WO2004091603A1 - Utilisation d’un ester de dha pour le traitement des malades cardiovasculaires - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un ester de DHA, comme le lyso-PCDHA ou de l'un de ses dérivés, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie cardiovasculaire associee à l'accumulation des cellules spumeuses au niveau des sites vasculaires impliqués dans le développement de la plaque d'artériosclérose, sites au niveau desquels ledit médicament inhibe les métalloprotéases de la matrice.

Description

UTILISATION D'UN ESTER DE DHA POUR LE TRAITEMENT DES MALADIES CARDIOVASCULAIRES .

La présente invention concerne le domaine du traitement et de la prévention des maladies cardiovasculaires . L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisa ion d'un este d'acide docosahexanoique (DHA) , comme le Lyso Phosphatidyl Choline DHA (lyso-PCDHA) et ses dérivés, pour le traitement ou la prévention de pathologies dans lesquelles on observe une accumulation des vésicules lipidiques dans le macrophage. Il s'agit notamment de pathologie résultant de la fixation des oxLDL au CD36 et tout spécialement de pathologies dans lesquelles les metalloproteases de matrice (T. Takino et al. 1995, J. Biol. Chem. 270, 23013-23021) sont impliquées.

Les metalloproteases de la matrice (MMPs) jouent un rôle majeur dans la physiologie du développement des tissus connectifs, la morphogénèse et la cicatrisation. Leur activité a été rapportée dans un nombre considérable de maladies, comme l'arthrite, les cancers, l'artériosclérose. Les MMPs sont aussi impliquées dans la formation et la stabilité de la plaque d'arthérome, le remodelage de la matrice extracellulaire et la migration ou l'infiltration cellulaire.

Ainsi, la plupart des décès résultant d'un infarctus du myocarde sont dus à des ruptures au niveau des lésions du réseau fibreux qui conduisent à des thromboses et a une rapide occlusion de l'artère. La présence de nombreux macrophages contribue à la vulnérabilité de ces zones d'artérioscléroses. Cette vulnérabilité est principalement liée à la libération de protëase dégradant la matrice et induisant des faiblesses, des fissures ou une rupture de la structure de la plaque. Plusieurs metalloproteases de matrice sont produites par les macrophages dans la plaque d'artériosclérose, comme la stromolysine 1, les metalloproteases de matrice MMP-3, MMP-1, MMP-7, MMP-9, MMP-12, la collagénase-1, la gélatinase, la matrilysine (Henney, A. M. et al., 1991, PNAS USA, 88, 8154-8158 ; Galis, Z. S. et al., 1994, J. Clin. Invest. 94, 2493- 2503 ; Bro n, D. L. et al., 1995, Circulation 91, 2125- 2131 ; Halpert, I. et al., 1996, PNAS USA, 93, 9748- 9753) . La sécrétion de ces divers metalloproteases de matrice pourrait être responsable de la dégradation de plusieurs composantes du réseau fibreux. Ainsi, l'identification des molécules capables de contrôler l'activité ou la production des MMPs constitue un enjeu majeur, notamment pour limiter la vulnérabilité de la plaque d'artériosclérose.

La Demanderesse a maintenant mis en évidence que la lyso Phosphatidylcholine comprenant de l'acide docosahexanoique (DHA) en position sn-1 ou sn-2 (lyso-PCDHA) est capable de bloquer de manière spécifique la captation de phospholipide et l'accumulation des vésicules lipidiques dans le macrophage. Le lyso-PCDHA est également capable de bloquer de manière spécifique la fixation des oxLDL au CD36 qui est le récepteur majeur des lipoprotéines modifiées. Ces propriétés du lyso-PCDHA sont spécifiques car ni le DHA, l'EPA (acide cicosanoique) ou l'AA (acide arachidonique) , ni la lyso-PC oléate ou d'autres lyso-PC acide gras ne présentent ces propriétés. La Demanderesse a également mis en évidence que le lyso-PCDHA peut bloquer l'expression des metalloproteases de matrice, alors que le DHA, l'EPA, l'AA ou d'autres lyso-PC ne sont pas capables d'une telle activité.

Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont également permis de mettre en évidence que le lyso-PCDHA est capable de bloquer l'expression de TollR4, qui est un membre de la famille des récepteurs Toll like, alors que le DHA non esterifiê induit une augmentation deux fois supérieure de l'expression de cette molécule TollR4. TollR4 forme un complexe avec le CD14 à la surface des cellules endothéliales et de macrophages. Ce complexe fonctionne comme un récepteur des protéines de choc thermique « heat shok proteins » comme HSP60 impliquées dans diverses voies de signalisation (Kol, A. et al., 2000, J. Immunol. 164, 13-17 ; Asea, A. et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, 15028-15034 ; Xu, Q., 2002, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 22, 1547-1575) . Ainsi, TLR4 constitue un médiateur important du recrutement des onocytes au niveau des sites de lésions vasculaires.

Les mécanismes de contrôle de la croissance, de l'érosion et de la rupture de la plaque d'artériosclérose conduisant aux épisodes thrombotiques sont méconnus. Il semble toutefois qu'ils mettent en jeu par exemple le dépôt et le retrait de lipide, la survie et la mort cellulaire, l'adhésion cellulaire, la dégradation et la mobilité de la matrice extracellulaire .

