JP2006519752A

JP2006519752A - 慢性骨髄性白血病を治療するために有用な医薬組成物

Info

Publication number: JP2006519752A
Application number: JP2004519034A
Authority: JP
Inventors: サントゥバンドヨパデャイ; ビカッシュチャンドラパル; サミールバタチャラ; ケシャブチャンドラロイ; ガウタムバンドヨパデャイ
Original assignee: カウンシルオブサイエンティフィクアンドインダストリアルリサーチ
Priority date: 2002-05-31
Filing date: 2003-01-10
Publication date: 2006-08-31
Also published as: WO2004004708A9; WO2004004708A1; EP1524973A1; AU2003201062A8; AU2003201062A1

Abstract

【課題】
【解決手段】本発明は、動物およびヒトにおいてＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼが構成的に発現された慢性骨髄性白血病を治療するために有用な医薬組成物に関し、前記組成物は、医薬的に許容される添加剤と共に、有効量のクロロゲン酸の類似体（例えば、ネオクロロゲン酸（５−Ｏ−カフェオイルキナ酸）、クリプトクロロゲン酸（４−Ｏ−カフェオイルキナ酸）、３−Ｏ−（３’−メチルカフェオイル）キナ酸および５−Ｏ−（カフェオイル−４’−メチル）キナ酸および／またはそれらの塩（例えば、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウム））を含む。

Description

（技術分野）
本発明は、クロロゲン酸またはその類似体から製造された、クロロゲン酸の類似体および／またはクロロゲン酸の類似体の塩（例えば、クロロゲン酸ナトリウム（Ｎａ−Ｃｈｌ）またはカリウムまたはアンモニウム塩）を含む組成物による、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に関する。

慢性骨髄性白血病は、致命的であり、白血病細胞の破壊に導く薬物は無く、これらの細胞は、化学療法（常に非特異的であり、従って、正常細胞に悪影響を及ぼす）に対して反応が乏しい。ＮａＣｈｌでの治療の独特な特性は、他の正常細胞が影響を受けないままにしながら、骨髄癌細胞を死滅させることである。

（背景技術）
骨髄性白血病は、通常２つの群：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に細分化される。ＡＭＬは、骨髄における骨髄細胞の数の増加と、それらの成熟の停止とを特徴とする。米国において、ＡＭＬの一年の発生率は、１００，０００人あたり約２．４人であり、６５歳またはそれ以上の大人１００，０００人あたり１２．６人を最高として、年齢と共に漸次、増加する。ＣＭＬは、造血幹細胞の悪性のクローン障害である。診察時年齢中央値は、５３歳であるが、子供を含む全ての年齢群で起こる。自然な生長のＣＭＬは、３から５年またはそれより早い間に、良性慢性期から、速やかに死に至る急性転化へ経過する。ＣＭＬの予後は、また、臨床医学の多大な進歩にもかかわらず、不十分である（１）（例えば非特許文献１参照）。ＣＤ３３は、骨髄細胞分化のプロセスにおいて、特定かつ有用なマーカーを意味する（２）（例えば非特許文献２参照）。最近の報告では、モノクローナル抗体によるＣＤ３３の関与が、生体外で、アポトーシスを誘導し、ＡＭＬ細胞およびＣＭＬ細胞の増殖の成長阻害を引き起こすことが、示唆されている（２、３）（例えば非特許文献２、３参照）。人体に適応させた、抗癌剤を結合させた抗ＣＤ３３モノクローナル抗体の試みが、ＣＤ３３の骨髄性特有の発現を利用し、ＡＭＬ患者において、著しく成功している（４）（例えば非特許文献４参照）。同様に、リンパ性白血病もまた、２つの群：急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）と慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に細分化される。リンパ性白血病は、Ｔ細胞およびＢ細胞の両方の系列に影響を及ぼし、子供において優勢である。キンマ（Piper betel）葉からの抽出物で、抗骨髄性活性が早くから主張されていた（２０００年１２月１２日出願の、特許Ｎｏ．ＰＣＴ／ＩＮＯＯ／００１１８）。キンマ抽出物から単離された２つの化合物が、また、抗骨髄性白血病活性を示した。１つの化合物は、３−Ｏ−クマリルキナ酸（特許出願Ｎｏ．ＵＳ６０／３８４，１６３、２００２年５月３１日出願。）であった。他方の化合物は、クロロゲン酸（特許出願Ｎｏ．ＵＳ６０／３９３７５０、２００２年７月８日出願。）であった。

