JP5124776B2

JP5124776B2 - 平滑筋収縮抑制剤

Info

Publication number: JP5124776B2
Application number: JP2007517932A
Authority: JP
Inventors: 誠小林; 博子岸; 俊弘横地; 東郎中原; 保幸公文
Original assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION YAMAGUCHI UNIVERSITY
Current assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION YAMAGUCHI UNIVERSITY
Priority date: 2005-05-27
Filing date: 2006-05-29
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2026-05-29
Also published as: WO2006126712A1; JPWO2006126712A1

Description

本発明は、平滑筋収縮抑制剤に関する。より詳しくは、平滑筋のカルシウム非依存性異常収縮の抑制剤、循環器系疾患治療剤および予防剤、さらにＲｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤に関する。

平滑筋の収縮には、細胞質のカルシウムイオン濃度の上昇に依存した収縮と、これに依存しない収縮があることが知られている。

即ち、神経刺激のような細胞膜脱分極の場合には、細胞質のカルシウムイオン濃度を上昇させ、カルシウムイオン−カルモジュリン複合体を形成し、この複合体によってミオシン軽鎖キナーゼが活性されてミオシン軽鎖がリン酸化されて収縮を起こすものと考えられている。このようなカルシウムイオン依存性の平滑筋収縮は、正常な収縮と考えられている。

一方、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）等の一部の血管収縮物質は、細胞質のRhoキナーゼを介してカルシウムイオン感受性が増強され、カルシウムイオン濃度上昇を超える収縮またはカルシウムイオン濃度に依存しない収縮を起こすことが知られている。これらは、カルシウムイオン非依存性の収縮であり、異常な収縮と考えられている。例えば、ＳＰＣは、細胞質のカルシウム濃度を上昇させることなく、Fynを活性化し、さらにＲｈｏキナーゼを活性化し、ミオシン軽鎖をリン酸化して、カルシウムイオンに非依存的に平滑筋を収縮させると考えられている（非特許文献１、２参照）。

このようなカルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮阻害剤としては、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤であるファスジル酸またはＹ−２７６３２が知られている（非特許文献３参照）。しかしながら、これらの薬剤は、カルシウム依存性収縮を抑制する作用も有しているため、副作用のみならず、その治療効果に限界がある。従って、選択的にカルシウム非依存性収縮のみを抑制する作用をもつ薬物が切望されているのが現状である。

また、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えずに、Fynの活性化を阻害する事によって、カルシウムイオン非依存的な異常収縮のみを選択的に抑制することが報告されている（特許文献１参照）。

しかし、ＥＰＡは、内服のみが可能であり、急性発症した血管病に的確に対応できない場合がある。さらに、ＥＰＡは、魚油から精製して得られるため、安定して供給することが難しい。また、ＥＰＡは、血液脳関門をほとんど通過しないため、脳血管に出血がない限り、脳血管病に対応することは難しい。

一方、ドコサペンタエン酸はイワシ油等に含まれる不飽和脂肪酸であるが、平滑筋収縮抑制作用については知られていない。また、ドコサペンタエン酸は、血液脳関門を通過可能であることが知られている。

本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
特開２００１−２６１５５６麻酔、４７巻、５号、５３０−５４０ページ、１９９８年生化学、６９巻、１号、１６−２９ページ、１９９７年Ｎａｔｕｒｅ，３８９巻、１０月３０日号、９９０−９９４頁、１９９７年

本発明の課題は、安定して供給でき、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えない、カルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮の抑制剤および予防剤を提供することにある。

本発明者らは、ドコサペンタエン酸が上記課題を解決することを見出し、本発明を完成させた。

即ち、本発明は、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、それらの塩、それらのメチルエステル、それらのエチルエステル、それらのブチルエステル、およびそれらのグリセリルエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、スフィンゴシルホスホリルコリンによるＲｈｏキナーゼ活性化のシグナル伝達によるカルシウムイオン非依存性平滑筋収縮の抑制剤である。

また、本発明は、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、それらの塩、それらのメチルエステル、それらのエチルエステル、それらのブチルエステル、およびそれらのグリセリルエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、スフィンゴシルホスホリルコリンによるＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害剤である。