L'artériosclérose est initiée à des sites spécifiques par des atteintes ou dysfonctionnement de l' endothêlium. La production de lipoprotéines oxydées (oxLDL) , d'autres oxydants et agents cytotoxiques est à l'origine des dommages vasculaires. La présente invention concerne l'utilisation d'un ester d'acide docosahexanoique (DHA) , sous sa forme Lyso Phosphatidyl Choline (lyso- PCDHA) , ou sous sa forme Phosphatidyl Choline (PCDHA) , pour la préparation d'un médicament pour inhiber l'accumulation de vésicules lipidiques dans le macrophage et bloquer la formation de cellules spumeuses .

L'invention est aussi fondée sur l'observation que le lyso-PCDHA et/ou le PCDHA purifiés peuvent inhiber l'accumulation de vésicules lipidiques dans le macrophage et bloquer la formation de cellules spumeuses . Les dérivés de DHA contenant de la Phosphatidyl Choline sont beaucoup plus efficaces dans cette fonction que la forme libre du DHA.

Cette activité unique et particulière démontre que les dérivés de DHA contenant de la Phosphatidyl Choline peuvent être utiles dans la prévention et la réduction de l'accumulation de cellules spumeuses au niveau des sites vasculaires où se développe une plaque d'athérosclérose et peuvent être utilisés comme agents pharmaceutiques pour le traitement de 1 ' thérosclérose et des maladies cardiovasculaires qui y sont liées. L'athérosclérose est la cause la plus importante des maladies cardiovasculaires et des décès d'origine cardiovasculaire dans les pays industrialisés (Ross R., 1993, Nature, 362, 801-809). L'athérosclérose coronarienne est responsable de plus de 500 000 décès par an aux Etats-Unis et d'un grand nombre d'autres complications cliniques.

L'athérosclérose est le résultat d'une réaction cellulaire et moléculaire non-équilibrée complexe, qui fonctionne normalement comme un mécanisme de défense en réponse à une atteinte vasculaire. Cependant, dans les situations pathologiques, ce mécanisme conduit à un dysfonctionnement de 1 ' endothélium, à des changements cellulaires dans l'intima artérielle et à une formation et une croissance continues d'une plaque artérielle contenant des lipides et des cellules spumeuses.

La composition des lésions vasculaires qui précèdent un épisode ischemique est morphologiquement bien caractérisée. Ces lésions ne présentent souvent aucun signe clinique et s'établissent progressivement dans une séquence temporelle de lésions précoces et avancées appelée Type I, II et III (Stary H. C, et al., 1994, Circulation, 89, 2462-2478). Les lésions de type I, II et III sont des étapes successives. Chaque type est caractérisé par l'accumulation de lipoprotéines et d'esters de cholestérol associés à des macrophages et des cellules spumeuses de macrophage pour former des plaques fibreuses. La formation et la croissance de ces plaques fibreuses est aussi associée à la rupture de l'architecture intime de la plaque.

Aux stades très avancés, la plaque est envahie par des cellules spumeuses apoptotiques chargées de lipides. Les lésions de type I, II et III sont considérées comme les précurseurs silencieux de l'athérosclérose. Les macrophages et les macrophages chargés de gouttelettes de lipides sont les composants cellulaires principaux d'un atherome. Leur prolifération et leur apoptose conduisent à la rupture de la plaque qui induit la phase ultime aiguë des maladies liées à 1 ' atherome impliquant la formation d'agrégats plaquettaires . Bien que ne présentant pas de signe clinique dans la majorité des cas, ces plaques peuvent être quantifiées par imagerie non invasive dans l'aorte et les artères coronaires des patients hyperlipidémiques .

Les mécanismes qui contrôlent la croissance, l'érosion de la plaque et la rupture de la plaque conduisant à des épisodes thrombotiques sont largement méconnus, et il existe un besoin non résolu en médicaments dans ce domaine. Le processus apparaît comme étant le résultat de mécanismes contradictoires. Cela inclut, par exemple, le dépôt et le retrait de lipides, la survie et la mort cellulaire, l'adhésion cellulaire et la dégradation et la mobilité de la matrice extracellulaire.

L'athérosclérose est initiée au niveau de sites spécifiques par une atteinte et un dysfonctionnement de 1 ' endothélium. La production de lipoprotéines oxydées (oxLDL) et d'autres agents cytotoxiques et oxydants est probablement l'événement initial entraînant une atteinte vasculaire. Il a été démontré que ces agents stimulent à la fois les mécanismes de survie et de pro-apoptose dans les cellules endothéliales et les macrophages. Ces réactions initiales ont lieu lors d'une hyperlipidémie, d'une dyslipidémie, d'une hypertension, d'un diabète et d'une variation de débit sanguin.

