TWI396564B - 生物材料及其配製方法 - Google Patents

Description

生物材料及其配製方法

本發明係相關於一種生物材料及其配製方法，特別是由去細胞化之魚鳞所配製之生物材料，以用於組織修復與移植方面。

組織工程係與生物以及藥物之生物材料息息相關，其能夠使進行移植手術之病人增強血管造影、組織整合，以及組織重建；生物材料係經由人工所合成的材料，應用於重建人造器官、修復或修補，甚至取代人體組織。

數十年來，膠原纖維、氫氧磷灰石(HAP)以及三鈣磷酸鹽(TCP)皆係經由許多數據證實且可安全用於人體移植組織之生物材料，然而，該些生物材料具有一些缺點，如機械支撐力不足、在交聯過程有化學物殘留，以及人畜共通疾病傳染等缺點。

因此，本案提出一種新的生物材料，具有較佳之機械支撐力，且於組織修復以及移植過程中，人畜共通疾病傳染機率大幅減低。

本發明之目的在於提供一由魚鳞配製的生物材料，該配製過程包含將去細胞化之魚鱗脫水直到含水量少於50%，以及磨碎該脫水過後的魚鱗直到磨碎的顆粒直徑平均尺寸 小於10,000μm，其中每一磨碎的顆粒皆包含海綿態基質以及粉末之混合物。在本發明一實施例中，魚鱗含水量少於25%，且磨碎的顆粒直徑平均尺寸小於5000μm。

另一方面，本發明由魚鳞配製的生物材料的過程包括在200℃以下之溫度進行處理。

本發明之另一目的在於提供如上所述之生物材料以用以修復組織以及組織移植。

為使本發明之優點及精神能更進一步的被揭示，茲配合圖式作一詳細說明如後。

請參照第一A圖，其係本發明配製生物材料之第一流程圖，本發明之生物材料配製過程係包括將魚鱗9去細胞化(S10)且脫水(S12)直到魚鱗9含水量少於50%；該些脫水磨碎過後的魚鱗9顆粒直徑平均尺寸小於10,000μm，其中，魚鱗9含水量少於25%，且其顆粒直徑平均尺寸小於5000μm。

該魚鱗9係以冷藏或冷凍的方式以提供給生物材料作配製，本發明選用直徑平均尺寸小於20cm的魚鱗9，首先，先將魚鳞9去細胞化(S10)，去細胞化係利用hypotonic、detergent、Triton X-100、SDS、protease inhibitor、DNase及RNase等試劑去除魚鱗9上的細胞，目的是避免由魚鱗9所配製而成的生物材料會因為上面所附著的細胞影響組織修復以及移植，甚至可能引發宿主免疫反應，進而產生排斥現象；要進行魚鱗9脫水動作(S12)之前，須先將 魚鱗9利用其他洗劑洗淨(S11)，該些洗劑可以例如是表面活性劑、洗潔劑、溫水以及極性溶劑，極性溶劑如約60℃的乙醇，但均不以此為限。然而，本發明並無限制任何特定的洗淨步驟，但皆須將魚鱗9洗淨至可以通過美洲鱟試劑鑑定(limulus amebocyte lysate test,LAL test)，而洗淨後的魚鱗9在LAL鑑定中的檢驗值必須小於1000 Eu/ml。

請參照第一B圖，其係本發明配製生物材料之第二流程圖，其步驟大致與第一流程圖所述之步驟相同，唯一不同之處在於去細胞化(S10)之步驟係位在洗淨(S11)步驟之後，不論係先將魚鳞9洗淨(S11)前進行去細胞化(S10)動作，或是將魚鳞9洗淨(S11)後進行去細胞化(S10)動作，二者皆能如序進入以下之步驟。

之後，將魚鳞9脫水(S12)，脫水方法有使用空氣噴器、烤箱、冷凍乾燥或其他傳統的脫水方法，此外，亦可利用浸泡魚鱗9於乙醇或其他極性有機溶劑以乾燥之，目的係將魚鱗9脫水直到含水量少於50%，最佳狀態係含水量少於25%；接著係將該些脫水後的魚鱗9磨碎至顆粒直徑平均尺寸小於10,000μm，顆粒最佳狀態係直徑約5000μm，而磨碎過後顆粒包含海綿態基質14以及粉末15之混合物，因此，本發明使用一篩網對該磨碎過後顆粒進行過篩動作，進而分離海綿態基質與粉末；該過篩步驟中，可使用一震動工具以加強過篩效果，藉由過篩器所過篩出的顆粒以粉末的形式提供生物材料使用，而過篩後所剩餘的顆粒則係以基質的形式提供生物材料使用；因此，磨碎魚鱗9的設備並沒有限定為特定之研磨器，只要能使磨碎後之顆粒平 均尺寸不超過10,000μm，最佳狀態係直徑少於5000μm，研磨機或是任何減小魚鱗9尺寸的設備皆可。

