JP5111608B2

JP5111608B2 - 全反射蛍光観察装置

Info

Publication number: JP5111608B2
Application number: JP2010521633A
Authority: JP
Inventors: 修孝隈崎; 智高橋; 宏一加藤; 孝信芳賀
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2009-05-20
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2029-05-20
Also published as: US20110121204A1; US8324596B2; WO2010010751A1; JPWO2010010751A1

Description

本発明は、全反射照明を利用して蛍光観察を行う装置に関する。

ＤＮＡやタンパク質などの生体物質を観察する際、蛍光色素で標識を行い、レーザ等の励起光を照射し、発生する蛍光を観察する方法が一般的である。近年では、分子レベルの蛍光を測定可能な技術として、エバネッセント光を利用した観察方法がある（非特許文献１）。屈折率が高い媒質から低い媒質に向けて一定以上の角度をもった光が入るときに、入射光が低い屈折率の媒質に伝播せず全反射が生じる。このとき境界面の低屈折率媒質側表面に、僅かに光が染み出す現象が生じる。その染み出し光が、エバネッセント光と呼ばれる。エバネッセント光の強度は屈折率境界平面から離れるに従って指数関数的に減衰し、屈折率境界平面から１５０ｎｍ程度の距離で励起光強度が１／ｅとなる。このため、観察試料を境界面に固定することにより、励起光を境界面近傍の試料のみに照射することが可能であり、遊離蛍光体や水のラマン散乱等に由来する背景光を抑制し、高コントラストな像が得られる。
さらに、前述の１分子蛍光検出の技術を利用したＤＮＡシーケンシングが提案されている（非特許文献２）。分析すべき試料ＤＮＡ断片を基板表面にランダムに１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させる。これを、前述のエバネッセント光を利用した蛍光検出によって測定し、塩基配列を決定する。具体的には、屈折率境界平面上の溶液層側に、単一のターゲットＤＮＡ分子をビオチン−アビジンのタンパク質結合を利用して固定化する。そして、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、かつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行う工程、次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、これを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。
エバネッセント光照射は、バックグラウンドが低く微弱な信号を観察可能というメリットがある反面、煩雑かつ正確な光学調整（入射角を厳しく制御）が必要不可欠であるというデメリットがある。上記問題を解決する手段として、特許文献１記載の全反射蛍光顕微鏡では、エバネッセント光の染み出し深さを一定に保つような機構を備えている。具体的には、予め記録された励起光の入射角とエバネッセント光の染み出し深さとの関係情報に基づき、ユーザが指定する染み出し深さになるよう、自動で励起光の入射角を制御する。
また、特許文献２記載の全反射蛍光Ｘ線分析装置では、励起光の入射角を適切に設定する手段を備えている。具体的には基板上のサンプルに対して励起Ｘ線を照射し、基板表面で反射した反射Ｘ線の強度をセンサで測定し、その強度をもとに励起Ｘ線の入射角を制御する。

特開２００６−１８９７４１号公報特開平３−２４６４５２号公報

Ｎａｔｕｒｅ１９９５，Ｖｏｌ．３７４，ｐｐ．５５５−５５９．ＰＮＡＳ２００３，Ｖｏｌ．１００，ｐｐ．３９６０−３９６４．

しかしながら、特許文献１記載の角度調整機能は、完全に水平な基板に対しては有効であるが、実際の基板表面には波打ちや粗さが局所的に存在し、また局所的な凸凹が存在するため、照射領域ごとに入射角が変化し、その結果励起光強度が一定せず、観察結果にばらつきが生じる。また、この機能は、全反射角度を一定に保つことは可能であるが、仮に、全反射していても励起光の入射角が臨界角より大きい場合、エバネッセント光の染み出しの深さは浅くなる。また、仮に、基板が完全に水平で入射角を一定に保つことができていても、入射角と臨界角の差が大きければ、その分エバネッセント光の染み出しの深さは浅くなる。このため、十分な励起光強度が得られず、結果として測定対象物の蛍光強度が弱くなってしまう。
さらに、特許文献２記載の全反射蛍光観察装置においては、基板の屈折率と媒質の屈折率の差が大きい場合や、基板の表面状態によっては、例えば透過状態であっても基板表面で一部反射が生じることがある。つまり全反射状態ではなくても反射光が存在するため、反射光を検出するだけでは一部反射光と全反射光との区別が難しい場合がある。
本発明の目的は、操作性が良く、感度が高く、かつ信頼性の高い蛍光観察手法及び装置を提供することにある。

