WO2023145785A1 - 血栓予防剤 - Google Patents

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6dpa
microalgae
present
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fatty acid
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昭一 池水
友美 大宅
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ＳｏＰｒｏｓ株式会社
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    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Definitions

  • the present invention relates to agents, foods, feeds, or pharmaceuticals used to prevent thrombosis. More specifically, it relates to an agent, food, feed, or pharmaceutical that contains n-6DPA, is orally administered, and has an excellent antithrombotic effect.
  • (n-3) type PUFAs (many Unsaturated fatty acids) are now commonly applied to health foods, supplements, and infant milk based on their brain function-improving action and triglyceride level-improving action.
  • Sources of PUFAs other than fish oil, harp seal and sunfish subcutaneous fat include the microalgae Thraustochytrids.
  • Thraustochytrids are heterotrophic algae that do not have chlorophyll belonging to Labyrinthulids and can be cultivated on a large scale in a fermenter.
  • Schizochytrium sp. ATCC20888 strain and its derivatives (Patent Documents 1 and 2), Aurantiochytrium limacinum SR21 strain and the like (Patent Documents 3 to 6, Non-Patent Document 1), Thraustochytrium sp.
  • Patent Document 7 Thraustochytrium microorganisms (Patent Documents 8 and 9), and the like have been proposed.
  • Thraustochytrium microorganisms Patent Documents 8 and 9
  • spirulina which are autotrophic algae that perform photosynthesis, are more common, and have been used as raw materials for many functional foods based on their high nutritional value.
  • n-6DPA n-6 docosapentaenoic acid
  • n-6DPA n-6 docosapentaenoic acid
  • Non-Patent Document 4 Non-Patent Document 4
  • Thraustochytrids Although it contains n-6DPA, it has not been industrially used.
  • Non-Patent Document 6 the antithrombotic action of n-6DPA, promotion of vascular endothelial cell migration in vitro (10 times that of EPA, Non-Patent Document 5), suppression of thrombus-related protein aggregation (10 times that of n-3DPA), and intravenous The effect of administration (Non-Patent Document 6) has been presented, and it is expected to be useful in cerebral infarction and myocardial infarction due to arteriosclerosis, pulmonary thromboembolism, which is a cause of aggravation of COVID-19, and metabolic syndrome. .
  • Japanese Patent No. 3127161 Japanese Patent No. 3669372 Japanese Patent No. 2764572 Japanese Patent No. 3985035 Japanese Patent No. 6655469 JP 2020-054391 A Japanese Patent No. 4280158 Japanese Patent No. 5762393 JP 2018-108096 A
  • An object of the present invention is to provide an agent, a food composition, a feed composition, and a pharmaceutical composition that contain n-6DPA and are orally administered to prevent thrombosis and have an excellent antithrombotic effect. .
  • the present invention employs the following configurations. That is, the first aspect of the present invention is "n-6DPA-containing microalgae, a fatty acid composition obtained from the microalgae and containing n-6DPA, or any one of n-6DPA, n- An antithrombotic agent, which is orally administered in an effective amount such that the amount equivalent to 6 DPA is 9 mg/kg ⁇ day or less.”
  • the second aspect of the present invention is the prevention of thrombosis according to the first aspect, wherein 7% or more of n-6DPA is contained in the total amount of the fatty acid composition contained in or obtained from the microalgae. is an agent.
  • the third aspect of the present invention is a thromboprophylaxis agent, wherein the effective amount in the first or second aspect is an amount equivalent to n-6DPA of 0.03 mg/kg ⁇ day or more. be.
  • the fourth aspect of the present invention is the antithrombotic agent according to any one of the first to third aspects, wherein the microalgae is Thraustochytrid.
  • the fifth aspect of the present invention is a food composition or feed composition for preventing thrombosis, containing the antithrombotic agent according to any one of the first to third aspects of the invention.
  • the sixth aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing thrombosis, containing the antithrombotic agent according to any one of the first to third aspects of the invention.
  • an agent, food composition, feed composition, or pharmaceutical composition that contains n-6DPA is orally administered to prevent thrombosis, and has a high antithrombotic effect.
  • 4 is a graph showing results of reference examples of the present invention. 4 is a graph showing results of reference examples of the present invention. It is a graph which shows the result of the Example of this invention.
  • microalgae contained in the agent of the present invention are described.
  • the microalgae contained in the agent of the present invention are algal bodies of microalgae that can be used as food. "Usable as food” refers to those that have been eaten or have been shown to have no problems in safety tests in animals and humans.
  • Microalgae is a general term for algae that require a microscope to identify individuals, and in a taxonomic sense, prokaryotic cyanobacteria belonging to bacteria in a broad sense, green algae closely related to higher plants, and flagella classified in the phylum Protozoa. Wide range of algae.
  • microalgae examples include Chlorella (green algae), Spirulina (cyanobacteria), Euglena (Japanese name: Euglena, protozoan/green algae), Dunaliella (green algae) , Nannochloropsis (true eyedrop algae), Labyrinthula Thraustochytrids (Labyrinthula is defined as a type of microalgae in this specification), etc., preferably originally containing PUFAs Spirulina, Euglena, Nannochloropsis, Labyrinthula Thraustochytrid, or Chlorella capable of containing PUFAs in algal cells by fatty acid addition culture, more preferably Nannochloropsis and Thraustochyt, which contain a large amount of PUFAs Lids, more preferably Labyrinthulid Thraustochytrids, which can be cultured in tanks in a closed system
  • the fatty acid composition contained in the agent of the present invention may be obtained from any microalga containing n-6DPA, regardless of whether it can be used as food. is preferred.
