JP5301135B2 - カルボキシメチルアルギニン生成抑制剤 - Google Patents
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(1) 下記の式(1)、式(2)又は式(3)で示される化合物、若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、カルボキシメチルアルギニン生成抑制剤。
皮膚に蓄積するAGEの生成を抑制し、皮膚の老化を抑制する試みがなされているが、蛍光を測定してAGEを定量しており、AGE構造体が特定されていない。本発明者は、カルボキシメチルアルギニン(CMA)に着目し、本構造体が酸加水分解に対して不安定であるため、通常の手法では機器分析で測定が困難であるため、CMAに対する特異的モノクローナル抗体を作製し、CMAの測定系を確立した。これにより、CMA生成阻害作用を示す化合物の検索が可能となった。また、カルボキシメチルリジン(CML)の生成を抑制する化合物が報告されているが、本発明者はカルボキシメチルアルギニン(CMA)がコラーゲンに顕著に生成するAGE構造体であることも確認した。
モノクローナル抗CMA抗体を作製するための抗原としては、カルボキシメチルアルギニンを用いることができる。カルボキシメチルアルギニンは、アルギニンとグリオキサールをNaOH溶液中で反応させ、HClで中性に戻した後、イオン交換カラムにアプライし、各分画を薄層クロマトグラフィーを用いてアセトニトリルで展開し、ニンヒドリン陽性でアルギニンとは異なる化合物を含むフラクションを回収することによって取得することができる。
モノクローナル抗体は常法により作成することができる。モノクローナル抗体を作製するためには、先ず、ヘモシアニン蛋白又はヒト血清アルブミンなどのタンパク質に結合させたCMAを抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1〜100mgであり、アジュバントを用いるときは1〜100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から1〜60日後、好ましくは1〜14日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
前記標識免疫測定法の好適な例として、酵素を標識とした免疫測定法であるELISA法を挙げることができる。ELISA法は、例えば、96穴プレートに検体またはその希釈液を入れて、4℃〜室温で一晩、または37℃で1〜3時間程度静置して検出すべきカルボキシメチルアルギニンを吸着させて固相化する。次に、本発明の抗体を反応させ、次いであらかじめ酵素を結合させた抗免疫グロブリン抗体(二次抗体)を反応させる。最後に酵素と反応する適当な発色性の基質(例えば、酵素がホスファターゼならp−ニトロフェニルリン酸等)を加え、この発色によって抗体を検出する。
コラーゲン、あるいはジェラチンをグルコースあるいはリボースと、カルボキシメチルアルギニン生成抑制剤の候補化合物の存在下、試験管内で37℃、1週間保温し、PBSで透析した後、カルボキシメチルアルギニンに対するモノクローナル抗体を用いたELISAによって生成阻害効果を検討することができる。
Rutin and Quercetin;
Li, Xiangjun; Zhang, Yuping; Yuan, Zhuobin. Chromatographia (2002), 55(3/4), 243-246.
Takamura, Chika; Hirata, Tetsuya; Yamaguchi, Yasuyo; Ono, Masateru; Miyashita, Hiroyuki; Ikeda, Tsuyoshi; Nohara, Toshihiro. Journal of Natural Medicines (2007), 61(2), 220-221.
Webby, Rosemary F. DSIR, Petone, N. Z. Phytochemistry (1991), 30(7), 2443-4.
Hatam, Natiq A. R.; Seifert, K. Planta Medica (1994), 60(6), 600.