従って、本出願人の初期の知見は、慢性骨髄性白血病を治療するための、キンマ葉抽出物の画分から調製したクロロゲン酸ナトリウムに関する本特許出願と、直接調和している。クロロゲン酸（Ｃｈｌ）は、抗アレルギー性活性を有することで知られている（５）（例えば非特許文献５参照）。Ｃｈｌはまた、肝臓および腎臓のグルコース−６−ホスファターゼ系を阻害する（６）（例えば非特許文献６参照）。Ｃｈｌは、表皮性リポキシゲナーゼ（lypoxygenase）活性と、ＴＰＡ誘導性耳炎症の阻害剤である（７）（例えば非特許文献７参照）。Ｃｈｌはまた、マウス皮膚においてＴＰＡ誘導性腫瘍促進に対して阻害効果を示す（７）（例えば非特許文献７参照）。Ｃｈｌの抗ＨＩＶ活性がまた、報告されている（８）（例えば非特許文献８参照）。ＢｃｒのＡｂｌ遺伝子との偶然の融合により、細胞を慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）へ変換させる、構成的に活性なチロシン・キナーゼ（Ｂｃｒ−Ａｂｌ）が生じる⁹（例えば非特許文献９参照）。非常に活性のある小分子が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ依存性細胞成長を阻害することが知られている^10,11（例えば非特許文献１０、１１参照）。そのような化合物の１つへの耐性の進展に関する最近の報告では、ＣＭＬを制御するための更なる治療的研究に対する必要性が強調されている¹²（例えば非特許文献１２参照）。ここに、草本、キンマから単離した化学的化合物が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ発現ＣＭＬ細胞株Ｋ５６２のアポトーシスを誘発する、Ａｂｌタンパク質チロシン・キナーゼを阻害することを我々は主張する。構造の解明により、この分子はクロロゲン酸と同定した。そのナトリウム、カリウム、アンモニウムおよび他の塩もまた、ＣＭＬ細胞に対する死滅活性を示すが、ただし、そのナトリウム塩、クロロゲン酸ナトリウム（ＮａＣｈｌ）は、クロロゲン酸の他の塩よりわずかに強い活性を示す。クロロゲン酸ナトリウムは、Ｋ５６２細胞を死滅させるのに、クロロゲン酸と比較して２．０倍強い効果を示す。興味深いことに、ＮａＣｈｌはまた、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陰性ＣＭＬ患者の末梢血液細胞に影響を与えることなく、ＣＭＬ患者のＢｃｒ−Ａｂｌ発現末梢血液細胞を破壊する。分子モデルの分析により、Ｎａ−Ｃｈｌが、ＡｂｌのキナーゼドメインのＡＴＰ結合部位を占めていることが示された。従って、ＮａＣｈｌは、ＣＭＬのさらなる治療薬として位置する。本出願において、Ｎａ−Ｃｈｌの抗骨髄性白血病活性が、初めて主張された。

引例
1. Sawyers CL, The New England Journal of Medicine, 340 (17): 1330-1340, 1999. 2. Vitale C, Romagnani Cら、 Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 96 (26): 15091-15096, 1999. 3. Vitale Cら Proc. Natl. Acd. Sci, USA., 98 (10): 5764-5769, 2001. 4. Sievers EL, Appelbaum FR et. al. Blood, 93: 3678-3684, 1999. 5. Ito H, Miyazaki T, Ono M and Sakurai H. Bioorg. Med. Chem. 6(7): 1051-1056, 1998. 6. Arion WJら、 Arch. Biochem. Biophys. 351(2): 279-285, 1998. 7. Conney AHら、 Adv. Enzyme Regul. 31: 385-396, 1991. 8. Supriyatna Gら、 Phytomedicine, 7 (Suppl. II): 87, 2000. 9. Rowley JD. Nature 243: 290-293, 1973. 10. Druker BJら、Nature Medicine 2: 561-566, 1996. 11. Nagar Bら、Cancer Research 62: 4236-4243, 2002. 12. Coutre PLら、Blood 95: 1758-1766, 2000.

本発明の目的
本発明の主要な目的は、クロロゲン酸の類似体および／またはクロロゲン酸の類似体の塩を含む医薬組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、慢性骨髄性白血病を治療するための、クロロゲン酸の類似体および／またはクロロゲン酸の類似体の塩を含む医薬組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、慢性骨髄性白血病の治療のための、クロロゲン酸の塩および／またはその塩（例えば、クロロゲン酸ナトリウム（Ｎａ−Ｃｈｌ）またはカリウムまたはアンモニウム塩。クロロゲン酸またはその類似体から調製される）を含む医薬組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、慢性骨髄性白血病の治療のための、キンマ葉抽出物から、または他の供給源から単離されたクロロゲン酸（Ｃｈｌ）から調製された化合物、クロロゲン酸ナトリウム（ＮａＣｈｌ）の新規な使用を提供することである。

本発明の別の目的は、化合物クロロゲン酸ナトリウムと共に基材を含む慢性骨髄性白血病の治療のための新規医薬組成物を提供することである。

さらに本発明の別の目的は、ＣＭＬを治療するため、クロロゲン酸からのクロロゲン酸ナトリウムの製造方法を提供することである。

さらに本発明の別の目的は、キンマの全ての植物部位から単離され、ＣＭＬの治療に関連する生物学的活性を有する、クロロゲン酸からのＮａＣｈｌの簡易製造方法を提供することである。

さらに本発明の別の目的は、ＣＭＬの治療のために、キンマの葉または他の全ての植物部位からの草本産物、クロロゲン酸のナトリウム塩を提供することである。

本発明の要旨
従って、本発明は、クロロゲン酸の類似体および／またはクロロゲン酸の類似体の塩（例えば、クロロゲン酸ナトリウム（Ｎａ−Ｃｈｌ）またはカリウムまたはアンモニウム塩、これらは、クロロゲン酸またはその類似体から製造された。）を含む組成物により、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療のための医薬組成物を提供する。

