JP2008215823A - 蛍光センサ - Google Patents

Abstract

【課題】励起光の影響を受けずに蛍光を精度良く検出可能で、しかも小型かつ安価に形成できる蛍光センサを得る。
【解決手段】試料１中の検出対象物質２の存在を示す蛍光体１０を集めるセンサ部２０と、前記蛍光体１０を励起する励起光８を発する励起光源７とを備えてなる蛍光センサにおいて、励起光源７の他に、励起光８とは波長が異なって実質的に蛍光体１０を励起することがない光４０を前記センサ部２０に照射する別の光源４１を少なくとも１つ設ける。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光法により試料中の特定物質を検出する蛍光センサに関するものである。

従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光法が広く用いられている。この蛍光法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光体で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。

図２は、上記の標識された物質を用いる蛍光法を実施するセンサの一例を概略図示するものである。本例の蛍光センサは一例として試料１に含まれる抗原２を検出するためのものであり、基板３には抗原２と特異的に結合する１次抗体４が塗布されている。そしてこの基板３上に設けられた試料保持部５の中において試料１が流され、次いで同様に蛍光体１０で標識されて抗原２と特異的に結合する２次抗体６が流される。その後、基板３の表面部分に向けて励起光源７から励起光８が照射され、また光検出器９により蛍光検出がなされる。このとき、光検出器９によって所定の蛍光が検出されたなら、上記２次抗体６と抗原２との結合、すなわち試料中における抗原２の存在を確認できることになる。

なお以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは２次抗体６であるが、この２次抗体６は抗原２と結合しなければ流されてしまって基板３上に存在し得ないものであるから、この２次抗体６の存在を確認することにより、間接的に検出対象物質である抗原２の存在が確認されることとなる。

また、光検出器９を用いずに人間が目視で蛍光を検出するようにしても、２次抗体６の存在を確認可能である。例えば、家庭で用いられるような簡易型のセンサを形成する場合は、コストを低く抑える観点から、光検出器を用いない構成が好適に採用される。

とりわけここ数年は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化が進んでいることもあって、以上述べた蛍光法はバイオ研究には欠かせない手段となっており、さらにバイオ以外の分野においても広範に利用されている。特に可視領域では、例えばFITC（蛍光波長：５２５ｎｍ、量子収率：０．６）や、Cy５（蛍光波長：６８０ｎｍ、量子収率：０．３）のように、実用の目安となる０．２を超える高い量子収率を持つ蛍光色素が開発されており、蛍光法の応用分野がさらに拡大することが期待されている。

しかしながら、図２に示したような従来の蛍光センサでは、基板と試料との界面における励起光の反射／散乱光や、検出対象物質以外の不純物／浮遊物Ｍ等による散乱光がノイズとなるため、せっかく光検出器を高性能化しても蛍光検出におけるＳ／Ｎは向上しないのが実情であった。

これに対する解決法として、従来、エバネッセント波を用いる蛍光法が提案されている。この方法を実施する蛍光センサの一例を図３に概略的に示す。なおこの図３において、図２中の要素と同等の要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する（以下、同様）。

この蛍光センサにおいては、前述の基板３に代わるものとしてプリズム（誘電体ブロック）１３が用いられ、その上には金属膜２０が形成されている。そして励起光源７からの励起光８が、このプリズム１３と金属膜２０との界面で全反射する条件で、プリズム１３を通して照射される。この構成においては、励起光８が上記界面で全反射するとき該界面近傍に染み出すエバネッセント波１１により２次抗体６が励起される。そして蛍光検出は、試料１に対してプリズム１３と反対側（図中では上方）に配された光検出器９によってなされる。

この蛍光センサにおいて、励起光８は図中の下方に全反射するので、上方から蛍光を検出するに当たり、励起光検出成分が蛍光検出信号に対するバック・グラウンドとなってしまうことがない。またエバネッセント波１１は上記界面から数百ｎｍの領域にしか到達しないので、試料中の不純物／浮遊物Ｍからの散乱を殆ど無くすことができる。そのため、このエバネッセント蛍光法は、従来の蛍光法と比べて（光）ノイズを大幅に低減でき、検出対象物質を１分子単位で蛍光測定できる方法として注目されている。

なお図３に示したものは、エバネッセント蛍光法による蛍光センサの中でも、特に高感度化を図った表面プラズモン増強蛍光センサである。この表面プラズモン増強蛍光センサにおいては金属膜２０が形成されていることにより、励起光８が照射されたとき該金属膜２０中に表面プラズモンが生じ、その電界増幅作用によって蛍光が増幅されるようになる。あるシミュレーションによると、その場合の蛍光強度は１０００倍程度まで増幅されることが判っている。