配製過程中更包含擠壓(S16)、過篩、全部或部分乾燥以及消毒之步驟，以產生無菌的生物材料，在最佳實施例中，該些步驟可於不論是否加熱，皆可進行。該生物材料可用於與不同種的連接修復組織或是活化與非活化的組成物結合。

此外，可將脫水後的魚鱗9透過加壓處理以產生一片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀的生物材料，其中該加壓處理可包括一溫度改變(可為加溫或是低溫甚至冷凍)過程，但不可高於200℃以上之溫度。在洗淨步驟(S11)之後，將魚鱗9置於200℃以下之溫度進行一擠壓過程(S16)以配製一片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀形式17之生物材料，而脫水後的魚鱗9易於進行擠壓動作。在進行擠壓過程(S16)之前，可選擇性地外加一將魚鱗9浸泡於水中之步驟(S18)，但該步驟需於洗淨步驟(S11)之後進行；此外，本發明還有另一個實施例，該生物材料不論係基質或是粉末形式皆可透過擠壓過程(S16)，以將該生物材料轉換為一片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀形式17，而該擠壓過程係於200℃以下之溫度進行。然而，本案之加熱處理並非如上所述限定於擠壓過程，任何熟知該項技藝者亦可能採用其他加熱處理方式，如任何形式之熱擠壓、熱重壓、模製之步驟，以配製該片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀之生物材料。

本發明之生物材料包含組織修復因子且可產生組織修復材料，該組織修復材料係用於修復不同組織傷害以及組 織缺陷部位；舉例而言，本發明之生物材料可用於調製注射劑於鄰近骨骼缺陷部位、軟骨修復部位、齒槽修復部位，或其他軟組織缺陷部位；另一實施例係將該生物材料製作為外科手術於鄰近骨骼缺陷部位、軟骨修復部位，或其他組織缺陷部位移植或植入用之覆蓋材料，因此，本發明可於由魚鱗取得具有組織修復材料之外科手術移植之連接組織，特別係用於連接組織缺陷部位。

綜上所述，本發明係關於一由魚鳞9所配製之生物材料，且該生物材料係以粉末、基質或是片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀之材料應用於不同組織修復以及移植方面。該些由魚鳞9取得的材料亦指出不論係粉末、基質或是片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀之生物材料皆包含組織修復因子，且甚至有可能產生不同的定則。

本發明將於以下詳細敘述說明內容，但均並不以此為限。

第一實施例：基質形式

請參照第一C圖，其係本發明第一實施例配製生物材料之第一流程圖，該過程係起始於將魚鱗進行去細胞化之步驟(S20)，接著將魚鳞進行洗淨動作(S19)，而洗淨後的魚鱗在LAL鑑定中的檢驗值必須小於1000 Eu/ml；請參照第一D圖，其係本發明第一實施例配製生物材料之第二流程圖，該過程係起始於將魚鳞進行洗淨動作(S19)，而洗淨後的魚鱗在LAL鑑定中的檢驗值必須小於1000 Eu/ml，接著將魚鱗進行去細胞化之步驟(S20)。

不論係先將魚鳞洗淨(S19)前進行去細胞化(S20)動作，或是將魚鳞洗淨(S19)後進行去細胞化(S20)動作，二者皆能如序進入以下之步驟。

之後進入到步驟(S21)，魚鱗將被脫水直到含水量少於25%，接著是步驟(S22)，脫水的魚鱗將被磨碎直到其顆粒直徑平均尺寸小於5000μm，該些顆粒包含海綿態基質以及粉末之混合物；步驟(S23)係進行一過篩步驟，利用一過篩器將基質由混合物中分離出來。

因此，經過過篩步驟後得到基質，該基質包含由HAP、TCP以及膠原蛋白所組成的纖維組織。

第二實施例：粉末形式

請再次參照第一C以及第一D圖，其分別係本發明第二實施例配製生物材料之第一流程圖以及本發明第二實施例配製生物材料之第二流程圖，配製粉末形式之生物材料之過程係相似於配製基質形式之生物材料之過程，如上所述，磨碎後之顆粒包含海綿態基質以及粉末之混合物；步驟(S23)係進行一過篩步驟，粉末形式不同之處在於，其係利用一過篩器將粉末由混合物中分離出來，因此粉末形式具有一個確切的機械結構，進而使其不同於基質形式，而粉末顆粒之直徑尺寸係小於5000μm。