Un dysfonctionnement endothélial crée une inflammation chronique, qui entraîne un recrutement continu de monocytes et de macrophages. Bien que bénéfique dans des conditions normales, ce phénomène peut devenir pathologique et contribuer à la déstabilisation de la plaque artérielle. Le processus est une réaction lente en comparaison du recrutement des monocytes pendant une infection, et peut durer le temps d'une vie. Les cellules endothéliales activées et les monocytes expriment des récepteurs piegeurs comme le CD36 ou le LOXl qui lient et recaptent les LDL modifiées. Cette réaction conduit à la formation de cellules spumeuses, à la déstabilisation de la plaque artérielle et cause la rupture de la plaque résultant en une thrombose aiguë .

L'existence d'un dys onctionnement de 1 ' endothélium, le dépôt continu de lipides et l'accumulation de cellules spumeuses sont les conséquences les plus importantes des lésions vasculaires chez les sujets à risque. En particulier, l'abondance d'oxLDL est un facteur important de 1 ' athérosclérose . La plupart des médicaments qui sont dirigés contre ces phénomènes ont pour but de traiter les causes de l'athérosclérose et de l'étape ultime de l'ischémie, dans les maladies athéromateuses . Mais il existe un besoin en médicaments pouvant traiter les conséquences du dépôt de lipides en contrôlant la croissance et la stabilité de la plaque.

Le développement d'une plaque artérielle est complexe et requiert l'expression de nombreux gènes ayant des fonctions multiples dans différentes cellules dont les cellules endothéliales, les macrophages et les cellules de muscle lisse. Le recrutement et la différentiation des macrophages et l'accumulation intracellulaire de vésicules riches en lipides sont reconnus comme étant le facteur principal responsable de la propagation, des changements de l'architecture et de l'instabilité d'une plaque athérosclérotique . Les lésions dans les racines aortiques sont riches en cellules spumeuses de macrophage plutôt qu'en cellules de muscle lisse. Par conséquent, il existe un besoin en molécules pouvant contrôler la formation des cellules spumeuses .

La présente invention est basée sur la démonstration, pour la première fois, que l'acide Lyso Phosphatidyl Choline docosahexanoique (lyso-PCDHA) purifié peut bloquer l'accumulation dans le macrophage de vésicules riches en lipides et empêcher la formation de cellules spumeuses.

Le lyso-PCDHA constitue selon l'invention un agent capable de stabiliser spécifiquement tant au niveau moléculaire que cellulaire la plaque d'artériosclérose. En effet, le lyso-PCDHA est capable de prévenir ou réduire l'accumulation des cellules spumeuses au niveau des sites vasculaires impliqués dans le développement de la plaque d'artériosclérose et constitue ainsi un moyen efficace pour traiter les maladies cardiovasculaires qui y sont liées, comme 1 ' artériosclérose . En conséquence, l'invention vise à offrir une méthode de traitement ou de prévention de pathologies dans lesquelles les metalloproteases de matrice et/ou le récepteur TollR4 et/ou la fixation des oxLDL au CD36 sont impliqués, consistant à administrer à un sujet une quantité efficace de lyso-PCDHA, l'un de ses dérivés ou un mélange de ceux-ci.

Il s'agit plus particulièrement de maladies résultant d'une activité enzymatique excessive des metalloproteases de la matrice, parmi lesquelles on peut citer la polyarthrite rhumatoide, l' ostéoarthrite, le cancer de la prostate, l'ulcère de la cornée et les ulcères gastriques, l'artériosclérose, les stéatoses hépatiques non alcooliques, l'insuffisance cardiaque, les dermatites et l'infection du derme, les brûlures et les transplantations d'organes.

L'invention a donc pour objet l'utilisation d'un ester d'acide docosahexanoique (DHA), comme le lyso-PCDHA ou de l'un de ses dérivés, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie dans laquelle les metalloproteases de la matrice et/ou le récepteur TollR4 et/ou le CD36 (fixation des oxLDL) sont impliqués soit séparément soit simultanément.

On entend par dérivés du lyso-PCDHA, les lyso-PCDHA dont le DHA est substitué en position sn-1 par un groupe chimique ou une substance capable d'augmenter l'activité du lyso-PCDHA.

Il peut s'agir d'un groupe acyle de 2 à 6 atomes de carbone, comme par exemple un groupe acétyle, propionyle ou butyle . Il peut aussi s'agir d'une autre molécule de DHA. L'invention vise tout particulièrement l'utilisation de lyso-PCDHA ou de l'un de ses dérivés pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des maladies cardiovasculaires, dans lesquelles ledit médicament inhibe ou régule négativement les metalloproteases de la matrice. Dans le traitement ou la prévention de ces maladies, le médicament selon l'invention est avantageusement également capable de bloquer l'expression de TollR4 et la fixation des oxLDL au CD36.

Tout spécialement l'invention concerne l'utilisation de lyso-PCDHA ou de l'un de ses dérivés pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des maladies cardiovasculaires associées à l ' accumulat ion des cellules spumeuses au niveau des sites vasculaires impl iqués dans l e développement de l a plaque d' artériosclérose , site au niveau desquels ledit médicament inhibe les metalloproteases de la matrice . Comme indiqué précédemment , le médicament selon l ' invent ion e st égal ement capabl e de bloquer l ' expression de TollR4 au niveau de ces sites et la fixation des oxLDL au CD36 .

