JP5021055B2 - 金属微粒子を用いた質量分析方法 - Google Patents
金属微粒子を用いた質量分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5021055B2 JP5021055B2 JP2010125259A JP2010125259A JP5021055B2 JP 5021055 B2 JP5021055 B2 JP 5021055B2 JP 2010125259 A JP2010125259 A JP 2010125259A JP 2010125259 A JP2010125259 A JP 2010125259A JP 5021055 B2 JP5021055 B2 JP 5021055B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sugar chain
- metal
- group
- substituted
- alkylene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
- C07C323/10—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
- C07C323/11—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
- C07C323/12—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D339/00—Heterocyclic compounds containing rings having two sulfur atoms as the only ring hetero atoms
- C07D339/02—Five-membered rings
- C07D339/04—Five-membered rings having the hetero atoms in positions 1 and 2, e.g. lipoic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
- C07H15/08—Polyoxyalkylene derivatives
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
、硫黄原子を含む有機残基誘導体を質量分析する方法に関する。本発明は、そのような質
量分析方法に用いる金属−有機残基複合体およびその製造方法に関する。本発明はまた、
本発明の金属−有機残基複合体を用いた糖鎖または糖鎖含有物質の捕捉方法、および金属
−有機残基複合体の有機残基と相互作用しうる物質の分子量を測定する方法に関する。本
発明はさらに、糖鎖捕捉用組成物または糖鎖もしくは糖鎖含有物質の質量分析用キットに
関する。
結合位置、アノメリシティ等の多様性により極めて複雑な上、糖鎖生合成は多数の糖鎖合
成関連酵素により行われるため、遺伝子やタンパク質の発現解析でその発現パターンを明
らかにすることができない。加えて、同一のタンパク質、脂質に結合する糖鎖構造には不
均一性があり、しばしば1つのタンパク質に複数の糖鎖が結合するため、タンパク質より
も高感度の解析技術が必然的に必要となる。
組織化膜が大いに期待される。一般に、金属(例えば、Au、Ag、Cuなど)基板をチ
オール誘導体溶液に浸漬すると、金属表面上にチオール誘導体が吸着し、分子間の相互作
用(例えば、ファンデルワールス力)によって、分子がナノメーターレベルで二次元方向
に規則的に整列することが知られている。分子が自発的に集合し、整列した組織を形成す
ることから、この形成された膜は「自己集合単分子膜」または「自己組織化膜」と呼ばれ
る。金属の表面を有機膜で被覆できることを利用して、機能性分子または生体分子(糖鎖
またはタンパク質など)を金属表面に固定したり、または金属表面を改変する研究が多く
の研究者によって行われている。
グする手法が報告されている(例えば、特許文献1参照)。しかしながら、この手法は、
金−液界面近傍の溶液の屈折率の変化で糖鎖の固定化を間接的にモニタリングしているに
過ぎず、糖鎖の正確な情報が得られているわけではない。
び分子生物学の分野において特に有用となってきている。この手法は、測定前に蛍光色素
または放射性標識を被検体に直接的に結合させて解析するという煩雑さを省き、高速で正
確な情報を提供できるという利点を有する。これまでに、金基板に結合したチオール化合
物がMALDI−TOF Massのレーザーで切断されて検出されるという報告がMr
ksichらによってなされている(例えば、非特許文献1参照)。しかし、金基板表面
上にたった一分子のチオール化合物が二次元方向に並んだ単分子膜をレーザーで切断する
ため、検出されるチオール化合物の絶対量が極めて微量であり、検出の際に夾雑物(例え
ば、バッファーまたは塩など)の影響を受けやすく、その結果感度が低下するおそれがあ
る。
訳後修飾解析を含めた次世代プロテオームを含めたグライコームにおいて極めて重要であ
り、その開発は渇望されている。
つ正確に解析でき、将来の糖鎖構造解析に応用できる新しい質量分析法を提供することに
ある。
度も金属表面に照射すること)が可能な金属表面を提供することにより高感度化が達成さ
れることを見出した。また、そのような金属表面に導入したチオール化合物がMALDI
−TOF MS法のみならず、低分子マトリックスを必要としないLDI−TOF MS
法によるレーザー照射によっても、金属との結合部分が切断・イオン化され、高感度に観
測されることを確認できたことにより、上記課題を解決した。
黄原子を含む有機残基誘導体をイオン化することを特徴とする、該硫黄原子を含む有機残
基誘導体を質量分析する方法。
(R−S)n−M1 (I)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子であり、M1は金属であり、nはM1に対す
る(R−S)基の化学量論比を表し、1以上の整数である)
で表される金属−有機残基複合体から硫黄原子を含む有機残基誘導体をイオン化すること
を特徴とする、
一般式(II):
R−SH (II)
(式中、RおよびSは前記と同意義である)で表される化合物もしくはその塩、および/
または
一般式(III):
R−S−S−R (III)
(式中、RおよびSは前記と同意義である)で表される化合物もしくはその塩、
を質量分析する方法。
M1−S−X−CH(R)−S−M1 (IV)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子であり、両端のM1は同一実体の金属であり
、Xは低級アルキレンまたは低級アルケニレンである)
で表される金属−有機残基複合体から硫黄原子を含む有機残基誘導体をイオン化すること
を特徴とする、
一般式(V):
HS−X−CH(R)−SH (V)
(式中、R、SおよびXは前記と同意義である)で表される化合物もしくはその塩、およ
び/または
一般式(VI):
を質量分析する方法。
1)金属が以下の式:
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH(CH3)、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−W1−O−NH2、
−S−W1−O−NH(CH3)、
−S−W1−O−W2−O−NH2、
−S−W1−O−W2−O−NH(CH3)、
−S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH2、
−S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH(CH3)、
−S−W1−C(=O)−NH−NH2、
−S−W1−C(=S)−NH−NH2、
−S−W1−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−W1−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−O−NH2、
−S−Z1−O−Z3−O−NH(CH3)、
−S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、または
る条件下で接触させる工程、
2)該糖鎖または該糖鎖含有物質が結合した金属−有機残基複合体を得る工程、および
3)得られた金属−有機残基複合体から硫黄原子を有する有機残基誘導体をイオン化する
工程、
を包含する、糖鎖または糖鎖含有物質を質量分析する方法。
記載の方法。
ずれかに記載の方法。
れかに記載の方法。
記載の方法。
ずれかに記載の方法。
原子を含む被検体をイオン化することを特徴とする、該硫黄原子を含む被検体を質量分析
する方法。
1)還元剤の存在下、テトラクロロ金酸および硫黄原子を有する被検体を反応させる工程
、
2)金微粒子に該硫黄原子を介して被検体が結合した金−被検体複合粒子を得る工程、お
よび
3)得られた金−被検体複合粒子から硫黄原子を有する被検体をイオン化する工程、
を包含する、硫黄原子を有する被検体を質量分析する方法。
13に記載の方法。
はそれらの混合溶媒からなる群から選択される溶媒中で行う、項目13に記載の方法。
り精製する、項目13に記載の方法。
の方法。
。
たは酵素反応に付し、反応系中の金属−被検体複合粒子から硫黄原子を有する被検体をイ
オン化することを特徴とする、該化学反応または酵素反応の進行を確認する方法。
記載の方法。
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH(CH3)、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−W1−O−NH2、
−S−W1−O−NH(CH3)、
−S−W1−O−W2−O−NH2、
−S−W1−O−W2−O−NH(CH3)、
−S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH2、
−S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH(CH3)、
−S−W1−C(=O)−NH−NH2、
−S−W1−C(=S)−NH−NH2、
−S−W1−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−W1−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−O−NH2、
−S−Z1−O−Z3−O−NH(CH3)、
−S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、または
12アルケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであ
り;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S
)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)
で表される基と結合した金属−有機残基複合体。
体。
12アルケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであ
り;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S
)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)
で表される化合物もしくはその塩を反応させることによる、金−有機残基複合粒子の製造
方法。
27に記載の製造方法。
合溶媒中で行う、項目28に記載の製造方法。
方法。
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH(CH3)、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−W1−O−NH2、
−S−W1−O−NH(CH3)、
−S−W1−O−W2−O−NH2、
−S−W1−O−W2−O−NH(CH3)、
−S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH2、
−S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH(CH3)、
−S−W1−C(=O)−NH−NH2、
−S−W1−C(=S)−NH−NH2、
−S−W1−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−W1−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−O−NH2、
−S−Z1−O−Z3−O−NH(CH3)、
−S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、または
12アルケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであ
り;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S
)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)
で表される基と結合した金属−有機残基複合体と、糖鎖または糖鎖含有物質とが反応しう
る条件下で接触させることを特徴とする、糖鎖または糖鎖含有物質の捕捉方法。
1)金属が硫黄原子を介して有機残基と結合した金属−有機残基複合体と、該有機残基と
相互反応しうる物質とを、接触させる工程、
2)該相互作用しうる物質が結合した金属−有機残基複合体を得る工程、および
3)得られた金属−有機残基複合体から硫黄原子を有する有機残基誘導体をイオン化する
工程、
を包含する、金属−有機残基複合体の有機残基と相互作用しうる物質の分子量を測定する
方法。
。
1)式:
2)1)で得られた金属−有機残基複合体を、糖鎖または糖鎖含有物質とが反応しうる条
件下で接触させる工程、および
3)2)で得られた金属−有機残基複合体から硫黄原子を有する有機残基誘導体をイオン
化する工程、
を包含する、糖鎖または糖鎖含有物質を質量分析する方法。
1)式:
とが反応しうる条件下で接触させる工程、
2)1)で得られた化合物と金属とを接触させる工程、および
3)2)で得られた金属−有機残基複合体から硫黄原子を有する有機残基誘導体をイオン
化する工程、
を包含する、糖鎖または糖鎖含有物質を質量分析する方法。
記載の方法。
一般式(II):
R−SH (II)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(III):
R−S−S−R (III)
(式中、RおよびSは前記と同意義である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(V):
HS−X−CH(R)−SH (V)
(式中、RおよびSは前記と同意義であり、Xは低級アルキレンまたは低級アルケニレン
である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(VI):
はそれらの混合物を含有する、糖鎖捕捉用組成物。
12アルケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであ
り;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S
)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)
で表される化合物を含有する、糖鎖捕捉用組成物。
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH(CH3
))m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−S
H)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−S
H)m、
M2−(S−W1−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−C(=O)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−C(=S)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−W1−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、または
一般式(VII):
mは、M2に対する硫黄原子を含む有機残基の化学量論比を表し、1以上の整数であり;
Y、W1およびW2は、それぞれ独立して、C1〜C12アルキレン、C2〜C12アル
ケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであ
り;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S
)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)で表される金属−有機残基複合体。
体。
(R−S)n−M1 (I)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子であり、M1は金属であり、nはM1に対す
る(R−S)基の化学量論比を表し、1以上の整数である)で表される金属−有機残基複
合体;または
一般式(IV):
M1−S−X−CH(R)−S−M1 (IV)
(式中、RおよびSは前記と同意義であり、両端のM1は同一実体の金属であり、Xは低
級アルキレンまたは低級アルケニレンである)で表される金属−有機残基複合体、
を含有する、糖鎖捕捉用組成物。
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH(CH3
))m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−S
H)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−S
H)m、
M2−(S−W1−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−C(=O)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−C(=S)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−W1−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、または
一般式(VII):
mは、M2に対する硫黄原子を含む有機残基の化学量論比を表し、1以上の整数であり;
Y、W1およびW2は、それぞれ独立して、C1〜C12アルキレン、C2〜C12アル
ケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであ
り;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S
)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)で表される金属−有機残基複合体を含有する、糖鎖捕捉用組
成物。
記載の組成物。
A)一般式(II):
R−SH (II)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(III):
R−S−S−R (III)
(式中、RおよびSは前記と同意義である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(V):
HS−X−CH(R)−SH (V)
(式中、RおよびSは前記と同意義であり、Xは低級アルキレンまたは低級アルケニレン
である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(VI):
はそれらの混合物;および
B)金属、
を含む、糖鎖または糖鎖含有物質の質量分析用キット。
A)以下の式:
12アルケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであ
り;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S
)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)
で表される、硫黄原子を含む有機残基誘導体;および
B)金属、
を含む、糖鎖または糖鎖含有物質の質量分析用キット。
記載のキット。
C)還元剤、
をさらに含む、項目50または51に記載のキット。
項目42に記載のキット。
(R−S)n−M1 (I)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子であり、M1は金属であり、nはM1に対す
る(R−S)基の化学量論比を表し、1以上の整数である)で表される金属−有機残基複
合体;または
一般式(IV):
M1−S−X−CH(R)−S−M1 (IV)
(式中、RおよびSは前記と同意義であり、両端のM1は同一実体の金属であり、Xは低
級アルキレンまたは低級アルケニレンである)で表される金属−有機残基複合体、
を含有する、糖鎖または糖鎖含有物質の質量分析用キット。
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH(CH3
))m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−S
H)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−S
H)m、
M2−(S−W1−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−C(=O)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−C(=S)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−W1−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、または
一般式(VII):
mは、M2に対する硫黄原子を含む有機残基の化学量論比を表し、1以上の整数であり;
Y、W1およびW2は、それぞれ独立して、C1〜C12アルキレン、C2〜C12アル
ケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであ
り;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S
)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)で表される金属−有機残基複合体を含む、糖鎖または糖鎖含
有物質の質量分析用キット。
記載のキット。
の粒子および該粒子の表面に被覆した金、銀、カドミウムまたはセレンの層を含む複合微
粒子である、項目6、26、36、40、45、49、53、59のいずれかに記載の方
法。
かに記載の方法。
法。
を提供することができる。
る。レーザーの乱反射可能な金属表面上に酵素反応の基質となる糖鎖を提示することによ
り、質量分析法によって酵素反応を追跡することができる。本発明によれば、質量分析の
際、通常の質量分析法では好ましくないバッファーまたは塩などがたとえ高濃度で存在し
たとしても、それらの影響を受けず、高感度に測定することができ、反応溶液の一部をそ
のまま分析に用いることができ、簡便である。また生成物を直接観測できるので、酵素反
応の速度論的解析も容易に行えるという利点を有する。
分子領域」について、マトリックス自身の強いピークにより、目的物のピークがうまく観
察できないことが欠点とされてきたが、本発明によれば、目的の低分子化合物を金属基板
(特に、金属微粒子)に担持することにより、マトリックスフリーなLDI−TOF M
Sを、高感度かつ正確に行うことができるという利点を有する。
利用して、金属微粒子表面に糖鎖や種々の官能基を提示することができ、またその金属微
粒子の溶解性を、金属微粒子表面に導入するリガンドの性質によって自在に制御すること
ができる。従って、チオール化合物で被覆した金属微粒子は、水系での反応のみならず有
機溶媒系での固相合成を行う際に有用な固相担体として利用することができる。微粒子は
反応溶媒に溶解しているが、精製の際には固体として遠心濾過によって溶液成分と分離可
能であるため、分離精製も非常に容易に行えるという利点がある。さらに反応の経過を質
量分析法によって直接追跡することができ、効率的に反応を行える。
e3O4)などの磁性粒子およびこの粒子の表面に被覆した金、銀、カドミウムまたはセ
レンなどの層を含む複合微粒子を使用することにより、これに硫黄原子を含む有機残基誘
導体を担持したのち、磁石等を用いて微粒子を簡易に回収し、精製無しで質量分析するこ
とができるという利点を有する。
子を提供することにより、金属−有機残基複合粒子を生細胞に直接取り込ませることがで
き、細胞内で生じる様々な化学反応(例えば、酵素反応)を、その反応生成物を質量分析
することで正確に解析することができる。
限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において
使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられるこ
とが理解されるべきである。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
チオールまたはジスルフィドなど)が結合可能な金属を含む、金属単体または金属複合体
を意味し、硫黄原子含有物質が結合可能である代表的な金属の種類として、金、銀、カド
ミウムおよびセレンなどが挙げられる。
金属が、その表面に照射されて反射したレーザーが何度も金属表面に照射されるような凹
凸面または湾曲面を有することを意味する。レーザーの乱反射が多いほど、質量分析の感
度が高くなる。レーザーの乱反射可能な表面を有する金属の理想的な例として、金属微粒
子が挙げられる。
た金属の粒子を意味し、単分散型であってもよいし、多分散型であってもよい。本発明の
金属微粒子が金属複合体である場合には、その複合体のコアとなる粒子の表面が、上記硫
黄原子含有物質が結合可能な金属の層で覆われた構造をとる。本発明で使用する代表的な
金属微粒子として、金または銀の金属単体の微粒子、あるいは鉄、ニッケル、コバルトま
たは酸化鉄(Fe3O4)などの磁性粒子の表面が金または銀で覆われた金属複合体の微
粒子が挙げられる。本発明の「金属微粒子」は、溶液中でコロイドを形成する。上で挙げ
た金属微粒子の例のほかにも、商品名Quantum Dots(Quantum Do
t Corporation,Hayward,CA,USA、以下「QDs」と示す)
も使用可能である。QDsに用いられる金属の種類としては、例えばZnSe、CdS、
CdSe、CdTeなどが挙げられる。典型的な例として、コアにCdSe、その周りに
ZnSを持つナノパーティクルがある。表面にでているZnと−SHの結合(この結合は
Au−Sと同じ種類)を介して−SH化合物をQDs表面に提示することができる。本明
細書において「微粒子」との用語は、「ナノパーティクル」または「ナノ粒子」と互換可
能に使用され得る。金微粒子の作製およびその応用については、JACS 125,77
90−7791(2003);Angew Chem Int Ed 40(12),2
257−2261(2001);Chem Eur J 9,1909−1921(20
03)に記載されている。
された有機化合物をさす。
義した「有機残基」が含まれる。
硫黄原子を介して有機残基が結合して得られた複合体を意味する。
に硫黄原子を介して有機残基が結合して得られた微粒子を意味する。本明細書において、
特に金微粒子の表面上に硫黄原子を介して糖鎖または糖鎖含有物質が結合して得られた微
粒子は、「糖鎖−金微粒子」との用語が使用される。
を介して被検体が結合して得られた複合体を意味する。
硫黄原子を介して被検体が結合して得られた微粒子を意味する。
ンとし(つまり、イオン化し)、真空中で運動させ電磁気力を用いてそれらイオンを質量
電荷比(m/z)に応じて分離・検出することを意味する。m/zに応じて分離・検出さ
れたイオンをもとに、横軸にm/z、縦軸にイオンの相対強度をとったスペクトルが、マ
ススペクトルである。分子量情報を与えるイオンは、一般に分子量関連イオン(中性分子
Mから電子1個が失われたM+.、電子1個が付加したM−.、プロトンが付加した[M
+H]+、プロトンが失われた[M−H]−、ハイドライドが失われた[M−H]+、ア
ルカリ金属(Naなど)が付加した[M+Na]+などがある)と呼ばれる。試料やイオ
ン化法(特にEI法では)によっては全く分子量関連イオンが出現しない場合があるが、
その場合はソフトなイオン化法を用いることで分子量関連イオンを確認できる。分子イオ
ンより低質量側に出現するイオンをフラグメントイオンと呼び、このフラグメントイオン
は分子イオンが分解したもので、試料分子の構造情報を与える。スペクトル中最もイオン
強度の高いイオンをベースピークと呼び、相対強度を100%としスペクトルを規格化す
るために用いる。
電子イオン化法は、気化した試料に熱電子をあててイオン化する方法で、最も普及して
いるイオン化法である。イオン化は試料をガス化して行なうため、液体あるいは個体試料
は予め気化させる必要がある。気化させるのに熱を加えるため熱不安定物質、難揮発性物
質の測定は不可能である。ただし、メチル化、シリル化、アシル化等の誘導体化により揮
発性、熱安定性が得られる物質の場合は測定が可能となる。通常70eVのエネルギーで
イオン化を行なうため、分子イオンの生成とともに過剰エネルギーによりフラグメントイ
オンが生成する(一般的な有機化合物のイオン化エネルギーは、10数eVである)。こ
のフラグメントイオンの情報より化合物の構造解析が可能となる。しかし、分子イオンが
出にくいため分子量情報が得られない場合が多い。この場合はイオン化エネルギーを20
eV程度に落すか、よりソフトなイオン化法(CI、DEI、DCI、
1106229068218_34
FAB、ESI)を選択する必要がある。
あらかじめイオン化された反応ガス(試薬ガス)の中に気化した試料を送り込みイオン
化する方法である。イオン分子反応を用いてイオン化するため、イオン化エネルギーが有
機化合物のイオン化エネルギーに近いためフラグメントイオンが非常に少なく、分子量情
報を持ったイオン((M+H)+、(M+NH4)+、(M−H)−など)がベースイオ
ンとして現れる。反応ガスとしては一般的にメタン、イソブタン、アンモニアが用いられ
ている。
ization法)
電子線の近傍で瞬間加熱を行ない試料が熱分解を起こす前に、気化させイオン化させる
方法で、熱不安定物質や難揮発性物質の測定が可能となる。さらに、通常の直接導入法に
おけるEI法より分子イオンが強く出るため分子量情報が得やすくなる。測定法は、試料
溶液をポイント・フィラメント(直径100μmの白金線)の先端に付着させ、イオン源
内に挿入後フィラメントを急速加熱し試料を気化させる。
ization法)
イオン源をCIの状態でDEIの操作を行なった場合が、DCIである。
試料とマトリックス分子を良く混合し、ターゲット上に塗布しXe等の高速中性原子を
衝突させイオン化させる方法である。EI、CIと違い、試料を気化させる必要がないた
め、熱不安定物質や難揮発性物質の測定に適している。しかし、低質量域にはマトリック
ス由来のバックグラウンドピークが強く現れるため低分子量の試料は測定が難しい場合が
ある。その場合はFRIT−FABによる測定が有効である。
ombardment法)
Continuous−flow FABとも呼ばれ、マトリックス溶液に溶解した試
料を連続的に流し溶出液出口を高速中性原子で衝突させイオン化させる方法である。
ation法)
大気圧イオン化法の一種で、キャピラリに高電圧を印加すると試料溶液が自ら噴霧、イ
オン化を行なう現象を利用したイオン化法である。FAB同様、試料を気化させる必要が
ないため、熱不安定物質や難揮発性物質の測定に適している。このことは、質量範囲の小
さい四重極型のタイプでも分子量の大きなペプチドやタンパクなどが測定できるようにな
る。通常のESI測定では構造情報を持つフラグメントイオンが得られないため、通常よ
り高めに電圧をCapillay/Skimmer−1に印加することによりIn−so
urce CIDが起き構造情報を持つフラグメントイオンを測定することが可能となる
。
d Laser Desorption Ionization −Time−of−F
light(Mass Spectrometer)の略語である。MALDIとは、田
中らによって見いだされ、Hillenkampらによって開発された技法である(Ka
ras M.,Hillenkamp,F.,Anal.Chem.1988,60,2
299−2301)。この方法では、試料とマトリックス溶液をモル比で(10−2〜5
×10−4):1に混合した後、混合溶液を標的上で乾固し、結晶状態にする。パルスレ
ーザー照射により、大きなエネルギーがマトリックス上に与えられ、(M+H)+、(M
+Na)+などの試料由来イオンとマトリックス由来イオンとが脱離する。微量のリン酸
緩衝液、Tris緩衝液、グアニジンなどで汚染されていても分析可能である。MALD
I−TOF(MS)は、MALDIを利用して飛行時間を元に質量を測定するものである
。イオンが一定の加速電圧Vで加速される場合、イオンの質量をm、イオンの速度をv、
イオンの電荷数をz、電気素量をe、イオンの飛行時間をtとしたとき、イオンのm/z
は、
m/z=2eVt2/L2
で表すことができる。このようなMALDI−TOF測定には、島津/KratosのK
OMPACT MALDI II/IIIなどを使用することができる。その測定の際に
は、製造業者が作成したパンフレットを参照することができる。MALDI−TOFの測
定時に使用されるレーザー照射の照射エネルギーを本明細書において「解離エネルギー」
という。
MS」とは対照的に、低分子マトリックス試薬を使用せずに、レーザー照射により目的
の分子を脱離・イオン化する方法を意味する。
体が同じ個体そのものであることを意味する。
連なってできた化合物をいう。単位糖が2つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は
、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、
生体中に含有される多糖類(グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロ
ース、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれ
らの複合体および誘導体)の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グ
リコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範
囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「
多糖(ポリサッカリド)」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、
特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包
含することがある。
。このような糖鎖含有物質は、生体内に多く見出され、例えば、生体中に含有される多糖
類の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖
脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるが
それらに限定されない。
つの水酸基および少なくとも1つのアルデヒド基またはケトン基を含む、ポリヒドロキシ
アルデヒドまたはポリヒドロキシケトンならびにその誘導体をいう。通常単糖は、一般式
CnH2nOnで表されるがそれらに限定されず、フコース(デオキシヘキソース)、N
−アセチルグルコサミンなども含まれる。ここで、上の式において、n=2、3、4、5
、6、7、8、9および10であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース
、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。
一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドー
ス、後者をケトースという。
の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換され、結果生じる物質をいう。そのような単糖の
誘導体としては、カルボキシル基を有する糖(例えば、C−1位が酸化されてカルボン酸
となったアルドン酸(例えば、D−グルコースが酸化されたD−グルコン酸)、末端のC
原子がカルボン酸となったウロン酸(D−グルコースが酸化されたD−グルクロン酸)、
アミノ基またはアミノ基の誘導体(例えば、アセチル化されたアミノ基)を有する糖(例
えば、N−アセチル−D−グルコサミン、N−アセチル−D−ガラクトサミンなど)、ア
ミノ基およびカルボキシル基を両方とも有する糖(例えば、N−アセチルノイラミン酸(
シアル酸)、N−アセチルムラミン酸など)、デオキシ化された糖(例えば、2−デオキ
シ−D−リボース)、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などがあるがそ
れらに限定されない。本明細書では、単糖という場合は、上記誘導体も包含する。あるい
は、ヘミアセタール構造を形成した糖において、アルコールと反応してアセタール構造の
グリコシドもまた、単糖の範囲内にある。
体が相互に力を及ぼしあうことをいう。そのような相互作用としては、例えば、共有結合
