JP5301565B2 - 生体材料の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は生体材料およびその製造方法に関し、特に、脱細胞化された魚鱗から生体材料を製造する方法に関する。製造された生体材料は組織の修復および移植の分野に用いることが可能である。

組織工学は生物学的及び薬学的な生体材料と密接に関連しており、移植手術を行う患者の血管新生や、組織統合、組織再構成を強化させることができる。生体材料は人工的に合成された材料であり、人工器官の再構成、修復または補修に適用され、ひいては人体組織に取って代わる。

数十年来、コラーゲン繊維、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）およびリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）は、いずれも多くのデータによって証明され、かつ人体組織移植に安全に用いられうる生体材料である。しかしながら、これらの生体材料には、機械的強度不足、架橋工程での化学物質の残留、および人畜共通疾病感染等の欠点が存在する。

従って、機械的強度を強化し、かつ、組織の修復および移植の過程において人畜共通疾病感染の確率を低下させた、新たな生体材料を提供することが必要である。

本発明の目的は、機械的強度を強化し、かつ、組織の修復および移植の過程において人畜共通疾病感染の確率を低下させた、新たな生体材料を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、上記の生体材料を提供して組織修復および組織移植に用いることである。

本発明のさらに別の目的は、上記の生体材料を製造する方法を提供することである。

本発明は魚鱗から生体材料を製造する方法を提供し、当該方法は、魚鱗を脱細胞化し、さらに、一定量の顆粒に粉砕するステップを含み、これらの顆粒には海綿状マトリックスと海綿状粉末との混合物が含まれる。

本発明の生体材料を製造する方法は、前記海綿状マトリックスおよび海綿状粉末を２００℃以下の温度で押出し成形して、フレーク状(flaky form)もしくは不定形塊状(lump form)にするか、あるいは特定の金型を用いて特定形状とするステップをさらに含んでもよい。

本発明の生体材料を製造する方法において、魚鱗を粉砕する前に、魚鱗を脱水するステップをさらに含んでもよい。前記脱水ステップでは、魚鱗を含水量が５０％未満になるまで脱水してもよい。前記魚鱗を脱水するステップの前に、魚鱗を洗浄するステップをさらに含んでもよい。ただし、魚鱗を脱細胞化するステップは前記魚鱗を洗浄するステップの前であってもよい。魚鱗を脱細胞化するステップは魚鱗を脱水するステップの前であってもよい。

本発明の生体材料を製造する方法は、海綿状マトリックスおよび海綿状粉末を顆粒中から分離するステップをさらに含んでもよい。

本発明における原料の魚鱗としては、直径の平均サイズが２０ｃｍ未満の魚鱗、例えば、大きなサイズ（１０〜２０ｃｍ）の魚鱗が可能であるが、小さなサイズの魚鱗でもよい。本発明の生体材料を製造する方法においては、魚鱗の生体材料の天然結合および立体構造を留めていることに重点があり、魚鱗の粉砕程度については特に限定されない。一般には、魚鱗を顆粒の直径の平均サイズが１０，０００μｍ未満になるまで粉砕する。使用する魚鱗原料の直径の平均サイズが１０，０００μｍ未満であって、さらに適宜粉砕する必要がある場合には、より小さい顆粒サイズに粉砕する。例えば、顆粒の直径の平均サイズが１０μｍ未満になるまで粉砕することが可能である。

本発明はさらに別の、魚鱗から生体材料を製造する方法を提供する。当該方法は、魚鱗を脱細胞化し、さらに、押出し工程を行って、フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定形状とするステップを含む。

本発明の生体材料を製造する方法において、前記押出し工程は２００℃以下の温度で行われる。ただし、魚鱗の押出し工程を行う前に、魚鱗を洗浄するステップをさらに含んでもよい。洗浄ステップの終了後、かつ魚鱗の押出し工程を行う前に、魚鱗を脱水するステップをさらに含んでもよい。前記脱水ステップでは、魚鱗を含水量が５０％未満になるまで脱水してもよい。ただし、魚鱗を脱細胞化するステップは魚鱗を洗浄するステップの前であってもよい。魚鱗を脱細胞化するステップは魚鱗を脱水するステップの前であってもよい。魚鱗の押出し工程を行う前に、魚鱗を水中に浸漬するステップをさらに含んでもよい。