特に、本発明は、骨髄癌細胞を死滅させ、他の正常細胞は影響を受けないままにする医薬組成物を提供する。慢性骨髄性白血病は致命的であり、白血病細胞の破壊に導く薬物は存在せず、これらの細胞は、常に非特異的であり、従って、正常細胞に悪影響を及ぼす化学療法に対して反応が乏しい。

クロロゲン酸の類似体および／またはクロロゲン酸の塩での治療の独特な特性は、骨髄癌細胞を死滅させ、他の正常細胞は影響を受けないままにすることである。

本発明の詳細な説明
従って、本発明は、動物およびヒトにおいてＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼが構成的に発現された慢性骨髄性白血病を治療するために有用な医薬組成物であって、前記組成物は、医薬的に許容される添加剤と共に、有効量のクロロゲン酸の類似体および／またはクロロゲン酸の類似体の塩を含む医薬組成物を提供する。

本発明の実施形態において、前記組成物は、Ａｂｌタイプのキナーゼの過剰発現により引き起こされる疾患の治療においても、同様に有用である。

別の実施形態において、クロロゲンの前記類似体は、ネオクロロゲン酸（５−Ｏ−カフェオイルキナ酸）、クリプトクロロゲン酸（４−Ｏ−カフェオイルキナ酸）、３−Ｏ−（３’−メチルカフェオイル）キナ酸および５−Ｏ−（カフェオイル−４’−メチル）キナ酸からなる群から選択される。

さらに別の実施形態において、クロロゲン酸の前記類似体は、自然源から得られるか、または合成的に製造される。

さらに別の実施形態において、クロロゲン酸類似体の塩は、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウムから選択される。

さらに別の実施形態において、前記添加剤は、タンパク質、炭水化物、糖のような栄養分、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、スターチ−ゼラチン・ペーストおよび／または医薬的に許容される基材、賦形剤、希釈剤もしくは溶媒からなる群から選択される。

本発明の別の実施形態は、この組成物を患者に投与する方法に関する。この組成物は、経口経路、静注経路、筋肉内経路または皮下経路により、投与されてもよい。

更に別の実施形態において、前記組成物は、ｋｇ体重／日毎に約１から１００ｍｇの範囲の服用レベルで、好ましくは１から２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の服用レベルで投与される。

さらに別の実施形態において、前記組成物は、少なくとも４週間から１２週間までの範囲の間、投与されてもよく、再発の場合、毒性無く前記患者に再度投与してもよい。

さらに別の実施形態において、前記組成物は、白血病細胞タイプＫ５６２およびＭｏｌｔ−４の成長を阻害する。

さらに別の実施形態において、前記組成物は、白血病細胞タイプＭｏｌｔ−４の成長を阻害する。

さらに別の実施形態において、前記組成物は、１０⁴／ウェルの濃度のＫ５６２細胞に対する生体外活性についてのＩＣ₅₀値が、２７．０ナノモル／ｍｌまでである。

本発明のさらなる実施形態は、動物およびヒトにおいてＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼが構成的に発現された慢性骨髄性白血病または、Ａｂｌタイプのキナーゼの過剰発現により引き起こされたいずれかの疾患を病む患者を治療する方法を提供する。

別の実施形態において、Ｋ５６２細胞に対するクロロゲン酸およびクロロゲン酸ナトリウムについてのＩＣ₅₀値は、それぞれ、１３．５μｍ／１０⁴細胞および２７．０μｍ／１０⁴細胞である（図２Ｃおよび２Ｄ）。

別の実施形態において、マウスモデルにおけるクロロゲン酸ナトリウムの急性毒性は、経口経路において、前記化合物が２ｇｍ／ｋｇ体重の服用レベルまで非毒性である。

本発明を、以下の例を参照しながら詳細に説明する。以下の例は、本発明を説明するためのものであり、従って、本発明の範囲を限定するためのものとは、解釈されない。

添付の図面の簡単な説明
図１。クロロゲン酸の塩の一つ、クロロゲン酸ナトリウムの構造。

図２。キンマ葉からのクロロゲン酸の精製と、細胞株およびＰｈ^+/-ＣＭＬ患者のＰＢＭＣ生体外に対するその効果。精製の工程図を示す。ＨＰＬＣにより画分Ｅから単離されたピーク０９の構造は、分光方法（ＩＲ、ＮＭＲ、¹³ＣＮＭＲ、ＦＡＢＭＳ）により、クロロゲン酸と推測された。細胞計数アッセイを、指示された量の抽出物（ａ）、画分（ｂ）、精製された化合物（ｃ）およびそのナトリウム塩（ｄ）と共に、または無しで、標準増殖培地の存在下で、細胞を平板培養することにより、行った。毎日、生存細胞を、トリパンブルーの排除により、評価して、数えた。（ｅ）、Ｎａ−Ｃｈｌ（６７．５ｎｍｏｌｅ／１０⁵細胞）で処理した後の、３人のＰｈ⁺ＣＭＬ患者と、１人のＰｈ^-ＣＭＬ患者から得られたＰＢＭＣの生存率。（ｆ）、６時間の間、ＮａＣｈｌ（６７．５ｎｍｏｌｅ／１０⁵細胞）で処理されたＫ５６２細胞の形態学的変化（位相差顕微鏡写真、×４００）。