(1)3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-β-D-glucuronopyranosyl complogenin 22-O-α-L-rhamnopyranoside (Complogenin glycoside)の抽出・分離法
マメ科植物イヌゲンゲGueldenstaedtia multiflora BGE. の根あるいは全草を乾燥したものである生薬「甜地丁」の根1.5 kgを容積5Lのプラスチック容器に入れ、その容器に甜地丁が浸る程度のメタノールを入れ、その後、80〜100℃の水浴で5時間熱をかけ、甜地丁に含まれる成分をメタノールに溶出させる。そのメタノール溶出液をナス型フラスコに入れ、フラスコをエバポレーターに装着しメタノールを除去することで、メタノール抽出エキス111 gを得た。このメタノール抽出エキスをDiaion HP-20カラムクロマトグラフィー(70 mm×500 mmガラスオープンカラム)にかけ、水(6 L)、メタノール(6 L)、アセトン(3 L)で連続的に溶出した。次に、メタノール溶出画分(43 g中10 g)をMCI gelカラムクロマトグラフィー(40 mm×600 mmガラスオープンカラム)にかけ、40%メタノール/水(4 L)、50%メタノール/水(2 L)、60%メタノール/水(2 L)、70%メタノール/水(2 L)、80%メタノール/水(2 L)で連続的に溶出し、溶媒システム60%メタノール/水では6つのフラクション(Fr. 1〜Fr. 6)に分画した。さらに、そのFr. 4(468.7 mg)をChromatrex ODSカラムクロマトグラフィー(20 mm×400 mmガラスオープンカラム)にかけ、溶媒システム60%メタノール/水(1 L)により8つのフラクション(Fr. I〜Fr. VIII)分画し、Fr. II(145.4 mg)をシリカゲルクロマトグラフィー(15 mm×170 mmガラスオープンカラム)にかけ、溶媒システム(クロロホルム:メタノール:水=7:3:0.5, 0.3 L)で溶出することで3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)- β-D-glucuronopyranosyl complogenin 22-O-α-L-rhamnopyranoside(9.5 mg)を単離した。
トチュウ科植物トチュウEucommia ulmoides Oliv. の緑色葉577.6 gを容積2L容器に入れ、水(65℃)で5時間抽出し、その水抽出液をろ過し、ろ液(1.5 L)を得た。次に、そのろ液をDiaion HP-20カラムクロマトグラフィー(70 mm×500 mmガラスオープンカラム)にかけ、水(6 L)、30%メタノール/水(10 L)、50%メタノール/水(6 L)、80%メタノール/水(6 L)、メタノール(6 L)で連続的に溶出した。その50%メタノール/水溶出画分(9.0 g)をShephadex LH-20カラムクロマトグラフィー(35 mm×700 mmガラスオープンカラム)にかけ、溶媒システム50%メタノール/水(2 L)及び、メタノール(2 L)で8つのフラクション(Fr. 1〜Fr. 8)に分画した。そのFr. 6はastragalin(55 mg)であった。さらに、Fr. 4(441 mg)をChromatrex ODSカラムクロマトグラフィー(30 mm×300 mmガラスオープンカラム)にかけ、溶媒システム30%メタノール/水(1 L)で溶出することでquercetin 3-O-sambubioside(155 mg)を単離した。
ノウゼンカズラ科植物アメリカキササゲCatalpa bignonioides Walt. の葉310 gを容積1 Lのプラスチック容器に入れ、その容器にアメリカキササゲが浸る程度のメタノールを入れ、その後、80〜100℃の水浴で5時間熱をかけ、アメリカキササゲに含まれる成分をメタノールに溶出させる。そのメタノール溶出液をナス型フラスコに入れ、フラスコをエバポレーターに装着しメタノールを除去することで、メタノール抽出エキス50.8 gを得た。このメタノール抽出エキスをDiaion HP-20カラムクロマトグラフィー(50 mm×300 mmガラスオープンカラム)にかけ、水(2 L)、メタノール(1.8 L)、アセトン(1 L)で連続的に溶出した。次に、メタノール溶出画分(19.5 g)をToyo peal HW-40Cカラムクロマトグラフィー(40 mm×500 mmガラスオープンカラム)にかけ、溶媒システムメタノール(2 L)により6つのフラクション(Fr. 1〜Fr. 6)に分画した。さらに、そのFr. 4(1.73 g)をSephadex LH-20カラムクロマトグラフィー(25 mm×700 mmガラスオープンカラム)にかけ、溶媒システム、メタノール(1 L)により7つのフラクション(Fr. I〜Fr. VII)に分画し、Fr. IIL(306 mg)をシリカゲルクロマトグラフィー(25 mm×300 mmガラスオープンカラム)にかけ、溶媒システム(クロロホルム:メタノール:水=9:1:0.1, 1 L)で溶出することでLuteolin-7-O-glucosideを単離した。
Quercetin (300 mg)を100 mlの茄子型フラスコに秤量し、ピリジン(2 ml)と無水酢酸(2 ml)を加えて、室温で2時間攪拌する。反応液に氷を加え、析出する沈殿をブフナーロート(直径3 cm)で吸引濾過して回収する。得られた沈殿(400 mg)にエタノール(5 ml)を加えて加温して溶解させ、室温で一晩放置することで、Penta acetate quercetin(280mg)を針状結晶として得た。
比較用の物質は、以下の文献に記載されている。
Kakkalide;
Yamazaki, Takashi; Nakajima, Yoshijiro; Niiho, Yujiro; Hosono, Tsuyoshi; Kurashige, Tatsuo; Kinjo, Junei; Nohara, Toshihiro. Journal of Pharmacy and Pharmacology (1997), 49(8), 831-833.
