CN101480503B - 配制生物材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种配制生物材料的方法，配制过程主要包括将去细胞化的鱼鳞脱水直到含水量少于50％，并磨碎这些脱水过后的鱼鳞直到磨碎的颗粒直径平均尺寸小于10,000μm，其中磨碎的颗粒包含海绵态基质以及粉末的混合物。本发明还涉及由鱼鳞所配制得到的生物材料，所述的配制过程包括在200℃以下的温度进行加热处理。

Description

配制生物材料的方法
技术领域
本发明是关于一种生物材料及其配制方法，特别是关于一种由去细胞化的鱼鳞配制生物材料的方法，所配制的生物材料可以用于组织修复与移植方面。
背景技术
组织工程与生物以及药物的生物材料息息相关，其能够使进行移植手术的病人增强血管造影、组织整合，以及组织重建；生物材料是经由人工所合成的材料，应用于重建人造器官、修复或修补，甚至取代人体组织。
数十年来，胶原纤维、羟基磷灰石(HAP)以及三钙磷酸盐(TCP)皆是经由许多数据证实且可安全用于人体移植组织的生物材料，然而，这些生物材料具有一些缺点，如机械支撑力不足、在交联过程有化学物残留，以及人畜共通疾病传染等缺点。
因此，需要提出一种新的生物材料，增强机械支撑力，且于组织修复以及移植过程中减低人畜共通疾病传染机率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的生物材料，以增强机械支撑力，且于组织修复以及移植过程中减低人畜共通疾病传染机率。
本发明的另一目的在于提供如上所述的生物材料以用以修复组织以及组织移植。
本发明的另一目的在于提供配制如上所述的生物材料的方法。
本发明提供了一种从鱼鳞配制生物材料的方法，该方法包括步骤：
将鱼鳞去细胞化，再将其磨碎至一定量的颗粒，其中这些颗粒包含海绵态基质以及粉末的混合物。
本发明的配制生物材料的方法还可包括：挤压所述海绵态基质以及粉末，以在200℃以下的温度形成片状或块状或通过特定模具得到特定形状。
本发明的配制生物材料的方法中，在磨碎鱼鳞之前，还可包括将鱼鳞脱水的步骤。所述脱水步骤可包括将鱼鳞脱水直到含水量少于50％。在所述将鱼鳞脱水步骤之前，还可包括将鱼鳞洗净的步骤。其中，将鱼鳞去细胞化的步骤可以是在所述将鱼鳞洗净步骤之前。将鱼鳞去细胞化的步骤也可以是在将鱼鳞脱水步骤之前。
本发明的配制生物材料的方法还可包括将海绵态基质以及粉末从颗粒中分离的步骤。
本发明中的原料鱼鳞可以是直径平均尺寸小于20cm的鱼鳞，例如大尺寸(10-20cm)的鱼鳞，也可以是较小尺寸的鱼鳞。本发明的配制生物材料的方法中，重点是保留鱼鳞生物材料的天然键结与立体结构，对于鱼鳞的磨碎程度没有特别限定，一般是将鱼鳞磨碎至颗粒直径平均尺寸小于10,000μm。如果所用鱼鳞原料的直径平均尺寸小于10,000μm，仍需要进行适当磨碎，将其磨碎至更小的颗粒尺寸，例如，可将其磨碎至颗粒直径平均尺寸小于10μm。
本发明还提供了另一种从鱼鳞配制生物材料的方法，该方法包括步骤：
将鱼鳞去细胞化，再将其进行挤压过程以形成片状或块状或通过特定模具得到特定形状的材料。
本发明的配制生物材料的方法中，所述挤压过程是在200℃以下的温度进行。其中，在进行鱼鳞挤压过程之前，还可包括洗净鱼鳞的步骤。在洗净步骤结束后，且在进行鱼鳞挤压过程之前，还可包括将鱼鳞脱水的步骤。所述脱水步骤包括将鱼鳞脱水直到含水量少于50％。其中，将鱼鳞去细胞化的步骤可以是在将鱼鳞洗净步骤之前。将鱼鳞去细胞化的步骤也可以是在将鱼鳞脱水步骤之前。在进行鱼鳞挤压过程之前，还可包括将鱼鳞浸泡于水中的步骤。