Ainsi, parmi les maladies cardiovasculaires associées à l'accumulation des cellules spumeuses au niveau des sites vasculaires impliqués dans le développement de la plaque d'artériosclérose, l'invention concerne prioritairement le traitement de l'artériosclérose et de 1 ' hypercholestérolémie .

La présente invention a donc pour but essentiel de fournir des médicaments à base d'acides gras spécifiques, qui peuvent être administrés très efficacement oralement et qui ont une efficacité accrue dans le traitement de l'athérosclérose et de ses complications .

Selon la présente invention, les dérivés estérifiés d'acide docosahexanoique (DHA estérifié) , et plus particulièrement le Lyso Phosphatidyl Choline DHA (lyso-PCDHA) ou le Phosphatidyl Choline DHA (PCDHA) , peuvent être employés, éventuellement sous leur forme purifiée, en tant qu'agents pharmaceutiques pour empêcher ou réduire la croissance d'une plaque athérosclérotique .

L'ester d'acide docosahexanoique (DHA estérifiê ou e-DHA) , sous ses formes Lyso Phosphatidyl Choline (lyso-PCDHA) ou Phosphatidyl Choline (PCDHA) , a été décrit dans EP 0 623 019 en tant qu'inhibiteur de l'agrégation plaquettaire, en raison de leur effet anti-thromboxane A2.

Cependant, comme expliqué précédemment, cet effet est tout à fait différent de l'objet de la présente invention en ce que, dans la maladie liée aux plaques d' atherome, les thrombi de plaquettes apparaissent lors de la phase aiguë finale pendant l'épisode de rupture de la plaque et indépendamment de l'accumulation des cellules spumeuses. Par conséquent, l'objet de l'invention est l'u ilisation des dérivés estérifiés d'acide docosahexanoique (DHA) en tant que substances actives pour la préparation d'un médicament pour bloquer la formation des cellules spumeuses, en particulier la formation des cellules spumeuses de macrophage, en inhibant l'accumulation des vésicules de lipides.

Dans un mode de réalisation particulier, les dérivés estérifiés d'acide docosahexanoique (DHA) peuvent être employés dans la préparation d'un médicament pour prévenir ou inhiber la croissance, l'érosion, la rupture et/ou la stabilité d'une plaque athérosclérotique .

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'ester d'acide docosahexanoique est choisi dans le groupe constitué par l'ester de DHA sous sa forme Lyso Phosphatidyl Choline (lyso-PCDHA) ;

- l'ester de DHA sous sa forme Phosphatidyl Choline (PCDHA) dans lequel le DHA est estérifié en position sn-2 et présente un groupe acyle de 2 à 6 atomes de carbone en position sn-1 ; et

- les triglycérides dans lesquels le DHA est estérifié en position sn-2 et présente des groupes acyles de 2 à 6 atomes de carbone en positions sn-1 et sn-3.

De préférence, l'ester d'acide docosahexanoique utilisé dans 1 ' invention est le DHA présentant une Lyso Phosphatidyl Choline en position sn-2.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le groupe acyle est choisi dans le groupe constitué par l'acétyle, le propionyle et le butyryle. De préférence, le groupe acyle est le butyryle.

La substance active utilisée dans l'invention, l'ester d'acide docosahexanoique (DHA estérifié) , et ses dérivés tels que précédemment décrits, ou un mélange de ces composés, peut être présente dans le médicament dans une proportion comprise entre 10% et 100% en poids de la composition totale. De préférence, elle est présente dans une proportion comprise entre 10% et 70% en poids de la composition totale. Le médicament préparé selon l'invention peut être formulé sous toutes les formes galéniques connues compatibles avec son utilisation, par exemple sous une forme acceptable pour une administration per os . De préférence, le médicament est sous une forme pour une administration par voie orale. Le médicament selon l'invention peut être administré par voie orale, sublinguale, nasale, pulmonaire, rectale ou parentërale (par exemple intravasculaire , intramusculaire, transcutanée, intra-articulaire) . A cet effet, il peut être présenté sous toute forme permettant l'administration par voie orale

(en particulier sous la forme de gélules, de solutions ou émulsions buvables, de poudres, de gels, de granulés, de tablettes ou de comprimés), par voie nasale (par exemple des solutions à administrer sous forme de gouttes ou de pulvérisations) , par voie pulmonaire (solutions en flacon pressurisé pour aérosols) , par voie rectale (suppositoires) , par voie cutanée (par exemple crèmes, onguents ou dispositifs transdermiques, encore appelés timbres ou patches) , par injection (solutions injectables, poudres lyophilisées permettant de reconstituer des solutions injectables) ou par voie transmuqueuse, comme par exemple par voie sublinguale (solutions en flacon pressurisé, ou comprimés à délitement buccal) .