図３。クロロゲン酸ナトリウムが、Ｐｈ⁺ＣＭＬ細胞株とＣＭＬ患者のＰＢＭＣにおけるアポトーシスを誘導する。
ａ）．細胞を処理しないまま（ＮＴ）、またはＮａＣｈｌ（６７．５ｎｍｏｌｅ／１０⁵細胞）と共に６時間培養し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩで染色した後、フローサイトメトリーで処理した。生存細胞は、左下四半分中にある。アネキシンＶで染色されたアポトーシスを起した細胞は、右下四半分中にある。アネキシンＶとＰＩの両方で染色された、後期アポトーシスを起した細胞は、右上四半分にある。
ｂ）．ＮａＣｈｌでの処理により、Ｐｈ⁺細胞において、初期細胞周期停止、続いてアポトーシスを生じる。細胞を、ＮａＣｈｌの存在下または不在下に、培養した。培地で１または２日後、細胞を集め、浸透化させ、ＤＮＡ内容分析のためＰＩで染色した。ゲートを死んだもの（＜２ｎＤＮＡ、Ｍ１）の割合を評価するために設定した。Ｇ０／Ｇ１（２ｎＤＮＡ、Ｍ２）およびＳ＋Ｇ２＋Ｍ（＞２ｎＤＮＡ、Ｍ３）細胞。
ｃ）．ＮａＣｈｌでの処理、続いてアネキシンＶ−アレキサ（Allexa）（登録商標）での染色、アネキシンＶでの染色の後のＫ５６２およびＭｏｌｔ−４細胞の蛍光イメージを、左パネル中に示し、明視野（bright filed）位相差図を右パネル中に示す。
ｄ）．ＮａＣｈｌでの処理により、Ｐｈ⁺細胞中のプロカスパーゼ（procaspase）−３の活性化に到る。細胞を、２４時間の間、ＮａＣｈｌで未処理または処理（Ｔ）した。細胞を回収し、溶解させ、当量の溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび電気運搬（electro-transferred）により分離した。フィルターを、プロカスパーゼ−３の分解産物（３２Ｋｄａ、上方のバンド）とカスパーゼ−３の分解産物（１７Ｋｄａ、下方のバンド）の両方を認識する抗カスパーゼ３で、精査した。

図４。クロロゲン酸ナトリウムが、Ｐｈ⁺細胞におけるＢｃｒ−Ａｂｌ自己リン酸化を阻害する。
ａ）Ａｂｌリン酸化状況のフローサイトメトリーの測定。細胞を処理しないまま（ＮＴ）、またはＮａＣｈｌで３時間培養（Ｔ）し、浸透化させ、ウサギ抗ホスホ−ｃ−Ａｂｌ（Ｔｙｒ２４５）抗体で染色した。点線、正常ウサギＩｇＧで染色；実線、免疫ＩｇＧで染色。
ｂ）Ａｂｌリン酸化状況の免疫ブロット−ベースの測定。細胞を回収し、溶解させ、同量の溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、電気運搬した。そのフィルターを、抗ホスホ−ｃ−Ａｂｌ（Ｔｙｒ２４５）（上部パネル）または抗−ｃ−Ａｂｌ抗体（中間パネル）で精査した。サンプル中の等しいタンパク質レベルを証明するため、抗アクチン抗体もローディング・コントロールとして用いた（下部パネル）。
ｃ）Ａｂｌ発現状況のフローサイトメトリーの測定。細胞を浸透化させ、ウサギ抗−ｃ−Ａｂｌ抗体で染色した。点線、正常ウサギＩｇＧで染色；実線、免疫ＩｇＧで染色。
ｄ）Ａｂｌチロシン・キナーゼの不活性な（パネル−Ａ＆Ｂ）型と、グリベック（Ａ）およびＣｈｌ（Ｂ）とのコンプレックスならびに、前記キナーゼの活性な（パネル−Ｃ＆Ｄ）型と、ＰＤ１７３９５５（Ｃ）およびＣｈｌ（Ｄ）とのコンプレックスの構造。前記不活性な型とグリベック（Ａ）とのコンプレックスおよび、前記活性な型とＰＤ１７３９５５（Ｃ）とのコンプレックスの構造は、Ｘ線結晶学により得た。前記不活性な型と、Ｃｈｌ（Ｂ）とのコンプレックスおよび、活性な型とＣｈｌ（Ｄ）とのコンプレックスの構造は、これらのｘ−線構造を用いてモデル化した。ロビンス（Ribbons）により、前記キナーゼの結合ポケットが示された；黄色線は、活性化ループ（activation loop）の一部であり、不活性な（Ａ＆Ｂ）コンホメーションおよび活性な（Ｃ＆Ｄ）コンホメーションにおいて相違する。前記阻害剤分子の周りのおおいは、それらのコナリー表面（Connolly surface）である。