この種の表面プラズモン増強蛍光センサについては、例えば特許文献１に詳しい記載がなされている。また、例えば非特許文献１に記載があるように、特に表面プラズモン増強は利用しないで、エバネッセント蛍光法による蛍光検出を行う蛍光センサも知られている。その場合は図３に示した金属膜２０が省かれて、プリズム１３に直接試料が接する状態とされ、それら両者の界面から染み出すエバネッセント波１１により２次抗体６等の蛍光体が励起される。

なお、上記の表面プラズモン増強蛍光センサにおいては、非特許文献２に示されているように、試料中の蛍光体と金属膜とが接近し過ぎていると、蛍光体内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得る。この金属消光に対処するために非特許文献２には、金属膜の上にＳＡＭ（自己組織化膜）を形成し、それにより試料中の蛍光体と金属膜とを該ＳＡＭの厚さ以上離間させることが提案されている。なお図３でも、このＳＡＭに番号２１を付けて示してある。
特許第３５６２９１２号公報 「バイオイメージングでここまで理解る」p.104-113 楠見明弘他著 羊土社 W.Knoll他、Analytical Chemistry（Anal.Chem.）75(2003) p.2610 Guang S.He 他「Optical limiting effect in a two-photon absorption dye doped solid matrix」,Applied Physics Letters67(17),23 October 1995 pp.2433-2435

ところで、以上説明したような蛍光センサにおいては、現状で標識として使用されている蛍光体の励起波長と蛍光波長との差（いわゆる「ストークスシフト」）が比較的小さいため、プリズム中の不純物により散乱した励起光が蛍光検出用の光検出器によって検出されてしまい、それにより測定信号のＳ／Ｎが低下するという問題が認められる。例えば前述のCy５にあっては、励起波長６３５〜６４５ｎｍに対して蛍光波長は６８０ｎｍであり、ストークスシフトは高々４０ｎｍ程度である。そこで蛍光検出の際には、光検出器の直前にバンドパスフィルターのような、シャープカット・フィルターと呼ばれる波長分離フィルターを設けることが普通に行われている。

しかしながら、この種のフィルターの波長分離能力は、上述のようなストークスシフトに対応するには不十分であるため、測定信号に光ノイズの混入が残ることが多い。また、この種のフィルターは概して透過率がかなり低いので、検出できる蛍光量が減少してしまい、この点から測定信号のＳ／Ｎ低下を招くこともある。さらにこの種のフィルターは高価であるので、それを用いた場合には蛍光センサのコストアップを招くという不都合も認められる。

以上、プリズム（誘電体ブロック）を用いてエバネッセント波により蛍光体を励起するようにした蛍光センサにおける問題について説明したが、プリズムを用いない構成においても、何らかの理由により励起光が光検出器に検出されたり、あるいは目視で蛍光を検出しようとするセンサ使用者の目に入ったりすると、同様に蛍光検出の精度が損なわれることになる。

本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、励起光の影響を受けずに蛍光を精度良く検出可能で、しかも小型かつ安価に形成できる蛍光センサを提供することを目的とする。

本発明による蛍光センサは、前述したように、
試料中の検出対象物質の存在を示す蛍光体を集めるセンサ部と、
前記蛍光体を励起する励起光を発する励起光源とを備えてなる蛍光センサにおいて、
励起光源の他に、励起光とは波長が異なって実質的に前記蛍光体を励起することがない光を前記センサ部に照射する別の光源が少なくとも１つ設けられていることを特徴とするものである。

なお、この本発明による蛍光センサはより望ましくは、
前記励起光を透過させる材料から形成された誘電体ブロックと、
この誘電体ブロックの前記センサ部となる一表面の近傍位置に試料を保持する試料保持部と、
前記励起光を、前記一表面部分の誘電体ブロックとその外側の媒質との界面に向けて、全反射条件を満たすように誘電体ブロックを通して入射させる励起光入射光学系とが設けられて、エバネッセント蛍光法により蛍光検出するものとされる。

また、上述のようにエバネッセント蛍光法により蛍光検出する構成を有する場合、さらに望ましくは、誘電体ブロックの一表面に金属膜が形成された上で、前記入射光学系が、この金属膜と誘電体ブロックとの界面に向けて励起光を入射させるように構成される。そしてそのように構成される場合、上記金属膜の上には、疎水性材料からなる不撓性膜が形成されることが望ましい。