、水素結合、ファンデルワ−ルス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、疎水性相
互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、相互作
用は、水素結合、疎水性相互作用などである。本明細書において「共有結合」とは、当該
分野における通常の意味で用いられ、電子対が2つの原子に共有されて形成する化学結合
をいう。本明細書において「水素結合」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、
電気的陰性度の高い原子に一つしかない水素原子の核外電子が引き寄せられて水素原子核
が露出し、これが別の電気的陰性度の高い原子を引き寄せて生じる結合をいい、例えば、
水素原子と電気的陰性度の高い(フッ素、酸素、窒素などの)原子との間にできる。
複合体」または「金属−被検体複合体」と「糖鎖または糖鎖含有物質」との相互作用によ
って、上記複合体の糖鎖捕捉部位に糖鎖または糖鎖含有物質が結合されることを意味する
。本発明における複合体の糖鎖捕捉部位は、保護されていてもよいアミノオキシ基、保護
されていてもよいN−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカル
バジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体を含むことが好ましい。
書において、「転移酵素」は「トランスフェラーゼ」と互換可能に使用され得る。基転移
反応は、以下の式(1):
X−Y+Z−H ⇔ X−H+Z−Y (1)
に示すように、一つの化合物(供与体)から基Yが他の化合物(受容体)に転移する形で
行われる。
糖鎖)をある場所(上記式(1)の化合物X−Yに相当)から別の場所(上記式(1)の
化合物Z−Hに相当)へと転移させるよう触媒する作用を有する酵素をいう。糖転移酵素
としては、例えば、ガラクトース転移酵素、グルコ−ス転移酵素、シアル酸転移酵素、マ
ンノ−ス転移酵素、フコ−ス転移酵素、キシロ−ス転移酵素、N−アセチルグルコサミン
転移酵素、およびN−アセチルガラクトサミン転移酵素などが挙げられるがそれらに限定
されない。そのような糖転移酵素としては、例えば、糖転移酵素の例としては、β1,4
−ガラクトース転移酵素、α−1,3−ガラクトース転移酵素、β1,4−ガラクトース
転移酵素、β1,3−ガラクトース転移酵素、β1,6−ガラクトース転移酵素、α2,
6−シアル酸転移酵素、α1,4−ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵
素、α1,2−フコース転移酵素、α1,3−フコース転移酵素、α1,4−フコース転
移酵素、α1,6−フコース転移酵素、α1,3−N−アセチルガラクトサミン転移酵素
、α1,6−N−アセチルガラクトサミン転移酵素、β1,4−N−アセチルガラクトサ
ミン転移酵素、ポリペプチドN−アセチルガラクトサミン転移酵素、β1,4−Nアセチ
ルグルコサミン転移酵素、β1,2−Nアセチルグルコサミン転移酵素、β1,3−Nア
セチルグルコサミン転移酵素、β1,6−Nアセチルグルコサミン転移酵素、α1,4−
Nアセチルグルコサミン転移酵素、β1,4−マンノース転移酵素、α1,2−マンノー
ス転移酵素、α1,3−マンノース転移酵素、α1,4−マンノース転移酵素、α1,6
−マンノース転移酵素、α1,2−グルコース転移酵素、α1,3−グルコース転移酵素
、α2,3−シアル酸転移酵素、α2,8−シアル酸転移酵素、α1,6−グルコサミン
転移酵素、α1,6−キシロース転移酵素、βキシロース転移酵素(プロテオグリカンコ
ア構造合成酵素)、β1,3−グルクロン酸転移酵素、ヒアルロン酸合成酵素、他の糖ヌ
クレオチドを糖ドナーとして用いる糖転移酵素およびドルコールリン酸型糖ドナーを用い
る糖転移酵素などが挙げられるがそれらに限定されない。
が伸長する反応をいう。
ような生体分子を含む試料を、本明細書において特に生体試料ということがある。本明細
書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを
含むがそれらに限定されない。従って、生体分子は、生体から抽出される分子を包含する
が、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。その
ような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌク
レオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸(例えば、cDNA、ゲノムDNA
のようなDNA、mRNAのようなRNAを含む)、ポリサッカリド、オリゴサッカリド
、脂質、低分子(例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など)、これ
らの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。本明細書では、生体分子は、好
ましくは、糖鎖または糖鎖を含む複合分子(例えば、糖タンパク質、糖脂質など)であり
得る。
れば特にその由来に限定はなく、動物、植物、細菌、ウイルスを問わない。より好ましく
は動物由来生体試料が挙げられる。好ましくは、例えば、全血、血漿、血清、汗、唾液、
尿、膵液、羊水、髄液等が挙げられ、より好ましくは血漿、血清、尿が挙げられる。生体
試料には個体から予め分離されていない生体試料も含まれる。例えば外部から試液が接触
可能な粘膜組織、あるいは腺組織、好ましくは乳腺、前立腺、膵臓に付属する管組織の上
皮が含まれる。
ド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ
酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であっ
てもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変された
アミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブ
ルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポ
リマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシ
ル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変(例えば、標識
成分との結合体化)。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の1または2以上のアナログ
を含むポリペプチド(例えば、非天然のアミノ酸などを含む)、ペプチド様化合物(例え
ば、ペプトイド)および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明の遺伝子
産物は、通常ポリペプチド形態をとる。このようなポリペプチド形態の本発明の遺伝子産
物は、本発明の診断、予防、治療または予後のための組成物として有用である。
び「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリ
マーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレ
オチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは
、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴ
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌ
クレオチドとして具体的には、例えば、2’−O−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリ
ゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’−P5’ホスホ
ロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボ
ースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5プロピニルウラシルで置換された誘導体オ
リゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5チアゾールウラシルで置換
された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC−5プロピニル
シトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフ
ェノキサジン修飾シトシン(phenoxazine−modified cytosi
ne)で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、DNA中のリボースが2’−O−プロピ
ルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボー
スが2’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示
される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された
配列と同様に、その保存的に改変された改変体(例えば、縮重コドン置換体)および相補
配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、1またはそれ以上
の選択された(または、すべての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオ
キシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る(Batzerら
、Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsukaら
、J.Biol.Chem.260:2605−2608(1985);Rossoli
niら、Mol.Cell.Probes 8:91−98(1994))。本発明の遺
伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。このようなポリヌクレオチド形態の本
発明の遺伝子または遺伝子産物は、本発明の診断、予防、治療または予後のための組成物
として有用である。
の「単離」とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の物質(例えば
、糖鎖または糖鎖含有物質である場合、糖鎖または糖鎖含有物質以外の因子、あるいは、
目的とする糖鎖または糖鎖含有物質以外の糖鎖または糖鎖含有物質;核酸である場合、核
酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸;タンパク質である場合、
タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質
など)から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」、糖鎖または糖鎖
含有物質には、本発明の精製方法によって精製された糖鎖または糖鎖含有物質が含まれる
。したがって、単離された糖鎖または糖鎖含有物質は、化学的に合成した糖鎖または糖鎖
含有物質を包含する。
の「精製」とは、その物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部を除去することをいう
。したがって、精製および分離は、その形態が一部重複する。したがって、通常、精製さ
れた物質(例えば、糖鎖または糖鎖含有物質のような生物学的因子)におけるその物質の
純度は、その物質が通常存在する状態よりも高い(すなわち濃縮されている)が、天然に
随伴する因子が低減されている限り、濃縮されていない状態も「精製」の概念に包含され
る。
濃縮」とは、その物質が濃縮前に試料に含まれている含有量よりも高い濃度に上昇させる
行為をいう。従って、濃縮もまた、精製および分離と、その概念が一部重複する。したが
って、通常、濃縮された物質(例えば、糖鎖または糖鎖含有物質のような生物学的因子)
は、その物質が通常存在する状態における不純物の含有量は低減されているが、目的とす
る物質の含有量が増加している限り、ある特定の不純物が増加していてもよく、「精製」
されていない状態も「濃縮」の概念に包含される。
件」とは、金属−有機残基複合体と、糖鎖または糖鎖含有物質とが相互作用し得る(好ま
しくは、共有結合を形成する)のに十分な条件(例えば、緩衝剤、溶媒の極性、温度、p
H、塩濃度、圧力など)をいう。このような条件を設定するのに必要なパラメータの設定
は、当業者の技術範囲内であり、相互作用の種類、糖鎖または糖鎖含有物質の種類、糖鎖
捕捉担体の種類(例えば、アルデヒド基と流体中で反応し得る官能基として、保護されて
いてもよいアミノオキシ基、保護されていてもよいN−アルキルアミノオキシ基、ヒドラ
ジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体
)など相互作用に関連する諸パラメータを考慮することにより、当業者は、そのような条
件を当該分野において周知の技術を用いて設定し、相互作用反応を行わせることができる
。好ましい実施形態では、そのような条件は、糖鎖が水溶液などの流体中で形成する環状
のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡において、アルデヒド基と反応して
特異的かつ安定な結合を形成させるような条件が挙げられるがそれに限定されない。ある
いは、反応に供する流体にケト基が実質的に含まれていないこともまた1つの好ましい条
件であり得る。そのような条件としては、例えば、pH5.6の酢酸緩衝液を常温常圧(
例えば、20℃および1気圧)にて用いることなどが挙げられる。
有機化学については、例えば、Organic Chemistry,R.T.Mor
rison,R.N.Boyd 5th ed.(1987年)などに記載されており、
これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
中の1または2以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原
子を1つ除去して1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を2つ除去
して2価の置換基に置換することも可能である。
が、置換Rによって置換されている場合、そのようなRは、単数または複数存在し、複数
存在する場合は、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換されたアルキル、シクロアル
キル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、シクロアルケニ
ル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置
換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたヘテロ環
基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シ
アノ、ニトロ、アミノ、置換されたアミノ、カルボキシ、置換されたカルボキシ、アシル
、置換されたアシル、チオカルボキシ、置換されたチオカルボキシ、アミド、置換された
アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルおよ
び置換されたスルフィニルからなる群より選択される。
る溶解度を上げるための置換基Rとしては、カルボキシル基またはアミノ基などの極性基
そのもの、または、分子内にカルボキシル基またはアミノ基などの極性基を置換基として
有する飽和または不飽和炭素鎖であることが好ましい。逆に、本発明の「金属−有機残基
複合体」を有機系の溶媒に可溶化させるための置換基Rとしては、疎水性のものが好まし
く、例えば、C1〜C6アルキル、C1〜C5アルキル、C1〜C4アルキル、C1〜C
3アルキル、C1〜C2アルキルなどが挙げられる。
有する基をいう。ここで、ヘテロ原子は、O、SおよびNからなる群より選択され、同一
であっても異なっていてもよく、1つ含まれていても2以上含まれていてもよい。ヘテロ
環基は、芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。ヘ
テロ環基は置換されていてもよい。
ヒドロキシル基で置換した有機化合物をいう。本明細書においては、ROHとも表記され
る。ここで、Rは、アルキル基である。好ましくは、Rは、C1〜C6アルキルであり得
る。アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プ
ロパノールなどが挙げられるがそれらに限定されない。
素(アルカン)から水素原子が一つ失われて生ずる1価の基をいい、一般にCnH2n+
1−で表される(ここで、nは正の整数である)。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり
得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってア
ルキルのHが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、C1〜C2アルキル、C1
〜C3アルキル、C1〜C4アルキル、C1〜C5アルキル、C1〜C6アルキル、C1
〜C7アルキル、C1〜C8アルキル、C1〜C9アルキル、C1〜C10アルキル、C
1〜C11アルキルまたはC1〜C12アルキル、C1〜C2置換されたアルキル、C1
〜C3置換されたアルキル、C1〜C4置換されたアルキル、C1〜C5置換されたアル
キル、C1〜C6置換されたアルキル、C1〜C7置換されたアルキル、C1〜C8置換
されたアルキル、C1〜C9置換されたアルキル、C1〜C10置換されたアルキル、C
1〜C11置換されたアルキルまたはC1〜C12置換されたアルキルであり得る。ここ
で、例えばC1〜C10アルキルとは、炭素原子を1〜10個有する直鎖または分枝状の
アルキルを意味し、メチル(CH3−)、エチル(C2H5−)、n−プロピル(CH3
CH2CH2−)、イソプロピル((CH3)2CH−)、n−ブチル(CH3CH2C
H2CH2−)、n−ペンチル(CH3CH2CH2CH2CH2−)、n−ヘキシル(
CH3CH2CH2CH2CH2CH2−)、n−ヘプチル(CH3CH2CH2CH2
CH2CH2CH2−)、n−オクチル(CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2
CH2−)、n−ノニル(CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2−