第三實施例：片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀形式

請參照第一E圖，其係本發明第三實施例配製生物材料之第一流程圖，目的係利用魚鱗配製片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀之生物材料。該過程係起始於將魚鱗去細 胞化步驟(S30)，之後將魚鳞進行洗淨動作(S29)，洗淨後的魚鱗在LAL鑑定中的檢驗值必須小於1000 Eu/ml；請參照第一F圖，其係本發明第三實施例配製生物材料之第二流程圖，目的係利用魚鱗配製片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀之生物材料。該過程係起始於將魚鱗進行洗淨動作(S29)，洗淨後的魚鱗在LAL鑑定中的檢驗值必須小於1000 Eu/ml，之後將魚鱗去細胞化步驟(S30)。

不論係先將魚鳞洗淨(S29)前進行去細胞化(S30)動作，或是將魚鳞洗淨(S29)後進行去細胞化(S30)動作，二者皆能如序進入以下之步驟。

之後進入到步驟(S31)，在步驟(S31)中，魚鱗將被脫水直到含水量少於25%，接著是步驟(S32)，脫水的魚鱗將被磨碎直到其顆粒直徑平均尺寸小於5000μm，該些顆粒包含海綿態基質以及粉末之混合物；步驟(S33)係進行一過篩步驟，利用一過篩器將混合物分離為基質以及粉末；步驟(S34)係將該基質以及粉末進行擠壓。

配製片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀之生物材料有二方法，方法一係在洗淨步驟(S29)之後，直接進行後續之動作；方法二如第一E圖以及第一F圖所示，在擠壓步驟之前，先將魚鱗進行洗淨以及脫水步驟。

因此，不論是脫水過後的魚鱗，未脫水但已洗淨後的魚鱗，或是由魚鳞所取得的基質形式以及粉末形式之生物材料，皆進行擠壓步驟以產生片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀的生物材料；利用完整的魚鱗或是由魚鱗取得不同類型的生物材料，先將其於一低溫下以大於100g/2.5cm³ 之壓力進行擠壓，而最佳壓力為1kg/2.5cm³ ，再將其送至一小於 200℃高溫下之壓模進行擠壓；在進行擠壓動作之前，該生物材料的交聯作用可藉由加熱或加入適當濃度的化學交聯劑達成；其中，在生物材料中，交聯劑會與胺群或其他反應物產生反應。

本發明之去細胞的過程中，除了洗去了部份的水溶性蛋白質與葡萄糖胺聚合醣外，原來的膠原蛋白與彈性蛋白纖維與大部分的葡萄糖胺聚合醣，仍然保存於其天然細胞外間質的結構內，因此去細胞化的生物材料能夠提供細胞遷入的自然結構，進而具有相當好的生物相容性。

第二A圖係利用本發明之生物材料20培養3T3(纖維細胞22)細胞五天的SEM圖，第二B圖係利用本發明之生物材料20培養成骨細胞24細胞5天的SEM圖，這些圖顯示不論是纖維細胞22或是成骨細胞24利用本發明之生物材料20皆能夠生長得相當完整。

第三A圖係利用本發明之生物材料20培養3T3(纖維細胞)細胞五天的共軛焦(confocol microscope)圖，第三B圖係利用本發明之生物材料20培養成骨細胞五天的共軛焦(confocol microscope)圖，這些圖顯示不論是纖維細胞或是成骨細胞利用本發明之生物材料20皆能夠生長得相當完整。

第四圖係利用本發明之生物材料20培養成骨細胞24五天的H&E染色圖，這些圖顯示成骨細胞24利用本發明之生物材料20皆能夠生長得相當完整。

以上所述係利用一較佳實施例及不同實施例以詳細說明本發明，其並非用以限制本發明之實施範圍，並且熟習 該項技藝者皆能明瞭，適當做些微的修改仍不脫離本發明之精神及範圍。