  • n-6DPA contained in the agent of the present invention may be obtained from any organism or synthesized, but is preferably obtained from microalgae from the viewpoint of production efficiency.
  • the Labyrinthulids are taxonomically classified into the Chromista kingdom, Anthrochaeta, Labyrinthula steel, and Labyrinthulaceae. They are further divided into Labyrinthulids belonging to the family Labyrinthulaceae and Thraustochytrids belonging to the family Thraustochytrids. Thraustochytrids have many examples of application from the viewpoint of cell proliferation and PUFAs production. and Botryochytrium, but are not particularly limited in the present invention.
  • Alga bodies of microalgae can be commercially available products, OEM products, or self-made products. Commercially available products include dried algal bodies of chlorella, spirulina and euglena, and dried algal bodies of Schizochytrium and Aurantiochytrium. In the case of OEM production or in-house production, although not particularly limited, alga bodies obtained by culturing under optimized conditions using a food-grade culture medium can be used.
  • any of known medium base materials containing natural or artificial seawater, carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and the like can be used as the solid medium and liquid medium used in culturing microalgae.
  • carbon sources include, but are not limited to, carbohydrates such as glucose, fructose and galactose, oils and fats such as oleic acid and soybean oil, glycerol, acetic acid and sodium acetate.
  • Carbon sources can be used, for example, at concentrations of 20-300 g per liter of medium. According to a particularly preferred embodiment, the culture can be continued by feeding the carbon source after the initial carbon source has been consumed. By culturing under such conditions, it is possible to increase the amount of carbon source to be consumed, and to increase the production of the fatty acid composition obtained from the microalgae.
  • the nitrogen source organic nitrogen such as yeast extract, corn steep liquor, peptone, polypeptone, sodium glutamate, urea, etc., or inorganic nitrogen such as ammonium acetate, ammonium sulfate, ammonium chloride, sodium nitrate, ammonium nitrate, ammonia can be used.
  • organic nitrogen such as yeast extract, corn steep liquor, peptone, polypeptone, sodium glutamate, urea, etc.
  • inorganic nitrogen such as ammonium acetate, ammonium sulfate, ammonium chloride, sodium nitrate, ammonium
  • the medium containing each of the above medium bases is preferably used after being adjusted to pH 4.0 to 9.5 with an appropriate acid or base and then sterilized by autoclaving.
  • the pH during culture is generally 3.5 to 10.0, preferably pH 4.0 to 9.5.
  • Liquid culture can be performed for 2-10 days under aeration and agitation.
  • the culture temperature is generally 10-45°C, preferably 15-35°C.
  • the scale of liquid culture is not particularly limited, commercially available closed system culture equipment can be used. Alga bodies can be collected from the obtained culture solution by a known conventional method such as centrifugation or filtration.
  • Alga bodies obtained by culturing can be dried by a non-limiting method including freeze-drying, air-drying, spray-drying, tunnel-drying, vacuum-drying (lyophilization), or similar processes.
  • the wet algal cells or the bacterial cells washed with water or the like after the wet algal cells have been recovered may be used directly without a drying step.
  • the freeze-drying process kills the algae, thus reducing the risk of bacterial growth during long-term storage.
  • the method for pulverizing the dried algae is not particularly limited, and devices such as batch-type or continuous-type blenders, mixers, mills, kneaders, pulverizers, pulverizers, grinders and the like can be mentioned.
  • the content of n-6DPA in total fatty acids in dry algal bodies is generally adjusted to 1% by weight or more, preferably 6% by weight or more, more preferably 6% by weight or more, depending on the microalgae species and their culture conditions. is 7% by weight or more.
  • Excessive doses of n-6DPA tend to inhibit thromboprophylaxis, while microalgae and fatty acid compositions obtained therefrom in particular contain a variety of PUFAs other than n-6DPA, which are used for purposes other than thromboprophylaxis. It can have various useful functions. Therefore, the upper limit of the n-6DPA content in the total fatty acids in the dry algal body is not particularly limited, but may be 30% by weight or less, preferably 25% by weight or less.
  • a fatty acid composition containing n-6DPA can be prepared from the algal body by a known method. That is, the wet or dry algal body after cultivation is physically crushed by a mill, ultrasonic waves, etc., or chemically dissolved with a solvent, and then extracted with a solvent such as chloroform, hexane, methanol, ethanol, etc. to contain PUFAs.
  • a fatty acid composition can be obtained. Additionally, the resulting fatty acid composition may be chemically or physically modified or processed according to the composition's requirements by any known technique.
  • n-6DPA can be prepared by known methods, for example, from the above fatty acid compositions or other fatty acid compositions containing n-6DPA. That is, it can be separated and purified from a mixed fatty acid or fatty acid ester by, for example, a urea addition method, a cooling separation method, a column chromatography method, or the like. Alternatively, it may be separated and purified by other methods in the art.
  • the fatty acid composition extracted from microalgae and n-6DPA are mixed with sugars, emulsifiers, milk proteins, antioxidants, etc. according to a conventional method to prepare an emulsion, and then subjected to a spray heat drying method, It may be processed into a powdered fat by methods including, but not limited to, a spray cooling method, a pulverization freeze-drying method, a pulverization cooling solidification method, a coating microcapsule method, a coating spray mixing method, or similar processes. .
  • the amount of n-6DPA equivalent per day (/kg of body weight) in oral administration of the agent of the present invention is 9 mg or less, preferably 7 mg or less, preferably 6 mg or less, because the antithrombotic effect rather decreases when excessive. It is preferably 5 mg or less, preferably 4 mg or less, preferably 3 mg or less.