)、n−デシル(CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2−)
、−C(CH3)2CH2CH2CH(CH3)2、−CH2CH(CH3)2などが例
示される。また、例えば、C1〜C10置換されたアルキルとは、C1〜C10アルキル
であって、そのうち1または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
1またはC2アルキルである。
されたシクロアルキル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルキルのHが置換
されたシクロアルキルをいう。具体例としては、C3〜C4シクロアルキル、C3〜C5
シクロアルキル、C3〜C6シクロアルキル、C3〜C7シクロアルキル、C3〜C8シ
クロアルキル、C3〜C9シクロアルキル、C3〜C10シクロアルキル、C3〜C11
シクロアルキル、C3〜C12シクロアルキル、C3〜C4置換されたシクロアルキル、
C3〜C5置換されたシクロアルキル、C3〜C6置換されたシクロアルキル、C3〜C
7置換されたシクロアルキル、C3〜C8置換されたシクロアルキル、C3〜C9置換さ
れたシクロアルキル、C3〜C10置換されたシクロアルキル、C3〜C11置換された
シクロアルキルまたはC3〜C12置換されたシクロアルキルであり得る。例えば、シク
ロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロヘキシルなどが例示される。
ば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチ
レン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、ノナンメチレン、デカンメチレン、ウンデカメ
チレン、ドデカメチレン等が挙げられる。
結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる1価の基をいい、一
般にCnH2n−1−で表される(ここで、nは2以上の正の整数である)。「置換され
たアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってアルケニルのHが置換されたアルケ
ニルをいう。具体例としては、C2〜C3アルケニル、C2〜C4アルケニル、C2〜C
5アルケニル、C2〜C6アルケニル、C2〜C7アルケニル、C2〜C8アルケニル、
C2〜C9アルケニル、C2〜C10アルケニル、C2〜C11アルケニルまたはC2〜
C12アルケニル、C2〜C3置換されたアルケニル、C2〜C4置換されたアルケニル
、C2〜C5置換されたアルケニル、C2〜C6置換されたアルケニル、C2〜C7置換
されたアルケニル、C2〜C8置換されたアルケニル、C2〜C9置換されたアルケニル
、C2〜C10置換されたアルケニル、C2〜C11置換されたアルケニルまたはC2〜
C12置換されたアルケニルであり得る。ここで、例えばC2〜C10アルキルとは、炭
素原子を2〜10個含む直鎖または分枝状のアルケニルを意味し、ビニル(CH2=CH
−)、アリル(CH2=CHCH2−)、CH3CH=CH−などが例示される。また、
例えば、C2〜C10置換されたアルケニルとは、C2〜C10アルケニルであって、そ
のうち1または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
置換されたシクロアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルケニルの
Hが置換されたシクロアルケニルをいう。具体例としては、C3〜C4シクロアルケニル
、C3〜C5シクロアルケニル、C3〜C6シクロアルケニル、C3〜C7シクロアルケ
ニル、C3〜C8シクロアルケニル、C3〜C9シクロアルケニル、C3〜C10シクロ
アルケニル、C3〜C11シクロアルケニル、C3〜C12シクロアルケニル、C3〜C
4置換されたシクロアルケニル、C3〜C5置換されたシクロアルケニル、C3〜C6置
換されたシクロアルケニル、C3〜C7置換されたシクロアルケニル、C3〜C8置換さ
れたシクロアルケニル、C3〜C9置換されたシクロアルケニル、C3〜C10置換され
たシクロアルケニル、C3〜C11置換されたシクロアルケニルまたはC3〜C12置換
されたシクロアルケニルであり得る。例えば、好ましいシクロアルケニルとしては、1−
シクロペンテニル、2−シクロヘキセニルなどが例示される。
例えば、ビニレン、プロペニレン、ブテニレン等が挙げられる。
有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる1価の基をいい、一般にCnH
2n−3−で表される(ここで、nは2以上の正の整数である)。「置換されたアルキニ
ル」とは、以下に規定する置換基によってアルキニルのHが置換されたアルキニルをいう
。具体例としては、C2〜C3アルキニル、C2〜C4アルキニル、C2〜C5アルキニ
ル、C2〜C6アルキニル、C2〜C7アルキニル、C2〜C8アルキニル、C2〜C9
アルキニル、C2〜C10アルキニル、C2〜C11アルキニル、C2〜C12アルキニ
ル、C2〜C3置換されたアルキニル、C2〜C4置換されたアルキニル、C2〜C5置
換されたアルキニル、C2〜C6置換されたアルキニル、C2〜C7置換されたアルキニ
ル、C2〜C8置換されたアルキニル、C2〜C9置換されたアルキニル、C2〜C10
置換されたアルキニル、C2〜C11置換されたアルキニルまたはC2〜C12置換され
たアルキニルであり得る。ここで、例えば、C2〜C10アルキニルとは、例えば炭素原
子を2〜10個含む直鎖または分枝状のアルキニルを意味し、エチニル(CH≡C−)、
1−プロピニル(CH3C≡C−)などが例示される。また、例えば、C2〜C10置換
されたアルキニルとは、C2〜C10アルキニルであって、そのうち1または複数の水素
原子が置換基により置換されているものをいう。
例えば、プロピニレン、ブチニレン等が挙げられる。
れて生ずる1価の基をいい、一般にCnH2n+1O−で表される(ここで、nは1以上
の整数である)。「置換されたアルコキシ」とは、以下に規定する置換基によってアルコ
キシのHが置換されたアルコキシをいう。具体例としては、C1〜C2アルコキシ、C1
〜C3アルコキシ、C1〜C4アルコキシ、C1〜C5アルコキシ、C1〜C6アルコキ
シ、C1〜C7アルコキシ、C1〜C8アルコキシ、C1〜C9アルコキシ、C1〜C1
0アルコキシ、C1〜C11アルコキシ、C1〜C12アルコキシ、C1〜C2置換され
たアルコキシ、C1〜C3置換されたアルコキシ、C1〜C4置換されたアルコキシ、C
1〜C5置換されたアルコキシ、C1〜C6置換されたアルコキシ、C1〜C7置換され
たアルコキシ、C1〜C8置換されたアルコキシ、C1〜C9置換されたアルコキシ、C
1〜C10置換されたアルコキシ、C1〜C11置換されたアルコキシまたはC1〜C1
2置換されたアルコキシであり得る。ここで、例えば、C1〜C10アルコキシとは、炭
素原子を1〜10個含む直鎖または分枝状のアルコキシを意味し、メトキシ(CH3O−
)、エトキシ(C2H5O−)、n−プロポキシ(CH3CH2CH2O−)などが例示
される。
の「シクロアルキル」、「置換されたシクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「置換
されたシクロアルケニル」以外の基をいう。炭素環基は芳香族系または非芳香族系であり
得、そして単環式または多環式であり得る。「置換された炭素環基」とは、以下に規定す
る置換基によって炭素環基のHが置換された炭素環基をいう。具体例としては、C3〜C
4炭素環基、C3〜C5炭素環基、C3〜C6炭素環基、C3〜C7炭素環基、C3〜C
8炭素環基、C3〜C9炭素環基、C3〜C10炭素環基、C3〜C11炭素環基、C3
〜C12炭素環基、C3〜C4置換された炭素環基、C3〜C5置換された炭素環基、C
3〜C6置換された炭素環基、C3〜C7置換された炭素環基、C3〜C8置換された炭
素環基、C3〜C9置換された炭素環基、C3〜C10置換された炭素環基、C3〜C1
1置換された炭素環基またはC3〜C12置換された炭素環基であり得る。炭素環基はま
た、C4〜C7炭素環基またはC4〜C7置換された炭素環基であり得る。炭素環基とし
ては、フェニル基から水素原子が1個欠失したものが例示される。ここで、水素の欠失位
置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であっ
てもよい。
る基をいう。ここで、ヘテロ原子は、O、SおよびNからなる群より選択され、同一であ
っても異なっていてもよく、1つ含まれていても2以上含まれていてもよい。ヘテロ環基
は、芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換
されたヘテロ環基」とは、以下に規定する置換基によってヘテロ環基のHが置換されたヘ
テロ環基をいう。具体例としては、C3〜C4炭素環基、C3〜C5炭素環基、C3〜C
6炭素環基、C3〜C7炭素環基、C3〜C8炭素環基、C3〜C9炭素環基、C3〜C
10炭素環基、C3〜C11炭素環基、C3〜C12炭素環基、C3〜C4置換された炭
素環基、C3〜C5置換された炭素環基、C3〜C6置換された炭素環基、C3〜C7置
換された炭素環基、C3〜C8置換された炭素環基、C3〜C9置換された炭素環基、C
3〜C10置換された炭素環基、C3〜C11置換された炭素環基またはC3〜C12置
換された炭素環基の1つ以上の炭素原子をヘテロ原子で置換したものであり得る。ヘテロ
環基はまた、C4〜C7炭素環基またはC4〜C7置換された炭素環基の炭素原子を1つ
以上へテロ原子で置換したものであり得る。ヘテロ環基としては、チエニル基、ピロリル
基、フリル基、イミダゾリル基、ピリジル基などが例示される。水素の欠失位置は、化学
的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であってもよい。
を1個欠失した官能基である。「置換されたフェニル基」とは、フェニル基のHが以下で
定義される置換基で置換されたものをいう。
基で置換され得ることに加えて、2価の置換基で置換され得る。そのような二価の置換は
、オキソ置換(=O)またはチオキソ置換(=S)であり得る。
)、臭素(Br)、ヨウ素(I)などの元素の1価の基をいう。
ロキシ」とは、ヒドロキシのHが下記で定義される置換基で置換されているものをいう。
(メルカプト基)であり、−SHで表される。「置換されたチオール」とは、メルカプト
のHが下記で定義される置換基で置換されている基をいう。
O2で表される基をいう。「アミノ」とは、−NH2で表される基をいう。「置換された
アミノ」とは、アミノのHが以下で定義される置換基で置換されたものをいう。
カルボキシ」とは、カルボキシのHが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。
した基をいい、−C(=S)OH、−C(=O)SHまたは−CSSHで表され得る。「
置換されたチオカルボキシ」とは、チオカルボキシのHが以下に定義される置換基で置換
されたものをいう。
ボニル、アルキル部分が前記「シクロアルキル」が結合したシクロアルキルカルボニル、
カルボニルに前記「アリール」が結合したアリールカルボニルを意味する。例えば、アセ
チル、n−プロパノイル、i−プロパノイル、n−ブチロイル、t−ブチロイル、シクロ
プロパノイル、シクロブタノイル、シクロペンタノイル、シクロヘキサノイル、ベンゾイ
ル、α−ナフトイル、β−ナフトイルを意味する。「置換されたアシル」とは、アシルの
水素を以下に定義される置換基で置換したものをいう。
であり、好ましくは、−CONH2で表される。「置換されたアミド」とは、アミドが置
換されたものをいう。
=O)−を含むものを総称したものをいう。「置換されたカルボニル」は、下記において
選択される置換基で置換されているカルボニル基を意味する。
置換した基であり、特性基−(C=S)−を含む。チオカルボニルには、チオケトンおよ
びチオアルデヒドが含まれる。「置換されたチオカルボニル」とは、下記において選択さ
れる置換基で置換されたチオカルボニルを意味する。
ものをいう。「置換されたスルホニル」とは、下記において選択される置換基で置換され
たスルホニルを意味する。
ものをいう。「置換されたスルフィニル」とは、下記において選択される置換基で置換さ
れているスルフィニルを意味する。
脱して生ずる基をいい、本明細書において、「炭素環基」に包含される。例えば、フェニ
ル、α−ナフチル、β−ナフチル、アンスニル、インデニル、フェナンスリル等が挙げら
れる。「置換されたアリール」とは、下記において選択される置換基で置換されているア
リールを意味する。
に結合する水素原子が1個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、「ヘテロ環基」
に包含される。例えば、フラニル、チオフェニル、ピリジル等が挙げられる。「置換され
たヘテロアリール」とは、下記において選択される置換基で置換されているヘテロアリー
ルを意味する。
らに詳しくは、1,2−フェニレン、1,3−フェニレン、1,4−フェニレン等が挙げ
られる。
リジンジイル等が挙げられる。さらに詳しくは、2,5−チオフェンジイル、2,5−フ
ランジイル等が挙げられる。
素原子を除いてできる1価の基をいう。「置換されたヒドロキシルアミノ」とは、下記に
おいて選択される置換基で置換されているヒドロキシルアミノを意味する。
素原子に結合する水素原子をアルキル基で置換したヒドロキシルアミノを意味する。
されたヒドラジド」とは、下記において選択される置換基で置換されているヒドラジドを
意味する。
いう。「置換されたチオセミカルバジド」とは、下記において選択される置換基で置換さ
れているチオセミカルバジドを意味する。
のをいう。「置換されたエステル」とは、下記において選択される置換基で置換されてい
るエステルを意味する。
される基であり、R4、R5およびR6は低級アルキル基を意味する。ここでいう「低級
アルキル」とは上記で定義したとおりである。通常、「4級アンモニウム塩」は、−N+
(R4)(R5)(R6)とハロゲン化物イオンとが対をなして塩を形成する。
ロキシル基」と互換可能である。
のをいう。「置換されたアルデヒド」とは、下記において選択される置換基で置換されて
いるアルデヒドを意味し、「アルデヒド誘導体」と互換可能に使用され得る。
ものをいう。「置換されたカルボン酸」とは、下記において選択される置換基で置換され
ているカルボン酸を意味し、「アルデヒド誘導体」と互換可能に使用され得る。
個の置換基を表すために使用される。
重ねあわせることのできない一対の化合物の一方またはその組をいう。立体異性体の一形
態であり、他の性質は同じであるにもかかわらず、旋光性のみが異なる。
1または2以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を
1つ除去して1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を2つ除去して
2価の置換基に置換することも可能である。
ニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、、チオール、シアノ
、ニトロ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、アシル、アシルアミノ、チオカルボキシ
、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルま
たは置換されたスルフィニルが挙げられるがそれらに限定されない。置換基が置換された
場合は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アル
コキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルコキシアルキル、ハロゲノアルキル
、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アシル、アシルオキシ、ヒドロキシ、メルカプト、カルボ
キシ、チオカルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルバモイ
ル、置換されていてもよいアミノで置換され得る。
護基を、保護が所望される官能基に付加する反応をいう。保護基により官能基を保護する
ことによって、より反応性の高い官能基の反応を抑制し、より反応性の低い官能基のみを
反応させることができる。
。脱保護反応としては、トリフルオロ酢酸(TFA)による反応およびPd/Cを用いる
還元反応のような反応が挙げられる。
moc)基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、t−ブトキシカルボニル基、t−
ブチルジメチル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、N−フタルイミジル基、トリ
メチルシリルエチルオキシカルボニル基、2−ニトロ−4,5−ジメトキシベンジル基、
2−ニトロ−4,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、カルバメート基などが代
表的な保護基として挙げられる。保護基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基などの反
応性の官能基を保護するために用いることができる。反応の条件や目的に応じ、種々の保
護基を使い分けることができる。ヒドロキシ基の保護基にはアセチル基、ベンジル基、シ
リル基またはそれらの誘導体などが、アミノ基の保護基にはアセチル基のほかベンジルオ
キシカルボニル基、t−ブトキシカルボニル基またはそれらの誘導体などを使用すること
ができる。アミノオキシ基およびN−アルキルアミノオキシ基の保護基として、トリメチ
ルシリルエチルオキシカルボニル基、2−ニトロ−4,5−ジメトキシベンジルオキシカ
ルボニル基またはそれらの誘導体が好ましい。
成物、溶媒など)を、当該分野で慣用される方法(例えば、抽出、蒸留、洗浄、濃縮、沈
澱、濾過、乾燥など)によって除去した後に、当該分野で慣用される後処理方法(例えば
、吸着、溶離、蒸留、沈澱、析出、クロマトグラフィーなど)を組み合わせて処理して単
離し得る。
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分
野の技術範囲内にある、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学
および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下
に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説
明されている。
該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Maniatis,T.et
al.(1989).Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.
