JP5213449B2 - 無機リン酸を高蓄積する植物およびその利用 - Google Patents
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Description
(2)上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子が、シロイヌナズナ由来のMyb様転写因子PHR1である、上記(1)に記載の植物体。
(3)上記Myb様転写因子PHR1が、
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸からなり、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質
である、上記(2)に記載の植物体。
(4)上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子が、
(c)配列番号1に示される塩基配列のオープンリーディングフレームを含む遺伝子、または
(d)配列番号1に示される塩基配列またはそのオープンリーディングフレームの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
である、上記(1)に記載の植物体。
(5)ペチュニア、トレニア、バーベナ、タバコ、バラ、インパチェンス、ベゴニア、またはニーレンベルギアである、上記(1)〜(4)のいずれか1項に記載の植物体。
(6)リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を発現するように植物体を形質転換する工程を包含する植物体の生産方法。
(7)上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを上記植物体に導入することによって、上記植物体を形質転換する、上記(6)に記載の方法。
(8)上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子が、シロイヌナズナ由来のMyb様転写因子PHR1である、上記(6)または(7)に記載の方法。
(9)上記Myb様転写因子PHR1が、
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸からなり、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質
である、上記(8)に記載の方法。
(10)上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子が、
(c)配列番号1に示される塩基配列のオープンリーディングフレームを含む遺伝子、または
(d)配列番号1に示される塩基配列またはそのオープンリーディングフレームの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
である、上記(6)または(7)に記載の方法。
(11)上記植物体が、ペチュニアである、上記(6)〜(10)のいずれか1項に記載の方法。
(12)上記植物体が、トレニアである、上記(6)〜(10)のいずれか1項に記載の方法。
(13)上記(6)〜(12)のいずれか1項に記載の方法によって生産される植物体。
(14)リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターであって、植物体に導入したときに、上記転写因子をコードする遺伝子を発現することができるように構成された、ベクター。
(15)上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子が、シロイヌナズナ由来のMyb様転写因子PHR1である、上記(14)に記載のベクター。
(16)上記Myb様転写因子PHR1が、
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸からなり、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質
である、上記(15)に記載のベクター。
(17)上記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子が、
(c)配列番号1に示される塩基配列のオープンリーディングフレームを含む遺伝子、または
(d)配列番号1に示される塩基配列またはそのオープンリーディングフレームの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
である、上記(14)に記載のベクター。
(18)上記(1)〜(5)のいずれか、または上記(13)に記載の植物体の繁殖材料。
(19)上記(1)〜(5)のいずれか、または上記(13)に記載の植物体を用いて水圏の余剰なリンを除去する工程を包含する、水質浄化法。
(20)上記(14)〜(17)のいずれかのベクターを導入され、形質転換された、植物体へ再生可能な植物細胞。