本発明の魚鱗から生体材料を製造する具体的な方法によれば、前記製造プロセスは、脱細胞化した魚鱗を含水量が５０％未満になるまで脱水するステップ、および、脱水後の魚鱗を、粉砕された顆粒の直径の平均サイズが１０，０００μｍ未満になるまで粉砕するステップを含み、粉砕された顆粒のそれぞれには海綿状マトリックスと海綿状粉末との混合物が含まれる。本発明の一実施形態では、魚鱗を含水量が２５％未満になるまで脱水し、かつ粉砕された顆粒の直径の平均サイズは５，０００μｍ未満である。

一方、本発明の魚鱗から生体材料を製造するプロセスには、２００℃以下の温度で処理を行うことを含む。

本発明はさらに、前記方法を用いて魚鱗から製造される生体材料を提供する。

本発明の方法を用いて製造された生体材料は、魚鱗の生体材料の本来の結合および立体構造を留めており、当該生体材料は良好な機械的強度を有し、組織修復および組織移植に用いることが可能であって、かつ、組織の修復および移植の過程において人畜共通疾病の感染確率を大幅に低下させることが可能である。

本発明の生体材料を製造する方法の第一のフローの概略図 本発明の生体材料を製造する方法の第二のフローの概略図 本発明の実施例１および実施例２の生体材料を製造する方法の第一のフローの概略図 本発明の実施例１および実施例２の生体材料を製造する方法の第二のフローの概略図 本発明の実施例３の生体材料を製造する方法の第一のフローの概略図 本発明の実施例３の生体材料を製造する方法の第二のフローの概略図 本発明の生体材料と共に３Ｔ３細胞（繊維芽細胞）を五日間培養したＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）図 本発明の生体材料と共に骨芽細胞を五日間培養したＳＥＭ図 本発明の生体材料と共に３Ｔ３細胞（繊維芽細胞）を五日間培養した共焦点顕微鏡図 本発明の生体材料と共に骨芽細胞を五日間培養した共焦点顕微鏡図 本発明の生体材料と共に骨芽細胞を五日間培養したヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色図

以下、本発明の利点および思想をさらに開示するために、図面を参照して詳細に説明する。

本発明の生体材料を製造する方法の第一のフローの概略図である図１Ａを参照する。本発明の生体材料製造プロセスは、魚鱗９を脱細胞化し（ステップＳ１０）、かつ魚鱗９を含水量が５０％未満になるまで脱水する（ステップＳ２０）ステップを含む。脱水・粉砕後の魚鱗９の顆粒の直径の平均サイズは１０，０００μｍ未満である。好ましくは、魚鱗９を含水量が２５％未満になるまで脱水し、かつ、顆粒の直径の平均サイズが５，０００μｍ未満になるまで粉砕する。

この魚鱗９は冷蔵または冷凍させた状態で生体材料の製造に提供される。本発明は直径の平均サイズが２０ｃｍ未満の魚鱗９を選択する。まず、魚鱗９を脱細胞化する（ステップＳ１０）。脱細胞化は低張液、界面活性剤、Triton X-100、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、タンパク質分解酵素阻害剤、デオキシリボヌクレアーゼ（DNase）、およびリボヌクレアーゼ（RNase）等の試薬を用いて魚鱗９に付着した細胞を除去する。この目的は、魚鱗９より製造される生体材料が、表面に付着した細胞により組織の修復および移植に影響を与え、ひいては被移植体の免疫反応を誘発し、さらには拒絶反応を生じうることを避けることである。魚鱗９の脱水操作（ステップＳ１２）を行う前に、まず魚鱗９を他の洗剤を用いて洗浄する（ステップＳ１１）必要がある。これらの洗剤としては、例えば、界面活性剤、洗浄剤、温水、および６０℃エタノールのような極性溶媒が可能であるが、これらに限られない。しかしながら、本発明ではいかなる特定の洗浄ステップも限定しないが、いずれの場合も魚鱗９をリムルス試験（limulus amebocyte lysate, LAL test）にパスする程度まで洗浄する必要があり、洗浄後の魚鱗９のリムルス試験における検査値は１，０００Eu／ｍｌ未満でなければならない。