  • the lower limit of the amount equivalent to n-6DPA per day (/kg of body weight) may be appropriately selected in consideration of the required antithrombotic effect and cost, and is not particularly limited. It is preferably 0.10 mg or more, preferably 0.15 mg or more, preferably 1.00 mg or more.
  • the food composition of the present invention contains the agent of the present invention and is used to prevent thrombosis. Specifically, it may be functional foods (including foods with function claims and foods for specified health uses, including food additives) and dietary supplements. Its form may be solid, semi-liquid or liquid.
  • Foods include foods containing oils and fats, such as natural foods (meat, fish, nuts, etc.), foods to which oils and fats are added during cooking (Chinese cuisine, ramen, soup, etc.), and foods using oils and fats as heat carriers (tempura, fried foods, etc.). , deep-fried tofu, fried rice, donuts, karin sugar, etc.), oily foods or processed foods with oil added during processing (butter, margarine, mayonnaise, dressing, chocolate, instant noodles, caramel, biscuits, cookies, cakes, ice cream, etc.), processing Examples include foods (okaki, hard biscuits, red bean buns, etc.) sprayed or coated with oil when finished.
  • oils and fats such as natural foods (meat, fish, nuts, etc.), foods to which oils and fats are added during cooking (Chinese cuisine, ramen, soup, etc.), and foods using oils and fats as heat carriers (tempura, fried foods, etc.). , deep-fried tofu, fried rice
  • fats and oils for example, agricultural foods (bread, noodles, rice, confectionery, tofu and processed products thereof, etc.), fermented foods (refined sake, medicinal sake, mirin, vinegar, soy sauce, miso, etc.) , livestock foods (yogurt, ham, bacon, sausages, etc.), marine products (kamaboko, fried tempura, hanpen, etc.), beverages (fruit juice drinks, soft drinks, sports drinks, alcoholic beverages, tea, etc.), but are particularly limited not.
  • agricultural foods bread, noodles, rice, confectionery, tofu and processed products thereof, etc.
  • fermented foods refined sake, medicinal sake, mirin, vinegar, soy sauce, miso, etc.
  • livestock foods yogurt, ham, bacon, sausages, etc.
  • marine products kamaboko, fried tempura, hanpen, etc.
  • beverages fruit juice drinks, soft drinks, sports drinks, alcoholic beverages, tea, etc.
  • Functional foods and dietary supplements include powders, granules, tablets, capsules, lozenges, internal liquids, suspensions, emulsions, syrups, drinks, natural liquid diets, semi-digested nutritional foods, and component nutrition. It can be produced as food and drink in the form of food, enteral nutrition, and the like. In that case, other nutritional ingredients or functional ingredients may be blended with the fats and oils of the present invention.
  • compositions for example, proteins, sugars, fats, trace elements, vitamins, emulsifiers, flavorings, etc., natural liquid diets, semi-digested nutritional foods, and elemental nutrition in which the alga body or fatty acid composition of the present invention is blended
  • Processed forms such as foods, drinks, and enteral nutrients can be mentioned, but the above-mentioned food and drink forms are also acceptable.
  • the feed composition of the present invention contains the agent of the present invention and is used to prevent thrombosis. Specifically, it may be animal feed, egg-laying poultry feed, microfeed organism feed. It can be expected to maintain the health of animals by preventing thrombosis, ie, the effect of promoting blood flow, or to maintain the health of humans through chicken eggs, fish, shellfish, and crustaceans.
  • Animal feeds include, but are not limited to, pet feeds, including pet feeds, livestock feeds, aquaculture feeds, zoo animal feeds, working animal feeds, or combinations thereof.
  • the extraction residue after the oil containing n-6DPA is extracted from the algal body can also be used for animal feed and the food composition. This extraction residue is preferable because it contains proteins, ash, carbohydrates, etc. in addition to the fatty acid composition.
  • Egg-laying poultry feed can be used for the production of eggs as feed for egg-laying poultry, especially chickens, and the production of n-6DPA-containing egg yolk oil. Further, egg yolk oil enriched with n-6DPA can be obtained by extracting oil from such poultry eggs, especially egg yolk, according to a conventional method. This egg yolk oil can be contained in the agent of the present invention or used as a raw material thereof.
  • the feed for micro-bait organisms can be used to culture micro-bait organisms such as rotifers and Artemia, which are essential for the cultivation of fish and shellfish and crustaceans. Feeding alga bodies or culture medium containing the fatty acid composition of the present invention to microfood organisms yields microfood organisms containing n-6DPA.
  • the microprey organisms described above can be contained in the agent of the present invention or can be a raw material thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the agent of the present invention and is used for the prevention of thrombosis through oral administration. Health maintenance can be expected due to n-6DPA's antithrombotic action, that is, the effect of promoting blood flow.
  • the pharmaceutical composition can be formulated for oral administration by a known formulation technique, and may be in any form such as solid, liquid, or semi-solid.
  • the n-6DPA or mixtures thereof in the pharmaceutical composition whether in free form or in pharmaceutically acceptable salts such as sodium, potassium, lithium or other alkali metal salts, zinc salts, Other metal salt forms such as calcium salts and magnesium salts, and various forms such as monoglycerides, diglycerides, triglycerides, esters of lower alcohols, phospholipids, glycolipids and amides may also be used.
  • lower alcohol refers to a monohydric alcohol having 6 or less carbon atoms, and examples thereof include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, pentanol, and hexanol.
  • the present invention encompasses a method for treating a subject that is likely to form a thrombus, which comprises the step of orally administering the agent of the present invention to a living body (human, non-human mammal, etc.). According to the treatment method of the present invention, the possibility of thrombus formation in the administration subject can be reduced.