PHR1遺伝子は、TOPO―TAクローニングキット(インビトロジェン株式会社)を用い、解説書に従いpCR2.1ベクターにサブクローニングした。プライマーPHRf(5’−ATGGAGGCTCGTCCAGTTCAT−3’(配列番号3))とPHRr(5’−TCAATTATCGATTTTGGGACGC−3’(配列番号4))を用いたPCR反応で増幅した産物をサブクローニングし、pSPB1892とした。エンハンサー配列を繰り返したカリフラワーモザイクウィルス35S(El235S)プロモーターとノパリンシンターゼ(nos)ターミネーターを有するバイナリーベクターpSPB176をBamHIとSalIで切断し、pSPB176Aを得た。pSPB1892をBamHIとXhoIで切断し、得られたPHR1遺伝子断片をpSPB176Aに挿入し、pSPB1898を得た。
引き続いて、公知の方法(Plant J. 5, 81, 1994)に基づいて、pSPB1898もしくはpSPB2314もしくはpSPB2377を用いてアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens Agl0株)を形質転換し、このpSPB1898もしくはpSPB2314もしくはpSPB2377を有する形質転換アグロバクテリウムをペチュニア(Petunia hybrida)、トレニア(Torenia hybrida)に感染させた。得られた組換え植物の葉から、RNeasyPlantminiKit(キアゲン)を用いてRNAを抽出し、定法に従ってRT−PCRにより導入した遺伝子が発現している系統を選択した。
(1)リン酸濃度測定法
リン酸濃度の測定はAmesの方法(Methods Enzymol. 8,115−118, 1966)を一部改変しておこなった。葉を約100mgずつ計量しながらサンプリングし、振盪破砕用の2mlチューブに直径4mmのジルコニアビーズと共に封入し、−80℃で凍結した。凍結したサンプルを室温中に取り出し、チューブ中に1%(V/V)酢酸を500μl入れ、振盪破砕機(キアゲン)で6分間振盪破砕した。破砕後、卓上遠心機で15000rpmで5分間遠心し、上清500μlを得て、リン酸抽出液とした。このリン酸抽出液を10−100倍希釈で終量800μlとなるように、蒸留水で調製した。この溶液にリン酸測定用試薬(組成は後述)を160μl加えよく撹拌して10分間放置した。分光光度計でAbs880を測定し、標準溶液を用いて描いた検量線と比較することによりリン酸濃度を求めた。得られたリン酸濃度と計量したサンプルの重さから1gの葉に含まれるリン酸量を算出した。
2.5M硫酸 10ml
0.1Mアスコルビン酸 6ml
0.27g/100ml 酒石酸アンチモニルカリウム 3ml
8g/100ml モリブデン酸アンモニウム 6ml
を混合して20mlの溶液とする。アスコルビン酸は要時調製。
得られた形質転換体の葉から上記の方法に従ってリン酸濃度を測定し、新鮮重あたりのリン酸含有量を決定した。表1および図1に示すように、形質転換トレニアでは35Sプロモーターを用いたpSPB1898とMacプロモーターを用いたpSPB2314ともに、野生型に比べて約5倍多いリン酸の蓄積を示した。
(1)水耕トレニア新鮮重あたりのリン酸量
また、トレニアのpSPB1898形質転換体を用いて水耕栽培を行い、水耕栽培においてもリン酸吸収能力の上昇が見られるかどうかを確認した。リン酸濃度5mg/Lの水耕溶液中で約1ヶ月間水耕栽培したトレニアの葉をサンプリングし、リン酸濃度を測定した。表3および図3に見られるように形質転換体は野生型に比べて約3倍のリン酸蓄積量を示しており、水耕栽培に用いてもPHR1遺伝子による吸収能力の増加は確認できた。
植物体全体でリン酸蓄積量が増加しているかどうかを確認するために、リン酸濃度5mg/Lで約2ヶ月間水耕栽培をおこなったトレニアのpSPB1898の地上部すべてを回収し、80℃で約2日間かけて乾燥させ、乾燥重量あたりのリン酸蓄積量を測定した(表4および図4)。野生型と形質転換体各3個体ずつを乾燥し、リン酸濃度を測定し、その平均値を出した。この結果、乾燥させたトレニアに関しても形質転換体は野生型に比べて約2.5倍と高いリン酸蓄積量を示すことがわかり、植物体全体でリン酸の蓄積量が増加していることを確認できた。
水耕液からのリン酸吸収量の差を明確にするために、以下の比較実験を行った。野生型トレニアもしくはPHR1導入形質転換トレニアを、プラスチック製コンテナ(23X23X11.5cm)内で発泡スチロールに穴を開けたものを支持体として浮かべ、脱イオン水に各種塩類を溶かした水耕溶液5リットルを用いて生育させた。水耕溶液のリン濃度は5mg/Lに設定した。各コンテナには4株の植物を用い、経日的に水耕溶液のサンプリングを行い、上述の方法によりリン酸濃度を測定した。また、葉からの蒸散や水面からの蒸発により水耕溶液の液量が減少するため、3日おきに脱イオン水を補充した。
10リットル中(リン濃度5mg/L)
1M KNO3 5ml
1M MgSO4 2ml
1M Ca(NO3)2 2ml
20mM Fe−EDTA 2.5ml
微量元素 1ml
1M KPO4バッファー(pH5.5) 1.61ml
350mM H3BO3 10ml