Ces formes pharmaceutiques sont préparées de façon usuelle et peuvent contenir des excipients et véhicules classiques appropriés. Les agents actifs, lyso-PCDHA ou ses dérivés sont administrés à des doses déterminées par des expériences de routine, en utilisant les tests connus de recherche d'une activité sur la plaque d'artériosclérose. Ainsi, à titre d'exemple, le lyso- PCDHA, ses dérivés ou un mélange de ceux-ci, constituant l'agent actif, est présent dans le médicament selon l'invention dans une proportion comprise entre 10 et 100%, de préférence entre 30 et 70%, en poids de la composition totale du médicament. Bien entendu, on peut adapter la posologie en fonction notamment du poids corporel du sujet traité ou du mode d'administration.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :

La figure 1 montre l'inhibition de l'accumulation de vésicules lipidiques dans des cellules macrophagiques et la spécificité du lysoPCDHA dans cette fonction. Les cellules, THP1, ont été incubées avec 10^"7 M de PMA pendant 24 heures pour induire le phénotype macrophage. Les cellules ont ensuite été incubées dans du milieu RPMI contenant 1% de sérum de veau fœtal en présence ou en absence d' inhibiteur

La figure 2 montre la spécificité et l'effet dose dépendant du Lyso PCDHA comparé au DHA acide gras, pour l'inhibition des vésicules de phospholipides .

La figure 3 indique la courbe dose réponse et la valeur moyenne de l'IC50 pour l'inhibition de la formation des cellules spumeuses par le lyso PCDHA. La figure 4 montre l'effet inhibiteur du lyso PCDHA sur la fixation de LDL oxydées marquées au Cy3 à la surface des cellules HEK exprimant le récepteur des oxLDL, CD36.

La figure 5 montre la spécificité du lyso PCDHA (carrés noirs) comparé au DHA acide gras (carrés blancs) pour l'inhibition de la fixation des oxLDL à la surface des cellules HEK exprimant le récepteur CD36.

La figure 6 montre l'inhibition spécifique de l'expression des gènes appartenant à la famille des metalloproteases et du gène TollR4 par le lyso PCDHA dans les cellules macrophagiques.

La figure 7 représente la caractérisation des lipoprotéines purifiées. A, B et C : spectres d'absorption entre 200 nm et 400 nm des LDL (100 microgrammes par ml) mesurées contre du PBS, des oxLDL (100 microgrammes par ml) mesurées contre du PBS/DTPA (acide diéthylènetriaminepentaacêtique) , et des oxLDL (100 microgrammes par ml) mesurées contre des LDL (100 microgrammes par ml) . D : mobilité électrophorétique sur gel d'agarose de LDL et oxLDL natives.

La figure 8 représente l'effet dose- dépendant du Lyso Phosphatidyl Choline DHA (lyso-PCDHA) sur l'inhibition des vésicules de lipides dans les cellules de macrophage, comparé a la molécule de DHA non estérifiêe purifiée (ne-DHA) .

Le tableau 1 ci-dessous indique les valeurs comparées des IC50 pour l'inhibition de la fixation des oxLDL au CD36 pour le lysoPCDHA, le DHA acide gras, l'acide arachidonique, le lyso PC oleate, l'EPA acide gras et le lysoPC acide gras.

Tableau 1

Exemple 1 : Préparation du lyso- phosphatidyl-choline DHA (LPCDHA) .

Les phosphatidylcholines DHA (PCDHAs) contenant le DHA en position sn2 peuvent être isolés à partir d'huile de poisson ou à partir d'une biomasse obtenue d'une culture de crypthecodinium conhii par un procédé décrit dans les brevets EP 0 298 787 et US 5,654,290. Les PCDHAs peuvent être obtenus par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) selon le protocole décrit par Christie et col. (J.Lipid Res. 1985, 26, 507-512 ) . Les PCDHAs obtenus par ce procédé peuvent contenir jusqu'à 66% de DHA. Dans un deuxième temps, la chaîne acyle en position snl des PCDHAs est hydrolysée par une lipase ayant une activité phospholipase A : subi. La forme acyl-DHAsn2- glycerophosphorylcholine (Lyso PCDHA) peut être purifiée sur gel de silice 60G tel que décrit par Polette et col. ( Lipids, 1999, 34, 1333-1337 ) ou par chromatographie .

Les PCDHAs peuvent également être obtenus par semi-synthèse à partir de glycerophosphorylcholine et de glycérophosphate contenant des résidus acétiques, propioniques, butyrique, caproïque ou DHA tel que décrit dans le brevet US 5,654, 290.

Exemple 2 : Formation des cellules spumeuses et inhibition de l'accumulation des vésicules lipidiques (figures 1 et 2) .

La différenciation des macrophages et la formation de cellules spumeuses peuvent être obtenues de la manière suivante : les cellules qui peuvent être des cellules THP1 à titre d'exemple, sont ensemencées dans un milieu contenant 1% de RPMI 1640 et 5 % de sérum de veau fœtal. Leur différenciation en macrophage est obtenue en présence de 10^"7 M de phorbol 12- myristate-13-acétate (PMA) pendant une période pouvant durée 24 heures à 37 °C en présence de C02. Les cellules sont ensuite lavées à l'aide du milieu RPMI pour retirer le PMA. Les cellules différenciées sont ensuite incubées en présence d'un milieu de culture RPMI contenant 1% de sérum de veau fœtal en présence de l'inhibiteur, lysoPCDHA ou autre compétiteur, à différentes concentrations pendant 6 heures.