  • the oral dose can be appropriately adjusted according to the condition of the subject (age, body weight, symptoms, etc.). Adjust so that the daily n-6DPA equivalent (/kg of body weight) is 9 mg or less.
  • n-6DPA all-cis-4,7,10,13,16-doc
  • the rat was anesthetized, and a green light probe and a pen-type blood flow meter were placed around the bifurcation of the inguinal artery of the right femoral artery.
  • the average time for vascular occlusion to last for 1 minute (vascular occlusion time) is shown in FIGS.
  • n-6DPA present in the blood has a very high antithrombotic effect at a concentration of 1/100 that of n-3DPA and EPA.
  • an excessive concentration of n-6DPA in the blood tends to inhibit thromboprophylaxis. This trend is not true for n-3DPA and EPA and is unique and unexpected for n-6DPA.
  • the SPA-214 strain produced by mutagenesis was cultured for 4 days in a liquid medium (glycerol 4%, yeast extract 4%, artificial seawater 0.9%) using a 90L culture apparatus.
  • About 3 kg of the wet algal body obtained by centrifuging the culture solution was vacuum freeze-dried to prepare about 700 g of dry algal body.
  • n-6DPA Dried algal body

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Abstract

本発明の課題は、ｎ－６ＤＰＡを含有しかつ経口投与されて血栓予防に用いられ、かつ血栓予防効果に優れる剤、食品組成物、餌飼料組成物、及び医薬品組成物を提供することである。　本発明に係る血栓予防剤は、ｎ－６ＤＰＡを含有する微細藻、当該微細藻から得られかつｎ－６ＤＰＡを含有する脂肪酸組成物、又はｎ－６ＤＰＡの何れか一つからなり、ｎ－６ＤＰＡ相当量が９ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙ以下になる有効量で経口投与されることを特徴とする。

Description

血栓予防剤
　本発明は、血栓予防の為に用いられる剤、食品や餌飼料又は医薬品に関する。より詳細には、ｎ－６ＤＰＡを含有し、経口投与されかつ血栓予防効果に優れる剤、食品、餌飼料、又は医薬品に関する。
　近年、魚油由来のＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）やＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、タテゴトアザラシやマンボウの皮下脂肪由来のｎ－３ＤＰＡ（ｎ－３ドコサペンタエン酸）などの（ｎ－３）系のＰＵＦＡｓ（多価不飽和脂肪酸）に於いて、脳機能改善作用や中性脂肪値改善作用を元にした健康食品やサプリメント、乳児用ミルクへの適用が一般的になってきている。
　魚油、タテゴトアザラシやマンボウの皮下脂肪以外のＰＵＦＡｓの供給源として、微細藻類であるスラウストキトリッドが挙げられる。スラウストキトリッドはラビリンチュラ類に属する葉緑素を持たない従属栄養性藻類で発酵槽による大規模培養が可能であることから、安定供給性及び安全性、ＳＤＧｓ（持続可能な開発目標）の観点で注目されており、ＰＵＦＡｓの供給源としてシゾキトリウム　エスピー（Schizochytrium sp.）ＡＴＣＣ２０８８８株とその派生株（特許文献１及び２）、オーランチオキトリウム　リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）ＳＲ２１株など（特許文献３～６、非特許文献１）、スラウストキトリウム エスピー（Thraustochytrium sp.）ＬＦＦ１株（特許文献７）、ヤブレツボカビ微生物（特許文献８及び９）などが提案されている。なお、微細藻類の中では光合成を行う独立栄養性藻類であるクロレラ、ユーグレナ、スピルリナがより一般的で、藻体の栄養価の高さを元に従来から多くの機能性食品の原料として用いられている（非特許文献２及び３）。
　（ｎ－６）系ＰＵＦＡｓであるｎ－６ＤＰＡ（ｎ－６ドコサペンタエン酸）に関しては、抗炎症（非特許文献４）や血栓予防作用が示唆されているが、多くのスラウストキトリッドがｎ－６ＤＰＡを含有するにも関わらず、産業利用に至っていない。特に、ｎ－６ＤＰＡの血栓予防作用については、試験管内の血管内皮細胞遊走性促進（ＥＰＡの１０倍、非特許文献５）、血栓関連蛋白質凝集抑制（ｎ－３ＤＰＡの１０倍）及びマウス静脈内投与による効果（非特許文献６）が提示されており、動脈硬化による脳梗塞や心筋梗塞、ＣＯＶＩＤ－１９の重症化要因である肺血栓塞栓症、メタボリックシンドロームなどに於ける有用性が期待される。