別の観点においては、本発明は、生物に、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、それらの塩、それらのメチルエステル、それらのエチルエステル、それらのブチルエステル、およびそれらのグリセリルエステルからなる群より選択される少なくとも１種を投与することを含む、スフィンゴシルホスホリルコリンによるＲｈｏキナーゼ活性化のシグナル伝達によるカルシウムイオン非依存性平滑筋収縮の抑制方法である。また、別の観点においては、本発明は、生物に、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、それらの塩、それらのメチルエステル、それらのエチルエステル、それらのブチルエステル、およびそれらのグリセリルエステルからなる群より選択される少なくとも１種を投与することを含む、スフィンゴシルホスホリルコリンによるＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害方法である。

本発明によれば、安定して供給でき、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えない、カルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮の抑制剤および予防剤を提供することができる。

図１は、平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するＥＰＡによる収縮抑制を示す図である。図２は、平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するｎ−６ＤＰＡによる収縮抑制を示す図である。図３は、平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対するｎ−３ＤＰＡによる収縮抑制を示す図である。図４は、平滑筋組織におけるＳＰＣ刺激に対する収縮抑制率を示す図である。図５は、平滑筋組織におけるカルシウムイオン濃度とｎ−６ＤＰＡによる収縮抑制を示す図である。図６は、平滑筋組織におけるカルシウムイオン濃度とｎ−３ＤＰＡによる収縮抑制を示す図である。

本発明が対象とする平滑筋としては、臓器や部位等について特に制限はないが、例えば、血管平滑筋、消化器平滑筋、呼吸器平滑筋等を挙げることができ、特に血管平滑筋を好ましい例として挙げることができる。

本発明に用いるドコサペンタエン酸としては、特に制限はないが、特に全−シス−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（本明細書において、「ｎ−３ＤＰＡ」または「ｎ−３ドコサペンタエン酸」ということがある。）または全−シス−４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（本明細書において、「ｎ−６ＤＰＡ」または「ｎ−６ドコサペンタエン酸」ということがある。）を好ましい例として挙げることができる。

ドコサペンタエン酸は、酸の形態のものの他、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩の様な塩の形態のものでもよく、特にナトリウム塩を好ましい塩として挙げることができる。また、ドコサペンタエン酸は、メチルエステル、エチルエステル、ブチルエステル、グリセリルエステル等のエステルの形態でもよく、特にエチルエステルを好ましいエステルとして挙げることができる。

本発明が対象とする循環器系疾患としては、特に制限はないが、例えば、脳血管攣縮、冠状動脈攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮、および手指血管攣縮のような血管攣縮を挙げることができる。特に、ドコサペンタエン酸は、血液脳関門を通過できるため、脳血管攣縮のような、脳血管病の治療剤、予防剤として有用である。

本発明において、「Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤」とは、ＳＰＣ等の刺激によりＲｈｏキナーゼが活性化され、これによりタンパク質リン酸化が亢進する一連の経路の全部またはその一部を阻害するものをいう。

本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤の剤形としては特に制限はなく、それぞれの目的に応じて適宜決定されるが、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤等の経口剤、注射剤、点眼剤、点鼻剤、貼付剤等を挙げることができる。

また、本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤には、薬学上許容されるキャリアや他の成分を含むことができる。

本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤の投与方法としては特に制限はなく、それぞれの目的に応じて適宜決定されるが、例えば経口、動脈内、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、経皮、経粘膜などの投与方法を挙げることができる。特に、循環器系疾患治療剤の場合は、動脈や静脈への注射による投与を好ましい例として挙げることができる。

本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤の投与量としては、それぞれの目的に応じて適宜決定され、その剤形、投与用法、症状の程度、性別、年齢、体重等により適宜調整されることとなる。例えば、循環器系疾患の治療剤として、動脈内あるいは静脈内への投与する場合は、通常１〜２００ｍｇ、好ましくは５〜１００ｍｇ、より好ましくは１０〜５０ｍｇのドコサペンタエン酸を、１日１回または複数回に分けて投与される。また、循環器系疾患の治療剤として経口投与する場合は、通常０．１〜９ｇ、好ましくは０．５〜６ｇ、より好ましくは１〜３ｇのドコサペンタエン酸を１日１回または複数回に分けて投与される。さらに、循環器系疾患の予防剤として経口投与する場合は、治療剤として投与する場合よりも一般的に少ない投与量となる。