根据本发明的一具体的由鱼鳞配制生物材料的方法，所述的配制过程包括将去细胞化的鱼鳞脱水直到含水量少于50％，以及磨碎该脱水过后的鱼鳞直到磨碎的颗粒直径平均尺寸小于10,000μm，其中每一磨碎的颗粒皆包含海绵态基质以及粉末的混合物。在本发明的一实施例中，是将鱼鳞脱水到含水量少于25％，且磨碎的颗粒直径平均尺寸小于5000μm。
另一方面，本发明由鱼鳞配制生物材料的过程包括在200℃以下的温度进行处理。
本发明还提供了利用所述方法由鱼鳞配制得到的生物材料。
利用本发明的方法配制得到的生物材料，保留了鱼鳞生物材料的天然键结与立体结构，该生物材料具有较佳的机械支撑力，可以用以修复组织以及组织移植，且于组织修复以及移植过程中人畜共通疾病传染机率大幅减低。
为使本发明的优点及精神能更进一步的被揭示，现配合图式作一详细说明如后。
附图说明
图1A为本发明的配制生物材料的方法的第一流程示意图；
图1B为本发明的配制生物材料的方法的第二流程示意图；
图1C为本发明第一实施例以及第二实施例配制生物材料的方法的第一流程示意图；
图1D为本发明第一实施例以及第二实施例配制生物材料的方法的第二流程示意图；
图1E为本发明第三实施例配制生物材料的方法的第一流程示意图；
图1F为本发明第三实施例配制生物材料的方法的第二流程示意图；
图2A为本发明的生物材料培养3T3(纤维细胞)细胞五天的SEM图；
图2B为本发明的生物材料培养成骨细胞五天的SEM图；
图3A为本发明的生物材料培养3T3(纤维细胞)细胞五天的共焦显微镜图；
图3B为本发明的生物材料培养成骨细胞五天的共焦显微镜图；
图4为本发明的生物材料培养成骨细胞五天的H&E染色图。
具体实施方式
请参照图1A，其为本发明的配制生物材料的方法的第一流程示意图，本发明的生物材料配制过程包括：将鱼鳞9去细胞化(步骤S10)且脱水(步骤S12)直到鱼鳞9含水量少于50％；这些脱水磨碎过后的鱼鳞9颗粒直径平均尺寸小于10,000μm，优选的，是将鱼鳞9脱水至含水量少于25％，且磨碎至其颗粒直径平均尺寸小于5000μm。
该鱼鳞9是以冷藏或冷冻的方式以提供给生物材料作配制，本发明选用直径平均尺寸小于20cm的鱼鳞9，首先，将鱼鳞9去细胞化(步骤S10)，去细胞化是利用低渗液(hypotonic solution)、清洁剂(detergent)、TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)、脱氧核糖核酸酶(DNase)及核糖核酸酶(RNase)等试剂去除鱼鳞9上的细胞，目的是避免由鱼鳞9所配制而成的生物材料会因为上面所附着的细胞影响组织修复以及移植，甚至可能引发宿主免疫反应，进而产生排斥现象；要进行鱼鳞9脱水动作(步骤S12)之前，须先将鱼鳞9利用其它洗剂洗净(步骤S11)，这些洗剂可以例如是表面活性剂、洗洁剂、温水以及极性溶剂，极性溶剂如约60℃的乙醇，但均不以此为限。然而，本发明并无限制任何特定的洗净步骤，但皆须将鱼鳞9洗净至可以通过LAL鉴定(limulusamebocyte lysate，LAL test)，而洗净后的鱼鳞9在LAL鉴定中的检验值必须小于1000Eu/ml。
请参照图1B，其为本发明的配制生物材料的方法的第二流程示意图，其步骤大致与第一流程示意图所述的步骤相同，唯一不同之处在于去细胞化(步骤S10)的步骤是位在洗净(步骤S11)步骤之后，不论是在将鱼鳞9洗净(步骤S11)前进行去细胞化(步骤S10)动作，或是将鱼鳞9洗净(步骤S11)后进行去细胞化(步骤S10)动作，二者皆能如序进入以下的步骤。