実施例
実施例１：クロロゲン酸ナトリウムの製造：
４．７ｋｇのキンマ葉を、新たに集め、蒸留水で洗浄し、その後、小片に切断した。小片の葉を一緒に集め、１．０リットルの蒸留水と混合し、混合ブレンダー中で完全に均一化した。そのホモジネートを、細かいチーズクロスを通して、大きな粒子をろ過して取り除き、ろ液を集めた。この工程を、２〜３回繰り返して、収量を最大にした。合わせたろ液をその後遠心分離し、一定量の透明な溶液を集めて、半固形塊（約１１０ｇｍであった）にまで凍結乾燥した。集めた物質を生物活性、すなわち、ＣＭＬ細胞の破壊について、検査した。その陽性な活性を観察して、精製を始めた。１０ｇｍの上記物質をセファデックスＬＨ−２０カラム上に載せ、溶離剤として、水、水−メタノール（１：１）、およびメタノールでクロマトグラフにかけた。３つの異なる溶媒システムからこのようにして得られた、３つの異なる画分を、別々に、生物活性について調べた。その活性は、メタノール−水（１：１）にのみ存在し、画分Ｅと名づけた。画分Ｅ（０．２３ｇ）をその後、Ｍ−ボンダ・パック（M-Bonda pak）カラム（１９×３００ｍｍ）を用い、メタノール：水：酢酸（２３：７６：１）の溶媒システムで、１２ｍｌ／分の流速で、２８０ｎｍで検出して、分取ＨＰＬＣに付した。精製された化合物、クロロゲン酸（４ｍｇ）を、保持時間９．１６分のピーク（ピークｎｏ．０９）から単離した。

１０．５ｍｇのクロロゲン酸を炭酸水素ナトリウム（３．６ｍｇ）と共に２ｍｌの水中で攪拌し、生じた溶液を凍結乾燥することにより、クロロゲン酸ナトリウム（１３ｍｇ）を製造した。生物活性について、試験した。その構造は、このようにして、クロロゲン酸ナトリウム（図１）と決定した。ＩＲ、ＮＭＲ、¹³ＣＮＭＲおよびＦＡＢＭＳｍ／２。

ＫＢｒ
IR γ_max cm^-1 : 3398(OH), 1685(CO), 1593, 1527, 1449, 1443, 1394, 1279, 1159, 1118, 1081, 1038, 975, 916および810

¹H-NMR (D₂O) : 7.45(1H), 6.99 (1H), 6.93(1H), 6.77(1H), 6.18(1H), 5.16(1H), 4.11(1H), 3.75(1H) および 2.09-1.85(4H)

¹³C NMR (D₂O) : 181.28, 169.49, 147.69, 146.45, 144.67, 127.14, 123.10, 116.51, 115.40, 114.68, 77.28, 73.33, 71.56, 71.17, 38.88および37.72
FABMS m/Z : 355 (M⁺+H) および 377 (M⁺+Na)

実施例２：
クロロゲン酸は、純粋な形態で市場で入手可能である。そのクロロゲン酸（１ｇｍ）を、炭酸水素ナトリウム（５ｍｌの水中０．２４ｇ）溶液で、手で振った。その溶液を純粋なクロロゲン酸ナトリウム（sodium chlogogenate）（１．１２ｇｍ）にまで凍結乾燥し、生物活性について試験した。キンマから単離されたか、または市販で入手されたかいずれかの、クロロゲン酸から製造されたクロロゲン酸ナトリウムは、同様な構造と活性を有していた。

実施例３：
Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬ細胞株（Ｋ５６２）、ＣＭＬ患者の末梢血液細胞、Ｂｃｒ−Ａｂｌ−陰性ＡＬＬ細胞株（Ｍｏｌｔ−４）および、ＣＭＬ患者の末梢血液細胞の培養。細胞計数アッセイを、指示量の抽出物、画分、精製された化合物およびそのナトリウム塩の存在下または不在下に、標準増殖培地の存在下で、細胞を平板培養することにより、行った。毎日、生存細胞を、トリパンブルーの排除により、数を数えて評価とした。

実施例４：
位相差顕微鏡法による、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬ細胞株Ｋ５６２の形態学的分析。細胞は、処理しないまま（ＮＴ）または、ＮａＣｈｌ（Ｎａｃｈｌ；６７．５ｎｍｏｌｅ／１０⁵細胞）で処理し、位相差顕微鏡法（倍率×４００）の下、観察した。

実施例５：
フローサイトメトリーによるアポトーシスの測定。細胞は、処理しないまま、またはＮａＣｈｌ（６７．５ｎｍｏｌｅ／１０⁵細胞）で６時間処理した。洗浄した後、細胞を、アネキシンＶと結合したフルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothyocyanate）（ＦＩＴＣ）およびプロピジウムアイオダイド(PI)で染色し、フローサイトメーター(FACSキャリバー（Calibur）、ベクトン・ディキンソン（Beckton Dickinson）、USA)で分析した。

実施例６
共焦点顕微鏡検査。Ｋ５６２およびＭｏｌｔ−４細胞を、実施例５で説明したように、ＮａＣｈｌで処理し、次いで、アネキシン−Ｖ−アレキサ（登録商標）で染色し、ポリ−Ｌ−リジン−被覆のカバーガラス上に、１０分間、付着させた。典型的な範囲の細胞を、ライカ（Leica）ＴＣＳＳＰ２共焦点レーザー顕微鏡（Heidolberg, Germany）で分析した。

実施例７：
ＤＮＡ細胞周期分析。細胞を、実施例５で説明したように、ＮａＣｈｌで培養した。１または２日の培養後、細胞を集め、浸透化させ、ＤＮＡ細胞周期分析のため、ＰＩで染色した。