特許第３１２７１６１号公報 特許第３６６９３７２号公報 特許第２７６４５７２号公報 特許第３９８５０３５号公報 特許第６６５５４６９号公報 特開２０２０－０５４３９１号公報 特許第４２８０１５８号公報 特許第５７６２３９３号公報 特開２０１８－１０８０９６号公報
生物工学会誌、日本生物工学会、2015、93巻、7号、p.426-429 食品と開発、インフォーマ　マーケッツ　ジャパン（株）、2019、54巻、11月号、p.4-7 生物工学誌、日本生物工学会、2013、91巻、11号、p.621-624 Lipid (2010), 45, p.375-384 脂質栄養学、脂質栄養学会、1996、5巻、1号、p.17-22 blood advances (2020), 4, p.4522-4537
　しかし、従来技術は、血栓予防効果について、ｎ－６ＤＰＡの用量との関係や、ｎ－６ＤＰＡを経口投与したときの傾向を何ら示唆していない。
　本発明の課題は、ｎ－６ＤＰＡを含有しかつ経口投与されて血栓予防に用いられ、かつ血栓予防効果に優れる剤、食品組成物、餌飼料組成物、及び医薬品組成物を提供することにある。
　前記課題を解決する為、ｎ－６ＤＰＡの血栓予防効果と経口投与用量との関係性を鋭意検討した結果、ｎ－６ＤＰＡの経口投与用量が過多になると、むしろ血栓予防効果が下がることを見出し、本発明の完成に至った。
　本発明は以下の構成を採用する。
　即ち、本発明の第１は、「ｎ－６ＤＰＡを含有する微細藻、当該微細藻から得られかつｎ－６ＤＰＡを含有する脂肪酸組成物、又はｎ－６ＤＰＡの何れか一つからなり、ｎ－６ＤＰＡ相当量が９ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙ以下になる有効量で経口投与されることを特徴とする血栓予防剤。」である。
　本発明の第２は、前記第１発明に於いて、微細藻に含有され又は微細藻から得られる脂肪酸組成物の全量に対し、ｎ－６ＤＰＡが７％以上含まれることを特徴とする血栓予防剤である。
　本発明の第３は、前記第１又は第２発明に於ける有効量が、ｎ－６ＤＰＡ相当量で０．０３ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙ以上になる量であることを特徴とする、血栓予防剤である。
　本発明の第４は、前記第１～第３発明のいずれか一つの発明に於ける微細藻が、スラウストキトリッドであることを特徴とする血栓予防剤である。
　本発明の第５は、前記第１～第３発明のいずれか一つの発明に於ける血栓予防剤を含有する、血栓予防用の食品組成物又は餌飼料組成物である。
　本発明の第６は、前記第１～第３発明のいずれか一つの発明に於ける血栓予防剤を含有する、血栓予防用の医薬品組成物である。
　本発明により、ｎ－６ＤＰＡを含有しかつ経口投与されて血栓予防に用いられ、かつ高い血栓予防効果を有する剤、食品組成物、餌飼料組成物又は医薬品組成物を提供することができる。
本発明の参考例の結果を示すグラフである。 本発明の参考例の結果を示すグラフである。 本発明の実施例の結果を示すグラフである。
　以下、本発明の構成について詳述する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　まず、本発明の剤に含まれる微細藻について述べる。本発明の剤に含まれる微細藻は食品として利用可能な微細藻類の藻体である。食品として利用可能とは食経験があること、或いは動物やヒトに於ける安全性試験で問題のないことが示されたものをいう。微細藻類とは個体の識別に顕微鏡が必要な藻類の総称で、分類学的には広義の細菌に属する原核生物の藍藻類、高等植物に近縁の緑藻類、原生動物門にも分類される鞭毛藻類まで多岐にわたる。本発明に於いて用いることができる食品としての利用可能な微細藻類の例としては、クロレラ（緑藻類）、スピルリナ（藍藻類）、ユーグレナ（和名：ミドリムシ、原生動物/緑藻類）、ドナリエラ（緑藻類）、ナンノクロロプシス（真正眼点藻類）、ラビリンチュラ類スラウストキトリッド（ラビリンチュラ類は本明細書では微細藻類の一種とする。）などが挙げられるが、好ましくは本来的にＰＵＦＡｓを含有するスピルリナ、ユーグレナ、ナンノクロロプシス、ラビリンチュラ類スラウストキトリッド、或いは脂肪酸の添加培養で藻体内にＰＵＦＡｓを含有させることのできるクロレラ、より好ましくはＰＵＦＡｓの含有量の多いナンノクロロプシス、スラウストキトリッド、更に好ましくは閉鎖系でのタンク培養が可能で安全性が高いラビリンチュラ類スラウストキトリッドが挙げられる。
　なお、本発明の剤に含まれる脂肪酸組成物は、食品として利用可能か否かにかかわらず、ｎ－６ＤＰＡを含有する任意の微細藻から得てよいが、食品として利用可能な微細藻から得ることが好ましい。
　本発明の剤に含まれるｎ－６ＤＰＡは、任意の生物から得て、あるいは合成してもよいが、製造効率の観点では微細藻から得ることが好ましい。
　ラビリンチュラ類は分類学的にはクロミスタ界、不等毛門、ラビリンチュラ鋼、ラビリンチュラ目に分類される。更に、ラビリンチュラ科に属するラビリンチュリッド（Labyrinthulids）とヤブレツボカビ科に属するスラウストキトリッド（Thraustochytrids）に大別される。スラウストキトリッドには細胞増殖性やＰＵＦＡｓ生産性の観点から応用面での検討例の多いシゾキトリウム属やオーランチオキトリウム属、オブロンギキトリウム属、スラウストキトリウム属、パリエティキトリウム属、ウルケニア属、及びボトリオキトリウム属等があるが、本発明に於いては特に限定されない。
　微細藻の藻体は、市販品、ＯＥＭ製造又は自製品を用いることができる。市販品としてはクロレラ、スピルリナ及びユーグレナの乾燥藻体、シゾキトリウムやオーランチオキトリウムの乾燥藻体が例示される。OEM製造や自製の場合は、特に限定されないが、食品グレードの培養基剤を用いて最適化された条件下での培養により得られた藻体を用いることができる。