之后，将鱼鳞9脱水(步骤S12)，脱水方法可以使用压缩空气脱水器(空气喷器)、烤箱、冷冻干燥或其它传统的脱水方法，此外，也可将鱼鳞9浸泡于乙醇或其它极性有机溶剂中以干燥该鱼鳞9，目的是将鱼鳞9脱水直到含水量少于50％，最佳状态是含水量少于25％；接着将这些脱水后的鱼鳞9磨碎至颗粒直径平均尺寸小于10,000μm，颗粒最佳状态是直径约5000μm，而磨碎过后颗粒包含海绵态基质14以及粉末15的混合物，因此，本发明使用过筛器例如筛网对该磨碎过后的颗粒进行过筛动作，进而分离海绵态基质与粉末；该过筛步骤中，可使用震动工具以加强过筛效果，藉由过筛器所过筛出的颗粒以粉末的形式提供生物材料使用，而过筛后所剩余的颗粒则是以基质的形式提供生物材料使用；因此，磨碎鱼鳞9的设备并没有限定为特定的研磨器，只要能使磨碎后的颗粒平均尺寸不超过10,000μm，最佳状态是直径小于5000μm，研磨机或是任何减小鱼鳞9尺寸的设备皆可。
配制过程中还可包括挤压(步骤S16)、过筛、全部或部分干燥以及消毒的步骤，以产生无菌的生物材料，在最佳实施例中，这些步骤可于不论是否加热的条件下皆可进行。该生物材料可用于与不同种的连接修复组织或是活化与非活化的组成物结合。
此外，可将脱水后的鱼鳞9通过加压处理以产生一片状或块状或通过特定模具得到特定形状的生物材料，其中该加压处理可包括一温度改变(可为加温或是低温甚至冷冻)过程，但不可高于200℃以上的温度。在洗净步骤(步骤S11)之后，将鱼鳞9置于200℃以下的温度进行一挤压过程(步骤S16)以配制片状或块状或通过特定模具得到特定形状形式17的生物材料，而脱水后的鱼鳞9易于进行挤压动作。在进行挤压过程(步骤S 16)之前，可选择性地外加一将鱼鳞9浸泡于水中的步骤(步骤S18)，但该步骤需于洗净步骤(步骤S11)之后进行；此外，本发明还有另一个实施例，该生物材料不论是基质或是粉末形式皆可通过挤压过程(步骤S16)，以将该生物材料转换为片状或块状或通过特定模具得到特定形状形式17，而该挤压过程是于200℃以下的温度进行。然而，本发明的加热处理并非如上所述限定于挤压过程，任何熟知该项技术的人员也可能采用其它加热处理方式，如任何形式的热挤压、热重压、模制的步骤，以配制该片状或块状或通过特定模具得到特定形状的生物材料。
本发明的生物材料包含组织修复因子且可产生组织修复材料，该组织修复材料是用于修复不同组织伤害以及组织缺陷部位；举例而言，本发明的生物材料可用于调制注射剂于邻近骨骼缺陷部位、软骨修复部位、齿槽修复部位，或其它软组织缺陷部位；另一实施例是将该生物材料制作为外科手术于邻近骨骼缺陷部位、软骨修复部位，或其它组织缺陷部位移植或植入用的覆盖材料，因此，本发明可用于由鱼鳞取得具有组织修复材料的外科手术移植的连接组织，特别是用于连接组织缺陷部位。
综上所述，本发明是关于一种由鱼鳞9所配制的生物材料，且该生物材料是以粉末、基质或是片状或块状或通过特定模具得到特定形状形式存在的材料，可应用于不同组织修复以及移植方面。这些由鱼鳞9取得的材料亦指出不论是粉末、基质或是片状或块状或通过特定模具得到特定形状的生物材料皆包含组织修复因子，且甚至有可能产生不同的定则(不同形状可能产生不同修复方式，例如修复骨骼与修复皮肤则有所不同)。
本发明将于以下详细叙述说明技术内容，但均并不以此为限。
第一实施例：基质形式
请参照图1C，其为本发明第一实施例配制生物材料的第一流程示意图，该过程是起始于将鱼鳞进行去细胞化的步骤(步骤S20)，接着将鱼鳞进行洗净动作(步骤S19)，而洗净后的鱼鳞在LAL鉴定中的检验值必须小于1000Eu/ml；请参照图1D，其为本发明第一实施例配制生物材料的第二流程示意图，该过程是起始于将鱼鳞进行洗净动作(步骤S19)，而洗净后的鱼鳞在LAL鉴定中的检验值必须小于1000Eu/ml，接着将鱼鳞进行去细胞化的步骤(步骤S20)。
不论是在将鱼鳞洗净(步骤S19)前进行去细胞化(步骤S20)动作，或是将鱼鳞洗净(步骤S19)后进行去细胞化(步骤S20)动作，二者皆能如序进入以下的步骤。