(2001);Ausubel,F.M.,et al.eds,Current Pr
otocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons Inc.,NY,10158(2000);Innis,M.A.(1
990).PCR Protocols:A Guide to Methods an
d Applications,Academic Press;Innis,M.A.
et al.(1995).PCR Strategies,Academic Pre
ss;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applicat
ions: Protocols for Functional Genomics,
Academic Press;Gait,M.J.(1985).Oligonucl
eotide Synthesis:A Practical Approach,IR
L Press;Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide
Synthesis:A Practical Approach,IRL Press
;Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and
Analogues:A Practical Approac ,IRL Press
;Adams,R.L.et al.(1992).The Biochemistry
of the Nucleic Acids,Chapman & Hall;Sha
barova,Z.et al.(1994).Advanced Organic C
hemistry of Nucleic Acids,Weinheim;Black
burn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in C
hemistry and Biology,Oxford University P
ress;Hermanson,G.T.(1996).Bioconjugate T
echniques,Academic Press;Method in Enzym
ology 230、242、247、Academic Press、1994;別冊
実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997;畑中、西村ら、糖質の科学
と工学、講談社サイエンティフィク、1997;糖鎖分子の設計と生理機能 日本化学会
編、学会出版センター、2001などに記載されており、これらは本明細書において関連
する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明の
よりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべ
きでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の
範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
機残基複合体から硫黄原子を含む有機残基誘導体をイオン化させて、硫黄原子を含む有機
残基誘導体を質量分析する方法を提供する。この方法によって、金属に結合した自己組織
化膜表面上での化学反応を高感度かつ正確に解析することが可能となる。
いし、例えば鉄、ニッケル、コバルトまたは酸化鉄(Fe3O4)などの磁性粒子および
この粒子の表面に被覆した金、銀、カドミウムまたはセレンなどの層を含む複合微粒子で
あってもよく、これらに限定されない。上記のような磁性を有する複合微粒子を使用する
場合には、これに硫黄原子を含む有機残基誘導体を担持したのち、磁石等を用いて微粒子
を簡易に回収し、精製無しで質量分析することができる。本発明で用いる金属の形態は特
に制限されず、質量分析用の金属基板であってもよいし、コロイドを形成し得る金属微粒
子であってもよいが、レーザーの乱反射が可能である表面形態を有する金属が好ましい。
これによって、質量分析の感度が高くなり、夾雑物(バッファーまたは塩など)が存在し
たとしても、質量分析測定に影響を及ぼす可能性が少なくなる。金表面に結合したチオー
ル化合物のLDI−TOF Massによるイオン化効率の観点において、本発明で用い
る金属の最も好ましい形態としては、金属微粒子が挙げられる。チオール基と金属との結
合を利用して、金属微粒子表面に糖鎖や種々の官能基を提示することができ、またその金
属微粒子の溶解性を、金属微粒子表面に導入するリガンドの性質によって自在に制御する
ことができる。従って、チオール化合物で被覆した金属微粒子は、水系での反応のみなら
ず有機溶媒系での固相合成を行う際に有用な固相担体として利用することができる。微粒
子は反応溶媒に溶解しているが、精製の際には固体として遠心濾過によって溶液成分と分
離可能であるため、分離精製も非常に容易に行えるという利点がある。さらに反応の経過
を質量分析法によって直接追跡することができ、効率的に反応を行える。また、本発明に
よれば、硫黄原子を介して細胞毒性の無い有機残基と結合した金属微粒子を提供すること
により、金属−有機残基複合粒子を生細胞に直接取り込ませることができ、細胞内で生じ
る様々な化学反応(例えば、酵素反応)を、その反応生成物を質量分析することで正確に
解析することができる。金属微粒子の代表例である金微粒子および銀微粒子は、それぞれ
テトラクロロ金酸およびAgNO3を還元剤存在下で還元させることによって作製するこ
とができる。好ましい還元剤として、水素化ホウ素ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム
が挙げられるが、これらに限定されない。これら金属を使用することによって、金属微粒
子の表面上に硫黄原子を含む有機残基誘導体の規則正しい自己組織化膜を形成することが
できる。
われる。本発明では、従来のMALDI−TOF MS法において使用されてきたマトリ
ックス試薬を特に必要としない。従来のMALDI−TOF MS法において、「薬剤候
補化合物として多いであろう低分子領域」について、マトリックス自身の強いピークによ
り、目的物のピークがうまく観察できないことが欠点とされてきたが、本発明のように目
的の低分子化合物を金属基板(特に、金属微粒子)に担持することにより、マトリックス
フリーなLDI−TOF MSを、高感度かつ正確に行うことができる。なお、本発明に
おいて、マトリックス試薬を使用する場合には、その好ましい試薬として、2,5−ジヒ
ドロキシベンゾイックアシッド、α−シアノ−4−ヒドロキシ−ケイ皮酸、シナピン酸、
trans−3−インドール−アクリル酸、1,5−ジアミノ−ナフタレン、3−アミノ
−4−ヒドロキシ安息香酸、9−ニトロ−アントラセン、2−ピコリン酸、3−ヒドロキ
シ−ピコリン酸、ニコチン酸、アントラニル酸、5−クロロ−サリチル酸、2’−(4−
ヒドロキシフェニルアゾ)安息香酸、ジスラノール、および3−アミノ−キノリンが挙げ
られるが、これらに限定されない。最も好ましいマトリックス試薬は、2,5−ジヒドロ
キシベンゾイックアシッドである。
一般式(I):
(R−S)n−M1 (I)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子であり、M1は金属であり、nはM1に対す
る(R−S)基の化学量論比を表し、1以上の整数である)
で表される金属−有機残基複合体から硫黄原子を含む有機残基誘導体をイオン化すること
を特徴とする、
一般式(II):
R−SH (II)
(式中、RおよびSは前記と同意義である)で表される化合物もしくはその塩、および/
または
一般式(III):
R−S−S−R (III)
(式中、RおよびSは前記と同意義である)で表される化合物もしくはその塩、
を質量分析する方法、を提供する。
一般式(IV):
M1−S−X−CH(R)−S−M1 (IV)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子であり、両端のM1は同一実体の金属であり
、Xは低級アルキレンまたは低級アルケニレンである)
で表される金属−有機残基複合体から硫黄原子を含む有機残基誘導体をイオン化すること
を特徴とする、
一般式(V):
HS−X−CH(R)−SH (V)
(式中、R、SおよびXは前記と同意義である)で表される化合物もしくはその塩、およ
び/または
一般式(VI):
を質量分析する方法、を提供する。
以下の工程:
1)金属が以下の式(本明細書において、以下の式の群を[X群]とする):
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH(CH3)、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−W1−O−NH2、
−S−W1−O−NH(CH3)、
−S−W1−O−W2−O−NH2、
−S−W1−O−W2−O−NH(CH3)、
−S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH2、
−S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH(CH3)、
−S−W1−C(=O)−NH−NH2、
−S−W1−C(=S)−NH−NH2、
−S−W1−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−W1−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−O−NH2、
−S−Z1−O−Z3−O−NH(CH3)、
−S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、
−S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH2、
−S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3)、
−S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH、
−S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH、または
12アルケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであ
り;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S
)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)
で表される基と結合した金属−有機残基複合体と、糖鎖または糖鎖含有物質とが反応しう
る条件下で接触させる工程、
2)該糖鎖または該糖鎖含有物質が結合した金属−有機残基複合体を得る工程、および
3)得られた金属−有機残基複合体から硫黄原子を有する有機残基誘導体をイオン化する
工程、
を包含する、糖鎖または糖鎖含有物質を質量分析する方法、を提供する。
とを接触させる前に、上記「糖鎖または糖鎖含有物質」中のアルデヒド基を遊離させる工
程を包含することが好ましくあり得る。これは、例えば、糖鎖のアルデヒド基が保護され
ている場合などにおいて、本発明の糖鎖と特異的に相互作用し得る物質が有利に相互作用
することができるようになるからである。そのようなアルデヒド基を遊離させる工程は、
好ましくは、酵素処理および/または化学法による供プロトン反応を包含する。酵素処理
としては、例えば、グリコシダーゼによる処理(例えば、ガラクトースの場合は、ガラク
トオキシダーゼで処理してアルデヒド基を得る)が挙げられ、化学法による処理としては
、ヒドラジン分解を挙げることができる。本発明の方法では、酵素処理および化学法をそ
れぞれ単独で用いてもよく、両方組み合わせて用いてもよい。酵素は、単数の種類であっ
てもよく、複数種類のものであってもよい。また、糖タンパク質糖鎖に含まれるシアル酸
からアルデヒドを遊離させる場合(例えば、シアル酸の8位と9位の間を開列させる場合
)は、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)などの酸化剤が用いられる。
体複合体から該硫黄原子を含む被検体をイオン化することを特徴とする、硫黄原子を含む
被検体を質量分析する方法を提供する。
1)還元剤の存在下、テトラクロロ金酸および硫黄原子を有する被検体を反応させる工程
、
2)金微粒子に該硫黄原子を介して被検体が結合した金−被検体複合粒子を得る工程、お
よび
3)得られた金−被検体複合粒子から硫黄原子を有する被検体をイオン化する工程、
を包含する、硫黄原子を有する被検体を質量分析する方法、を提供する。
ナトリウムを使用することが好ましいが、これらに限定されない。
ーテル系溶媒またはそれらの混合溶媒からなる群から選択される溶媒中で行われる。好ま
しいアルコール系溶媒としては、メタノール、エタノール、n−プロパノール、イソプロ
パノール、n−ブタノールが挙げられる。好ましいエーテル系溶媒賭しては、ジメチルエ
ーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランが挙げられる。上記工程1)が行われる
温度は−20℃から200℃、好ましくは0℃〜150℃、さらに好ましくは20℃〜1
00℃である。また、化合物が安定なものであれば、室温〜溶媒の還流温度であることが
好ましい。上記工程1)は、0.1時間〜24時間、好ましくは1時間〜12時間で行わ
れる。
合した金属−被検体複合粒子は、遠心濾過により精製される。しかし、遠心濾過をせずに
そのまま金属−被検体複合粒子を質量分析に供したとしても、感度が低下しないという複
合粒子特有の利点を有する。
複合粒子が磁性を帯びるため、工程2)は磁石を用いて行うことができる。また、酵素反
応の基質となる化合物を「検体」部分に有する磁性を帯びた金属−被検体複合粒子を、生
細胞と接触させ、反応後に細胞をつぶして磁石で回収し、質量分析することで、細胞内で
起こっている様々な酵素反応を解析することができる。
3)を用いることにより行うことができる。
反応または酵素反応に付し、反応系中の金属−被検体複合粒子から硫黄原子を有する被検
体をイオン化し、質量分析により化学反応または酵素反応の進行を確認する方法を提供す
る。
に限定されない。
って、糖転移酵素の活性を確認することができる。
ていてもよいN−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジ
ド基およびシステイン残基ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される基、および
b)硫黄原子、を含む基と結合した金属−有機残基複合体を提供する。
a)保護されていてもよいアミノオキシ基、保護されていてもよいN−アルキルアミノ
オキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基ならび
にそれらの誘導体からなる群から選択される基、および
b)チオール基またはジスルフィド基、
を含む化合物もしくはその塩を反応させることによる、金−有機残基複合粒子の製造方
法を提供する。
を提示することができる。
金属が、上記[X群]の式で表される基と結合した金属−有機残基複合体、を提供する
。この金属−有機残基複合体は、以下の式(本明細書において、以下の式の群を[Y群]
とする):
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH(CH3
))m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−S
H)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−S
H)m、
M2−(S−W1−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−C(=O)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−C(=S)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−W1−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、または
一般式(VII):
mは、M2に対する硫黄原子を含む有機残基の化学量論比を表し、1以上の整数であり;
Y、W1およびW2は、それぞれ独立して、C1〜C12アルキレン、C2〜C12アル
ケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであ
り;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S
)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)とも表すことができる。
称:AHMT)のSH基が金属と反応し結合してできた複合体である。このAHMTは、
ホルムアルデヒドまたはアルデヒドと特異的に反応する呈色試薬として知られている(例
えば、特許文献2、3、4および非特許文献2参照)。
いて、以下の式の群を[Z群]とする):
12アルケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであ
り;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S