本発明では、エバネッセント光を利用して蛍光観察を行う装置について、基板表面の角度によらず、常に励起光が基板表面で全反射となるよう励起光の入射角を調整する。この方法は、観察基板に対し励起光の角度を連続的に変化させて入射する工程と、入射後の励起光を光センサで検知する工程と、光センサの検知結果から全反射角を設定する工程とを含む。
また、本発明では、エバネッセント光を利用して蛍光観察を行う装置について、基板表面の局所的な凹凸によらず、常に励起光が基板表面で全反射となるよう励起光の入射角を調整する。この方法は、観察基板に対し任意の入射角で励起光を照射する工程と入射後の励起光を光センサで検知する工程と、光センサの検知結果をもとに、現在の入射角の状態を判定する工程と、前記判定結果をもとに、励起光が基板表面で全反射するよう、励起光の入射角を調整する工程とを含む。
基板に対して照射された励起光は、その入射角によって進行方向が変化する。即ち、透過光，反射光，表面伝播光である。これらをそれぞれに対応する光センサで検出することにより、励起光の入射角が臨界角に対しどのような状態かを判定し、その判定結果に基づき励起光の入射角を変化させ、最適な全反射角度を実現する。
１つの実施形態においては、基板に照射された後の励起光を３つの光センサで検出することにより、全反射の角度を自動的に設定する。この方法では、測定対象領域に励起光を照射する工程と、入射角を連続的に変化させる工程と、入射後の励起光の３状態（透過・反射・表面伝播）をそれぞれに対応する光センサで検知する工程と、検知結果をもとに励起光が基板表面で全反射するよう、励起光の入射角を適切に設定する工程を含む。
別の実施形態においては、基板に照射された後の励起光を３つの光センサで検出することにより、全反射照明を実現する励起光の入射角を自動的に設定する。この方法では、測定対象領域に励起光を照射する工程と、その結果生じる透過光または反射光または表面伝播光をそれぞれに対応する光センサで検知する工程と、検知結果をもとに現在の入射角の状態を判定する工程と、判定結果をもとに励起光の入射角を変化させる工程と、以上の工程を励起光が基板表面で全反射するまで連続的に行う工程を含む。
別の実施形態においては、基板に照射された後の励起光を１つの光センサで検出することにより全反射の角度を自動的に設定する。この方法では、透過光・反射光・表面伝播光を１つの光センサに導く工程と、それぞれの信号の有無を１つのセンサ内で区画化された領域に検知する工程と、検知結果をもとに励起光が基板表面で全反射するよう、励起光の入射角を適切に設定する工程を含む。
別の実施形態においては、基板に照射された後の励起光を１つの光センサで検出することにより全反射照明を実現する励起光の入射角を自動的に設定する。この方法では、測定対象領域に励起光を照射する工程と、その結果生じる透過光または反射光または表面伝播光を１つの光センサに導く工程と、それぞれの光の有無を１つのセンサ内で区画化された領域で検知する工程と、検知結果をもとに現在の入射角の状態を判定する工程と、判定結果をもとに励起光の入射角を変化させる工程と、以上の工程を励起光が基板表面で全反射するまで連続的に行う工程を含む。
別の実施形態においては、基板に照射された後の励起光を２つの光センサで検出することにより全反射の角度を自動的に設定する。この方法では、透過光，反射光，表面伝播光のうち表面伝播光を含む２種類に対応する光センサで検知する工程と、検知結果をもとに励起光が基板表面で全反射するよう、励起光の入射角を適切に設定する工程を含む。
別の実施形態においては、基板に照射された後の励起光を２つの光センサで検出することにより全反射照明を実現する励起光の入射角を自動的に設定する。この方法では、測定対象領域に励起光を照射する工程と、その結果生じる透過光または反射光または表面伝播光のうち表面伝播光を含む２種類の光を、それぞれに対応する光センサで検知する工程と、検知結果をもとに現在の入射角の状態を判定する工程と、判定結果をもとに励起光の入射角を変化させる工程と、以上の工程を励起光が基板表面で全反射するまで連続的に行う工程を含む。
別の実施形態においては、基板に照射された後の励起光を１つの光センサで検出することにより全反射の角度を自動的に設定する。この方法では、透過光，反射光，表面伝播光のうち表面伝播光を含む２種類を１つの光センサに導く工程と、それぞれの信号の有無を１つのセンサ内で区画化された領域に検知する工程と、検知結果をもとに励起光が基板表面で全反射するよう、励起光の入射角を適切に設定する工程を含む。
別の実施形態においては、基板に照射された後の励起光を１つの光センサで検出することにより全反射照明を実現する励起光の入射角を自動的に設定する。この方法では、測定対象領域に励起光を照射する工程と、その結果生じる透過光または反射光または表面伝播光のうち表面伝播光を含む２種類の光を１つの光センサに導く工程と、それぞれの光の有無を１つのセンサ内で区画化された領域で検知する工程と、検知結果をもとに現在の入射角の状態を判定する工程と、判定結果をもとに励起光の入射角を変化させる工程と、以上の工程を励起光が基板表面で全反射するまで連続的に行う工程を含む。
別の実施形態においては、基板に照射された後の励起光を１つの光センサで検出することにより全反射の角度を自動的に設定する。この方法では、表面伝播光を光センサで検知する工程と、検知結果をもとに励起光が基板表面で全反射するよう、励起光の入射角を適切に設定する工程を含む。
別の実施形態においては、基板に照射された後の励起光を１つの光センサで検出することにより全反射照明を実現する励起光の入射角を自動的に設定する。この方法では、測定対象領域に励起光を照射する工程と、その結果生じる表面伝播光を光センサで検知する工程と、検知結果をもとに現在の入射角の状態を判定する工程と、判定結果をもとに励起光の入射角を変化させる工程と、以上の工程を励起光が基板表面で全反射するまで連続的に行う工程を含む。