之后进入到步骤S21，鱼鳞将被脱水直到含水量少于50％，接着是步骤S22，脱水的鱼鳞将被磨碎直到其颗粒直径平均尺寸小于10000μm，这些颗粒包含海绵态基质以及粉末的混合物；步骤S23是进行过筛步骤，利用过筛器将基质由混合物中分离出来。
因此，经过过筛步骤后得到基质，该基质包含由HAP、TCP以及胶原蛋白所组成的纤维组织。
第二实施例：粉末形式
请再次参照图1C以及图1D，其分别为本发明第二实施例配制生物材料的第一流程图以及本发明第二实施例配制生物材料的第二流程图，配制粉末形式的生物材料的过程相似于配制基质形式的生物材料的过程，如上所述，磨碎后的颗粒包含海绵态基质以及粉末的混合物；步骤S23是进行过筛步骤，配制粉末形式的生物材料的不同之处在于，其是利用过筛器将粉末由混合物中分离出来，因此粉末形式具有一个确切的机械结构(这里所提及的机械结构指的是因为本发明并无将生物材料经过酵素或酶处理，所以生物材料原本的机械结构被完整保存，也就是不只胶原蛋白与羟基磷灰石等成分被保留下来，甚至连该材料天然的立体结构与交链都被完整保留)，进而使其不同于基质形式，而粉末颗粒的直径尺寸是小于5000μm。
第三实施例：片状或块状或通过特定模具得到特定形状形式
请参照图1E，其为本发明第三实施例配制生物材料的第一流程示意图，目的是利用鱼鳞配制片状或块状或通过特定模具得到特定形状的生物材料。该过程是起始于将鱼鳞去细胞化步骤(步骤S30)，之后将鱼鳞进行洗净动作(步骤S29)，洗净后的鱼鳞在LAL鉴定中的检验值必须小于1000Eu/ml。请参照图1F，其为本发明第三实施例配制生物材料的第二流程示意图，目的是利用鱼鳞配制片状或块状或通过特定模具得到特定形状的生物材料，该过程是起始于将鱼鳞进行洗净动作(步骤S29)，洗净后的鱼鳞在LAL鉴定中的检验值必须小于1000Eu/ml，之后进行将鱼鳞去细胞化步骤(步骤S30)。
不论是在将鱼鳞洗净(步骤S29)前进行去细胞化(步骤S30)动作，或是将鱼鳞洗净(步骤S29)后进行去细胞化(步骤S30)动作，二者皆能如序进入以下的步骤。
之后进入到步骤S31，在步骤S31中，鱼鳞将被脱水直到含水量少于25％，接着是步骤S32，脱水的鱼鳞将被磨碎直到其颗粒直径平均尺寸小于5000μm，该些颗粒包含海绵态基质以及粉末的混合物；步骤S33是进行过筛步骤，利用过筛器将混合物分离为基质以及粉末；步骤S34是将该基质以及粉末进行挤压。可将基质或粉末分别进行挤压，也可将基质与粉末混合后进行挤压。根据所配制生物材料的使用用途的不同，例如修复骨骼用的生物材料或是修复皮肤用的生物材料，可将基质与粉末按不同的所需用量比例进行混合。
配制片状或块状或通过特定模具得到特定形状的生物材料有二种方法，方法一是在洗净步骤(步骤S29)之后，直接进行后续的动作；方法二如图1E以及图1F所示，在挤压步骤之前，先将鱼鳞进行洗净以及脱水步骤。
因此，不论是脱水过后的鱼鳞，未脱水但已洗净后的鱼鳞，或是由鱼鳞所取得的基质形式以及粉末形式的生物材料，皆进行挤压步骤以产生片状或块状或通过特定模具得到特定形状的生物材料；利用完整的鱼鳞或是由鱼鳞取得不同类型的生物材料，先将其于一低温下以大于100g/2.5cm3的压力进行挤压，而最佳压力为1kg/2.5cm3，再将其送至一小于200℃高温下的压模进行挤压(该步骤的重点是挤压动作，挤压温度仅是示例性说明，可以在低温(例如-18℃到4℃)下挤压，或是高温(例如约30-60℃)下挤压，最好应不超过200℃，因温度不同具体的挤压力与挤压时间会有所不同，以得到片状或块状或通过特定模具得到特定形状的生物材料)；在进行挤压动作之前，该生物材料的交联作用可藉由加热或加入适当浓度的化学交联剂(例如可以是戊二醛(glutaaldehyde)、EDC或是其它通常所用的化学交联剂)达成；其中，在生物材料中，交联剂会与胺群或其它反应物产生反应。