本発明の生体材料を製造する方法の第二のフローの概略図である図１Ｂを参照する。そのステップは第一のフローと概ね同様であり、脱細胞化のステップ（ステップＳ１０）が洗浄ステップ（ステップＳ１１）の後に位置することのみが異なる。魚鱗９を洗浄する（ステップＳ１１）前に脱細胞化操作（ステップＳ１０）を行うか、それとも魚鱗９を洗浄した（ステップＳ１１）後に脱細胞化操作（ステップＳ１０）を行うかを問わず、両者はいずれも順次以下のステップに進むことができる。

その後、魚鱗９を脱水する（ステップＳ１２）。脱水方法は、圧縮空気脱水器（エアスプレー）、オーブン、冷凍乾燥または他の従来の脱水方法を用いることが可能である。また、魚鱗９をエタノールまたは他の極性有機溶媒に浸漬して当該魚鱗９を乾燥させてもよい。魚鱗９を含水量が５０％未満になるまで脱水するためであり、好ましい状態としては、含水量は２５％未満である。続いてこれら脱水後の魚鱗９を顆粒の直径の平均サイズが１０，０００μｍ未満になるまで粉砕する。好ましい状態としては、顆粒の直径は約５，０００μｍである。また、粉砕後の顆粒には海綿状マトリックス１４と海綿状粉末１５との混合物が含まれる。そのため、本発明は、例えば「篩い」のようなフィルター器具を用いて当該粉砕後の顆粒をフィルター処理することで、さらに海綿状マトリックスと海綿状粉末を分離する。このフィルター処理ステップにおいて、ふるい効果を高めるために振動手段を用いてもよい。これにより、フィルター器具によってフィルター処理された顆粒は粉末の形態で生体材料として使用され、フィルター処理後に残った顆粒はマトリックスの形態で生体材料として使用される。そのため、魚鱗９を粉砕する装置は特定の粉砕機に限定されない。粉砕後の顆粒の平均サイズが１０，０００μｍを超えなければ、好ましい状態としては直径が５，０００μｍ未満であれば、魚鱗９のサイズを減少させる任意の粉砕装置であってよい。

無菌の生体材料を生産するために、製造プロセスはさらに、押出し（ステップＳ１６）、フィルター処理、全体または部分的な乾燥、および滅菌を行うステップを含んでもよい。好ましい実施形態においては、これらのステップは加熱条件下であるか否かを問わず、実行可能である。当該生体材料は、様々な結合組織修復用組成物や、他の活性／不活性成分と混合してもよい。

また、脱水後の魚鱗９を押出処理することにより、フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定形状の生体材料を生成することが可能である。この押出処理には温度変化（加熱でも、低温ひいては冷凍でもよい）の工程を含んでもよいが、２００℃以上の温度になってはならない。洗浄ステップ（ステップＳ１１）の後、魚鱗９を２００℃以下の温度に置いて押出し（ステップＳ１６）を行って、フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定の形状１７とされた生体材料を製造する。脱水後の魚鱗９は押出し操作が容易である。押出し工程（ステップＳ１６）を行う前に、魚鱗９を水中に浸漬するステップ（ステップＳ１８）を任意に加えてもよい。ただし、このステップは洗浄ステップ（ステップＳ１１）の後に行う必要がある。また、本発明にはさらに別の実施形態があり、当該生体材料はマトリックスであるか粉末の形態であるかを問わず、いずれも押出し工程（ステップＳ１６）を行うことが可能であって、当該生体材料をフレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて形態１７に転換する。当該押出し工程は２００℃以下の温度で行われる。しかしながら、本発明の加熱処理は上記のように押出し工程に限定されるわけではなく、当業者であれば、各種の熱押出し、熱加圧、モールディングのステップのような形式の他の加熱処理方式を用いても、当該フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定形状とされた生体材料を製造することが可能である。