本発明によれば、励起光が全反射状態となるよう入射角を自動的に設定することが可能となり、操作性が向上する。また観察領域の表面状態に左右されず常に最適な入射角を制御できるため、従来法と比較して信頼性が向上する。さらに、必要以上に入射角を浅くすることが無いため、エバネッセント光強度を強く保つことができ、その結果従来法と比較して強い信号強度を得ることができる。

第１図は実施例１における装置の説明図。
第２図は実施例１における角度調整のフロー図。
第３図は実施例２における装置の説明図。
第４図は実施例３における装置の説明図。
第５図は実施例４における装置の説明図。
第６図は実施例５における装置の説明図。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、種々の変更，改良，組み合わせが可能である。
実施例では、表面に測定試料が配置された基板と、基板に励起光を照射する光源と、基板から生じる発光を測定する検出器と、基板に照射後の励起光を検知する光センサと、光センサの検知結果に基づいて励起光の入射角を調整する調整装置と、を有する全反射蛍光観察装置を開示する。
また、実施例では、全反射照明を利用して蛍光観察を行う装置において、励起光の入射角を自動的に調整する方法であって；表面に測定試料が配置された基板に対し、励起光の入射角を連続的に変化させ；励起光が基板へ入射することにより生じる透過光，表面伝播光、又は反射光の少なくとも１つを光センサで検知し；入射角制御機構が、光センサの検知パターンをもとに励起光の入射角が全反射角となるよう入射角を調整する；方法を開示する。
また、実施例では、全反射照明を利用して蛍光観察を行う装置において、励起光の入射角を自動的に調整する方法であって；表面に測定試料が配置された基板に対し、励起光の入射角を連続的に変化させ；励起光が基板へ入射することにより生じる透過光、又は表面伝播光の少なくとも１つを光センサで検知し；入射角制御機構が、光センサの検知パターンをもとに励起光の入射角が全反射角となるよう入射角を調整する；方法を開示する。
また、実施例では、全反射照明を利用して蛍光観察を行う装置において、励起光の入射角を自動的に調整する方法であって；表面に測定試料が配置された基板に対し、励起光の入射角を連続的に変化させ；励起光が基板へ入射することにより生じる表面伝播光又は反射光の少なくとも１つを光センサで検知し；入射角制御機構が、光センサの検知パターンをもとに励起光の入射角が全反射角となるよう入射角を調整する；方法を開示する。
また、実施例では、全反射照明を利用して蛍光観察を行う装置において、励起光の入射角を自動的に設定する方法であって；表面に測定試料が配置された基板に対し、励起光の入射角を連続的に変化させ；励起光が基板へ入射することにより生じる表面伝播光を光センサで検知し；入射角制御機構が、光センサの検知パターンをもとに励起光の入射角が全反射角となるよう入射角を調整する；方法を開示する。
また、実施例では、基板が、光を透過する部材で形成されていることを開示する。
また、実施例では、基板に照射後の励起光が、透過光，表面伝播光、及び反射光を含むことを開示する。
また、実施例では、光センサが、透過光，表面伝播光、又は反射光のいずれか、若しくはその組み合わせを検知することを開示する。
また、実施例では、制御機構が、透過光，表面伝播光、及び反射光の検知結果の組み合わせから、現在の入射角の状態を判定することを開示する。
また、実施例では、制御機構が、現在の入射角の状態をもとに、駆動機構に対し次の動作を指示するためのアルゴリズムを内部に備えていることを開示する。