Medicarpin;
Soby, Scott; Caldera, Sriyani; Bates, Robert; VanEtten, Hans. Phytochemistry (1996), 41(3), 759-65.
Medicarpin-β-glucoside;
Al-Khalil, Suleiman; Masalmeh, Amneh; Abdalla, Shtaywy; Tosa, Hideki; Iinuma, Munekazu. Journal of Natural Products (1995), 58(5), 760-3.
Fujiwara, Yukio; Takaki, Ayumi; Uehara, Yukie; Ikeda, Tsuyoshi; Okawa, Masafumi; Yamauchi, Ken; Ono, Masateru; Yoshimitsu, Hitoshi; Nohara, Toshihiro. Tetrahedron (2004), 60(22), 4915-4920.
Tomatine;
Ikeda, Tsuyoshi; Yamauchi, Ken; Nakano, Daisuke; Nakanishi, Kenji; Miyashita, Hiroyuki; Ito, Shin-ichi; Nohara, Toshihiro. Tetrahedron Letters (2006), 47(26), 4355-4359.
Desgalactotigonin;
Ikeda, Tsuyoshi; Tsumagari, Hidetsugu; Honbu, Takehiko; Nohara, Toshihiro. Biological & Pharmaceutical Bulletin (2003), 26(8), 1198-1201.
Chen, Changxiang; Zhou, Jun. Yunnan Zhiwu Yanjiu (1994), 16(4), 397-400.
Timosaponin AIII;
Meng, Zhi-Yun; Zhang, Jian-Ying; Xu, Sui-Xu; Sagahara, Kazunori. Planta Medica (1999), 65(7), 661-663.
Ono, Masateru; Nishimura, Kazuya; Suzuki, Keita; Fukushima, Takeshi; Igoshi, Keiji; Yoshimitsu, Hitoshi; Ikeda, Tsuyoshi; Nohara, Toshihiro. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (2006), 54(2), 230-233.
Isotubocaposide B and Isotubocaposigenin;
Kiyota, Naoko; Shingu, Kazushi; Yamaguchi, Koki; Yoshitake, Yasuyuki; Harano, Kazunobu; Yoshimitsu, Hitoshi; Ikeda, Tsuyoshi; Nohara, Toshihiro. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (2007), 55(1), 34-36.
Diosgenin;
Noguchi, Eishin; Fujiwara, Yukio; Matsushita, Sayaka; Ikeda, Tsuyoshi; Ono, Masateru; Nohara, Toshihiro. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (2006), 54(9), 1312-1314.
Cilistol A
Zhu, X.-H.; Takagi, M.; Ikeda, T.; Midzuki, K.; Nohara, T. Phytochemistry (2001), 56(7), 741-745.