)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)
で表される化合物もしくはその塩を反応させることによる、金−有機残基複合粒子の製造
方法、が提供される。
しうる条件下で接触させることを特徴とする、糖鎖または糖鎖含有物質の捕捉方法、が提
供される。
1)金属が硫黄原子を介して有機残基と結合した金属−有機残基複合体と、該有機残基と
相互反応しうる物質とを、接触させる工程、
2)該相互作用しうる物質が結合した金属−有機残基複合体を得る工程、および
3)得られた金属−有機残基複合体から硫黄原子を有する有機残基誘導体をイオン化する
工程、
を包含する、金属−有機残基複合体の有機残基と相互作用しうる物質の分子量を測定する
方法、が提供される。
工程:
1)式:
2)1)で得られた金属−有機残基複合体を、糖鎖または糖鎖含有物質とが反応しうる条
件下で接触させる工程、および
3)2)で得られた金属−有機残基複合体から硫黄原子を有する有機残基誘導体をイオン
化する工程、
を包含する方法であってもよいし、以下の工程:
1)式:
とが反応しうる条件下で接触させる工程、
2)1)で得られた化合物と金属とを接触させる工程、および
3)2)で得られた金属−有機残基複合体から硫黄原子を有する有機残基誘導体をイオン
化する工程、
を包含する方法であってもよい。
一般式(II):
R−SH (II)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(III):
R−S−S−R (III)
(式中、RおよびSは前記と同意義である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(V):
HS−X−CH(R)−SH (V)
(式中、RおよびSは前記と同意義であり、Xは低級アルキレンまたは低級アルケニレン
である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(VI):
はそれらの混合物を含有する糖鎖捕捉用組成物を提供する。
る化合物を含有する。
一般式(I):
(R−S)n−M1 (I)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子であり、M1は金属であり、nはM1に対す
る(R−S)基の化学量論比を表し、1以上の整数である)で表される金属−有機残基複
合体;または
一般式(IV):
M1−S−X−CH(R)−S−M1 (IV)
(式中、RおよびSは前記と同意義であり、両端のM1は同一実体の金属であり、Xは低
級アルキレンまたは低級アルケニレンである)で表される金属−有機残基複合体、
を含有する、糖鎖捕捉用組成物を提供する。
る金属−有機残基複合体を含有する。
以下のA)およびB):
A)一般式(II):
R−SH (II)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(III):
R−S−S−R (III)
(式中、RおよびSは前記と同意義である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(V):
HS−X−CH(R)−SH (V)
(式中、RおよびSは前記と同意義であり、Xは低級アルキレンまたは低級アルケニレン
である)で表される化合物もしくはその塩;
一般式(VI):
はそれらの混合物;および
B)金属、
を含む、糖鎖または糖鎖含有物質の質量分析用キット、を提供する。
以下のA)およびB):
A)上記[Z群]の式で表される、硫黄原子を含む有機残基誘導体;および
B)金属、
を含む。
分析用キットは、C)還元剤、をさらに含む。
一般式(I):
(R−S)n−M1 (I)
(式中、Rは有機残基であり、Sは硫黄原子であり、M1は金属であり、nはM1に対す
る(R−S)基の化学量論比を表し、1以上の整数である)で表される金属−有機残基複
合体;または
一般式(IV):
M1−S−X−CH(R)−S−M1 (IV)
(式中、RおよびSは前記と同意義であり、両端のM1は同一実体の金属であり、Xは低
級アルキレンまたは低級アルケニレンである)で表される金属−有機残基複合体、を含有
する、糖鎖または糖鎖含有物質の質量分析用キット、を提供する。
上記[Y群]の式で表される金属−有機残基複合体を含む。
ましい組み合わせとして、糖鎖捕捉官能基/糖鎖、糖鎖/タンパク質、抗原/抗体などが
挙げられる。
が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によ
ってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的
な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実
施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および
文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細
書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
DI TOF Massによる直接検出)
テトラクロロ金酸25mgをフラスコ中で1mLの超純水に溶解した。リガンド(1)
55mgを20mLのメタノールに溶解し、テトラクロロ金酸水溶液に加えた。溶液を激
しく撹拌しながら、水素化ホウ素ナトリウム56mgを超純水5mLに溶かした溶液を少
量ずつ加えた。室温で2時間撹拌を続けた後に、反応溶液をContriplus YM
50(ミリポア社)を用いて遠心濾過し(20℃、3,500rpm)、リガンド1を表
面に導入した金微粒子を得た。微粒子は水、アセトン、メタノールに可溶であった。遠心
濾過操作で得られた微粒子(図1のa))およびろ液(図1のb))のMALDI−TO
F Massを測定した。マトリックスとして2,5−ジヒドロキシベンゾイック酸(D
HB)を用いた。図1より、金微粒子から切断、イオン化したリガンド(1)に基づくピ
ークを確認した。
ジスルフィドを有する化合物(2)のメタノール溶液をテトラクロロ金酸水溶液に加え
て、水素化ホウ素ナトリウム水溶液を少量ずつ滴下した。室温で3時間撹拌した後にCe
ntriplus YM−50を用いて遠心濾過をし、化合物2を導入した金微粒子を得
た。微粒子をメタノールに溶解し、トリフルオロ酢酸を25%の濃度に成るように加え、
室温で2時間撹拌した後、反応系の一部をマイクロコンを用いて遠心濾過し、マトリック
スとしてDHBを用いてMALDI−TOF Massによる質量分析測定によって反応
の進行を確認した(図2)。図2より、保護基が脱離して得られた生成物に基づくピーク
を確認した。
ド分子量直接測定)
アグリコン末端にチオール基を有するマルトトリオース誘導体(3)(12.5mg,
21.6μmol)をメタノール20mLに溶解し、テトラクロロ金酸15μLを加えた
。この溶液に水素化ホウ素ナトリウム水溶液(30mg/2mL,0.79mmol)を
少量ずつ加え、室温で3時間撹拌した。Centriplus YM−50を用いた遠心
濾過により微粒子を精製した。微粒子を超純粋に溶解し、マトリックスとして2,5−ジ
ヒドロキシベンゾイック酸(DHB)を用いてMALDI−TOF Massによる質量
分析を行った(図3)。図3より、ジスルフィド体3に基づくピークの出現から、糖鎖リ
ガンドで修飾した金微粒子の場合にもMALDI−TOF Massによって容易にリガ
ンドの質量が検出できることが示された。
N−アセチルグルコサミンを末端に有する化合物4(10mg,7.6μmol)およ
び化合物(1)(52mg,69μmol)をメタノール(35mL)−純水(5mL)
混合溶媒に溶解し、テトラクロロ金酸(25.5mg,75μmol)を加えた。この溶
液に水素化ホウ素ナトリウム水溶液(70mg/5mL)を少量ずつ加え、室温で12時
間撹拌した。Centriplus YM−50を用いた遠心濾過により微粒子を精製し
た。微粒子を純水に溶解し、マトリックスとして2,5−ジヒドロキシベンゾイック酸(
DHB)を用いてMALDI−TOF Massによる質量分析を行った(図4)。図4
より、化合物(1)、化合物(4)のホモジスルフィド体および化合物(1)と(4)の
ヘテロジスルフィド体に対応する分子量ピークが観察された。ここで、遠心分離により精
製した微粒子の電子顕微鏡(TEM)写真を図5に示す。
)による糖鎖伸長反応)
実施例4に従って作製した糖鎖−金微粒子(GlcNAc−Au:50μM)、UDP
−Gal(400μM)のMHEPESバッファー溶液(10mMMnCl2、0.15
MNaCl)100μL]を調製した。β1−4ガラクトース転移酵素(GalT)を4
mU加え、25℃でMALDI−TOF Massを用いて糖鎖伸長反応を追跡した。反
応溶液の遠心濾過を行なわず、マトリックスとして2,5−ジヒドロキシベンゾイック酸
(DHB)を用いてMALDI−TOF Massによる質量分析を行った(図6)。図
6より、化合物(4)(出発物質)に対応するピークは消失し、新たに酵素反応によって
ガラクトースが付加した化合物5(生成物)と化合物(1)のヘテロジスルフィド体に対
応する分子量ピーク([M+Na]+1220.662)が観察され、糖鎖−金微粒子上
での酵素反応を追跡できることが示された。図6のスペクトルから得た糖鎖伸長反応にお
ける時間−反応度プロットを図7に示す。このプロットより、MALDI−TOF Ma
ssを用いた質量分析により、GlcNAc−Au上でのGalT反応がうまく捕らえら
れることが明らかとなった。
活性測定)
実施例4に従って作製した糖鎖−金微粒子(GlcNAc−Au:50μM)、UDP
−Gal(400μM)のMHEPESバッファー溶液(10mMMnCl2、0.15
MNaCl)100μL]を調製した。これにβ1−4ガラクトース転移酵素(GalT
)4mUおよびUDP(0〜500μMの9通りの濃度)を加え、反応温度25℃で60
分間反応させた。UDP濃度(μM)と阻害活性(%)との関係を図8に示す。このプロ
ットから、UDPのIC50は、300μMであることが明らかとなった。
糖鎖捕捉官能基としてBoc保護されたオキシアミノ基を末端に持つチオール化合物(
6)(22mg,17μmol)と化合物1(54mg,71μmol)をメタノール2
0mLに溶解し、テトラクロロ金酸(34mg,100μmol)を加えた。この溶液に
水素化ホウ素ナトリウム水溶液(31mg/3mL)を少量ずつ加え、室温で12時間撹
拌した。反応溶液をCentriplus YM−50を用いて遠心濾過し、微粒子を精
製した(100000>分子量>50000)。微粒子を純水に溶解し、マトリックスと
して2,5−ジヒドロキシベンゾイック酸(DHB)を用いてMALDI−TOF Ma
ssによる質量分析を行った(図9)。図6より、化合物(6)のジスルフィド体、Bo
c基が脱保護された化合物(7)と化合物(6)のヘテロジスルフィド体、化合物(6)
と化合物(1)のヘテロジスルフィド体、化合物(7)と化合物(1)のジスルフィド体
に対応するピークが観察された。
実施例7で作製した微粒子(10mg)をメタノール2mLに溶解し、トリフルオロ酢
酸1mLを加え、室温で18時間撹拌した。反応溶液をCentriplus YM−5
0を用いて遠心濾過し、微粒子を精製した。微粒子を純水に溶解し、MALDI−TOF
Massによる質量分析を行った(図10)。図10より、化合物(6)由来のピーク
は消失し、Boc基が脱保護された化合物(7)と化合物(1)とのジスルフィド体が観
察された。金微粒子上でのアミノ基の脱保護反応が確認された。
実施例8に従って作製した糖鎖捕捉金微粒子をエッペンドルフチューブに170μgず
つ分け入れ100μLの純水に溶解した。マンノース、グルコース、N−アセチルグルコ
サミン、マンノペンタオースをそれぞれ1mgずつ量りとり、パーティクル溶液に加えて
溶かした。37℃で6日間インキュベートした。反応後の溶液をCentriplus
YM−50を用いて遠心濾過し、微粒子を精製した。微粒子を純水に溶解し、MALDI
−TOF Massによる質量分析を行った(マンノース(図11)、グルコース(図1
2)、N−アセチルグルコサミン(図13)、マンノペンタオース(図14))。図11
〜図14において、各糖鎖がオキシアミンと共有結合を形成したものに対応するピークが
化合物1とのジスルフィド体としてそれぞれ観察された。金微粒子に提示したオキシアミ
ノ基による糖鎖捕捉反応が示された。
D−グルコース 10mg(0.056mol)を水10mLに溶かし、96穴プレー
トに1μLから10μLまで1μL刻みでD−グルコース溶液を入れ、次いで、10個の
ウェルにそれぞれ10mM NaIO4を50μLずつ加えた。10分間室温で静置した
後、それぞれのウェルに41mM AHMT(4−アミノ−3−ヒドラジノ−5−メルカ
プト−1,2,4−トリアゾール)(0.5M HCl)50μLを加えてから、2M
KOH 100μLを加えた。室温で2時間静置すると呈色を起こしたので、A492を
測定し、各D−グルコース濃度に対してOD(光学密度)492nmをプロットした。そ
の結果、このプロットがほぼ直線関係を示したことから、AHMTとD−グルコースのア
ルデヒド基との反応が一次反応で進行することが明らかとなった。
AHTMの着色試験用サンプルとして、ウシ血清中に含まれるシアロ糖タンパク質を用
いた。次の4種類のサンプルを調製し、AHTMの着色を観察した。
を合わせ、10分間、氷上で静置した。次いで、50mM AHMT 200 μlを加
え、室温で30分間静置した。
、50mM AHMT 200μlを加え、室温で30分間静置した。
を合わせ、10分間、氷上で静置した。次いで、室温で30分間静置した。
、室温で30分間静置した。
の糖と反応し、その結果AHMTとも良好に反応したことが明らかとなった。
MALDI−TOF MS用の円形プレート4枚を1500秒間金蒸着した。これらの
プレートを以下の4通りの方法で処理した。
。1時間室温で静置後、水でプレート表面の余分なAHMTを除去した。トリプシン消化
済みの10mg/ml Fetuin 200μlと10mM NaIO4 50μlを
混合し、プレート上に乗せた。10分間静置後、0.2M NaOH 50μlを同様に
プレート上に乗せ、氷上で1時間静置した(図17)。
。1時間室温で静置後、水でプレート表面の余分なAHMTを除去した。酵素消化未処理
の10mg/ml Fetuin 200μlと10mM NaIO4 50μlを混合
し、プレート上に乗せた。10分間静置後、0.2M NaOH 50μlを同様にプレ
ート上に乗せ、氷上で1時間静置した(図17)。
00μlと10mM NaIO4 50μlを混合し、氷上で10分間静置した。50m
M AHMT(0.2M NaOH)200μlを加え、ピンク色に呈色を起こしてから
プレートにスポットし、氷上で1時間静置した(図18)。
と10mM NaIO4 50μlを混合し、氷上で10分間静置した。50mM AH
MT(0.2M NaOH)200μlを加え、ピンク色に呈色を起こしてからプレート
にスポットし、氷上で1時間静置した(図18)。
。その結果を図19に示す。図19は、トリプシンで消化したFetuinは、手順1と
手順2のいずれの工程を経ても、金基板表面上のAHTMにより、遊離アルデヒドを有す
る糖ペプチドが捕捉され、酵素未処理の場合は、手順1および手順2のいずれの場合もう
まく捕捉できなかったことを示す。
鎖−金微粒子(GlcNAc−Au)上での糖鎖伸長反応およびMALDI−TOF M
assによる酵素反応追跡)
Neisseria meningtids MC50株のLgtB遺伝子産物である
β1−4ガラクトース転位酵素(GalT)を大腸菌で発現し、菌体を破砕して0.2%
TrionX−100を含むバッファーに懸濁した。菌体破砕液中の全タンパク質濃度は
8.5mg/mLであった。実施例4に従って作製した糖鎖−金微粒子(GlcNAc−
Au)のHEPESバッファー(10mM HEPES,10mM MnCl2,150
mM NaCl)溶液(GlcNAc濃度;500μM)を120μL,UDP−Gal
(500μM)20μL,および上記菌体破砕液40μLを混合し、25度で32時間イ
ンキュベートした。反応溶液のうち10μLをCentriconYM50を用いて遠心
ろ過し、微粒子を超純水で洗浄した。糖鎖微粒子のMALDI−TOF Mass測定を
行ったところ、酵素反応の生成物(化合物5)に対応する分子量のピークが検出された(
図18)。これにより本方法が発現した酵素の活性測定法として非常に簡便、高速であり
、優れた手法であることが示された。
よる直接検出)
実施例4に従って作製した糖鎖−金微粒子(GlcNAc−Au)をMALDI−TO
F Mass用ターゲットにアプライし、マトリックスを用いずに、直接LDI−TOF
Mass測定を行ったところ、化合物(1)、化合物(4)のホモジスルフィド体、お
よび化合物(1)と(4)のヘテロジスルフィド体に対応する分子量のピークが観察され
た(図19a)。一方、同量の糖鎖−微粒子(GlcNAc−Au)をヨウ素と混合し、
チオールリガンドを金微粒子表面から遊離させ、反応溶液のTOF−Mass測定を行っ
た場合には、反応溶液中にチオール化合物(1)および(4)を含むにもかかわらず、チ
オール化合物のイオン化は観察されなかった(図19b)。このとき、2,5ジヒドロキ
シベンゾイック酸(DHB)に代表されるような低分子マトリックスは使用していない。
したがってこれにより、金微粒子表面に導入したチオール化合物は、低分子マトリックス