　次に、本発明の剤に含まれる微細藻、脂肪酸組成物、ｎ－６ＤＰＡの製造方法について、微細藻の培養、藻体の回収、乾燥及び粉末化を中心に述べる。微細藻の培養に於いて用いる固体培地及び液体培地は、天然又は人工海水、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む公知の培地基材等、いずれも使用することができる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、ガラクトースなどの炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸、酢酸ナトリウムなどが例示できるが、これらに限定されない。炭素源は、例えば、培地１Lあたり２０～３００ｇの濃度で使用することができる。特に好ましい態様によれば、初発の炭素源を消費しつくしたのちに、炭素源をフィードすることにより引き続き培養を行うことができる。このような条件で培養を行うことにより、消費させる炭素源の量を増大させることが可能になり、微細藻から得られる脂肪酸組成物の生産量を増大させることができる。また、窒素源としては、酵母エキス、コーンスティープリカー、ペプトン、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、アンモニア等の無機窒素を使用することができるが、これらに限定されない。無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
　前記の各培地基材を含有する培地は、適当な酸又は塩基によりｐＨ４．０～９．５に調製後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。培養時のｐＨは、一般的に３．５～１０．０であり、好ましくはｐＨ４．０～９．５である。液体培養は２～１０日間、通気攪拌下で行うことができる。培養温度は一般的には１０～４５℃ 、好ましくは１５～３５℃ である。なお、培養温度は脂肪酸組成物を生産しうる培養温度に制御することが好ましい。液体培養のスケールは特に限定されないが、市販の閉鎖系培養設備を用いることができる。得られた培養液からの藻体の回収は、例えば、遠心分離法や濾過法などの公知の常法により行うことができる。
　培養によって得られた藻体（湿藻体）は、凍結乾燥、空気乾燥、噴霧乾燥、トンネル乾燥、真空乾燥(凍結乾燥)又は類似の過程を含む限定されない方法によって乾燥できる。湿藻体又は湿藻体の回収後に水などで洗浄された菌体は、乾燥工程を経ずに直接用いてもよい。スラウストキトリウム・オーランチオキトリウム属の場合、凍結乾燥処理によって藻体が死滅するため、長期保存における雑菌繁殖のリスクを下げることができる。乾燥藻体の粉体化の方法は特に限定されず、装置としてバッチ式或いは連続式のブレンダー、ミキサー、ミル機、混錬機、粉砕機、解砕機、磨砕機等の機器類が挙げられる。
　本発明では乾燥藻体における総脂肪酸中のｎ－６ＤＰＡ含有率は、微細藻種及びその培養条件により１重量％以上に調製することが一般的であるが、好ましくは６重量％以上、更に好ましくは７重量％以上である。これにより、所要の血栓予防効果を奏するのに必要な藻体、脂肪酸組成物の含有量を抑えることができ、製造の面で効率的である。
　ｎ－６ＤＰＡの用量が過多であると血栓予防阻害の傾向がある一方、特に微細藻やそれから得られる脂肪酸組成物にはｎ－６ＤＰＡ以外にも多様なＰＵＦＡｓが含まれ、それらが血栓予防以外の種々有用な機能を持ち得る。このため、乾燥藻体における総脂肪酸中のｎ－６ＤＰＡ含有率の上限は、特に限定されないものの、３０重量％以下であってよく、好ましくは２５重量％以下である。
　ｎ－６ＤＰＡを含有する脂肪酸組成物は前記藻体から公知の方法で調製することができる。すなわち、培養後の湿藻体或いは乾燥藻体をミルや超音波等による物理的破砕或いは溶剤による化学的溶解の後、クロロホルム、ヘキサン、メタノール、エタノール等を用いた溶媒抽出により、ＰＵＦＡｓを含有した脂肪酸組成物を得ることができる。更に、得られた脂肪酸組成物は任意の公知の技法によって組成物の要件に基づき化学的又は物理的に改変又は加工処理されてもよい。
　ｎ－６ＤＰＡは、例えば前記脂肪酸組成物又はｎ－６ＤＰＡを含有する他の脂肪酸組成物から公知の方法で調製することができる。すなわち、混合脂肪酸或いは脂肪酸エステルから、例えば、尿素付加法、冷却分離法、カラムクロマトグラフィー法等により分離精製することができる。また、当技術分野における他の方法により分離精製されてもよい。
　微細藻から抽出された脂肪酸組成物、及びｎ－６ＤＰＡは、常法に従い、糖質、乳化剤、乳タンパク質、酸化防止剤などを混合することで乳化物を調製した後、噴霧式加熱乾燥法、噴霧式冷却法、粉砕式凍結乾燥法、粉砕式冷却固化法、コーティング式マイクロカプセル法、コーティング式散布混合法又は類似の過程を含むがこれらに限定されない方法によって、粉末油脂に加工されてもよい。
　本発明の剤の経口投与における１日当りのｎ－６ＤＰＡ相当量（／体重ｋｇ）は、過大になると血栓予防効果がむしろ低下するため、９ｍｇ以下であり、好ましくは７ｍｇ以下、好ましくは６ｍｇ以下、好ましくは５ｍｇ以下、好ましくは４ｍｇ以下、好ましくは３ｍｇ以下である。
　１日当りのｎ－６ＤＰＡ相当量（／体重ｋｇ）の下限は、所要の血栓予防効果とコスト等を勘案して適宜選択されてよく、特に限定されないが、例えば０．０３ｍｇ以上であってよく、好ましくは０．１０ｍｇ以上、好ましくは０．１５ｍｇ以上、好ましくは１．００ｍｇ以上である。
　本発明に於ける食品組成物は、上記本発明の剤を含有し、血栓予防に用いられる。具体的には、機能性食品（機能性表示食品や特定保健用食品を含む。食品添加剤も含む。）及び栄養補助食品であってよい。その性状は、固形、半液状又は液状であってもよい。
　食品としては、油脂を含む食品、例えば、天然食品（肉、魚、ナッツ等）、調理時に油脂を加える食品（中華料理、ラーメン、スープ等）、熱媒体として油脂を用いた食品（天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等）、油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品（バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等）、加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品（おかき、ハードビスケット、あんパン等）が挙げられる。また、油脂を含む食品に限定されず、例えば、農産食品（パン、めん類、ごはん、菓子類、豆腐及びその加工品等）、発酵食品（清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、味噌等）、畜産食品（ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等）、水産食品（かまぼこ、揚げ天、はんぺん等）、飲料（果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等）も挙げられるが、特に限定されない。