第１図は、本実施例における、角度調整機能を有するＤＮＡ塩基配列解析装置の構成図である。装置は正立型の顕微鏡のような構成であり、基板１に捕捉する蛍光分子を蛍光検出にて測定する。なお倒立型の装置構成にすることも可能である。なお、本操作は単分子蛍光検出法に基づく場合、測定はＨＥＰＡフィルタを介したクリーンルームのような環境にて行う。
一連の反応は１の反応基板上で行う。基板１は透明材質でできており、材質としては例えば合成石英などが使用できる。基板にはプライマが複数固定されている。例えばプライマの５′末端がビオチン化されており、基板表面がアビジン化されており、ビオチン−アビジン結合を利用して基板１表面に固定されている。プライマは基板上にランダムに配置されていても構わないが、観察時の効率を考慮し、規則的に配置されていることが望ましい。
蛍光励起用のレーザ装置２（ＹＡＧレーザ，５３２ｎｍ）からのレーザ光２ａは、λ／４波長板３を通過して円偏光となり、ミラーユニット４を介して全反射照明用の石英製プリズム５に入射され、基板１の裏側から照射される。石英製プリズム５と基板１は無蛍光グリセリンを介して接触させており、レーザ光はその界面で反射することなく、基板１に導入される。ミラーユニットは自動で角度・位置調整可能な自動ステージと反射用ミラーから構成されており、ミラーユニットコントローラ６によって制御されている。
基板に入射したレーザ光は、基板表面のサンプルを照射した後、その入射角によって進行方向が変化する。入射角が臨界角より小さい場合、レーザ光は基板表面で全反射せず、基板表面方向へと透過する（透過光）。入射角が臨界角と同等の場合、基板表面を伝播する（表面伝播光）。入射角が臨界角より大きい場合、レーザ光は基板表面で全反射する（反射光）。このとき基板表面のごく近傍にエバネッセント光が発生する。なお、臨界角は、基板の屈折率と、基板表面に存在する媒質の屈折率から以下の式によって求められる。
（式） θ＝ａｒｃｓｉｎ（ｎ２／ｎ１）
ｎ１：基板の屈折率ｎ２：媒質の屈折率、ｎ１＞ｎ２
第２図は、本実施例における入射角調整時のフロー図である。具体的な角度調整方法は以下の手順に従って行う。基板表面の測定領域に対し、任意の入射角でレーザ光を照射する。角度は、例えば４５度である。入射後のレーザ光は臨界角との関係から、透過光または表面伝播光または全反射光となる。装置には透過光，表面伝播光，反射光を検出するための光センサ７，８，９が設置されており、これらのセンサの検知結果は、ミラーユニットコントローラ６へ送られる。
ミラーユニットコントローラ６はその情報をもとに、ミラーユニット４を駆動させる。駆動の手段は電動マイクロメータによる。この他にも、ゴニオステージ，ガルバノミラー，ポリゴンミラー，音響光学素子（ＡＯＭ）等が利用可能である。ミラーユニットコントローラ６は内部に下表に示す５つのモードを有しており、光センサ７，８，９の検知パターンより、モードを決定する。それぞれのモードごとに決められたルールに従ってミラーユニット４は入射角が全反射角度となるよう自動で調整を行う。若しくは、ミラーユニットコントローラ６はミラーユニット４に対し、それぞれのモードごとに決められた動作の指示を出す。ミラーユニット４はこの指示に従って駆動し、レーザ光が基板表面で全反射するよう、入射角を調整する。
尚、表における「信号のあり」及び「信号なし」は、測定値そのものをしめすものではなく、レベルの概念を示す記号である。
例えば、基板１が合成石英で媒質が水の場合、臨界角は約６６度であり、入射角４５度でレーザ光２ａを照射した場合、レーザ光２ａは基板１を透過する。このとき光センサ７，８，９の信号パターンは（透過光，表面伝播光，反射光）＝（１，０，０）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＡと判定し、下表のルールに従い入射角を大きくするよう光軸調整を行う。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＡと判定し、ミラーユニット４に対し入射角を大きくするよう指示を出す。
入射角が約６６度に達すると表面伝播光が発生し、光センサ７，８，９の信号パターンは（透過光，表面伝播光，反射光）＝（０，１，０）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＢと判定し、下表のルールに従い更に入射角を大きくするよう光軸調整を行う。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＢと判定し、ミラーユニット４に対し更に入射角を大きくするよう指示を出す。
入射角が臨界角を超えた瞬間、表面伝播光は消え、代わりに全反射光が発生する。このときの信号パターンは（透過光，表面伝播光，反射光）＝（０，０，１）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＣと判定し、角度調整を停止する。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＣと判定し、ラーユニット４に対し角度調整停止の指示を出す。
また、例えば、基板１がサファイアで媒質が空気の場合の臨界角は約３４度であり、入射角４５度でレーザ光２ａを照射した場合、レーザ光２ａは基板１表面で全反射する。このとき光センサ７，８，９の信号パターンは（透過光，表面伝播光，反射光）＝（０，０，１）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＤと判定し、下表のルールに従い入射角を小さくするよう光軸調整を行う。入射角が３４度に達すると表面伝播光が発生し、光センサ７，８，９の信号パターンは（透過光，表面伝播光，反射光）＝（０，１，０）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＢと判定し、下表のルールに従い入射角を大きくするよう光軸調整を行う。入射角が臨界角を超えた瞬間、表面伝播光は消え、代わりに全反射光が発生する。このときの信号パターンは（透過光，表面伝播光，反射光）＝（０，０，１）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＣと判定し、角度調整を停止する。
なお基板１の屈折率と媒質の屈折率の差が大きい場合や、基板１の表面状態によっては、例えば透過状態であっても基板１表面で一部反射が生じることがある。このため、モードＡおよびＢのときに反射光センサ９が反応する場合がある。