化合物を使用せずに直接レーザー照射によってイオン化し、TOF Massによって検
出できることが示された(LDI−TOF Mass)。
ucT)による糖鎖伸長反応)
実施例5に従って得られた糖鎖(Gal−GlcNAc)−金微粒子を10mM HE
PESバッファー(10mM MnCl2,150mM NaCl)に溶解し、α1,3
−FucT VIを5mU,GDPフコースを500μMになるように加え、反応温度2
5度でインキュベートした。反応開始後5,10,20,30,40,50,60分後に
反応系から1μLずつ取り出し、MALDI−TOF Mass測定を行った(図20、
21)。またLDI−TOF Mass測定によっても、生成物に対応するピークを観察
した。
(8)
実施例15に従って作製した糖鎖(Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc;
Lex)金微粒子のLDI−TOF Mass測定を行った。さらに得られたピーク([
M(化合物8)+Na]+1368.75)を親イオンとしてLDI−TOF/TOF解
析を行ったところ、フラグメントイオンのパターンから、Lexの糖鎖構造が同定された
(図22)。これにより、硫黄原子を介して金属に結合した有機残基は、LDI−TOF
、LDI−TOF/TOF Massによって質量分析および構造解析が可能であること
が示された。
Massのイオン化効率の比較)
実施例1に従って作製した金微粒子を、チオール化合物濃度が100μMになるように
バッファーに溶解した。この溶液0.2μLを、MALDI−TOF Mass用プレー
トに直径2mmの円形状にアプライした。一方、化合物1を、チオール濃度500μMに
なるようにメタノールに溶解し、0.1μLをMALDI−TOF Mass用金プレー
トに直径2mmの円形状にアプライして、金基板上での自己組織化膜を形成した。金プレ
ートは使用直前に金蒸着を行った。上記2サンプルについて、LDI−TOF Mass
測定を行った。レーザー強度を一定にして、ターゲットプレート上の同一箇所に1ショッ
トずつレーザーを照射した。繰り返して計10回同様の操作を行い、それぞれ得られたピ
ーク強度を記録した(図23)。その結果、金基板ではレーザー照射回数が増えると共に
イオン化強度が徐々に低下し、照射4回程度でピークが完全に観察されなくなった。一方
、金微粒子表面からのイオン化は、レーザー照射10回目でも十分量観察された。さらに
30回、50回とレーザー照射を繰り返しても、化合物1に基づくピークが観察され続け
た。このように、金表面に結合したチオール化合物のLDI−TOF Massによるイ
オン化効率は金担体の形状に依存し、金微粒子表面からのイオン化は板状の金基板と比較
して優位であることが示された。
TOF Massによる直接観察)
市販の酸化鉄(Fe3O4)粒子(直径0.2μm程度)10mgを40mLのメタノ
ールに懸濁した。テトラクロロ金酸17%塩酸溶液50μL、リガンド(9)10mgを
加えた。この溶液に水素化ホウ素ナトリウム20mgを超純水2mLに溶かした水溶液を
少量ずつ加えた。室温で一時間振盪した後、磁石を用いて微粒子を回収し、リガンド9を
表面に導入した磁性金微粒子を得た。メタノールで洗浄した後、マトリックスとして2,
5ジヒドロキシベンゾイック酸(DHB)を用いてMALDI−TOF Mass測定を
行ったところ、イオン化したリガンド9に基づくピークを確認した。さらに、マトリック
スを使用せずに、微粒子を直接MALDI−TOF Mass用ターゲットプレートにア
プライしてレーザー照射をしたところ、イオン化したリガンド9に基づくピークを確認し
た(図24)。これにより磁性金微粒子表面に結合したチオール化合物に直接レーザー照
射することで、DHB等のマトリックスを使用せずにLDI−TOF Massによって
微粒子上のチオール化合物のイオン化が可能であることを示した。
実施例18と同様の方法にて、N−アセチルグルコサミンを末端に有する化合物10の
水溶液(10nmol/μL)1mL、化合物11(58mg、79μmol)をメタノ
ール40mLに溶解し、酸化鉄微粒子6mgを加えて懸濁させた。この溶液にテトラクロ
ロ金酸17%塩酸溶液100μLを加え、水素化ホウ素ナトリウム30mgを超純水4m
Lに溶かした水溶液を少量ずつ滴下した。室温で一時間振盪した後、磁石を用いて微粒子
を回収し、リガンド10,11を表面に導入した磁性金微粒子を得た。微粒子メタノール
で洗浄し、LDI−TOF Mass測定行ったところ(図25)、化合物(10)、化
合物(11)のホモジスルフィド体、および化合物(10)と(11)のヘテロジスルフ
ィド体に対応する分子量ピークが検出された。一方、DHBをマトリックスとして用いて
MALDI−TOF Mass測定を行った場合にも、LDI−TOF Massで得ら
れたピークと同一の分子量ピークが得られた。
転位酵素(GalT)による糖鎖伸長反応)
実施例19に従って作製した糖鎖−磁性金微粒子を400μLの超純水に懸濁した溶液
5μL、10mMHEPESバッファー(10mM MnCl2、150mM NaCl
を含む)に溶解したUDP−Gal(濃度1mM)20μLを、1.5mLサイズのエッ
ペンドルフチューブ内で混合した。β1−4ガラクトース転位酵素(GalT)4mUを
加え、37度で酵素反応を行った。反応開始から5時間後、反応溶液の一部(5μ)を取
り出し、超純水で洗浄した。磁石によって回収した微粒子のMALDI−TOF Mas
s測定を行ったところ(図26)出発物質に対応するピーク(化合物10と11のジスル
フィド対)は消失し、新たに酵素反応によってガラクトースが付加した化合物(12)と
(11)のヘテロジスルフィド体に対応する分子量([M+Na]+=1127.251
)が検出された。これによって糖鎖を表面に提示した磁性金微粒子表面での酵素反応が簡
便に追跡できることが示された。
OF Massによる直接検出)
CdCl2・2.5H2O(9.6mg、42μmol)を超純水10mLに溶解し、
化合物9(10mg)のメタノール溶液(液量2mL)を加えて撹拌した。この溶液にN
a2S・9H2O(10mg、42μmol)を2mL超純粋に溶解したものを少量ずつ
加え、室温で2時間撹拌を続けた。黄色の沈殿が生じたので遠心分離(350rpm、5
分)によって沈殿を除去し、上清をCentriplusYM−50を用いて遠心ろ過し
、フィルター上に得られた微粒子をメタノールおよび超純粋で洗浄した。微粒子のLDI
−TOF Mass測定を行ったところ、化合物9のホモジスルフィド体に対応する分子
量([M+Na]+958.306、[M+K]+974.293)のピークが観察され
た(図27)。一方、DHBをマトリックスとして用いてMALDI−TOF Mass
測定を行った場合にも、LDI−TOF Massで得られたピークと同一の分子量ピー
クが得られた。これにより、CdS微粒子表面に導入したチオール化合物が(MA)LD
I−TOF Massによって検出できることが示された。
化反応)
実施例1と同様の方法にて、化合物13を表面に導入した金微粒子を作製した。この金
微粒子1.5mgを乾燥ジクロロメタン1mLに溶解し、2,3,4,6−テトラ−O−
アセチル−D−ガラクトース トリクロロアセトイミデート(14)5mgを加えた。反
応系を0℃に冷やし、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸10μLを加えて
6時間撹拌した。CentriconYM−50を用いて反応系を遠心ろ過した後に、微
粒子をメタノールに溶解し、ナトリウムメトキシドを4mg加えて室温で20時間撹拌し
た。微粒子はメタノールに不溶化していたため、遠心(3000rpm、1分)によって
沈殿させて上清を除去した。微粒子を超純水に溶解し、(MA)LDI−TOF Mas
s測定を行ったところ、ガラクトース残基が導入されたグリコシル化反応生成物の分子量
に対応するピークが観察された(図28)。このことから、チオール化合物で被覆した金
微粒子は有機溶媒中での固相合成担体として使用可能であり、かつ固相合成の反応過程が
(MA)LDI−TOF Massによって非常に簡便に追跡できることが示された。
GlcNAc結合タンパク質であるコムギ胚芽レクチン(WGA)を27μM,ガラク
トース結合タンパク質であるピーナッツレクチンを20μMになるようにリン酸バッファ
ー(pH,7.4)100μLに溶解し、実施例19に従って作製した糖鎖(GlcNA
c)−磁性金微粒子を超純水に懸濁したものを2μL加えた。室温で30分インキュベー
ト後、磁石によって微粒子を回収し、100μLの超純水で計3回洗浄した。洗浄後、磁
性微粒子を磁石で回収したものを100μLの超純水に懸濁し、0.5μLをDHB(1
0mg/mL)0.5μLと混合し、MALDI−TOF Mass測定を行ったところ
(図29)WGAに対応するピークのみが観察された。糖鎖−磁性金微粒子を用いること
で、タンパク質の混合物の中から磁性金微粒子に担持した糖鎖と特異的に相互作用するタ
ンパク質を釣り上げ、釣り上げたタンパク質を質量分析によって同定できることが示され
た。
による阻害剤の検出)
リン酸バッファー(100mM, pH7.4)400μLに、α−アミラーゼ(SI
GMA A6255)5.8×10−8モル、2−Iminothiolane hyd
rochloride 5.8×10−8モル(1等量)を加え、エッペンドルフチュー
ブに入れて攪拌し、37℃で30分インキュベートした。30分後、金微粒子(SIGM
A G1652)を200μL加えて攪拌後、室温で12時間静置した。続いて反応液を
限外ろ過(Microcon YM−50、Millipore)し、限外ろ過膜上に得
られたα−アミラーゼ−金微粒子複合体を超純水100μLで洗浄−遠心濃縮した。この
操作を3回繰り返した。α−アミラーゼ−金微粒子複合体を超純水100μLに溶解し、
アカルボース(5.8×10−7モル,10等量)を加え、4℃で12時間静置した。そ
の後得られた反応液を“限外ろ過処理前反応液(1)”とした。また反応液の一部は限外ろ
過を行い、α−アミラーゼと結合力の弱い低分子化合物を取り除いたものを“限外ろ過処
理後反応液(2)”として、(1)、(2)について反応液0.5μLとマトリックス溶液(DH
B,10mg/mL)0.5μLを混合し、MALDI−TOF Mass測定を行った
(図30、31)。限外ろ過処理後(2)では、処理前(1)では微量のため検出できなかった
アカルボースのトランスグリコシル化により生成する、α−アミラーゼに対してより結合
力の強い6糖、7糖、8糖の生成物を選択的に検出できることが分かった。
市販の鉄粒子(粒径2〜3μm)1.5mgを100μlの水に懸濁した。水100μl、リガンド(1)1mgおよび10mg/mlのテトラクロロ金カリウム溶液100μlを加えた。この溶液を撹拌しながら35wt%Hydrazine 20μlを少量ずつ加えた。3時間室温で静置した後、磁石を用いて微粒子を回収し、メタノールおよび水で洗浄した。これにメタノール100μl、リガンド(1)1mgおよびテトラクロロ金カリウム溶液100μlを加え、撹拌しながら35wt%Hydrazine 20μlを少量ずつ加えた。室温で一晩震盪させた後、磁石を用いて微粒子を回収し、メタノールと水で洗浄した後、マトリックスとして2,5ジヒドロキシベンゾイック酸(DHB)を用いてMALDI−TOF Mass用ターゲットプレートにアプライしてレーザー照射したところ、イオン化したリガンド(1)のホモジスルフィド体に対応するピークを確認した。
クロロホルムとメタノールとの混合溶媒(クロロホルム:メタノール=1:1)1mLにガラクトシルセラミド2mgを溶かした。その溶液にオゾンをバブリングさせ、ガラクトシルセラミドの長鎖塩基部分のオレフィンをオゾン分解してアルデヒドにした。反応の様子はTLCによって確認した。30分後ジメチルスルフィド200μlを添加し反応を終了させた。この反応溶液10μlに、実施例8に従って作製したオキシルアミン金微粒子溶液10μlを加え60℃で12hインキュベートした。その後、CentriplusYM−50を用いて遠心ろ過し、フィルター上に残った金ナノ微粒子をメタノールで洗浄した。マトリックスとして2,5ジヒドロキシベンゾイック酸(DHB)を用いてこの金微粒子のMALDI−TOF Mass測定を行ったところ、化合物7にガラクトシルセラミドが捕捉されたものに対応するピークが観察された(図32)。これにより、オキシルアミン金微粒子によって糖脂質が捕捉できることが示された。
を提供することができる。
る。レーザーの乱反射可能な金属表面上に酵素反応の基質となる糖鎖を提示することによ
り、質量分析法によって酵素反応を追跡することができる。本発明によれば、質量分析の
際、通常の質量分析法では好ましくないバッファーまたは塩などがたとえ高濃度で存在し
たとしても、それらの影響を受けず、高感度に測定することができ、反応溶液の一部をそ
のまま分析に用いることができ、簡便である。また生成物を直接観測できるので、酵素反
応の速度論的解析も容易に行えるという利点を有する。
分子領域」について、マトリックス自身の強いピークにより、目的物のピークがうまく観
察できないことが欠点とされてきたが、本発明によれば、目的の低分子化合物を金属基板
(特に、金属微粒子)に担持することにより、マトリックスフリーなLDI−TOF M
Sを、高感度かつ正確に行うことができるという利点を有する。
利用して、金属微粒子表面に糖鎖や種々の官能基を提示することができ、またその金属微
粒子の溶解性を、金属微粒子表面に導入するリガンドの性質によって自在に制御すること
ができる。従って、チオール化合物で被覆した金属微粒子は、水系での反応のみならず有
機溶媒系での固相合成を行う際に有用な固相担体として利用することができる。微粒子は
反応溶媒に溶解しているが、精製の際には固体として遠心濾過によって溶液成分と分離可
能であるため、分離精製も非常に容易に行えるという利点がある。さらに反応の経過を質
量分析法によって直接追跡することができ、効率的に反応を行える。
e3O4)などの磁性粒子およびこの粒子の表面に被覆した金、銀、カドミウムまたはセ
レンなどの層を含む複合微粒子を使用することにより、これに硫黄原子を含む有機残基誘
導体を担持したのち、磁石等を用いて微粒子を簡易に回収し、精製無しで質量分析するこ
とができる。
子を提供することにより、金属−有機残基複合粒子を生細胞に直接取り込ませることがで
き、細胞内で生じる様々な化学反応(例えば、酵素反応)を、その反応生成物を質量分析
することで正確に解析することができる。
Claims (6)
- 以下の式:
または
(式中、Y、W1およびW2は、それぞれ独立して、C1〜C12アルキレン、C2〜C12アルケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであり;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)
で表される化合物を含有する、質量分析用糖鎖捕捉用組成物。 - 以下の式:
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−W1−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−C(=O)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−C(=S)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−W1−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、または
一般式(VII):
(式中、M2は金属であり;
mは、M2に対する硫黄原子を含む有機残基の化学量論比を表し、1以上の整数であり;Y、W1およびW2は、それぞれ独立して、C1〜C12アルキレン、C2〜C12アルケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであり;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)で表される金属−有機残基複合体を含有する、質量分析用糖鎖捕捉用組成物。 - 以下の式:
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2)m
(式中、M2は金属であり;
mは、M2に対する硫黄原子を含む有機残基の化学量論比を表し、1以上の整数であり;
Yは、C1〜C12アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)で表される金属−有機残基複合体を含有する、請求項2記載の質量分析用糖鎖捕捉用組成物。
- 以下のA)およびB):
A)以下の式:
または
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであり;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)
で表される、硫黄原子を含む有機残基誘導体;および
B)金属、
を含む、糖鎖または糖鎖含有物質の質量分析用キット。 - 以下の式:
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−W1−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH2)m、
M2−(S−(CH2CH2O)n−W1−O−W2−O−NH(CH3))m、
M2−(S−W1−C(=O)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−C(=S)−NH−NH2)m、