(1)カルボキシメチルアルギニン(CMA)の作製法
0.1 Mアルギニンと0.1 Mグリオキサールを1 N NaOH溶液25mL中で37度、24時間反応し、1H HClで中性に戻した。イオン交換カラムであるDowex 50 10 mLにアプライした後、1mLずつ分取し、各分画を薄層クロマトグラフィーを用いて80%アセトニトリルで展開し、ニンヒドリン陽性でアルギニンとは異なる化合物を含むフラクションを回収した。その後、アミノ酸分析機で単一化合物であることを確認した。その後、NMRで構造解析を行い、CMA(Iijima Kら、Biochem. J. 347, 23-27, 2000)と同一であることを確認した。
(i) 抗体産生細胞の採取
常法に従いCMA 1 mgを10 mgのカルボジイミイドと4 mgのヘモシアニン蛋白(KLH: keyhole limpet hemocyanin)あるいはヒト血清アルブミン(HSA)と1 mlのリン酸緩衝液中で1時間反応し、CMA付加体であるCMA-KLH、CMA-HSAを作製した。その後マウス1匹に付き0.1 mgのCMA -KLHをフロイント完全アジュバント(FCA)で免疫、その2週間後、4週間後に同量のCMA-KLHをフロイント不完全アジュバント(FIA)で皮内に追加免疫を行った。3回免疫後より2週間後、尾静脈より採血を行い抗体価が上昇していることをCMA-HSAを抗原としたELISAにより評価し、5000倍希釈した抗血清とCMA-HSAが有意に反応することを確認した後、動物から脾臓を摘出し抗体産生細胞を採集した。
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞(P3U1)との細胞融合を行う。細胞融合は、血清を含まないRPMI-1640培地中で、1×106 〜1×107 個/mlの抗体産生細胞と2×105 〜2×106個/mlのミエローマ細胞とを平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール存在下で混合した。その後、HAT培地存在下で10日間培養した後、培養上清0.05 mlを採取し、ELISAの一次抗体として使用した。ELISAは、10 μg/mlのCMA-KLHあるいはCML-HSAを各ウェルに0.05 mlずつ固相化した。抗体に結合した一次抗体はHRP標識した抗マウスIgG抗体で検出し、その後、1,2-phenylenediamine dihydrochlorideで発色し、ELISAリーダーで492 nmの吸光度を測定した。融合細胞のクロ-ニングは、限界希釈法等により行い、最終的にCMA-KLH陽性でCML-HSA陰性のモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立した。その後、類似AGE構造体である、CML、Ne-(carboxyethyl)lysine (CEL)、S-(carboxymethyl)cysteine (CMC)、未修飾のアルギニンと交差反応を示さない株をELISAにて選択した。
プリスタン0.5 mlを予め腹腔に投与したBalb/cマウスに、得られたハイブリドーマを約1×107 個腹腔内投与し、およそ10日後に腹水を採集した。得られた腹水よりプロテインGアフィニティークロマトグラフィーを用いてイムノグロブリンGを精製した。本ハイブリドーマが産生する抗体(3F5)はアイソタイピングの結果、IgG1であった。
上記で得られたハイブリドーマ3F5が産生するモノクローナル抗体(以下、モノクローナル抗体3F5と称する)の反応性を調べた。具体的には、0.1 mlのCMA-HSA (0.1 μg/ml)をイムノプレートに固相化した後、1 mMから段階希釈したCMA, CML, CEL, CMC, アルギニン0.05 mlと0.1 μg/mlの3F5を等量混合し、混合液0.1 mlをイムノプレートの各ウェルに加えた。その後、イムノプレートに結合した抗体3F5はHRP標識抗マウスIgG抗体で検出を行った。
5 mg/mlのリボースと2 mg/mlのジェラチンを化合物、各0.1 mM存在下、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.4)中で、37℃で1週間保温した後、PBSで24時間透析を行った。各サンプル10 μg/ml、0.1 mlをイムノプレートに固相化した後、PBSで可溶化した0.5% gelatin溶液でプレートをブロッキングした。その後、カルボキシメチルアルギニンに対するモノクローナル抗体3F5(1μg/ml)を0.1mlずつ各ウェルに加え、1時間保温した。洗浄後、HRP標識抗マウスIgG抗体を各ウェルに加え1時間保温した。洗浄後、1,2-フェニレンジアミン二塩酸塩により5分間発色して吸光度492 nmを測定した。
Claims (4)
- 下記の式(1)、式(2)又は式(3)で示される化合物、若しくはその塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、カルボキシメチルアルギニン生成抑制剤。
- 式(1)で示される化合物が、ルチン(Rutin)、 クエルセチン(Quercetin)、アストラガリン(Astragalin)、クエルセチン3−O−サンブビオシド(Quercetin 3-O-sambubioside)、ルテオリン−7−O−グルコシド(Luteolin-7-O-glucoside)、又はペンタアセテートクエルセチン(Penta acetate quercetin)の何れかである、請求項1に記載のカルボキシメチルアルギニン生成抑制剤。
- コラーゲンのメイラード反応の後期生成物(AGE)化を抑制するために用いる、請求項1又は2に記載のカルボキシメチルアルギニン生成抑制剤。
- 皮膚外用剤として用いる、請求項1から3の何れかに記載のカルボキシメチルアルギニン生成抑制剤。
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