Les cellules sont ensuite fixées dans de la paraformaldéhyde 2% pendant 15 minutes à température ambiante, et colorées à l'aide d'une solution Oil Red Opour visualiser les lipides intracellulaires. La quantité de vésicules formées est ensuite déterminée par la mesure de la fluorescence intracellulaire en utilisant un microscope à fluorescence couplé à une caméra CCD. La viabilité des cellules pendant l'essai peut être mesurée à l'aide du Trypan bleu.

Les valeurs illustrées dans la figure 2 démontrent l'effet inhibiteur spécifique du LysoPCDHA comparé à l'acide gras DHA sous sa forme purifiée. La courbe effet-dose illustrée dans la figure 3 a été obtenue en utilisant des concentrations de lysoPCDHA allant de 10^"7 M à 10^"4 M.

Exemple 3 : Inhibition de la fixation des oxLDL au CD36 (figures 4 et 5) .

Les méthodes qui permettent d'exprimer le récepteur des oxLDL à la surface de cellules, et de mesurer la fixation des LDL oxydées à la membrane de ces cellules ont été décrites dans le brevet WO 01/94952 A2. Ces méthodes peuvent être résumées de la manière suivante : Des cellules fibroblastiques de type HEK, transfectées par un plasmide contenant la séquence codante du CD36, comprenant le domaine cytoplasmique de ce récepteur, sont ensemencées pendant 72 heures dans des plaques 96 puits contenant de la lysine et du milieu MEM contenant 10% de sérum de veau fœtal.

Les LDL humaines sont isolées à partir de plasma frais à l'aide d'une méthode en deux étapes impliquant des ultracentrifugations sur gradient de KBr (Léger et col Free Rad Res . 2002, 36, 127-142 ). Les LDL sont dialysées pendant 24 heurs contre un tampon à pH 7,4 contenant NaCL 150mM, Phosphate de sodium 10 mM, DTPA 10 μM. Les LDL peuvent être oxydées en présence de cuivre en incubant dans des conditions stériles, 0,2 mg/ml de LDL avec 5 μM de CuS04 pendant 16 heures à 37°C. L'oxydation peut être stoppée par l'addition de BHT à 40μM final et du DTPA à 100 μM final. Les LDL oxydées sont ensuite dialysées contre 150 mM NaCl et du Phosphate de sodium à 10 mM, pH 7,4 pendant 24 heures.

Les LDL et les oxLDL sont ensuite caractérisées en mesurant leur taux de ApoB, protéine totale, cholestérol total, et leur teneur en vitamine E, l'apparition de diènes conjugués, et leur composition en oxysterol et en acides gras.

Les oxLDL sont marquées par l'ester de succinidyl Cyanine 3 (Amersham Pharmacia Biotech) tel que décrit par Stanton et col (JBC, 1992, 267, 22446- 22451) . Après une dialyse exhaustive, le rendement du marquage peut être évalué par la mesure de l'absorbance à 548 nm.

Exemple 4 : Mesure de l'expression différentielle des gènes (figure 6) . Les cellules pré-incubées avec ou sans inhibiteur, sont utilisées pour extraire les ARN totaux à l'aide de kit d'extraction tel que le kit Quiagen, RNeasy Mini Kit selon les recommandations du fournisseur. La qualité des ARN totaux peut être estimée à l'aide du bioanalyser Agilent 2100. Les ARN totaux sont ensuite amplifiés sous forme d'ARNa selon la méthode suivante :

Synthèse d'ADNcomplementaire : les ARNtotaux sont dissous dans un mix contenant lμl de dNTP lOmM et lμl de primer T7-dT 24 à 20mM dans un volume final de lOμl ; incubés pendant Sminutes à 65°C et refroidis dans de la glace. On ajoute ensuite, 4 μl d'un mélange contenant 2μl de 0,1 M DTT et Iμl d'inhibiteur de RNase recombinante RNaseOUT (40 U/μl) . Le mélange est incubé à 42 °C pendant 2 minutes et on ajoute 200 U de Superscript II RNase H RT (In Vitrogen) . La réaction est poursuivie 1 heure à 42 °C. On ajoute ensuite 30 μL d'un mélange contenant 10 mM de dNTP (3 μl) , 4 μl de DNA polymerase I (10 U/μl) , 1 μl de DNA ligase (100 U / μl) , 1 μl de RNase H (2 U/μl) . 91 μl d'eau sont ajoutés au mélange. La réaction est poursuivie pendant 2 heures à 16 °C. Elle est suivie par une incubation de 10 min à 16°C en présence de T4 DNA polymerase (5 U/ml) . La réaction est stoppée par l'addition de 10 μl d'E DTA à 0,5 M. Les ADNc sont ensuite extraits du mélange par des techniques conventionnelles .

Amplification à l'aide de la RNA polymerase T7 : pour amplifier les ADNc on peut utiliser le kit MEGAscript TM T7 de A bion et suivre les indications du fournisseur. Les ARNa obtenus peuvent être récupérés à l'aide du kit Quiagen RNeasy, leur concentration est mesurée et la qualité de l'amplification peut être évaluée à l'aide du bioanalyseur de chez Agilent. Un second tour d'amplification peut éventuellement être réalisé.