本発明の生体材料は組織修復因子を含むため、組織修復材料を作製することが可能である。この組織修復材料は、様々な組織傷害および組織欠陥部位の修復に用いられる。例えば、本発明の生体材料は、骨欠陥部位、軟骨修復部位、歯槽修復部位若しくは他の軟組織欠陥部位又はそれらの近傍用の注射製剤として調整することが可能である。他の実施形態では、当該生体材料を、外科手術における骨欠陥部位、軟骨修復部位若しくは他の組織欠陥部位又はそれらの近傍への移植やインプラント用の被覆材料とする。そのため、本発明は魚鱗から組織修復材料を有する外科手術移植の結合組織を取得するために用いることが可能であり、特に結合組織欠損部位に用いられる。

以上のように、本発明は魚鱗９から製造される生体材料に関し、かつ、当該生体材料は、粉末；マトリックス；または、フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型により特定形状とされた材料であって、様々な組織の修復および移植の分野に応用することが可能である。これら魚鱗９から得られる材料はまた、粉末やマトリックスであるか、フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定形状とされた生体材料であるかを問わず、いずれも組織修復因子を含み、かつ、規則性が異なりうる（形状によって修復方式が異なりうる。例えば、骨修復と皮膚修復とで修復方式は異なる）。

以下に本発明の技術内容を詳細に記述するが、これらに限られるものではない。

実施例１：マトリックス形態
本発明の実施例１の生体材料を製造する第一のフローの概略図である図１Ｃを参照する。このプロセスは魚鱗を脱細胞化するステップ（ステップＳ２０）からスタートする。続いて、魚鱗の洗浄操作（ステップＳ１９）が行われる。洗浄後の魚鱗のリムルス試験における検査値は１，０００Eu／ｍｌ未満でなければならない。本発明の実施例１の生体材料を製造する第二のフローの概略図である図１Ｄを参照する。このプロセスは魚鱗の洗浄操作（ステップＳ１９）からスタートする。洗浄後の魚鱗のリムルス試験における検査値は１，０００Eu／ｍｌ未満でなければならない。続いて、魚鱗を脱細胞化するステップ（ステップＳ２０）が行われる。

魚鱗を洗浄する（ステップＳ1９）前に脱細胞化操作（ステップＳ２０）を行うか、それとも魚鱗を洗浄した（ステップＳ１９）後に脱細胞化操作（ステップＳ２０）を行うかを問わず、両ステップはいずれも順次次のステップに進むことができる。

その後、ステップＳ２１に進み、魚鱗は含水量が５０％未満になるまで脱水される。次いでステップＳ２２で、脱水された魚鱗は顆粒の直径の平均サイズが１０，０００μｍ未満になるまで粉砕される。これらの顆粒には海綿状マトリックスと海綿状粉末との混合物が含まれる。ステップＳ２３はフィルター処理を行うステップであり、フィルター器具を用いて混合物中からマトリックスを分離する。

従って、フィルター処理ステップ後にマトリックスが得られ、このマトリックスにはHAP、TCPおよびコラーゲンタンパク質から構成される繊維組織が含まれる。

実施例２：粉末形態
本発明の実施例２の生体材料を製造する第一のフローの概略図である図１Ｃ、および第二のフローの概略図である図１Ｄを再度参照する。粉末形態の生体材料を製造するプロセスは、マトリックス形態の生体材料を製造するプロセスと類似している。上記の通り、粉砕後の顆粒には海綿状マトリックスと海綿状粉末との混合物が含まれる。ステップＳ２３はフィルター処理を行うステップである。粉末形態の生体材料を製造する際に異なる点は、フィルター器具を用いて混合物中から粉末を分離する点である。そのため、粉末形態は一定の機械的構造を有する（ここでいう機械的構造とは、本発明は生体材料に対して酵素による処理を行っていないため、生体材料本来の機械的構造が完全に保たれていることを指す。すなわち、コラーゲンタンパク質およびヒドロキシアパタイト等の成分が保たれているのみならず、当該材料の天然の立体構造および鎖状構造もすべて完全に保たれている）。さらに、マトリックス形態と異なり、粉末顆粒の直径サイズは５，０００μｍ未満である。