本発明に用いるドコサペンタエン酸は、魚油等から抽出することの他、実施例１および実施例２に示すように、ドコサペンタエン酸生産能を有する微生物を用いて製造することができる。

本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００５−１５５５７１号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。

ｎ−６ＤＰＡの調製例１
シゾキトリウム属ＳＲ２１株（ＢＰ−５０３４又はＩＦＯ３２６９３）を以下のようにして培養した。

５００ｍｌ−フラスコに２００ｍｌの培地を入れ、ＳＲ２１を植菌し、２５℃で４日間、１分当たり１２０回転の振とう培養を行った。培地組成は、塩分濃度が海水の５０％である人工海水１リットル当たり、炭素源としてグルコース６０ｇ、窒素源として酵母エキス１．０ｇ、コーンスチープリカー１．０ｇ、酢酸アンモニウム１．２ｇ、他にリン酸一カリウム４．０ｇとした。

培養後菌体を遠心沈降法で回収し、凍結乾燥を行ったところ、４．６ｇの乾燥菌体が得られた。乾燥菌体を、１０％塩酸を含むエタノール中で、６０℃、３時間反応させ、エチルエステル混合物２．０ｇを得た。このエチルエステル混合物の脂肪酸組成は、パルミチン酸４５％、ｎ−６ドコサペンタエン酸８．５％、ドコサヘキサエン酸３４％であった。

次に、高度不飽和脂肪酸組成を上げるために尿素付加法を行った。すなわち２．０ｇのエチルエステル混合物と尿素５ｇを４０ｍｌの熱エタノールに完全に溶解し、撹拌しながら徐冷した。常温にしてから、さらに４℃の冷蔵庫で一晩おいて晶析させた。晶析したものを、低温下で濾過し、ろ液を回収した。ろ液中より回収されたエチルエステル混合物は１．０ｇでその脂肪酸組成はｎ−６ドコサペンタエン酸１８％、ドコサヘキサエン酸７５％を示した。このエチルエステル混合物中のｎ−６ドコサペンタエン酸を、液体クロマトグラフィにより精製した。用いたカラムはＯＤＳ逆相カラム（ＩｎｔｅｒｓｉｌＰＲＥＰ−ＯＤＳ、内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）で、溶媒は９８％メタノール、２％水、検出器は２０５ｎｍ波長の紫外吸光光度計、フラクションコレクターにより、ｎ−６ドコサペンタエン酸を回収した。回収したｎ−６ドコサペンタエン酸エチルエステルは１５０ｍｇ、その純度はガスクロマトグラフィ分析により、９６．９％であった。

得られたｎ−６ドコサペンタエン酸エチルエステルに、当量の０．１Ｎ−ＮａＯＨ溶液を加え、ｎ−６ドコサペンタエン酸ナトリウム塩を調製した。これを０．１ｍＭの濃度に調製した。

ｎ−６ＤＰＡの調製例２
ラビリンチュラ属菌Ｌ５９株（ＦＥＲＭＰ−１８９８７）の培養を、以下のようにして行った。

塩分濃度が海水の５０％である人工海水１リットル当たり、大豆レシチン３０ｇ、ペプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、寒天１０ｇ、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０を１．２５ｇ加えたものを熱して良く溶解させた後、蒸気滅菌した。この寒天培地は固化する前に無菌的に注射筒を用いて良く撹拌することにより、大豆レシチンを寒天培地内に良く分散させた。３００ｍｌの寒天培地より、内径９０ｍｍのシャーレを３０組調製した。予め餌菌としてサイクロバクター属細菌を寒天培地に増殖させておいたものにＬ５９株を植菌し、１４日間、２５度で静置培養を行った。