実施例８：
免疫ブロットアッセイ。細胞を回収し、溶解させ、当量の溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび電気運搬により分離した。そのフィルターを、抗カスパーゼ３抗体（Ｂ．Ｄ．ファーミンゲン（B.D. Pharmingen））、抗−ｃ−Ａｂｌ抗体または抗ホスホ−ｃ−Ａｂｌ抗体（セル・シグナル・テクノロジー（cell signaling Technology））で精査した。

実施例９：
Ａｂｌリン酸化またはＡｂｌ発現状況のフローサイトメトリーの測定。細胞を、浸透化させ（permeabelysed）、ウサギ抗ホスホ−ｃ−Ａｂｌ抗体、抗−ｃ−Ａｂｌ抗体またはコントロール・ウサギ抗体で染色し、フローサイトメーターで分析した。

実施例１０：
不活性な形態のキナーゼおよび活性な形態のキナーゼとのＣｈｌのコンプレックスの構造を、インサイト（Insight）ＩＩ９８．０（アッセリス（Accelrys））を用いてモデル化した。そのコンプレックスのモデルは、２つの重要な薬物分子（Ｃｈｌと、いくらかの構造的および機能的類似性がある）と酵素との２つのコンプレックスの最近決定された構造を用いて組み立てられた。Ｃｈｌの構造は、最少化および力学的シミュレーションを繰り返して、組み立て、最適化された。コンプレックスの当初の構造は、Ｃｈｌの官能基を、前記薬物分子の実験的構造の同様な基と重ね合わせることにより、組み立てられた。それは、ｃｆｆ９１力場を用いるエネルギー最少化（最急降下法および共役勾配法の１００工程各々）により、最適化された。その後、３００°Ｋで１０工程中の１の立体構造サンプリングと平衡の、１００工程ごとに１フェムト（fempto）秒の１０００工程について、力学を実行した。シミュレーションの最後に、最も低い位置エネルギーを有する構造を、シミュレーションの次のサイクルのために、取り上げた。最少化と力学のこの組み合わせを、満足のいく構造が得られるまで繰り返した。一連の最適化は、結合ポケットの窩における当初条件を変化させて行った。位置拘束（Position constraints)を、エネルギー最少化および分子力学の間、１０Åより遠かった原子に適用した。

実施例３＆４の結果：
キンマ葉の水抽出物が、用量依存的にＫ５６２細胞を死滅させた（図２ａ）。その抽出物は、ＡＡＬ細胞株Ｍｏｌｔ−４に対して測定可能な効果を有さなかった。Ｋ５６２細胞の画分Ｅ誘導死滅活性は、ピーク０９（図２ｂ）に限定されており、そのピークはその後クロロゲン酸と同定され（図２ｃ）、粗抽出物または画分Ｅと比較して、Ｋ５６２細胞のより高い死滅活性を示した。興味深いことに、クロロゲン酸ナトリウム（ＮａＣｈｌ）は、Ｋ５６２細胞を死滅させることについて、クロロゲン酸より２倍効力がある（図２ｄ）。ＮａＣｈｌは、また、フィラデルフィア染色体（Ｂｃｒ−Ａｂｌ）陽性ＣＭＬ患者の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を死滅させることにおいても、活性である（図２ｅ）。ＮａＣｈｌは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陰性ＣＭＬ患者ＰＢＭＣについて、効果がない（図２ｅ）。位相差顕微鏡法によれば、ＮａＣｈｌは、Ｋ５６２細胞において、形態学的変化（核濃縮）、アポトーシスの徴候（図２ｆ）を誘導することが示された。Ｋ５６２細胞に対するクロロゲン酸およびクロロゲン酸ナトリウムについてのＩＣ₅₀値は、それぞれ、１３．５μｍ／１０⁴細胞および２７．０μｍ／１０⁴細胞であった図２Ｃ＆２Ｄ。マウスモデルにおけるクロロゲン酸ナトリウムの急性毒性に関し、前記化合物は、経口経路において、２ｇｍ／ｋｇ体重の服用レベルまで、非毒性であった。