本发明中的去细胞化的过程中，除了洗去了部分的水溶性蛋白质与葡萄糖胺聚合醣外，原来的胶原蛋白与弹性蛋白纤维与大部分的葡萄糖胺聚合醣仍然保存于其天然细胞外间质的结构内，因此去细胞化的生物材料能够提供细胞迁入的自然结构，进而具有相当好的生物兼容性。
图2A是利用本发明的生物材料20培养3T3(纤维细胞22)细胞五天的SEM图，图2B是利用本发明的生物材料20培养成骨细胞24细胞5天的SEM图，这些图显示不论是纤维细胞22或是成骨细胞24利用本发明的生物材料20皆能够生长得相当完整。
图3A是利用本发明的生物材料20培养3T3(纤维细胞)细胞五天的共焦显微镜(confocol microscope)图，图3B是利用本发明的生物材料20培养成骨细胞五天的共焦显微镜(confocol microscope)图，这些图显示不论是纤维细胞或是成骨细胞利用本发明的生物材料20皆能够生长得相当完整。
图4是利用本发明的生物材料20培养成骨细胞24五天的H&E染色图，这些图显示成骨细胞24利用本发明的生物材料20皆能够生长得相当完整。
以上所述是利用一较佳实施例及不同实施例以详细说明本发明，其并非用以限制本发明的实施范围，并且熟悉该技术的人员都能明了，适当做些微的修改仍不脱离本发明的精神及范围。

Claims (13)

1.一种从鱼鳞配制生物材料的方法，该方法包括步骤：
将鱼鳞去细胞化，再将其磨碎成颗粒，其中这些颗粒包含海绵态基质以及粉末的混合物；
其中，在磨碎鱼鳞之前，还包括将鱼鳞脱水的步骤，所述脱水步骤包括将鱼鳞脱水直到含水量少于50％；
在将鱼鳞脱水步骤之前，还包括将鱼鳞洗净的步骤，洗净后的鱼鳞在LAL鉴定中的检验值必须小于1000Eu/ml。
2.如权利要求1所述的配制生物材料的方法，该方法还包括：挤压所述海绵态基质以及粉末，以在200℃以下的温度形成片状或块状或通过特定模具得到特定形状。
3.如权利要求1所述的配制生物材料的方法，其中，将鱼鳞去细胞化的步骤是在将鱼鳞洗净步骤之前。
4.如权利要求1所述的配制生物材料的方法，其中，将鱼鳞去细胞化的步骤是在将鱼鳞脱水步骤之前。
5.如权利要求1所述的配制生物材料的方法，该方法还包括将海绵态基质以及粉末从颗粒中分离的步骤。
6.如权利要求1所述的配制生物材料的方法，其中是将鱼鳞磨碎至颗粒直径平均尺寸小于10,000μm。
7.如权利要求1所述的配制生物材料的方法，其中，所述鱼鳞直径平均尺寸小于20cm。
8.一种从鱼鳞配制生物材料的方法，该方法包括步骤：
将鱼鳞去细胞化，再将其进行挤压过程以形成片状或块状或通过特定模具得到特定形状的材料；
所述挤压过程是在200℃以下的温度进行；
在进行鱼鳞挤压过程之前，还包括洗净鱼鳞的步骤，洗净后的鱼鳞在LAL鉴定中的检验值必须小于1000Eu/ml。
9.如权利要求8所述的配制生物材料的方法，其中，在洗净步骤结束后，且在进行鱼鳞挤压过程之前，还包括将鱼鳞脱水的步骤；所述脱水步骤包括将鱼鳞脱水直到含水量少于50％。
10.如权利要求9所述的配制生物材料的方法，其中，将鱼鳞去细胞化的步骤是在将鱼鳞脱水步骤之前。
11.如权利要求8所述的配制生物材料的方法，其中，将鱼鳞去细胞化的步骤是在将鱼鳞洗净步骤之前。
12.如权利要求8所述的配制生物材料的方法，其中，在进行鱼鳞挤压过程之前，还包括将鱼鳞浸泡于水中的步骤。
13.如权利要求8所述的配制生物材料的方法，其中，所述鱼鳞直径平均尺寸小于20cm。
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