本調整機構により、基板１内でのレーザ光２ａの入射角は常に約６６度（角度は基板１の屈折率と試料溶液の屈折率によって変化する）となり、基板１表面で全反射し、エバネッセント照明となる。これにより、高いＳ／Ｎで蛍光測定が可能になる。なお、レーザの照射領域は約２ｍｍ径とした。
具体的な配列解析方法は、以下の手順に従って行う。測定サンプルである一本鎖核酸を、基板１上に固定されたプライマにハイブリダイズさせる。反応は、例えば、６０℃・１０分間で行う。プライマの配列は、前記一本鎖核酸と少なくとも一部が相補的であればよい。なお、プライマの塩基長は、ハイブリダイゼーション効率を鑑みて１０以上であることが望ましい。
次に、標識されたｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰを逐次添加しながら塩基伸長反応を行い、プライマ下流の塩基配列を解読する。例えば、まずＣｙ３−ｄＡＴＰ及び、ＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液（２０ｎＭＣｙ３−ｄＡＴＰ，０．１Ｕ／μＬＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．８，２ｍＭＭｇＣｌ２）を、基板１上のフラグメントと５分間反応させる。次に、洗浄バッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．８，２ｍＭＭｇＣｌ２）によって、未反応のＣｙ３−ｄＡＴＰを除去する。
各種試薬，バッファーは試薬保管ユニット１０に保管し、分注ユニット１１を介し、送液チューブ１２を通じて基板に送られる。試薬保管ユニット１０には、試料液容器１０ａ、４種の標識ｄＮＴＰ溶液容器１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ，１０ｅ，ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ溶液容器１０ｆ，ポリメラーゼ溶液容器１０ｇ，洗浄バッファー容器１０ｈ等が用意される。反応後の試薬は、廃液チューブ１３を通じて廃液容器１４に溜まる。
波長５３２ｎｍのＹＡＧレーザを励起光として照射し、Ｃｙ３−ｄＡＴＰの取り込みが行われたフラグメントから蛍光１５を発生させる。なお、Ｃｙ３分子から発生する蛍光は、強い励起光の照射で消光するため、観察時にはより低い励起光強度で観察を行うことが望ましい。励起光強度は、例えば、１０００ｍＷ／ｍｍ^２である。消光を抑制する手段としては、脱酸素剤の添加も有効である。これは、Ｃｙ３分子の消光が、溶液中の溶存酸素との反応に起因するためである。脱酸素剤は、例えば、ペルオキシダーゼ，スーパーオキシドディスムターゼなどが使用できる。
蛍光１５は、集光レンズ（対物レンズ）１６で集められ、フィルタユニット１７で必要な波長の蛍光を取り出し、結像レンズ１８で、２次元センサカメラ１９で蛍光像を検出する。フィルタユニット１７には、検出する蛍光に対応したフィルタが複数保持されており、その制御は制御ＰＣ２１が行う。例えば、４種の蛍光色素が付加されたｄＮＴＰを使う場合は、フィルタユニット１７で該当する４種の蛍光体用のフィルタを切り替えて蛍光像を検出することなどで対応できる。２次元センサカメラ１９の露光時間の設定、蛍光画像の取り込みタイミングなどの制御は、２次元センサカメラコントローラ２０を介して制御ＰＣ２１が行う。２次元センサカメラ１９は、例えば、画素サイズが１６×１６μｍで、画素数５１２×５１２画素のＥＭ−ＣＣＤカメラで、蛍光観察時の露光時間は１００ｍｓｅｃである。その他一般的な冷却ＣＣＤカメラの他、Ｃ−ＭＯＳエリアセンサなどの撮像カメラなどを使うことができる。センサは冷却型が望ましく、−２０℃程度以下にすることで、センサの持つダークノイズを低減でき、測定の精度を高めることができる。取り込まれた蛍光観察データはモニタ２２で観察できる。
蛍光観察データをもとにＣｙ３−ｄＡＴＰの取り込みが行われたフラグメントの位置を特定し、配列を決定する。Ｃｙ３蛍光を観察後、強い励起光を照射するなどして、既に取り込まれたＣｙ３−ｄＡＴＰ由来の蛍光が次工程で生じないようにする。以上の一連の反応工程をｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰの順に行う。この操作を８０サイクル行うことで、各フラグメントの固相側のおよそ２０〜３０塩基が解読できる。本実施例では、蛍光色素としてＣｙ３を、励起光源として波長５３２ｎｍのＹＡＧレーザを用いているが、標識分子，光源の組み合わせはこれに限るものではない。