本発明の蛍光センサは、励起光源の他に、励起光とは波長が異なって実質的に蛍光体を励起することがない光をセンサ部に照射する別の光源が少なくとも１つ設けられているので、例えば前述したプリズムの部分で散乱した励起光は、人間の目には、その別の光源からの光と混合して別の波長域の光として視認されるようになる。その別の波長域の光は、上記別の光源からの光の波長次第で、一般に励起光と色の違いが僅少である蛍光と大きく色が異なるものとすることができる。そこで検出対象の蛍光は、プリズムの部分で散乱する等した励起光と明確に弁別して、精度良く視認されるようになる。

そしてこの本発明による蛍光センサは、互いに波長差が小さい励起光と蛍光とを弁別するために従来装置のように高価なシャープカット・フィルター等を用いる必要も無いものであるから、その種の従来装置と比較して安価に形成可能となる。

なお、この本発明による蛍光センサが、誘電体ブロックを用いてエバネッセント蛍光法により蛍光検出するものである場合は、本来誘電体ブロックにおいて励起光が散乱しやすくなっていても、その影響を確実に回避できるので、蛍光を精度良く視認できる効果が特に顕著なものとなる。

また本発明の蛍光センサにおいて、特に誘電体ブロックの一表面に金属膜が形成された上で、前記入射光学系が、この金属膜と誘電体ブロックとの界面に向けて励起光および前記別の光を入射させるように構成された場合は、金属膜において発生する表面プラズモンセンサの電界増幅作用によって蛍光が増幅されるので、蛍光をより明確に視認可能となる。

そしてその場合、特に上記金属膜の上に、疎水性材料からなる不撓性膜が形成されている場合は、例えば液体状の試料中の蛍光体が金属膜に対して、金属消光が起きる程度まで近接してしまうことが防止される。そこでこの場合は前述のような金属消光を招くことがなくなり、表面プラズモンによる電場増幅作用を確実に得て、高感度で蛍光を視認可能となる。

また、特に不撓性膜が疎水性材料から形成されていれば、液体状の試料中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる分子が該不撓性膜の内部にまで入り込むことが無く、よってそれらの分子が励起光の励起エネルギーを奪ってしまうことが防止される。そこでこの場合は、極めて高い励起エネルギーが確保され、極めて高い感度で蛍光を視認可能となる。

なお、上記の「不撓性」とは、センサを普通に使用しているうちに膜厚が変わってしまうほどに変形することが無い程度の剛性を備えていることを意味するものとする。

以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。

図１は、本発明の一実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサ（以下、単に蛍光センサという）を示す概略側面図である。図示の通りこの蛍光センサは、例えば波長６５０ｎｍ の励起光８を発する半導体レーザ等の励起光源７と、上記励起光８を透過させる材料からなり、この励起光８が一端面から入射する位置に配されたプリズム（誘電体ブロック）１３と、このプリズム１３の一表面１３ａに形成された金属膜２０と、この金属膜２０の上に形成されたポリマーからなる不撓性膜３１と、プリズム１３と反対側から不撓性膜３１に液体状試料１が接するように該試料１を保持する試料保持部５と、センサ部となる上記金属膜２０の部分に向けて例えば波長５００ｎｍの光４０を照射する発光ダイオード（LED）等の光源４１とを備えてなるものである。

本実施形態では励起光源７が、励起光８を、プリズム１３と金属膜２０との界面に向けて、全反射条件を満たすようにプリズム１３を通して入射させるように配置されている。つまりこの励起光源７自体が、プリズム１３に対して励起光８を上述のように入射させる励起光入射光学系を構成している。しかしこのような構成に限らず、励起光８を上述のように入射させるレンズやミラーなどからなる入射光学系を、励起光源７とは別途設けるようにしても構わない。さらには、上記光４０を金属膜２０の部分に導く光学系を別途設けてもよい。

プリズム１３は一例として、日本ゼオン株式会社製 ZEONEX（登録商標） 330Ｒ（屈折率1.50）からなるものである。一方金属膜２０は、プリズム１３の一表面１３ａ上に金をスパッタして形成されたものであり、膜厚は５０ｎｍとされている。また不撓性膜３１は、金属膜２０の上に屈折率1.59のポリスチレン系ポリマーをスピンコートして形成されたものであり、膜厚は２０ｎｍとされている。