9~18‧‧‧各個步驟流程

S19~S23‧‧‧第一實施例以及第二實施例各個步驟流程

S29~S34‧‧‧第三實施例各個步驟流程

第一A圖，本發明配製生物材料之第一流程圖；第一B圖，本發明配製生物材料之第二流程圖；第一C圖，本發明第一實施例以及第二實施例配製生物材料之第一流程圖；第一D圖，本發明第一實施例以及第二實施例配製生物材料之第二流程圖；第一E圖，本發明第三實施例配製生物材料之第一流程圖；第一F圖，本發明第三實施例配製生物材料之第二流程圖；第二A圖，本發明之生物材料培養3T3(纖維細胞)細胞五天的SEM圖；第二B圖，本發明之生物材料培養成骨細胞五天的SEM圖；第三A圖，本發明之生物材料培養3T3(纖維細胞)細胞五天的共軛焦圖；第三B圖，本發明之生物材料培養成骨細胞五天的共軛焦圖；第四圖，本發明之生物材料培養成骨細胞五天的H&E染色圖。

9~18‧‧‧各個步驟流程

Claims (13)

1. 一種從鱗片配製生物材料的方法，其步驟包括：將魚鱗片去細胞化；清洗該魚鱗片，以使洗淨後的該魚鱗片符合美洲鱟試劑(LAL)鑑定中的檢驗值必須小於1000 Eu/ml之標準；將該魚鱗片脫水直到含水量少於50%；磨碎該魚鱗片，以使魚鱗片顆粒尺寸小於5,000μm；篩選該魚鱗片顆粒，以使魚鱗片顆粒中的海綿態基質及粉末分離，其中該海綿態基質包含由氫氧磷灰石(HAP)、三鈣磷酸鹽(TCP)以及膠原蛋白所組成的纖維組織。
2. 如申請專利範圍第1項所述之配製生物材料的方法，更包含在該篩選該魚鱗片顆粒步驟後擠壓該海綿態基質以及粉末，以在200℃以下之溫度形成一片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀。
3. 如申請專利範圍第2項所述之配製生物材料的方法，更包含在該擠壓步驟之前，進行生物交聯作用(cross-link)。
4. 如申請專利範圍第3項所述之配製生物材料的方法，其中上述之生物交聯作用(cross-link)是以加熱或加入交聯劑以和該海綿態基質中的胺群產生反應。
5. 如申請專利範圍第1項所述之配製生物材料的方法，其中上述之去細胞的過程中，包含洗去了部份的水溶性蛋白質與葡萄糖胺聚合醣外，並將原來的膠原蛋白與彈性蛋白纖維與大部分的葡萄糖胺聚合醣，保存於其天然細胞外間質的結構內。
6. 如申請專利範圍第1項所述之配製生物材料的方法，其中 該魚鱗片脫水是以冷凍乾燥、乙醇或其他極性有機溶劑乾燥。
7. 一種從鱗片配製生物材料的方法，該生物材料係指使用於組織修復，其步驟包括：清洗魚鱗片，以使洗淨後的該魚鱗片符合美洲鱟試劑(LAL)鑑定中的檢驗值必須小於1000 Eu/ml之標準；將該魚鱗片去細胞化；將該魚鱗片脫水直到含水量少於50%；磨碎該魚鱗片，以使魚鱗片顆粒尺寸小於5,000μm；篩選該魚鱗片顆粒，以使魚鱗片顆粒中的海綿態基質及粉末分離，其中該海綿態基質包含由氫氧磷灰石(HAP)、三鈣磷酸鹽(TCP)以及膠原蛋白所組成的纖維組織；進行擠壓過程以形成一片狀或塊狀或透過特定模具得到特定形狀之材料。
8. 如申請專利範圍第7項所述之配製生物材料的方法，其中擠壓過程係在200℃以下之溫度進行。
9. 如申請專利範圍第7項所述之配製生物材料的方法，其中在進行鱗片擠壓過程之前，更包含進行生物交聯作用(cross-link)。
10. 如申請專利範圍第9項所述之配製生物材料的方法，其中上述之生物交聯作用(cross-link)是以加熱或加入交聯劑以和該海綿態基質中的胺群產生反應。
11. 如申請專利範圍第7項所述之配製生物材料的方法，其中上述之去細胞的過程中，包含洗去了部份的水溶性蛋白質與葡萄糖胺聚合醣外，並將原來的膠原蛋白與彈性蛋白纖維 與大部分的葡萄糖胺聚合醣，保存於其天然細胞外間質的結構內。
12. 如申請專利範圍第7項所述之配製生物材料的方法，其中上述之該魚鱗片脫水是以冷凍乾燥、乙醇或其他極性有機溶劑乾燥。
13. 如申請專利範圍第7項所述之配製生物材料的方法，其中在進行鱗片擠壓過程之前，更包含一將鱗片浸泡於水中之步驟。