また、本実施例では、１種類の蛍光色素を用い、逐次反応による塩基配列解読を行っているが、別の方式を用いても構わない。例えば、４種類のｄＮＴＰの３′−ＯＨ基に対し、ニトロベンジル基を介して異なる４種類の蛍光色素を結合させた標識ｄＮＴＰを用いる場合、本実施例のようにｄＮＴＰを１種類ずつ反応させなくても良い。すなわち、３′−ＯＨ基の蛍光色素が保護基となり、取り込みが行われた段階でその後の伸長反応が進まなくなる。このことを利用して、塩基配列の解読を行う。例えば、４種類の蛍光標識ｄＮＴＰ及び、ＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液（２０ｎＭ蛍光標識ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ，０．１Ｕ／μＬＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．８，２ｍＭＭｇＣｌ２）を、基板１上のフラグメントと５分間反応させる。次に洗浄バッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．８，２ｍＭＭｇＣｌ２）によって、未反応の蛍光標識ｄＮＴＰを除去する。励起光を照射し２次元センサカメラで前記４種類の蛍光を観察し、各蛍光標識ｄＮＴＰの取り込みが行われたフラグメントを特定し、配列を決定する。４種類の蛍光色素としては、例えばＣｙ３，Ｃｙ５，Ｃｙ５．５，Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を用いることができる。蛍光のクロスコンタミネーションを防ぐため、なるべく蛍光波長帯が離れているものを選択することが好ましい。励起光は、それぞれの蛍光色素の波長特性に適した励起光源を用いるか、バンドパスフィルタ等を用いて多波長光から目的の波長成分を分離して用いる。蛍光も同様に、それぞれの蛍光色素の波長特性に適したバンドパスフィルタ等を用いて、目的の波長成分を分離して蛍光観察を行う。観察後、化学的又は物理的手段によって蛍光色素を切り離し、直前に取り込まれた蛍光標識ｄＮＴＰの３′−ＯＨ基を解放する。切り離す手段は、例えば波長３６０ｎｍ以下のＵＶ照射などである。切り離した蛍光色素を洗浄バッファーにより除去する。以上の一連の操作を複数回行うことで、塩基配列の解読が可能である。
本実施例では、フィルタユニット１７内の４種のフィルタを切り替えて順番に測定するが、４種の蛍光波長を同時に測定することもできる。たとえば、フィルタユニットに変えて２次元分光ユニットを使用すれば、２次元の画像で多色測定が可能である。この場合、プライマは基板上に規則的に配置されていることが望ましい。また、２次元分光ユニットとして、例えば、プリズムなどを光学系の中に配置し、画像の一方向に色分散させることで各プライマ位置からの蛍光を同時に検出し、さらに、４波長帯以上の波長帯を同時に検出することができる。尚、分散幅がプライマの配列ピッチよりも小さくなるようにする。またこの方式では連続的に反応させ、連続的に計測することもできる。
以上の操作により、全反射照明を利用して蛍光観察を行う装置について、基板表面の角度によらず、常に励起光が基板表面で全反射となるよう励起光の入射角を調整する。なお、本実施例では、観察領域で入射角の調整を行っているが、別の領域で調整を行っても良い。例えば、既に蛍光サンプルが固定された基板を観察する際、サンプル固定領域近傍で入射角調整を行うことで、調整に伴うレーザ光の照射によって測定サンプルの蛍光が消光することを防ぐことが可能である。
また、基板全体、つまり、基板の各位置ごとの調整パラメータをあらかじめ測定して記憶しておき、基板の測定位置を変えたときに、その記憶データをもとに入射角度調整を連続的に行うことも可能である。
本実施例によれば、全反射角度のマニュアル調整操作が不要となり、従来法と比較して操作性が向上する。また、基板表面の波打ち等に影響されずに常に全反射角度を一定に保つことが可能なため、従来法と比較して安定性，信頼性が向上する。