培養後、全ての寒天培地を回収し、凍結乾燥を行った。この乾燥試料を１０％塩酸を含むエタノール中で、６０℃、３時間反応させ、４５０ｍｇのエチルエステル混合物を得た。本菌は高度不飽和脂肪酸としてほとんどｎ−６ドコサペンタエン酸しか含んでいないため、菌体より抽出した脂肪酸エチルエステル混合物より、液体クロマトグラフィによる精製を行うことなく尿素付加法のみでｎ−６ドコサペンタエン酸の精製を行うことができる。すなわち４５０ｍｇのエチルエステル混合物と尿素２ｇを１５ｍｌの熱エタノールに完全に溶解し、撹拌しながら徐冷した。先と同様な方法によりろ液を回収し、８５ｍｇのエチルエステル試料を得た。この試料のｎ−６ドコサペンタエン酸組成は、９８％以上であった。

張力試験
＜標本＞
ブタ冠状動脈（左前下行枝）を主幹分岐部から１ｃｍ遠位で約３ｃｍ切り取り、あらかじめ混合ガス（９５％Ｏ₂，５％ＣＯ₂）を通気し氷冷したＫｒｅｂｓ液（１２３ｍＭＮａＣｌ，４．７ｍＭＫＣｌ，１５．５ｍＭＮａＨＣＯ₃，１．２ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄，１．２ｍＭＭｇＣｌ₂，１．２５ｍＭＣａＣｌ₂，１１．５ｍＭＤ−ｇｌｕｃｏｓｅ）に浸した。以下のサンプル調製は、上記Ｋｒｅｂｓ液を１５分おきに交換しながら行った。血管の周りの脂肪を取り除いたあと、外膜を取り除き、綿棒で内皮を除去し、剃刀を用いて平滑筋条片１ｍｍ×４ｍｍを作製した。

＜試料＞
ｎ−６ＤＰＡは、実施例１にしたがって得られたｎ−６ドコサペンタエン酸ナトリウム塩を濃度を調製して用いた。ｎ−３ＤＰＡは、アザラシ油由来の市販のｎ−３ドコサペンタエン酸エチルエステル１００ｍｇを用いて、そのナトリウム塩を調製して用いた。
ＥＰＡは、市販のエイコサペンタエン酸のナトリウム塩を用いた。

＜装置＞
標本をつるしたワイヤーをトランスデューサー（ＦＤピックアップ：日本光電）につなぎ、増幅器（歪圧力用アンプ：日本光電）を通して記録計（卓上型ペンレコーダーＵ−２２８：Ｐａｎｔｏｓ）で張力を検出した。標本は３７℃に保った５ｍＬのマグヌス管中にひたし、試験液は３７℃に保ち混合ガスを負荷したものを用いた。

＜測定方法＞
レファレンス（１００％）の収縮として、１１８ｍＭ高カリウム溶液による脱分極性のカルシウム依存性収縮を１５分間起こし、その後Ｋｒｅｂｓ液で１５分間弛緩させる操作を繰り返し、高カリウム脱分極による張力の波形が安定してきたところで、４０ｍＭカリウム溶液を加え、その収縮がプラトーに達したところでブラジキニン１μＭを加えて、内皮の有無を確認した。ブラジキニンによって平滑筋が弛緩しないことにより、内皮が除去されていると判断した。その後、Ｋｒｅｂｓ液で２０分弛緩させ、ＳＰＣ３０μＭで刺激を加えた。更に、ＳＰＣ刺激による張力が最大、かつ、プラトーになったところで、ｎ−６ＤＰＡ、ｎ−３ＤＰＡ、ＥＰＡ（参考例）を最終濃度が６０μＭ（または３０μＭ）になるように加えた。

＜結果＞
図１にＥＰＡによる参考例を、図２にｎ−６ＤＰＡによる実施例を、図３にｎ−３ＤＰＡによる実施例をそれぞれ示す。

いずれもブラジキニンによる内皮依存性弛緩反応は観察されなかったので、内皮細胞は除去されている血管であることがわかる。

図１〜３より、ｎ−６ＤＰＡおよびｎ−３ＤＰＡは、ＥＰＡと同様にＳＰＣによる異常収縮を抑制することがわかる。

さらに図４に、濃度を６０μＭおよび３０μＭとした場合の、複数サンプルによるＳＰＣ刺激の抑制率を示す。

図４より、ｎ−６ＤＰＡおよびｎ−３ＤＰＡのＳＰＣ収縮抑制作用は、６０μＭと３０μＭの間に有意な差は認められず、３０μＭでも６０μＭのＥＰＡと同様にＳＰＣによる異常収縮を抑制することがわかる。

