔装置の動作を説明するための説明図である。 細胞穿孔装置の動作を説明するための説明図である。 細胞穿孔装置の動作を説明するための説明図である。 細胞穿孔装置の動作を説明するための説明図である。 細胞穿孔装置の動作を説明するための説明図である。 細胞穿孔装置の動作を説明するための説明図である。 細胞穿孔装置の動作を説明するための説明図である。 細胞穿孔装置の動作を説明するための説明図である。

符号の説明

１０ 細胞穿孔装置
１１ 試料保持部材
１２ 画像取得手段
１４ 穿孔形成手段
１６ 移動手段
１８ 制御ユニット
２０ 支持体
３４ 撮影手段
３６ 接眼レンズ
３８ モニタ
４０ 試料台
４２ ステージ移動機構
４４ 位置検出手段
４６ 移動経路設定手段
４８ 動作制御手段
５０ 画像合成部
５２ 試料
５６ 視野
５８ 照射位置
Ｃ 対象細胞

Claims (12)

1. 対象細胞を含有する試料を保持する試料保持部材と、
   前記試料保持部材に保持された前記対象細胞に穿孔を形成する穿孔形成手段と、
   前記対象細胞と前記穿孔形成手段とを相対的に移動させる移動手段と、
   対象領域の画像を取得する画像取得手段と、
   取得した画像に撮影された対象細胞の位置を検出する位置検出手段と、
   検出された前記対象細胞の位置に基づいて、前記対象細胞と前記穿孔形成手段とを相対的に移動させる経路を設定する移動経路設定手段と、
   前記移動経路設定手段の設定に基づいて前記移動手段を操作し、前記対象細胞に穿孔を形成する動作制御手段と、を有し、
   前記画像取得手段は、撮影対象領域を複数に分割して撮影し、複数の画像を取得したのち、取得した複数の画像を合成して撮影対象領域全体の画像を取得し、
   前記動作制御手段は、前記対象細胞に穿孔を形成したら、検出した前記対象細胞の全てに穿孔を形成したかを判定し、全ての前記対象細胞に穿孔を形成したと判定したら処理を終了することを特徴とする細胞穿孔装置。
2. 前記対象細胞は、前記試料に複数個分散されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞穿孔装置。
3. 前記移動経路設定手段は、前記対象細胞と他の前記対象細胞とを結ぶ最短距離を移動経路として設定することを特徴とする請求項２に記載の細胞穿孔装置。
4. 前記動作制御手段は、前記対象細胞の端部に穿孔を形成することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞穿孔装置。
5. 前記移動手段は、前記試料保持部材を水平方向及び垂直方向の少なくとも一方に移動させる移動機構であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞穿孔装置。
6. 前記穿孔形成手段は、前記試料の前記対象細胞にレーザ光を照射し、前記対象細胞に穿孔を形成することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞穿孔装置。
7. 前記動作制御手段は、前記穿孔形成手段と前記試料保持部材とを相対的に移動させて穿孔位置に前記対象細胞を搬送したら、前記試料保持部材の位置の再調整が入力されたことを検出し、前記穿孔形成手段の動作を許可する信号を検出した後、前記穿孔形成手段からレーザ光を照射させることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞穿孔装置。
8. 前記画像取得手段は、画像を取得する際に焦点合わせを電動で行う電動焦点合わせ機構を有することを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の細胞穿孔装置。
9. 対象細胞を含有する試料を保持する試料保持部材と、穿孔位置に配置されている物体に穿孔を形成する穿孔形成手段とを有し、穿孔形成手段により前記対象細胞に穿孔を形成する細胞穿孔形成方法であって、
   前記試料を撮影し、前記試料全体の画像を取得する画像取得ステップと、
   取得した画像から前記試料に含有される対象細胞の位置及び大きさを検出する対象細胞検出ステップと、
   前記検出した対象細胞の位置及び大きさから、前記穿孔形成手段と前記試料保持部材とを相対的に移動させて、前記対象細胞を前記穿孔位置に搬送する経路を算出し、設定する経路設定ステップと、
   前記経路設定ステップで設定した経路で前記穿孔形成手段と前記試料保持部材とを相対的に移動させ、前記相対移動の際に、前記穿孔位置に前記対象細胞が搬送されたら前記対象細胞に穿孔を形成する穿孔形成ステップと、
   前記対象細胞に穿孔を形成したら、検出した前記対象細胞の全てに穿孔を形成したかを判定し、前記全ての対象細胞に穿孔を形成したと判定したら処理を終了する判定ステップと、を有し、
   前記画像取得ステップは、撮影対象領域を複数に分割して撮影し、複数の画像を取得したのち、取得した複数の画像を合成して撮影対象領域全体の画像を取得することを特徴とする細胞穿孔形成方法。
10. 前記対象細胞は、前記試料中に複数個含有されており、
    前記経路設定ステップは、複数の前記対象細胞が順次、前記穿孔位置に搬送されるように前記経路を設定することを特徴とする請求項９に記載の細胞穿孔形成方法。
11. 前記穿孔形成手段は、前記穿孔位置である照射位置にレーザ光を照射し、前記物体に穿孔を形成することを特徴とする請求項９または１０に記載の細胞穿孔形成方法。
12. 前記穿孔形成手段と前記試料保持部材とを相対的に移動させて穿孔位置に前記対象細胞を搬送したら、前記試料保持部材の位置の再調整が入力されたことを検出し、前記穿孔形成手段の動作を許可する信号を検出した後、前記穿孔形成手段からレーザ光を照射させる動作制御ステップを有することを特徴とする請求項９から１１のいずれか１項に記載の細胞穿孔形成方法。

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