実施例３：フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定形状とされた形態
本発明の実施例３の生体材料を製造する第一のフローの概略図である図１Ｅを参照する。その目的は、魚鱗から、フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定形状とされた生体材料を製造することである。このプロセスは魚鱗を脱細胞化するステップ（ステップＳ３０）からスタートする。その後、魚鱗の洗浄操作（ステップＳ２９）が行われる。洗浄後の魚鱗のリムルス試験における検査値は１，０００Eu／ｍｌ未満でなければならない。本発明の実施例３の生体材料を製造する第二のフローの概略図である図１Ｆを参照する。その目的は、魚鱗から、フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定形状とされた生体材料を製造することである。このプロセスは魚鱗の洗浄操作（ステップＳ２９）からスタートする。洗浄後の魚鱗のリムルス試験における検査値は１，０００Eu／ｍｌ未満でなければならない。その後、魚鱗を脱細胞化するステップ（ステップＳ３０）が行われる。

魚鱗を洗浄する（ステップＳ２９）前に脱細胞化操作（ステップＳ３０）を行うか、それとも魚鱗を洗浄した（ステップＳ２９）後に脱細胞化操作（ステップＳ３０）を行うかを問わず、両者はいずれも順次以下のステップに進むことができる。

その後、ステップＳ３１に進み、ステップＳ３１において、魚鱗は含水量が２５％未満になるまで脱水される。次いでステップＳ３２で、脱水された魚鱗は顆粒の直径の平均サイズが５，０００μｍ未満になるまで粉砕される。これらの顆粒には海綿状マトリックスと海綿状粉末との混合物が含まれる。ステップＳ３３はフィルター処理を行うステップであり、フィルター器具を用いて混合物中からマトリックスおよび粉末を分離する。ステップＳ３４では、このマトリックスおよび粉末の押出しを行う。マトリックスおよび粉末の押出しはそれぞれに行われてもよく、マトリックスおよび粉末を混合した後に押出しが行われてもよい。例えば骨修復用の生体材料であるか皮膚修復用の生体材料であるかといった、製造する生体材料の使用用途の違いにより、マトリックスと粉末とを異なる所要量の割合で混合することが可能である。

フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定形状とされた生体材料を製造する方法には二種類あり、一つ目の方法は、洗浄ステップ（ステップＳ２９）の後に後続の操作を直接行う方法である。二つ目の方法は、図１Ｅおよび図１Ｆに示すように、押出しステップの前に、まず魚鱗を洗浄し脱水するステップを行う方法である。

そのため、脱水後の魚鱗であるか、未脱水であるが洗浄後の魚鱗であるか、それとも魚鱗から得られたマトリックス形態および粉末形態の生体材料であるかを問わず、いずれの場合も押出しステップを行って、フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定形状とされた生体材料を生成する。１種の魚鱗全体または様々な種類の魚鱗から得られる生体材料を用いて、まず低温下で１００ｇ／２．５ｃｍ^３よりも大きい圧力で押出しを行う。好ましい圧力は１ｋｇ／２．５ｃｍ^３である。さらに、２００℃の高温下の押出し金型に送って押出しを行う（このステップの重点は押出し操作であって、押出し温度は例示的な説明に過ぎない。低温（例えば−１８℃〜４℃）下で押し出しても、高温（例えば３０℃〜６０℃）下で押し出してもよいが、好ましくは２００℃を超えるべきではない。温度の違いによって具体的な押出し力および押出し時間は異なり、フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定形状とされた生体材料が得られる）。押出し操作を行う前に、当該生体材料の架橋作用を加熱または適切な濃度の化学架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド、ＥＤＣまたは他の一般的に用いられる化学架橋剤が可能）を加えることにより架橋させてもよい。ただし、生体材料において、架橋剤はアミン類または他の反応性成分と反応しうる。

本発明の脱細胞化の工程において、一部の水溶性タンパク質およびグルコサミノグリカンが洗浄により除かれる以外、本来のコラーゲンタンパク質、弾性タンパク質繊維および大部分のグルコサミノグリカンは依然として天然細胞外間質の構造内に保たれる。そのため、脱細胞化された生体材料は、自然に細胞移入することができ、さらに、かなり良好な生体適合性を有する。