なお、プリズム１３は上記材料の他、公知の樹脂や光学ガラスを用いて適宜形成することができる。コストの点からは、光学ガラスよりも樹脂の方がより好ましいと言える。樹脂から形成する場合は、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリカーボネイト（PC）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（APO）等の樹脂を好適に用いることができる。

この蛍光センサが検出対象としているのは、一例としてCRP抗原２（分子量11万 Da）であり、それと特異的に結合する１次抗体（モノクロナール抗体）４が上記不撓性膜３１の上に固定されている。この１次抗体４は、例えば末端をカルボキシル基化したPEGを介して、アミンカップリング法により、上記ポリマーからなる不撓性膜３１に固定される。一方２次抗体６としては、蛍光体（蛍光色素： Cy５）１０で標識化したモノクロナール抗体（１次抗体４とはエピトープ ＜epitope;抗原決定基＞が異なる）が用いられる。

上記アミンカップリング法は一例として次の（１）〜（３）のステップからなるものである。なおこれは、30μｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。

（１）リンカー先端（末端）の-COOH基を活性化
０.１molのNHSと０.４molのEDCとを等体積混合した溶液を30μｌ加え、３０分間室温静置。なお、
NHS：N-hydrooxysuccinimide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
である。

（２）1次抗体４の固定化
PBSバッファ（pH7.4）で5回洗浄後、1次抗体溶液（500μg/ｍｌ）を30μｌ加え、３０〜６０分間室温静置
（３）未反応の -COOH基をブロッキング
PBSバッフア（pH7.4）で5回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（pH8.5）を30μｌ加え、20分間室温静置。さらにPBSバッフア（pH7.4）で5回洗浄。

一方、励起光源７としては上記半導体レーザに限らず、その他の公知の光源を適宜選択使用可能である。また励起波長を変えれば、Ｃｙ５以外の蛍光体を標識として用いることもできる。

以下、この蛍光センサの作用について説明する。まず試料保持部５の中において液体状の試料１が流され、次いで同様に蛍光体１０で標識されてCRP抗原２と特異的に結合する２次抗体６が流される。

その後、プリズム１３に向けて励起光源７から励起光８が照射される。このとき、プリズム１３と金属膜２０との界面からエバネッセント波１１が染み出すようになる。そこで、もし１次抗体４にCRP抗原２が結合していれば、さらに該抗原２に２次抗体６が結合し、その２次抗体６の標識である蛍光体１０がエバネッセント波１１によって励起されることとなる。励起された蛍光体１０はピーク波長が６８０ｎｍの蛍光４２を発し、その蛍光４２は例えば分析実施者の目によって視認される。こうして蛍光４２が視認された場合は、それにより、CRP抗原２に２次抗体６が結合していること、すなわち試料１にCRP抗原２が含まれていることを確認可能となる。

なお上記エバネッセント波１１は、プリズム１３と金属膜２０との界面から数百ｎｍ程度の領域にしか到達しない。そこで、試料１中の不純物／浮遊物による励起光の散乱は略皆無とすることができる。

上述のようにして蛍光検出する際、励起光８がプリズム１３中の不純物によって散乱することがあり、その散乱光は前述した全反射の条件を満足しなくなって、一部が金属膜２０を抜けて上方に出射することがある。この励起光８の波長は６５０ｎｍであって波長６８０ｎｍの蛍光４２と同様に赤色領域にあるので、それら両者を目視により弁別するのは困難である。そうであると、実際に蛍光４２が発せられたかどうか、すなわち試料１中にCRP抗原２が存在するのかどうかを判断することが難しくなる。

本実施形態の蛍光センサにおいては、このような不具合を無くすために前述の光源４１が設けられており、この光源４１は蛍光検出に際して励起光源７とともに駆動される。光源４１から出射して金属膜２０の部分に向かう波長５００ｎｍの光４０は、励起光８と同様にプリズム１３内の不純物において散乱して、一部が金属膜２０を抜けて上方に出射する。そこで分析実施者には、この波長５００ｎｍの光４０と波長６５０ｎｍの励起光８とが混合した光４３が観察されるようになる。この光４３は、人間の目には概ね黄色の光として視認されるので、赤色領域の光とは明確に弁別可能である。そこで分析実施者は、金属膜２０の部分に光を視認したとき、その光が黄色であれば蛍光４２は生じていないと判断でき、一方その光がほぼ赤色（波長５００ｎｍの光４０と波長６５０ｎｍの励起光８と波長６８０ｎｍの蛍光４２が混合したもの）であれば蛍光４２が生じている、つまり試料１中にCRP抗原２が存在すると判断できることになる。