140mM MnCl2 5ml
50mM CuSO4 500μl
100mM ZnSo4 500μl
20mM Na2MoO4 500μl
5M NaCl 100μl
10mM CoCl2 50μl
PHR1遺伝子によるリン酸吸収能の増大が他の植物でも見られるかどうかを確認するために、インパチェンス、ベゴニア、タバコ、バーベナ、ニーレンベルギア、バラにPHR1遺伝子を導入した。
インパチェンス(Impatiens walleriana)の形質転換は基本的にUS Patent 6,121,511に従い、品種グリッターレッド(サカタのタネ)とテンポピンク(タキイ種苗)を用いておこなった。ビトロ苗から切り出した茎頂、節、葉柄、葉片を前培養液体培地(1mg/L TDZ 添加MS培地)で5日間前培養後、前培養固形培地(0.05mg/L NAA, 6mg/L Zeatin, 0.3%ゲランガム 添加MS培地)に48時間静置した。その後、pSPB2314を導入したアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens Agl0株)を感染させ、選択培地上(0.05mg/L NAA, 6mg/L Zeatin, 100mg/L Kanamycin, 500mg/L Carbenicillin, 100mg/L Cefotaxime, 0.3%ゲランガム添加MS培地)で4−8週間培養しシュートを得た(表7)。葉片は容易に褐変してしまいシュートは得られなかった。茎頂および節では1つの外植片より多くのシュートが得られたが、偽陽性も多数含まれると考えられた。葉柄からのシュートは出現に時間がかかり、数も少ないが、最も確からしい。
タバコ(Nicotiana tabacum)、バーベナ(Verbena hybrida)、ニーレンベルギア(Nierembergia sp.)の形質転換はそれぞれ公知の方法(Science 227, 1229,1985; Plant Cell Rep. 21, 459, 2003; Plant Biotech. 23, 19, 2006)に基づき行った。得られた植物体の遺伝子導入については、各植物体の葉よりDNAを抽出し、PHR1遺伝子をテンプレートとしたPCRにより確認した。タバコで11個体、バーベナで16個体、ニーレンベルギアで1個体のPHR1形質転換植物を取得した。
pSPB2314を有する形質転換アグロバクテリウムの菌液中に無菌苗の葉から誘導したバラ(Rosa hybrida)のカルスを5分間浸し、滅菌濾紙で余分な菌液を拭き取った後、継代用培地に移植し、2日間暗所で共存培養した。その後、カルベニシリンを400mg/l 加えたMS液体培地で洗浄し、継代用培地 にカナマイシン50mg/l とカルベニシリン200mg/lを加えた選抜・除菌用培地へ移植し、選抜培地上で生育阻害を受けず、正常に増殖する部分の移植と培養を繰り返し、カナマイシン耐性カルスを選抜した。カナマイシン耐性を示した形質転換カルスを、カナマイシン50mg/l、カルベニシリン 200mg/l を添加した再分化用の培地で培養することでカナマイシン耐性のシュート原基が得られており、バラでもPHR1形質転換植物が得られる見込みが高い。
MS培地で生育しているPHR1形質転換タバコの無菌苗より葉をサンプリングし、PHR1の発現量をRT−PCRにより確認した。その結果発現量の多い系統を選抜系統とし、該系統の無菌苗をMS培地で育苗したのち、葉の一部のサンプリングを行い、葉中のリン酸濃度を既述の方法により測定した。また、PHR1形質転換バーベナの鉢上げ個体からもタバコの場合と同様に葉をサンプリングし、PHR1の発現量をRT−PCRにより確認した。その結果発現量の多い系統を選抜系統とし、該系統の葉をサンプリングしたのち葉中のリン酸濃度を既述の方法により測定した。
Claims (3)
- シロイヌナズナ由来のMyb様転写因子PHR1をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを導入することによって、その転写因子をコードする遺伝子を発現するように形質転換された植物体を用いて水圏の余剰なリンを除去する工程を包含する水質浄化法であって、前記転写因子が、
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1〜20個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸からなり、リン酸飢餓応答遺伝子を活性化する機能を有するタンパク質である、前記方法。 - 前記リン酸飢餓反応に関与する遺伝子の転写因子をコードする遺伝子が、配列番号1に示される塩基配列のオープンリーディングフレームを含む遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 前記植物体がペチュニア、トレニア、バーベナ、タバコ、バラ、インパチェンス、ベゴニア、またはニーレンベルギアである、請求項1または2に記載の方法。
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