- Expression différentielle : L'expression différentielle des gènes peut être évaluée de différentes manières en utilisant plusieurs technologies comme la RT-PCR, le Differential Display, ou la méthode SAGE. Dans la présente invention la technologie des puces à ADN a été préférée. Des réseaux contenant 24 000 sondes différentes (Agilent) ont été utilisés pour mesurer l'expression différentielle. Pour cette analyse, le marquage des cibles au Cy3 et Cy5, l'hybridation des cibles aux réseaux d'ADN, et la mesure des rapports d'expression Cy3/ Cy5 ont été réalisés selon les indications du fournisseur Agilent, après détection au scanner Agilent G2565AA les rapports d'intensité sont analysés.

Exemple 5 : Inhibition de la formation de vésicules de lipides évaluée par la densité de fluorescence du Lyso Phosphatidyl Choline DHA marqué.

Les cellules spumeuses étaient des cellules THP1 stimulées par du PMA en présence de LDL oxydées. 1) Culture de cellules. Une série de cellules primaires ou de lignées cellulaires établies peut être employée pour surveiller l'effet du Phosphatidyl Choline DHA ou du Lyso Phosphatidyl Choline DHA sur le phenotype athérogène. Cellules qui sont capables d'incorporer des lipoprotéines, des lipoprotéines modifiées incluant les lipoprotéines oxydées ou acétylées, des triglycérines, des chilomicrons et qui sont capables de former des vésicules qui sont caractéristiques des cellules spumeuses associées à la plaque athérosclérotique . Ceci inclut, mais ne se limite pas à, U937, KG1, THP1, HUVEC, et les cellules de muscle lisse.

Dans l'exemple présent, les cellules THP1 ont été employées pour mettre en œuvre un système cellulaire pouvant reproduire la formation d'une cellule spumeuse dans la plaque.

La lignée des cellules THP-1 de la Collection Européenne de Cultures Cellulaires (ECACC, Wilshire, UK) a été choisie pour produire un modèle cellulaire qui imite la différentiation et la croissance d'une cellule spumeuse. De manière connue, les cellules (5.10⁵ cellules/ml) ont été maintenues et mises en culture dans du RPMI-1640, 10% de FBS, 100 unités/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine, 200 mM de L-Glutamine (Biowhittaker, Verviers, Belgique) à 37°C, dans un incubateur à 5% de C02. Le milieu a été remplacé tous les 2 à 3 jours.

2) Isolement et modification des lipoprotéines . Des LDL humaines ont été isolées à partir de plasma frais en utilisant une ultracentrifugation sur gradient de KBr en deux étapes (Léger et al., Free Rad. Res., 2002, 36, 127-142) ; des LDL ont été dialysées contre du NaCl 150 mM, du phosphate de sodium 10 mM, du DTPA 10 μM (pH 7,4) pendant 24 heures. Des LDL oxydées par le cuivre ont été préparés dans des conditions stériles en incubant 0,2 mg/ml de LDL avec 5μM de CuS0₄ pendant 16 heures à 37 °C. À la fin de cette incubation, l'oxydation a été arrêtée par addition de BHT (concentration finale de 40 μM) et de DTPA (concentration finale de 100 μM) . Des OxLDL ont été intensivement dialysées contre du NaCl 150 mM et du phosphate de sodium 10 mM (pH 7,4) pendant 24 heures. Toutes les préparations ont été filtrées à l'aide de filtres de 0,4 μm.

Les LDL et oxLDL ont été intensivement caractérisées en mesurant leur concentration en ApoB, en protéine totale, en cholestérol total et en vitamine E, en mesurant l'apparition de diènes conjugués (DO à 234 nm) et par la détermination de leur composition en acides gras (voir tableau 2) . Enfin, les lipoprotéines ont été également caractérisées par leur mobilité électrophorétique. Le marquage des OxLDL avec l'ester de succinimidyl Cyanine 3 (Amersham Pharmacia Biotech) a été réalisé comme décrit dans Stanton et al., JBC, 11992, 267, 22446-22451. À la fin du procédé de marquage, le Cy3-OxLDL a été intensivement dialysée et l'efficacité du marquage a été évaluée en mesurant 1 ' absorbance à 548 nm. 3) Inhibition du recaptage des lipoprotéines .

Pour induire la différent iat ion en macrophages, 1,5.10⁵ cellules/puits ont été ensemencées dans des plaques 96 puits dans un milieu de culture additionné de 10^"7M de phorbol 12 -myristate- 13 -acétate (PMA ; Sigma) pendant 24 heures à 37°C, à 5% de C0₂. Après une heure de culture dans du RPMI 1640, 1% de FBS, les cellules ont été incubées pendant 2 heures avec 1 ' oxLDL (1 μg/ml) marquée par cy3 en présence ou en l'absence de DHA sous sa forme de lyso-PCDHA ou sous sa forme non estérifiée. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et les noyaux ont été colorés avec 20 μg/ml de Hoechst 33342 pendant 10 minutes à température ambiante. Après deux lavages avec du PBS, les images du recaptage du Cy-3 oxLDL ont été obtenues à l'aide d'un microscope à fluorescence couplé à une caméra CCD. Chaque image a été analysée et quantifiée en utilisant le logiciel QFluoro (Leica) . 4) Préparation et purification du Lyso

Phosphatidyl Choline DHA (lyso-PCDHA) .