また本実施形態の蛍光センサにおいては、金属膜２０の上に膜厚が２０ｎｍの不撓性膜３１が設けられているので、試料１中の蛍光体１０が金属膜２０に対して、金属消光が起きる程度まで近接してしまうことが防止される。そこでこの蛍光センサによれば、前述のような金属消光を招くことがなくなり、表面プラズモンによる電場増幅作用を確実に得て、高感度で蛍光を検出可能となる。

そして上記不撓性膜３１は疎水性材料であるポリスチレン系ポリマーから形成されているので、液体状の試料１中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる分子が該不撓性膜３１の内部に入り込むことが無く、よってそれらの分子が励起光８の励起エネルギーを奪ってしまうことが防止される。そこでこの蛍光センサによれば、極めて高い励起エネルギーが確保され、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。

なお、この蛍光センサにおいて、CRP抗原２と結合しないで不撓性膜３１の表面から離れている２次抗体６は、そこまでエバネッセント波１１が届かないので蛍光を発することがない。そこで、試料１中でそのような２次抗体６が浮遊していても測定上問題が無いので、測定毎に洗浄つまりＢ／Ｆ分離（バウンド／フリー分離）を行う必要もない。

また、図１中に破線で示す光検出器９を設けて、分析実施者が蛍光４２を視認したとき、その蛍光の強度を該光検出器９で検出するようにしてもよい。その蛍光強度は、試料１中にCRP抗原２が多く存在するほど高くなるので、その検出蛍光強度に基づいてCRP抗原２を定量分析することも可能になる。

また、励起光８とともに金属膜２０の部分に入射させる光４０の波長や数は、以上説明した実施形態のものに限定されるものではない。すなわち、例えば赤色領域の励起光とともにシアン領域の光４０をセンサ部に入射させれば、それらが混合した光４３は白色光となり、それも赤色領域の蛍光４２と明確に弁別可能となる。また、上記シアン領域の光４０に代えて、青色領域および緑領域の２つの光を用いても、同様に混合した光４３は白色光となる。

また本発明の蛍光センサは、前述した金属膜２０を省いて、表面プラズモン増強は行わないように構成することも可能であるし、さらにはエバネッセント波１１で蛍光体１０を励起することはしないで、通常の伝搬光である励起光によって蛍光体１０を励起するように構成することも可能である。そのようないずれの構成においても、励起光とともに別の光をセンサ部に入射させることにより、先に説明した通りの効果を同様に得ることができる。

本発明の一実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサを示す概略側面図 従来の蛍光センサの一例を示す概略側面図 従来の蛍光センサの別の例を示す概略側面図

符号の説明

１ 試料
２ 抗原
４ １次抗体
６ ２次抗体
７ 励起光源
８ 励起光
９ 光検出器
１０ 蛍光体
１１ エバネッセント波
１３ プリズム（誘電体ブロック）
２０ 金属膜
３１ 不撓性膜
４０ 励起光以外の別の光
４１ 光源
４２ 蛍光
４３ 励起光と別の光が混合した光

Claims (4)

1. 試料中の検出対象物質の存在を示す蛍光体を集めるセンサ部と、
   前記蛍光体を励起する励起光を発する励起光源とを備えてなる蛍光センサにおいて、
   前記励起光源の他に、前記励起光とは波長が異なって実質的に前記蛍光体を励起することがない光を前記センサ部に照射する別の光源が少なくとも１つ設けられていることを特徴とする蛍光センサ。
2. 前記励起光を透過させる材料から形成された誘電体ブロックと、
   この誘電体ブロックの前記センサ部となる一表面の近傍位置に試料を保持する試料保持部と、
   前記励起光を、前記一表面部分の誘電体ブロックとその外側の媒質との界面に向けて、全反射条件を満たすように誘電体ブロックを通して入射させる励起光入射光学系とを備えていることを特徴とする請求項１記載の蛍光センサ。
3. 前記誘電体ブロックの一表面に金属膜が形成されており、
   前記入射光学系が、この金属膜と誘電体ブロックとの界面に向けて励起光を入射させるように構成されていることを特徴とする請求項２記載の蛍光センサ。
4. 前記金属膜の上に、疎水性材料からなる不撓性膜が形成されていることを特徴とする請求項３記載の蛍光センサ。

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