張力−細胞質のカルシウムイオン濃度の同時測定試験
＜標本＞
実施例３と同様に、ブタ冠状動脈の平滑筋組織を用いた。

＜装置＞
実施例３の装置に、細胞質カルシウム濃度測定のために、蛍光測定装置（ＣＡＭ２３０：ＪＡＳＣＯ）を付加した。

＜測定方法＞
まず試験管に混合ガスを負荷したＫｒｅｂｓ液２ｍｌを入れ、１００μｌのｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）を加えて、十分にピペッテイングを行った。次にその１ｍｌをエッペンドルチューブに移した。暗室で５０μｇのＦｕｒａ−２ＡＭ（ＤＯＪＩＮＤＯ）に４０μｌのＤＭＳＯを加えた後、５０−６０回ピペッテイングをし、そのうちの１０μｌを上記のエッペンドルチューブに加え、すぐに十分にピペッテイングをした。その後、遮光してある超音波装置で氷冷しながら５分破砕しｖｏｒｔｅｘをかける操作を６回繰り返した。暗室でエッペンドルチューブから元の試験管にＦｕｒａ−２ＡＭを溶かした液を戻し、上記の標本を入れ、３７℃に保ち、Ｆｕｒａ−２を４時間負荷した。４時間後、標本を取り出し、Ｋｒｅｂｓ液に浸し４５分待ち、細胞に付着したＦｕｒａ−２ＡＭを除いた。標本を収縮装置につるし、高カリウム液による脱分極性の収縮を１５分間起こし、その後Ｋｒｅｂｓ液で１５分間弛緩させる操作を２、３回繰り返し、この後さらに張力測定と同時に蛍光測定装置（ＣＡＭ２３０）を用いて、３４０ｎｍと３８０ｎｍで交互に励起したときの５１０ｎｍの蛍光強度を測定し、その比をとることで細胞質カルシウム濃度変化の指標とした。蛍光測定を始めた後、高カリウム脱分極性の収縮を１５分間おこし、その後Ｋｒｅｂｓ液で１５分間弛緩させる作業を数回繰り返し、Ｆｕｒａ−２の離脱が収まるのを待った。一定になったところで、ＳＰＣ３０μＭによる刺激を加え、収縮がプラトーになったところで、ｎ−６ＤＰＡおよびｎ−３ＤＰＡを最終濃度が６０μＭになるように加えた。

＜結果＞
図５にｎ−６ＤＰＡによる実施例を、図６にｎ−３ＤＰＡによる実施例をそれぞれ示す。

図５、６より、ｎ−６ＤＰＡおよびｎ−３ＤＰＡはともに、細胞質カルシウムイオン濃度を変化させることなく、ＳＰＣによる異常収縮を抑制することがわかる。なお、細胞質カルシウム濃度が時間とともに低下しているのは、細胞内Ｆｕｒａ−２が細胞外に漏出するためとＦｕｒａ−２自身の光退色のためである。

したがって、ｎ−６ＤＰＡおよびｎ−３ＤＰＡはともに、Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系を選択的に阻害することがわかる。

本発明によれば、安定して供給でき、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えずに、カルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮の抑制剤および予防剤を提供することができる。

Claims

７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、それらの塩、それらのメチルエステル、それらのエチルエステル、それらのブチルエステル、およびそれらのグリセリルエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、スフィンゴシルホスホリルコリンによるＲｈｏキナーゼ活性化のシグナル伝達によるカルシウムイオン非依存性平滑筋収縮の抑制剤。
７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、それらの塩、それらのメチルエステル、それらのエチルエステル、それらのブチルエステル、およびそれらのグリセリルエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、スフィンゴシルホスホリルコリンによるＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害剤。