図２Ａは本発明の生体材料２０と共に３Ｔ３細胞（繊維芽細胞２２）を五日間培養したＳＥＭ図であり、図２Ｂは本発明の生体材料２０と共に骨芽細胞２４を五日間培養したＳＥＭ図である。これらの図は、繊維芽細胞２２であるか骨芽細胞２４であるかを問わず、本発明の生体材料２０を用いると、いずれの場合もかなり完全に生育できることを示している。

図３Ａは本発明の生体材料２０と共に３Ｔ３細胞（繊維芽細胞）を五日間培養した共焦点顕微鏡図であり、図３Ｂは本発明の生体材料２０と共に骨芽細胞を五日間培養した共焦点顕微鏡図である。これらの図は、繊維芽細胞であるか骨芽細胞であるかを問わず、本発明の生体材料２０を用いると、いずれの場合もかなり完全に生育できることを示している。

図４は本発明の生体材料２０と共に骨芽細胞２４を五日間培養したＨ＆Ｅ染色図である。この図は、骨芽細胞２４は本発明の生体材料２０を用いると、かなり完全に生育できることを示している。

以上は好ましい実施形態および異なる実施形態を用いた本発明の詳細な説明であって、本発明の実施範囲を制限するものではない。また、当業者にとって、多少の改変を適宜行っても本発明の要旨および範囲を逸脱しないことは自明である。

Claims (19)

1. 魚鱗を脱細胞化し、さらに、顆粒に粉砕するステップを含み、前記顆粒には海綿状マトリックスと海綿状粉末との混合物が含まれる、
   魚鱗から生体材料を製造する方法。
2. ２００℃以下の温度で前記海綿状マトリックスおよび前記海綿状粉末を押し出して、フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定の形状を得るステップをさらに含む、請求項１に記載の生体材料を製造する方法。
3. 魚鱗を粉砕する前に、魚鱗を脱水するステップをさらに含む、請求項１に記載の生体材料を製造する方法。
4. 前記脱水ステップは、魚鱗を含水量が５０％未満になるまで脱水する、請求項３に記載の生体材料を製造する方法。
5. 魚鱗を脱水するステップの前に、魚鱗を洗浄するステップをさらに含む、請求項３に記載の生体材料を製造する方法。
6. 魚鱗を脱細胞化するステップは、魚鱗を洗浄するステップの前である、請求項５に記載の生体材料を製造する方法。
7. 魚鱗を脱細胞化するステップは、魚鱗を脱水するステップの前である、請求項３に記載の生体材料を製造する方法。
8. 海綿状マトリックスおよび海綿状粉末を前記顆粒中から分離するステップをさらに含む、請求項１に記載の生体材料を製造する方法。
9. 魚鱗を顆粒の直径の平均サイズが１０，０００μｍ未満になるまで粉砕する、請求項１に記載の生体材料を製造する方法。
10. 前記魚鱗の直径の平均サイズは２０ｃｍ未満である、請求項１に記載の生体材料を製造する方法。
11. 魚鱗を脱細胞化し、さらに、押出し工程を行って、フレーク状もしくは不定形塊状、或いは特定の金型を用いて特定形状とした材料を形成するステップを含む、
    魚鱗から生体材料を製造する方法。
12. 前記押出し工程は２００℃以下の温度で行われる、請求項１１に記載の生体材料を製造する方法。
13. 魚鱗の押出し工程を行う前に、魚鱗を洗浄するステップをさらに含む、請求項１１に記載の生体材料を製造する方法。
14. 洗浄ステップの終了後、かつ魚鱗の押出し工程を行う前に、魚鱗を脱水するステップをさらに含む、請求項１３に記載の生体材料を製造する方法。
15. 前記脱水ステップは、魚鱗を含水量が５０％未満になるまで脱水する、請求項１４に記載の生体材料を製造する方法。
16. 魚鱗を脱細胞化するステップは、魚鱗を脱水するステップの前である、請求項１４に記載の生体材料を製造する方法。
17. 魚鱗を脱細胞化するステップは、魚鱗を洗浄するステップの前である、請求項１３に記載の生体材料を製造する方法。
18. 魚鱗の押出し工程を行う前に、魚鱗を水中に浸漬するステップをさらに含む、請求項１１に記載の生体材料を製造する方法。
19. 前記魚鱗の直径の平均サイズは２０ｃｍ未満である、請求項１１に記載の生体材料を製造する方法。