　機能性食品及び栄養補助食品としては、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、ドリンク剤、自然流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、経腸栄養剤等の形態を有する飲食品として製造することができる。その際、本発明の油脂とともに他の栄養成分或いは機能性成分を配合してもよい。また、医薬製剤の形態、例えば蛋白質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の藻体或いは脂肪酸組成物が配合された自然流動食、半消化態栄養食及び成分栄養食や、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態を挙げることができるが、前記の飲食品の形態であってもよい。
　本発明に於ける餌飼料組成物は、上記本発明の剤を含有し、血栓予防に用いられる。具体的には、動物用飼料、採卵用家禽用飼料、微小餌料生物用餌料であってよい。血栓予防作用、すなわち血流促進効果による動物の健康維持、或いは鶏卵や魚介類・甲殻類を介したヒトの健康維持を期待することができる。
　動物用飼料としては、愛玩動物用の飼料を含むペット用飼料、家畜用飼料、水産養殖用飼料、動物園動物用飼料、使役動物用飼料又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。また、藻体からｎ－６ＤＰＡを含有する油脂を抽出した後の抽出残渣も、動物飼料や前記食品組成物に使用することができる。この抽出残渣は、脂肪酸組成物の他に、蛋白質、灰分、炭水化物なども含んでいるため好ましい。
　採卵用家禽用飼料は、採卵用家禽、特に鶏用の飼料として卵の生産、並びにｎ－６ＤＰＡ含有卵黄油の生産に用いることができる。また、このような家禽卵、特に卵黄から常法に従って油脂を抽出することによって、ｎ－６ＤＰＡを強化した卵黄油が得られる。この卵黄油は、本発明の剤に含まれ、又はその原料になり得る。
　微小餌料生物用餌料は、魚貝類や甲殻類の養殖に必須とされるワムシやアルテミア等の微小餌料生物の培養に用いることができる。本発明の脂肪酸組成物を含有する藻体又は培養液を微小餌料生物に与えることにより、ｎ－６ＤＰＡを含有する微小餌料生物が得られる。上記の微小餌料生物は、本発明の剤に含まれ、又はその原料になり得る。
　本発明に於ける医薬品組成物は、上記本発明の剤を含有し、経口投与を通じた血栓予防に用いられる。ｎ－６ＤＰＡの血栓予防作用、すなわち血流促進効果による健康維持が期待できる。
　当該医薬品組成物は、公知の調剤技術により経口投与用に製剤化され得、固体状、液体状、半固体状等の任意の形態であってよい。医薬品組成物中のｎ－６ＤＰＡ又はそれらの混合物は、遊離の形であっても、また薬剤として許容されうる塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、又は他のアルカリ金属塩、亜鉛塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のような他の金属塩の形態や、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、低級アルコールのエステル、リン脂質、糖脂質、アミド等の種々の形態であってもよい。ここで低級アルコールとは炭素数６以下の一価アルコールを指し、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール等を例示することができる。
　本発明は、本発明の剤を生体（ヒト及びヒト以外の哺乳類等）に経口投与する工程を含む、血栓が形成される可能性がある対象の処置方法を包含する。
　本発明の処置方法によれば、投与対象における血栓形成の可能性を低減することができる。
　経口投与量は、投与対象の状態（年齢、体重、症状等）等に応じて適宜調整できるが、上述のとおり、ｎ－６ＤＰＡの用量が高すぎると、かえって血栓予防効果が低下するため、１日当りのｎ－６ＤＰＡ相当量（／体重ｋｇ）が９ｍｇ以下となるように調整する。
　以下、本発明について実施例により詳説する。だだし、実施例はあくまで一例であり、本発明はこれにより限定されるものではない。なお、以下に於いて、特に断らない限り、％は重量％を示す。
参考例：ラットＰＩＴ血栓モデルを用いたＰＵＦＡｓ・静脈投与の評価試験
（１）投与サンプルの調製
　ｎ－６ＤＰＡ（ａｌｌ－ｃｉｓ－４，７，１０，１３，１６－ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ；Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、ｎ－３ＤＰＡ（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ－ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ；Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、ＥＰＡ（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ－ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ；Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）は投与当日に使用量を分注し、窒素ガス吹き付けによりエタノールを留去した。