実施例１では、３つの光センサで透過光，表面伝播光、及び反射光を検知しているが、これら３つの光を１つの光センサ２３で検出することもできる。具体的には、前述の３種類の光は、直接もしくはミラー等の光学素子によって光センサ２３の区画化された３領域にそれぞれ導かれる。光センサ２３の検知結果は、ミラーユニットコントローラ６へ送られる。ミラーユニットコントローラ６はその情報をもとに、ミラーユニット４を駆動させる。ミラーユニットコントローラ６は実施例１同様、内部に５つのモードを有しており、それぞれのモードごとに決められたルールに従ってミラーユニット４は入射角が全反射角度となるよう自動で調整を行う。若しくは、ミラーユニットコントローラ６は、実施例１同様、内部に５つのモードを有しており、光センサ２３の検知パターンより、モードを判定する。ミラーユニットコントローラ６はミラーユニット４に対し、それぞれのモードごとに決められた動作の指示を出す。ミラーユニット４はこの指示に従って駆動し、レーザ光が基板表面で全反射するよう、入射角を調整する。

実施例１では、透過光，表面伝播光、及び反射光の３つの光を検知しているが、検知する光は透過光と表面伝播光の２つとすることもできる。実施例１同様、基板１表面の測定領域に対し、任意の入射角でレーザ光２ａを照射する。角度は、例えば、４５度である。装置には透過光，表面伝播光を検出するための光センサ７，８が設置されており、これらのセンサの検知結果は、ミラーユニットコントローラ６へ送られる。ミラーユニットコントローラ６はその情報をもとに、ミラーユニット４を駆動させる。駆動は実施例１同様の手段で行う。ミラーユニットコントローラ６は内部に下表に示す５つのモードを有しており、光センサ７，８の検知パターンより、モードを決定する。それぞれのモードごとに決められたルールに従ってミラーユニット４は入射角が全反射角度となるよう自動で調整を行う。若しくは、ミラーユニットコントローラ６は実施例１同様、内部に５つのモードを有しており、光センサ７，８の検知パターンより、モードを判定する。ミラーユニットコントローラ６はミラーユニット４に対し、それぞれのモードごとに決められた動作の指示を出す。ミラーユニット４はこの指示に従って駆動し、レーザ光が基板表面で全反射するよう、入射角を調整する。
例えば、基板１が合成石英で媒質が水の場合、臨界角は約６６度であり、入射角４５度でレーザ光２ａを照射した場合、レーザ光２ａは基板１を透過する。このとき光センサ７，８の信号パターンは（透過光，表面伝播光）＝（１，０）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＡと判定し、下表のルールに従い入射角を大きくするよう光軸調整を行う。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＡと判定し、ミラーユニット４に対し入射角を大きくするよう指示を出す。
入射角が約６６度に達すると表面伝播光が発生し、光センサ７，８の信号パターンは（透過光，表面伝播光）＝（０，１）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＢと判定し、下表のルールに従い更に入射角を大きくするよう光軸調整を行う。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＢと判定し、ミラーユニット４に対し入射角を大きくするよう指示を出す。
入射角が臨界角を超えた瞬間、表面伝播光は消え、代わりに全反射光が発生する。このときの信号パターンは（透過光，表面伝播光）＝（０，０）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＣと判定し、角度調整を停止する。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＣと判定し、ミラーユニット４に対し角度調整停止の指示を出す。
本実施例では、透過光用と表面伝播光用の光センサを別々に用意しているが、実施例２のように１つの光センサの区画化された２領域に導く方式であっても良い。

実施例１では、透過光，表面伝播光、及び反射光の３つの光を検知しているが、検知する光は表面伝播光と反射光の２つでも実現できる。実施例１同様、基板１表面の測定領域に対し、任意の入射角でレーザ光２ａを照射する。角度は、例えば４５度である。装置には表面伝播光，反射光を検出するための光センサ８，９が設置されており、これらのセンサの検知結果は、ミラーユニットコントローラ６へ送られる。ミラーユニットコントローラ６はその情報をもとに、ミラーユニット４を駆動させる。駆動は実施例１同様の手段で行う。ミラーユニットコントローラ６は内部に下表に示す５つのモードを有しており、光センサ８，９の検知パターンより、モードを決定する。それぞれのモードごとに決められたルールに従ってミラーユニット４は入射角が全反射角度となるよう自動で調整を行う。若しくは、ミラーユニットコントローラ６は実施例１同様、内部に５つのモードを有しており、光センサ８，９の検知パターンより、モードを判定する。ミラーユニットコントローラ６はミラーユニット４に対し、それぞれのモードごとに決められた動作の指示を出す。ミラーユニット４はこの指示に従って駆動し、レーザ光が基板表面で全反射するよう、入射角を調整する。
例えば、基板１が合成石英で媒質が水の場合、臨界角は約６６度であり、入射角４５度でレーザ光２ａを照射した場合、レーザ光２ａは基板１を透過する。このとき光センサ８，９の信号パターンは（表面伝播光，反射光）＝（０，０）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＡと判定し、下表のルールに従い入射角を大きくするよう光軸調整を行う。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＡと判定し、ミラーユニット４に対し入射角を大きくするよう指示を出す。
入射角が約６６度に達すると表面伝播光が発生し、光センサ８，９の信号パターンは（表面伝播光，反射光）＝（１，０）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＢと判定し、下表のルールに従い更に入射角を大きくするよう光軸調整を行う。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＢと判定し、ミラーユニット４に対し入射角を大きくするよう指示を出す。
入射角が臨界角を超えた瞬間、表面伝播光は消え、代わりに全反射光が発生する。このときの信号パターンは（表面伝播光，反射光）＝（０，１）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＣと判定し、角度調整を停止する。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＣと判定し、ミラーユニット４に対し角度調整停止の指示を出す。本実施例では、表面伝播光用と反射光用の光センサを別々に用意しているが、実施例２のように１つの光センサの区画化された２領域に導く方式であっても良い。