実施例５から９の結果：
ＮａＣｈｌでの処理は、Ｍｏｌｔ−４細胞、正常ＰＢＭＣまたは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陰性ＣＭＬ患者のＰＢＭＣにおいて、アポトーシスを誘導しなかった。対照的に、同じ処理が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性Ｋ５６２細胞および、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬ患者のＰＢＭＣにおいて、アポトーシスを増加させた（図３ａ）。ＤＮＡ細胞周期分析によれば、また、ＮａＣｈｌが、細胞周期停止、次いでＢｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬ細胞株Ｋ５６２細胞および、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性ＣＭＬ患者のＰＢＭＣにおいて、ＤＮＡの衰弱を誘導することが示された（図３ｂ）。共焦点顕微鏡検査によれば、ＮａＣｈｌでの処理後、陽性アネキシンＶ染色が、Ｍｏｌｔ−４細胞ではなく、しかし、Ｋ５６２細胞において、図３ｃに示された。Ｋ５６２細胞、Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｐｈ）陽性ＣＭＬ患者のＰＢＭＣにおいてはアポトーシスが有り、Ｍｏｌｔ−４細胞、またはＢｃｒ−Ａｂｌ陰性ＣＭＬ患者もしくは正常供給者のＰＢＭＣにおいてはアポトーシスが無いことが、カスパーゼ３活性化の免疫ブロット検出により更に確認された（図３ｄ）。ＮａＣｈｌは、Ａｂｌタンパク質レベルの発現に影響を及ぼすことなく、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質チロシンキナーゼのリン酸化（phosphorilation）を阻害する。このことは、ホスホ−ｃ−Ａｂｌ状態のフローサイトメトリー検出により（図４ａ）、および免疫ブロット検出により（図４ｂ、上部パネル）、明らかである。Ａｂｌタンパク質の発現は、フローサイトメトリー（図４ｃ）および免疫ブロット（図４ｂ、中間パネル）により、また分析した。従って、我々の知見は、クロロゲン酸ナトリウムが、Ａｂｌタンパク質チロシンキナーゼ（細胞のアポトーシスをもたらすＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼを含む）のリン酸化を阻害することを示している。Ｋ５６２細胞に対するクロロゲン酸およびクロロゲン酸ナトリウムについてのＩＣ₅₀値は、それぞれ、１３．５μｍ／１０⁴細胞および２７．０μｍ／１０⁴細胞であった図２Ｃ＆２Ｄ。マウスモデルにおけるクロロゲン酸ナトリウムの急性毒性については、前記化合物は、経口経路において２ｇｍ／ｋｇ体重の服用レベルまで非毒性であった。

実施例１０の結果：
図−４ｄには、クロロゲン酸（Ｃｈｌ、パネル−Ｂ）が、グリベックの（パネル−Ａ）と同様な位置で、不活性な立体構造のＡｂｌキナーゼの結合ポケットに、およびＰＤ１７３９５５のと同様な位置で（パネル−Ｃ）活性な立体構造のＡｂｌキナーゼの結合ポケットに（パネル−Ｄ）、適合しうることが示されている。前記キナーゼの活性および不活性な立体構造の結合ポケット内の、リガンドの結合と関連した実験的なエネルギーは、マイナスであり、安定なコンプレックス形成を示す、他の小分子阻害剤、例えば、グリベックおよびＰＤ１７３９５５のものに匹敵する。荷電および中性形態のＣｈｌの結合エネルギーは、相違し、電気的相互作用の規模は、中性の阻害剤とは異なり、分子の電気的状態に左右される。モデリング研究によれば、Ｃｈｌは、ＰＤ１７３９５５のように、前記キナーゼの活性な立体構造および不活性な立体構造の両方に結合することができることが示された。Ｃｈｌは、グリベックのコンプレックスにおいても見られるように、周囲の残基と多数の水素結合を形成するが、一方、疎水性相互作用の幾つかは、そのままである。ＰＤ１７３９５５と比較して、Ｃｈｌは、より多数の水素結合を形成するが、一方、同様の数の疎水性接触を維持している。Ｃｈｌの芳香族水酸基が、結合ポケット中で水素結合のネットワークを形成しており、これらの基が、コンプレックス形成において重要であることを示唆していることが、見出された。

図１は、クロロゲン酸の塩の一つ、クロロゲン酸ナトリウムの構造を示す。図２は、キンマ葉からのクロロゲン酸の精製と、細胞株およびＰｈ^+/-ＣＭＬ患者のＰＢＭＣ生体外に対するその効果を示す。精製の工程図を示す。図３は、クロロゲン酸ナトリウムが、Ｐｈ⁺ＣＭＬ細胞株とＣＭＬ患者のＰＢＭＣにおけるアポトーシスを誘導するのを示す。図４は、クロロゲン酸ナトリウムが、Ｐｈ⁺細胞におけるＢｃｒ−Ａｂｌ自己リン酸化を阻害するのを示す。