　その後、ＤＭＳＯを用いて、０．００２５、０．０２５、０．２５、２．５ｍｇ／ｍＬのｎ－６ＤＰＡ溶液と、０．２５、２．５、２５ｍｇ／ｍＬのｎ－３ＤＰＡ溶液及びＥＰＡ溶液を調製し、投与サンプルとした。
（２）サンプル投与とラットＰＩＴ血栓モデルによる評価
　公知の常法（薬学雑誌、日本薬学会、2012、132巻、9号、p.1019-1024）に従い、ＰＩＴ動物モデル（ＰＩＴ；Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）によるＰＵＦＡsの血栓予防の評価試験を行った。試験動物としてはハンドリングの観点からＷｉｓｔａｒラット（９週齢の雄、９匹/群）を使用し、前記ｎ－６ＤＰＡ溶液、ｎ－３ＤＰＡ溶液、ＥＰＡ溶液、及びＤＭＳＯ（対照:比較例）を静脈投与した。ラット体重（ｋｇ）当たりの各サンプルの投与量を以下に示す。
　ｎ－６ＤＰＡ：０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、１ｍｇ、３ｍｇ、５ｍｇ、７ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ
　ｎ－３ＤＰＡ及びＥＰＡ：１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ
　各サンプルを静脈投与後、ラットを麻酔し、右大腿動脈の鼠径動脈分岐部分を中心に緑色光のプローブとペン型血流計を設置した。生理食塩液（(株)大塚製薬工場製）を用いて調製したローズベンガル（１０ｍｇ／ｍＬ、富士フィルム和光純薬（株）製）1ｍＬ（／ラットｋｇ）を尾静脈から投与し、同時に緑色光を照射することで血栓形成を誘導した。血管閉塞が１分間持続するまでの平均時間（血管閉塞時間）を図１及び２に示す。
　血液中に存在するｎ－６ＤＰＡは、ｎ－３ＤＰＡ及びＥＰＡの１００分の１の濃度で非常に高い血栓予防効果があることが確認された。また、１０ｍｇ（／ラットｋｇ）投与区の結果から、血液中のｎ－６ＤＰＡ濃度が過多になると血栓予防の阻害傾向が意外にも認められた。この傾向は、ｎ－３ＤＰＡ及びＥＰＡにはあてはまらず、ｎ－６ＤＰＡに特有で予想外なものである。
実施例：ラットＰＩＴ血栓モデルを用いた乾燥藻体・経口投与の評価試験
（１）乾燥藻体の製造
　オーランチオキトリウム属ＮＢＲＣ１１１９２２株（Aurantiochytrium sp.、製品評価技術基盤機構から分譲）から紫外線突然変異誘発により作出したＳＰＡ－２１４株を、９０Ｌ培養装置を用いて液体培地（グリセロール４％、酵母エキス４％、人工海水０．９％）で４日間、培養した。培養液の遠心分離処理によって得られた湿藻体約３ｋｇを真空凍結乾燥処理し、乾燥藻体約７００ｇを調製した。
（２）脂質の抽出とＰＵＦＡｓ分析
　常法（特開２０２０－５４３９１号公報）に従って、湿菌体にクロロホルム・メタノール（体積比２：１）を加えて脂質を抽出、濃縮乾固後、ｎ－ヘキサンで再抽出したサンプルをガスクロマトグラフィー（ＧＣ－ＦＩＤ）により分析した。これにより、脂肪酸は脂肪酸メチルエステルとして抽出され、全脂肪酸メチルエステルに対する各脂肪酸メチルエステルのピーク面積の割合（％）を求めた。乾燥藻体に含まれる各ＰＵＦＡsの比率を以下に示す。
　ＤＨＡ：１１．６％、ｎ－６ＤＰＡ：２．９％、ｎ－３ＤＰＡ：０．１％、ＥＰＡ：０．１％
（３）投与サンプルの調製及び投与とラットＰＩＴ血栓モデルによる評価
　乾燥藻体を注射用水（（株）大塚製薬工場製）を用いて０．４、４、４０ｍｇ／ｍＬとなるよう懸濁した各投与サンプル及び注射用水（対照：比較例）を、Ｗｉｓｔａｒラット（５週齢の雄、８匹／群）に経口ゾンデを用いて連続経口投与（２８日間、１回／日）した。ラット体重（ｋｇ）当たりの乾燥藻体及びその乾燥藻体が含有するｎ－６ＤＰＡの１日の投与量を以下に示す。
　乾燥藻体（ｎ－６ＤＰＡ）：４ｍｇ（０．１２ｍｇ）、４０ｍｇ（１．２ｍｇ）、４００ｍｇ（１２ｍｇ）
　連続経口投与後、前記と同様に血栓形成を誘導し、血管閉塞時間を測定した（図３）。
　乾燥藻体の連続経口投与に於いて血栓予防効果が認められた。４００ｍｇ（／ラットｋｇ・ｄａｙ）投与区の結果から、経口投与する藻体の用量が過多になると血栓予防の阻害傾向が意外にも認められた。実施例で用いた乾燥藻体のＰＵＦＡs組成において、ＤＨＡは血栓予防能を有しないことが既知であり、ｎ－３ＤＰＡとＥＰＡは微量かつ血栓予防能がｎ－６ＤＰＡよりも低い（図１及び２）こと、また、図１の血中ｎ－６ＤＰＡの量と血栓予防効果との関係性をあわせ考慮すると、経口投与における血栓予防効果及び用量過多による血栓予防阻害は、ｎ－６ＤＰＡに起因することが明らかである。
　なお、乾燥藻体の投与期間中、ラットの体重変化等の異常は確認されなかった。

Claims (6)

  1. 　ｎ－６ＤＰＡ（ｎ－６ドコサペンタエン酸）を含有する微細藻、当該微細藻から得られかつｎ－６ＤＰＡを含有する脂肪酸組成物、又はｎ－６ＤＰＡの何れか一つからなり、ｎ－６ＤＰＡ相当量が９ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙ以下になる有効量で経口投与されることを特徴とする血栓予防剤。
  2. 　前記微細藻に含有され又は前記微細藻から得られる脂肪酸組成物の全量に対し、ｎ－６ＤＰＡが７％以上含まれることを特徴とする請求項１記載の血栓予防剤。
  3. 　前記有効量は、ｎ－６ＤＰＡ相当量が０．０３ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙ以上になる量であることを特徴とする請求項１又は２記載の血栓予防剤。
  4. 　微細藻がスラウストキトリッドであることを特徴とする請求項1～３のいずれか１項記載の血栓予防剤。
  5. 　請求項１～４のいずれか1項記載の血栓予防剤を含有する、血栓予防用の食品組成物又は餌飼料組成物。
  6. 　請求項１～４のいずれか1項記載の血栓予防剤を含有する、血栓予防用の医薬品組成物。
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