実施例１では、透過光，表面伝播光、及び反射光の３つの光を検知しているが、検知する光は表面伝播光のみでも実現できる。実施例１同様、基板１表面の測定領域に対し、入射角９０度でレーザ光２ａを照射する。装置には表面伝播光を検出するための光センサ８が設置されており、この検知結果はミラーユニットコントローラ６へ送られる。ミラーユニットコントローラ６はその情報をもとに、ミラーユニット４を駆動させる。駆動は実施例１同様の手段で行う。ミラーユニットコントローラ６は内部に下表に示す４つのモードを有しており、光センサ８の検知パターンより、モードを決定する。それぞれのモードごとに決められたルールに従ってミラーユニット４は入射角が全反射角度となるよう自動で調整を行う。若しくは、ミラーユニットコントローラ６は内部に下表に示す４つのモードを有しており、光センサ８の検知パターンより、モードを判定する。ミラーユニットコントローラ６はミラーユニット４に対し、それぞれのモードごとに決められた動作の指示を出す。ミラーユニット４はこの指示に従って駆動し、レーザ光が基板表面で全反射するよう、入射角を調整する。
例えば、基板１が合成石英で媒質が水の場合、臨界角は約６６度であり、入射角９０度でレーザ光２ａを照射した場合、レーザ光２ａは基板１を透過する。このとき光センサ８の信号パターンは（表面伝播光）＝（０）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＡと判定し、下表のルールに従い入射角を大きくするよう光軸調整を行う。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＡと判定し、ミラーユニット４に対し入射角を大きくするよう指示を出す。
入射角が６６度に達すると表面伝播光が発生し、光センサ８の信号パターンは（表面伝播光）＝（１）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＢと判定し、下表のルールに従い更に入射角を大きくするよう光軸調整を行う。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＢと判定し、ミラーユニット４に対し入射角を大きくするよう指示を出す。
入射角が臨界角を超えた瞬間、表面伝播光は消え、代わりに全反射光が発生する。このときの信号パターンは（表面伝播光）＝（０）となる。この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＣと判定し、角度調整を停止する。若しくは、この信号パターンを受け、ミラーユニットコントローラ６はモードＣと判定し、ミラーユニット４に対し角度調整停止の指示を出す。

本発明は、単分子蛍光観察に有用である。したがって、生物，化学，医療等を含むライフサイエンス分野において幅広く利用可能である。

１基板
２レーザ装置
２ａレーザ光
３ λ／４波長板
４ミラーユニット
５プリズム
６ミラーユニットコントローラ
７透過光用光センサ
８表面伝播光用光センサ
９反射光用光センサ
１０試薬保管ユニット
１０ａ試料液容器
１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ，１０ｅ標識ｄＮＴＰ溶液容器
１０ｆｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ溶液容器
１０ｈ洗浄バッファー容器
１０ｇポリメラーゼ溶液容器
１１分注ユニット
１２送液チューブ
１３廃液チューブ
１４廃液容器
１５蛍光
１６対物レンズ
１７フィルタユニット
１８結像レンズ
１９２次元センサカメラ
２０２次元センサカメラコントローラ
２１制御ＰＣ
２２モニタ
２３光センサ

Claims

表面に測定試料が配置された基板と、
前記基板に励起光を照射する光源と、
前記基板から生じる発光を測定する検出器と、
前記励起光が前記へ入射することにより生じる透過光、又は表面伝播光の少なくとも１つを検知する光センサと、
前記光センサの検知パターンをもとに励起光の入射角が全反射角となるよう入射角を調整する調整装置と、
を有することを特徴とする全反射蛍光観察装置。
請求項１記載の全反射蛍光観察装置において、
前記基板が、光を透過する部材で形成されていることを特徴とする装置。
請求項１記載の全反射蛍光観察装置において、
前記制御機構が、透過光，表面伝播光、及び反射光の検知結果の組み合わせから、現在の入射角の状態を判定することを特徴とする装置。
表面に測定試料が配置された基板と、
前記基板に励起光を照射する光源と、
前記基板から生じる発光を測定する検出器と、
前記基板に照射後の前記励起光を検知する光センサと、
前記光センサの検知結果に基づいて励起光の入射角を調整する調整装置と、
を有し、
前記制御機構が、透過光，表面伝播光、及び反射光の検知結果の組み合わせから、現在の入射角の状態を判定することを特徴とする装置。
請求項１または４記載の全反射蛍光観察装置において、
前記制御機構が、現在の入射角の状態をもとに、駆動機構に対し次の動作を指示するためのアルゴリズムを内部に備えていることを特徴とする装置。
全反射照明を利用して蛍光観察を行う装置において、励起光の入射角を自動的に調整する方法であって；
表面に測定試料が配置された基板に対し、励起光の入射角を連続的に変化させ；
前記励起光が前記基板へ入射することにより生じる透過光，表面伝播光、及び反射光を光センサで検知し；
入射角制御機構が、光センサの検知パターンをもとに励起光の入射角が全反射角となるよう入射角を調整する；
方法。
全反射照明を利用して蛍光観察を行う装置において、励起光の入射角を自動的に調整する方法であって；
表面に測定試料が配置された基板に対し、励起光の入射角を連続的に変化させ；
前記励起光が前記基板へ入射することにより生じる透過光、又は表面伝播光の少なくとも１つを光センサで検知し；
入射角制御機構が、光センサの検知パターンをもとに励起光の入射角が全反射角となるよう入射角を調整する；
方法。
全反射照明を利用して蛍光観察を行う装置において、励起光の入射角を自動的に設定する方法であって；
表面に測定試料が配置された基板に対し、励起光の入射角を連続的に変化させ；
前記励起光が前記基板へ入射することにより生じる表面伝播光を光センサで検知し；
入射角制御機構が、光センサの検知パターンをもとに励起光の入射角が全反射角となるよう入射角を調整する；
方法。