Claims

動物およびヒトにおいてＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼが構成的に発現された慢性骨髄性白血病を治療するために有用な医薬組成物であって、
前記組成物が、医薬的に許容される添加剤と共に、有効量のクロロゲン酸の類似体および／またはクロロゲン酸の類似体の塩を含む医薬組成物。
請求項１に記載の組成物であって、前記組成物が、Ａｂｌタイプのキナーゼの過剰発現により引き起こされる疾患にも有用である組成物。
請求項１に記載の組成物であって、クロロゲンの前記類似体が、ネオクロロゲン酸（５−Ｏ−カフェオイルキナ酸）、クリプトクロロゲン酸（４−Ｏ−カフェオイルキナ酸）、３−Ｏ−（３’−メチルカフェオイル）キナ酸および５−Ｏ−（カフェオイル−４’−メチル）キナ酸からなる群から選択される組成物。
請求項１に記載の組成物であって、クロロゲン酸の前記類似体が、自然源から得られたか、または合成的に製造された組成物。
請求項１に記載の組成物であって、クロロゲン酸類似体の塩が、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウムから選択される組成物。
請求項１に記載の組成物であって、前記添加剤が、タンパク質、炭水化物、糖のような栄養分、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、スターチ−ゼラチン・ペーストおよび／または医薬的に許容される基材、賦形剤、希釈剤もしくは溶媒からなる群から選択される組成物。
請求項１に記載の組成物であって、経口経路、静注経路、筋肉内経路または皮下経路で投与される組成物。
請求項１に記載の組成物であって、ｋｇ体重／日毎に１ｍｇから２０ｍｇの範囲の服用レベルで投与される組成物。
請求項１に記載の組成物であって、少なくとも４週間から１２週間までの間、投与される組成物。
請求項１に記載の組成物であって、前記組成物が、ＣＭＬの再発した容態にも有用である組成物。
請求項１に記載の組成物であって、前記組成物が、白血病細胞タイプＫ５６２およびＭｏｌｔ−４の成長を阻害する組成物。
請求項１に記載の組成物であって、１０⁴／ウェルの濃度のＫ５６２細胞に対する生体外活性についてのＩＣ₅₀値が、２７．０ナノモル／ｍｌまでである組成物。
動物およびヒトにおいてＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼが構成的に発現された患者において、慢性骨髄性白血病の治療のための請求項１に記載の医薬組成物の使用であって、
前記組成物が、医薬的に許容される添加剤と共に、有効量のクロロゲン酸の類似体および／またはクロロゲン酸の類似体の塩を含む使用。
請求項１３に記載の使用であって、前記患者が、哺乳動物、好ましくは人間から選択される使用。
請求項１３に記載の使用であって、前記組成物が、Ａｂｌタイプのキナーゼの過剰発現により引き起こされる疾患にも有用である使用。
請求項１３に記載の使用であって、クロロゲンの前記類似体が、ネオクロロゲン酸（５−Ｏ−カフェオイルキナ酸）、クリプトクロロゲン酸（４−Ｏ−カフェオイルキナ酸）、３−Ｏ−（３’−メチルカフェオイル）キナ酸および５−Ｏ−（カフェオイル−４’−メチル）キナ酸からなる群から選択される使用。
請求項１３に記載の使用であって、クロロゲン酸の前記類似体が、自然源から得られたか、または合成的に製造された使用。
請求項１３に記載の使用であって、クロロゲン酸類似体の塩が、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウムから選択される使用。
請求項１３に記載の使用であって、前記添加剤が、タンパク質、炭水化物、糖のような栄養分、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、スターチ−ゼラチン・ペーストおよび／または医薬的に許容される基材、賦形剤、希釈剤もしくは溶媒からなる群から選択される使用。
請求項１３に記載の使用であって、前記組成物が、経口経路、静注経路、筋肉内経路または皮下経路で投与される使用。
請求項１３に記載の使用であって、前記組成物が、ｋｇ体重／日毎に１ｍｇから２０ｍｇの範囲の服用レベルで投与される使用。
請求項１３に記載の使用であって、前記組成物が、少なくとも４週間から１２週間までの間、投与される使用。
請求項１３に記載の使用であって、前記組成物が、ＣＭＬの再発した容態にも有用である使用。
請求項１３に記載の使用であって、前記組成物が、白血病細胞タイプＫ５６２およびＭｏｌｔ−４の成長を阻害する使用。
請求項１３に記載の使用であって、１０⁴／ウェルの濃度のＫ５６２細胞に対する生体外活性についての前記組成物のＩＣ₅₀値が、２７．０ナノモル／ｍｌまでである使用。
動物およびヒトにおいて、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼが構成的に発現された慢性骨髄性白血病ＣＭＬを治療する方法であって、
前記方法が、医薬的に許容される添加剤と共に、有効量のクロロゲン酸の類似体および／またはクロロゲン酸の類似体の塩を含む医薬組成物を投与することを含む方法。
請求項２６に記載の方法であって、前記組成物が、Ａｂｌタイプのキナーゼの過剰発現により引き起こされる疾患にも有用である方法。
請求項２６に記載の方法であって、クロロゲンの前記類似体が、ネオクロロゲン酸（５−Ｏ−カフェオイルキナ酸）、クリプトクロロゲン酸（４−Ｏ−カフェオイルキナ酸）、３−Ｏ−（３’−メチルカフェオイル）キナ酸および５−Ｏ−（カフェオイル−４’−メチル）キナ酸からなる群から選択される方法。
請求項２６に記載の方法であって、クロロゲン酸の前記類似体が、自然源から得られたか、または合成的に製造された方法。
請求項２６に記載の方法であって、クロロゲン酸類似体の塩が、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウムから選択される方法。
請求項２６に記載の方法であって、前記添加剤が、タンパク質、炭水化物、糖のような栄養分、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、スターチ−ゼラチン・ペーストおよび／または医薬的に許容される基材、賦形剤、希釈剤もしくは溶媒からなる群から選択される方法。
請求項２６に記載の方法であって、前記組成物が、経口経路、静注経路、筋肉内経路または皮下経路で投与される方法。
請求項２６に記載の方法であって、前記組成物が、ｋｇ体重／日毎に１ｍｇから２０ｍｇの範囲の服用レベルで投与される方法。
請求項２６に記載の方法であって、前記組成物が、少なくとも４週間から１２週間までの間、投与される方法。
請求項２６に記載の方法であって、前記組成物が、ＣＭＬの再発した容態にも有用である方法。
請求項２６に記載の方法であって、前記組成物が、白血病細胞タイプＫ５６２およびＭｏｌｔ−４の成長を阻害する方法。
請求項２６に記載の方法であって、１０⁴／ウェルの濃度のＫ５６２細胞に対する生体外活性についての前記組成物のＩＣ₅₀値が、２７．０ナノモル／ｍｌまでである方法。