Tout d'abord, le DHA contenant de la Phosphatidyl Choline en position sn-2 peut être purifié à partir d'un extrait d'huile de poisson ou d'un extrait alcoolique de biomasse de Crypthecodini um conhii (dinoflagellé hétérotrophe) , selon le procédé décrit dans les brevets EP 0 298 787 et US 5,654,290. Le DHA contenant de la Phosphatidyl Choline est isolé des lipides polaires par chromatographie liquide sous haute pression (HPLC) selon le procédé décrit par Christie (Christie W.W., 1985, J. Lipid. Res . , 26, 507- 512) .

Les chaînes acyles en position sn-1 du DHA contenant de la Phosphatidyl Choline sont hydrolysées par n'importe quelle lipase ayant une activité phospholipase A : sub.l. Le Lyso-PCDHA obtenu peut être purifié par chromatographie sur gel de silice 60G selon

Polette (Polette A. et al., 1999, Lipids, 34, 1333- 1337) . La pureté de la 1-lyso, 2-DHA-glycéro- phosphocholine (lyso-PCDHA) peut être vérifiée par HPLC et était de manière régulière au-dessus de 99% , avec plus de 94% de lyso-PCDHA, estérifié en position sn-2.

Le tableau 2 ci-après rapporte la caractérisation des lipoprotéines.

Tableau 2

Claims

REVENDICATIONS

1) Utilisation d'un ester d'acide docosahexanoique (DHA) pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie dans laquelle les metalloproteases de la matrice et/ou le récepteur TolR4 et/ou le CD36 sont impliquées .

2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'ester d'acide docosahexanoique est choisi dans le groupe constitué par : l'ester de DHA sous sa forme Lyso Phosphatidyl Choline (lyso-PCDHA) ; - l'ester de DHA sous sa forme Phosphatidyl

Choline (PCDHA) dans lequel le DHA est estérifié en position sn-2 et présente un groupe acyle de 2 à 6 atomes de carbone en position sn-1 ; et

- les triglycérides dans lesquels le DHA est estérifié en position sn-2 et présente des groupes acyles de 2 à 6 atomes de carbone en positions sn-1 et sn-3.

3) Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'ester d'acide docosahexanoique est le lyso-PCDHA ou de l'un de ses dérivés.

4) Utilisation de lyso-PCDHA ou de l'un de ses dérivés selon l'une des revendications 1 à 3 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie résultant d'une activité enzymatique excessive des metalloproteases de matrice. 5) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite maladie est choisie dans le groupe comprenant les maladies cardiovasculaires, la polyarthrite rhumatoïde, l'ostéoart rite, le cancer de la prostate, l'ulcère de la cornée et les ulcères gastriques, l'artériosclérose, les stéatoses hépatiques non alcooliques, l'insuffisance cardiaque, les dermatites et l'infection du derme, les brûlures et les transplantations d'organes.

6) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie cardiovasculaire, dans laquelle ledit médicament inhibe ou régule négativement les metalloproteases de la matrice.

7) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit médicament bloque en outre l'expression de TolR4 et/ou la fixation des oxLDL au CD36.

8) Utilisation d'un ester d'acide docosahexanoique (DHA) tel que défini dans l'une des revendications précédentes en tant que principe actif pour la préparation d'un médicament pour bloquer la formation de cellules spumeuses.

9) Utilisation selon la revendication 8, dans la préparation d'un médicament pour bloquer la formation de cellules spumeuses de macrophage. 10) Utilisation selon l'une des revendications 8 ou 9, dans la préparation d'un médicament pour inhiber l'accumulation de vésicules lipidiques dans le macrophage.

11) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans la préparation d'un médicament pour prévenir ou inhiber la croissance, l'érosion, la rupture et/ou la stabilité d'une plaque athérosclérotique.

12) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie cardiovasculaire associée à l'accumulation des cellules spumeuses au niveau des sites vasculaires impliqués dans le développement de la plaque d'artériosclérose, sites au niveau desquels ledit médicament inhibe les metalloproteases de la matrice.

13) Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit médicament bloque en outre au niveau desdits sites l'expression de TollR4 et/ou la fixation des oxLDL au CD36.

14) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce que ladite maladie est l'artériosclérose ou l'hypercholestérolémie.

15) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 à 14, caractérisé en ce que le dérivé de lyso-PCDHA est choisi parmi les lyso-PCDHA dont le DHA est substitué en position sn-1 par un groupe chimique ou une substance avantageusement capable d'augmenter l'activité du lyso-PCDHA.

16) Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit groupe chimique est un groupe acyle de 2 à 6 atomes de carbone, comme par exemple un groupe acétyle, propionyle ou butyle.

17) Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite substance est une autre molécule de DHA.

18) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'ester d'acide docosahexanoique, ses dérivés, ou un mélange de ces composés, est présent dans le médicament dans une proportion comprise entre 10% et 100% en poids de la composition totale.

19) Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que l'ester d'acide docosahexanoique, et ses dérivés, ou un mélange de ces composés, est présent dans le médicament dans une proportion de préférence comprise entre 10% et 70% en poids de la composition totale.

20) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est formulé pour une administration orale.