M2−(S−W1−NH−C(=O)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−W1−NH−C(=S)−CH(NH2)−W4−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z2−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−O−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH2)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−Z5−O−NH(CH3))m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−O−Z6−SH)m、
M2−(S−Z1−Z3−Z4−CH(NH2)−Z6−SH)m、または
一般式(VII):
(式中、M2は金属であり;
mは、M2に対する硫黄原子を含む有機残基の化学量論比を表し、1以上の整数であり;Y、W1およびW2は、それぞれ独立して、C1〜C12アルキレン、C2〜C12アルケニレンまたはC2〜C12アルキニレンであり;
W4は、C1〜C2アルキレンであり;
Z1は、置換されていてもよいアリレンまたは置換されていてもよいヘテロアリレンであり;
Z2は、含窒素複素環であり;
Z3およびZ5は、それぞれ独立してC1−C12アルキレンであり;
Z4は、−O−C(=O)、−O−C(=S)、−NH−C(=O)、−NH−C(=S)、−O−、または−S−であり;
Z6は、C1−C2アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)で表される金属−有機残基複合体を含む、糖鎖または糖鎖含有物質の質量分析用キット。 - 以下の式:
M2−(S−Y−(OCH2CH2)n−NH−C(=O)−CH2−O−NH2)m
(式中、M2は金属であり;
mは、M2に対する硫黄原子を含む有機残基の化学量論比を表し、1以上の整数であり;
Yは、C1〜C12アルキレンであり;
nは1〜10の整数である)で表される金属−有機残基複合体を含む、請求項5記載の糖鎖または糖鎖含有物質の質量分析用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010125259A JP5021055B2 (ja) | 2004-03-31 | 2010-05-31 | 金属微粒子を用いた質量分析方法 |
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004108285 | 2004-03-31 | ||
JP2004108285 | 2004-03-31 | ||
JP2004174847 | 2004-06-11 | ||
JP2004174847 | 2004-06-11 | ||
JP2005020442 | 2005-01-27 | ||
JP2005020442 | 2005-01-27 | ||
JP2010125259A JP5021055B2 (ja) | 2004-03-31 | 2010-05-31 | 金属微粒子を用いた質量分析方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006511686A Division JP4557973B2 (ja) | 2004-03-31 | 2005-03-29 | 金属微粒子を用いた質量分析方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010185886A JP2010185886A (ja) | 2010-08-26 |
JP5021055B2 true JP5021055B2 (ja) | 2012-09-05 |
Family
ID=35063896
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006511686A Expired - Fee Related JP4557973B2 (ja) | 2004-03-31 | 2005-03-29 | 金属微粒子を用いた質量分析方法 |
JP2010125259A Expired - Fee Related JP5021055B2 (ja) | 2004-03-31 | 2010-05-31 | 金属微粒子を用いた質量分析方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006511686A Expired - Fee Related JP4557973B2 (ja) | 2004-03-31 | 2005-03-29 | 金属微粒子を用いた質量分析方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090206245A1 (ja) |
EP (1) | EP1731905A4 (ja) |
JP (2) | JP4557973B2 (ja) |
WO (1) | WO2005095941A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7771943B2 (en) * | 2007-06-04 | 2010-08-10 | The University Of Wollongong | Method for the determination of the position of unsaturation in a compound |
JP2009242372A (ja) * | 2008-03-11 | 2009-10-22 | Yokohama City Univ | 均一な糖鎖構造を有するエリスロポエチン誘導体 |
US8110797B2 (en) * | 2009-02-06 | 2012-02-07 | Florida State University Research Foundation, Inc. | Electrospray ionization mass spectrometry methodology |
US20120184052A1 (en) * | 2009-09-28 | 2012-07-19 | World Precision Instruments Inc. | Isolation and Analysis of Thiol Protein Matter Using Gold Nano-Particles |
CN101967517B (zh) * | 2010-03-19 | 2012-11-07 | 黄乐群 | 一种无需借助pcr的基因检测方法 |
JP5637049B2 (ja) * | 2011-03-31 | 2014-12-10 | 住友ベークライト株式会社 | 糖鎖測定方法および糖鎖固定化基材 |
JP5895694B2 (ja) * | 2012-05-11 | 2016-03-30 | 株式会社島津製作所 | マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析用マトリックス |
CN102721779A (zh) * | 2012-06-19 | 2012-10-10 | 浙江农林大学 | 植物硒形态的检测方法 |
JP6156098B2 (ja) * | 2013-11-27 | 2017-07-05 | 株式会社島津製作所 | イオントラップ質量分析装置 |
US9383352B2 (en) * | 2014-03-26 | 2016-07-05 | Diabetomics, Inc. | Salivary protein glycosylation test for diagnosis and monitoring of diabetes |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4511658A (en) * | 1983-02-28 | 1985-04-16 | Kansas State University Research Foundation | Colorimetric detector for formaldehyde vapor |
JPH07325083A (ja) * | 1994-05-31 | 1995-12-12 | Nakarai Tesuku Kk | 糖タンパク質の特定糖鎖割合の測定方法 |
US6506564B1 (en) * | 1996-07-29 | 2003-01-14 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
NZ516848A (en) * | 1997-06-20 | 2004-03-26 | Ciphergen Biosystems Inc | Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine |
WO2001051665A2 (en) * | 2000-01-13 | 2001-07-19 | Nanosphere Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US7186814B2 (en) * | 2001-11-09 | 2007-03-06 | Nanosphere, Inc. | Bioconjugate-nanoparticle probes |
JP2003194820A (ja) * | 2001-12-26 | 2003-07-09 | Fuji Photo Film Co Ltd | バイオセンサー用表面 |
US7413770B2 (en) * | 2002-08-01 | 2008-08-19 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Ethylene glycol monolayer protected nanoparticles |
-
2005
- 2005-03-29 WO PCT/JP2005/005940 patent/WO2005095941A1/ja active Application Filing
- 2005-03-29 US US10/594,848 patent/US20090206245A1/en not_active Abandoned
- 2005-03-29 EP EP05727895A patent/EP1731905A4/en not_active Withdrawn
- 2005-03-29 JP JP2006511686A patent/JP4557973B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-05-31 JP JP2010125259A patent/JP5021055B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1731905A4 (en) | 2012-08-22 |
JPWO2005095941A1 (ja) | 2008-02-21 |
JP2010185886A (ja) | 2010-08-26 |
WO2005095941A1 (ja) | 2005-10-13 |
JP4557973B2 (ja) | 2010-10-06 |
EP1731905A1 (en) | 2006-12-13 |
US20090206245A1 (en) | 2009-08-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5021055B2 (ja) | 金属微粒子を用いた質量分析方法 | |
JP6475673B2 (ja) | Ptfe様のアルミニウム・コート・ガラススライド上のグリカンアレイおよび関連する方法 | |
JP5147815B2 (ja) | 糖鎖捕捉分子を用いた糖鎖精製濃縮法および糖鎖構造解析法 | |
US10266502B2 (en) | Process for the cycloaddition of a halogenated 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne | |
WO2008153615A2 (en) | Preparing carbohydrate microarrays and conjugated nanoparticles | |
Liang et al. | MALDI MS in-source decay of glycans using a glutathione-capped iron oxide nanoparticle matrix | |
AU780370B2 (en) | Novel fucosylated oligosaccharides and process for their preparation | |
Nagahori et al. | Direct and efficient monitoring of glycosyltransferase reactions on gold colloidal nanoparticles by using mass spectrometry | |
de Paz et al. | Synthesis of a Ley neoglycoconjugate and Ley-functionalized gold glyconanoparticles | |
Wilson et al. | Ultraviolet photodissociation at 355 nm of fluorescently labeled oligosaccharides | |
Yang et al. | Chemoselective ligation reaction of N-acetylglucosamine (NAG) with hydrazide functional probes to determine galactosyltransferase activity by MALDI mass spectrometry | |
JP4566604B2 (ja) | 糖鎖標識試薬 | |
Wang et al. | The ammonia-catalyzed release of glycoprotein N-glycans | |
US20080138908A1 (en) | Mass Spectrometry | |
Ghirardello et al. | Recent applications of ionic liquid-based tags in glycoscience | |
JP4942014B2 (ja) | O−結合型糖アミノ酸 | |
US8053246B2 (en) | Method of esterifying bio-related molecule for mass spectrometry and method of mass spectrometry of obtained esterified derivative | |
de Souza et al. | Synthesis of gold glyconanoparticles: Possible probes for the exploration of carbohydrate‐mediated self‐recognition of marine sponge cells | |
JP5999568B2 (ja) | アンモニウム塩による還元性糖鎖遊離方法 | |
Kapkova | Mass spectrometric analysis of carbohydrates labeled with a biotinylated tag | |
Kwase et al. | Protecting‐Group‐Free Glycoconjugate Synthesis: Hydrazide and Oxyamine Derivatives in N‐Glycoside Formation | |
KR100804713B1 (ko) | 당류의 직접적인 표면 고정화 방법 | |
US20110275108A1 (en) | Method for releasing reducing glycan by ammonium salt | |
Pabst | Porous graphitized carbon chromatography coupled to mass spectrometry for the analysis of protein linked glycans with focus on isomeric structures |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100531 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120120 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120319 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120607 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120613 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150622 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |