JP6156098B2 - イオントラップ質量分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、イオンを一時的に保持するとともに保持したイオンを開裂させるイオントラップを備えたイオントラップ質量分析装置に関し、さらに詳しくは、タンパク質・ペプチドなどの生体由来の化合物の同定や構造解析に好適なイオントラップ質量分析装置に関する。

糖鎖やペプチドなどの生体由来の高分子化合物の同定や構造解析においては、３次元四重極型イオントラップを搭載した質量分析装置が広く用いられている。イオントラップに一時的に保持した各種イオンを質量分析する手法としては、イオントラップ自体の質量分離機能を利用する場合と、イオントラップからイオンを放出し、イオントラップの外側に配置した飛行時間型質量分離器（ＴＯＦＭＳ）によりイオンを質量分離して検出する場合とがあるが、以下の説明では、それらを包含してイオントラップ質量分析装置ということとする。

イオントラップ質量分析装置を用いた一般的な高分子化合物の分析手法は次の通りである。

分析対象である化合物をマトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）イオン源などによりイオン化して得られた各種イオンをイオントラップ内に捕捉したあと、特定の質量電荷比m/zを有するイオンをプリカーサイオンとして選択的にイオントラップ内に残し、他の不要なイオンをイオントラップ外部に排出するようなイオン選別操作を行う。その後、イオントラップ内に衝突誘起解離（ＣＩＤ＝Collision-Induced Dissociation）ガスを導入し、プリカーサイオンを励振させてＣＩＤガスに衝突させることで、該イオンを開裂させる。１回の開裂操作だけで目的とする構造体が十分に解離しない場合には、プリカーサイオンの選別操作と開裂操作とを複数回繰り返すこともある。そうして分析対象である化合物由来のイオンに対し１回以上の開裂操作を行うことで細かく断片化させたプロダクトイオンについて、質量走査を伴うイオンの検出を実行してＭＳⁿスペクトルを取得し、このＭＳⁿスペクトルを解析して分析対象化合物の構造を推定する。

このように、イオントラップにおいてＣＩＤによる開裂操作を行う際には、通常、それに先立って、特定の１種（場合によっては複数種）のプリカーサイオンをイオントラップ内に残すイオン選別操作が実施される。ただし、このイオン選別操作は必須の操作ではなく、イオン選別操作を行うことなく開裂操作を実施することも可能である。

例えば特許文献１に記載の質量分析装置では、ＭＳ²スペクトル上でプリカーサイオンからのリン酸基やアルカリ金属イオンの優先的な脱離により生成されたプロダクトイオン（該文献における「ドミナントイオン」）が検出された場合に、このドミナントイオンについてイオン選別操作を行うことなく開裂操作を行うような制御が行われている。なお、ここでいう「優先的な脱離」とは、活性化エネルギが小さいために切断され易い結合部位が切れることで生じる断片の脱離であるから、脱離する断片は殆ど既知である。

また特許文献２に記載の質量分析装置では、リン酸やシアル酸のような遊離性の高い分子による修飾を受けた精製タンパク質について、プリカーサイオンを選択するイオン選別操作を行うことなく開裂操作を行うことにより修飾分子の脱離を促進させ、量が増大した修飾を受けていないペプチドイオンをプリカーサイオンとしてＭＳ²分析を実施している。

ところで、イオントラップには安定的に捕捉可能であるイオンの最低質量電荷比（低質量カットオフ、ＬＭＣ＝Low Mass Cut-off）が存在するため、イオントラップ質量分析装置では、ＬＭＣよりも小さな質量電荷比を持ったイオンを測定することができない。イオントラップを構成する電極に印加する電圧を調整することで低質量カットオフを下げることは可能であるが、低質量カットオフを下げると、低質量カットオフよりも大きな質量電荷比範囲におけるイオン捕捉のためのポテンシャル井戸が浅くなってイオンの捕捉効率が下がってしまう。ＭＳⁿ分析におけるイオン選別操作及び開裂操作の際には、プリカーサイオンに対する捕捉効率をできるだけ上げる必要があり、そうすると低質量カットオフを或る程度高くせざるをえない。一般的に、低質量カットオフの値はプリカーサイオンの質量電荷比の２０〜３０％程度である。即ち、プリカーサイオンの質量電荷比m/zが１０００であれば、低質量カットオフの値は２００〜３００程度である。

生体由来の化合物の中には分子量が非常に大きなものがあり、例えば生体内で前駆体タンパク質より産生される生理活性ペプチド（内因性ペプチド）には分子量が５０００Da以上であるものも少なくない。このように大きなペプチドをイオントラップ質量分析装置で分析しようとする場合、ＭＳ²測定時のイオントラップにおける低質量カットオフがm/z１０００（アミノ酸残基数で１０個程度に相当）以上とかなり大きくなり、捕捉可能なプロダクトイオンが質量電荷比が高いもののみに片寄ってしまう。つまり、質量電荷比が小さなプロダクトイオンに関する情報は得られなくなり、構造解析などに支障をきたすことになる。

一方、上述した例とは逆に、質量電荷比m/zが１０００程度と比較的小さなペプチドを対象とした同定処理では、ペプチドを構成するアミノ酸の数が少ないために、通常のプロテオミクス解析に使われるタンパク質データベース検索ではアミノ酸配列候補を一意に絞り込むことが難しい場合がしばしばある。こうした場合に、高エネルギＣＩＤを用いたＴＯＦ／ＴＯＦ型質量分析装置による分析では、低質量電荷比範囲に現れるアミノ酸の側鎖を含むインモニウムイオンやペプチドの末端イオンを検出することによってペプチド候補を絞り込むことも可能である。しかしながら、イオントラップ質量分析装置では、低質量カットオフが２００程度と比較的大きいことから、構造解析に有用なインモニウムイオンやペプチドの末端イオンを捕捉することができず、ペプチド候補の絞り込みのための情報が不足することになる。

上記のような２つのケースにおいて、イオントラップ質量分析装置を用いて目的ペプチドの同定や構造解析を行うためには、ｎが３以上である多段のＭＳⁿ分析を行うことで、より小さな質量電荷比を有するプロダクトイオンの情報を収集する必要がある。しかしながら、そうした多段のＭＳⁿ分析を行う場合には、異なる部分構造を持つと推定される複数のプロダクトイオンをそれぞれ次のプリカーサイオンとした質量分析を行う必要があり、分析に多大な時間を要する。また、イオン選別操作では、プリカーサイオン以外の不要なイオンのみを除去することは難しくプリカーサイオンの一部も意図せずに除去されてしまうため、イオン選別操作を経るとプリカーサイオン量も減少する。そのため、多段のＭＳⁿ分析において十分な分析感度を確保するには、データの積算回数を増やすために繰り返し測定回数を多くする必要がある。これも、分析時間の増加につながるし、またサンプル消費量の増大を招くこととなる。

米国特許第７５８６０８９号明細書 特開２０１１−１４５０８９号公報

本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その主な目的は、生理活性ペプチドのような分子量が大きな化合物について、或いは、逆に分子量が小さなペプチドなどの化合物について、ＭＳⁿ分析における分析時間の短縮とサンプル消費量の節約を図りつつ、同定や構造解析のために有用な情報を収集することができるイオントラップ質量分析装置を提供することである。

上記課題を解決するためになされた本発明に係るイオントラップ質量分析装置の第一の態様は、分析対象のタンパク質又はペプチドである化合物由来のイオンを捕捉するとともに捕捉したイオンを開裂させるイオントラップを具備し、開裂により生成されたプロダクトイオンを該イオントラップ自体で又は該イオントラップの外側に設けた質量分離器により質量分離して検出するイオントラップ質量分析装置において、
a)前記イオントラップに捕捉したイオンに対し特定のイオンを選択的に残すイオン選別操作を行うことなく所定のプリカーサイオンについての開裂操作を実施するイオン非選択開裂制御部と、
b)前記イオントラップに捕捉したイオンに対しイオン選別操作に引き続き所定のプリカーサイオンについての開裂操作を実施するイオン選択開裂制御部と、
c)前記イオン選択開裂制御部の制御の下でＭＳⁿ分析（ただしｎは２以上の整数）を実行することで得られたＭＳⁿスペクトルにおいて、タンパク質又は糖タンパク質に特徴的であるピーク群を検出する特徴ピーク群検出部と、
d)前記特徴ピーク群検出部によりピーク群が検出された場合に、前記ＭＳⁿ分析と同じイオン選別操作及び開裂操作に引き続き、前記イオン非選択開裂制御部の制御の下で前記ピーク群をプリカーサイオンとした開裂操作を実行してマススペクトルを取得するように前記イオン選択開裂制御部及び前記イオン非選択開裂制御部を制御する分析制御部と、
を備えることを特徴としている。

ここで、分析対象のタンパク質やペプチドは、糖ペプチドなど各種修飾を受けたタンパク質やペプチドを含む。
また、イオントラップにおける開裂操作は典型的には、イオントラップ内に導入されたガスと励振されたイオンとの衝突による衝突誘起解離（低エネルギ衝突誘起解離）である。

以下の説明では、イオン非選択開裂制御部の制御の下で実施される、イオントラップに捕捉したイオンに対し特定のイオンを選択的に残すイオン選別操作を行うことなく所定のプリカーサイオンについて行われる開裂操作をプリ開裂操作といい、「ＭＳⁿ分析と同じイオン選別操作及び開裂操作に引き続き、前記イオン非選択開裂制御部の制御の下で、前記ピーク群をプリカーサイオンとした開裂操作を実行して」取得されたマススペクトルをＭＳ^n+preCIDスペクトルということとする。なお、ここでは「preCID」という記号を用いているが、開裂操作はＣＩＤに限らない。

本発明に係るイオントラップ質量分析装置の第一の態様において、ＭＳⁿスペクトル、例えばＭＳ²スペクトルに、上記例示したような複数のピークを含む特徴的なピーク群が存在した場合、それらピークはタンパク質や糖タンパク質（或いはペプチドや糖ペプチド）の基本的な構造部分を含むイオンピークである可能性が高い。そこで、特徴ピーク群検出部により、実測のＭＳⁿスペクトルにおいてこうした特徴的なピーク群が検出されると、分析制御部は、その特徴的なピーク群をプリカーサイオンとしたプリ開裂操作を実行するようにイオン選択開裂制御部及びイオン非選択開裂制御部を制御する。それによって、上記特徴的なピーク群に含まれるピークに対応したイオンが開裂してプロダクトイオンが生成されるから、このプロダクトイオンを質量分析することでＭＳ^n+preCIDスペクトルを取得する。

上記特徴的なピーク群に含まれるピークをプリカーサイオンとした開裂操作を実行する前に該プリカーサイオンを選択するイオン選別操作を行ってしまうと、不要なイオンが除去される反面、そのプリカーサイオン自体の量も減少する。これに対し、プリ開裂操作の場合、それに先立つイオン選別操作は実行されないのでプリカーサイオンの量は減らず、開裂操作によって生成されるプロダクトイオンの量も多くなる。もちろん、開裂操作を実行する際には低質量カットオフを下げて捕捉可能な質量電荷比範囲の下限を広げる必要があり、それによってプリカーサイオンの捕捉効率が下がる可能性はあるものの、それによるイオンの減少の程度はイオン選別操作を実行することによる減少に比べれば少なくて済む。それ故に、通常のＭＳⁿ⁺¹分析を行う場合に比べて開裂によって生成されるプロダクトイオンの量は多くなり、プロダクトイオンの信号強度は高くなる。また、低質量カットオフを下げることで低い方向に拡大される質量電荷比範囲に観測されるプロダクトイオンの信号強度も高くなる。

なお、ＭＳ^n+preCIDスペクトルは、例えば単独で又は他のマススペクトルと併せてタンパク質データベースを利用したデータベース検索に供され、タンパク質やペプチドの同定や構造解析が実施される。或いは、上記ＭＳ^n+preCIDスペクトルは、ＭＳⁿ⁺¹分析のための特定のピーク又はピーク群を抽出するために利用される。

本発明に係るイオントラップ質量分析装置の第一の態様において、上記タンパク質又は糖タンパク質に特徴的であるピーク群は例えば、ペプチドからのアミノ酸残基中の特定結合部位の開裂により生じたピーク群であり、アミノ酸残基２個以上のアミノ酸配列がスペクトル上のピーク間隔から推定可能である複数のピークを含むものとすることができる。

また本発明に係るイオントラップ質量分析装置の第一の態様において、上記タンパク質又は糖タンパク質に特徴的であるピーク群は例えば、糖鎖のニュートラルロスにより生じたピーク群であり、２個以上の糖鎖又はその環開裂断片がスペクトル上のピーク間隔から推定可能である複数のピークを含むものとすることができる。

また本発明に係るイオントラップ質量分析装置の第一の態様において、上記タンパク質又は糖タンパク質に特徴的であるピーク群は例えば、糖鎖のニュートラルロスにより生じたピーク群であり、Ｎ型糖ペプチドに特徴的なトリプレットピークであるものとすることができる。即ち、この場合のトリプレットピークとは、低質量電荷比側から、糖が全て脱離したペプチドイオン、糖ＨｅｘＮＡｃの環開裂により生じた０，２Ｘ（８３Da）付加ペプチドイオン、及びＨｅｘＮＡｃ（２０３Da）付加ペプチドイオンにそれぞれ対応する３本のピークである。

さらにまた本発明に係るイオントラップ質量分析装置の第一の態様において、上記タンパク質又は糖タンパク質に特徴的であるピーク群は例えば、ジスルフィド結合により結合した複数のペプチドに特徴的である３２Da又は３４Da間隔で並ぶトリプレットピークであるものとすることができる。

また、上記タンパク質又は糖タンパク質に特徴的であるピーク群が、糖鎖のニュートラルロスにより生じたピーク群で、２個以上の糖鎖又はその環開裂断片がスペクトル上のピーク間隔から推定可能である複数のピークを含む場合、前記分析制御部は、前記ＭＳⁿ分析と同じイオン選別操作及び開裂操作に引き続き、前記イオン非選択開裂制御部の制御の下で前記ピーク群をプリカーサイオンとした開裂操作を実行して取得したマススペクトル、つまりＭＳ^n+preCIDスペクトルに対しＮ型糖ペプチドに特徴的なトリプレットピークを検出し、該特徴的なトリプレットピークが検出された場合には該トリプレットピークをプリカーサイオンとしたＭＳⁿ⁺¹分析を実行するように前記イオン選択開裂制御部及び前記イオン非選択開裂制御部を制御する構成とすることができる。

この構成によれば、ＭＳⁿ⁺¹分析を実行しながら、開裂操作の回数は１回多い、実質的にはＭＳⁿ⁺²分析を行ったのと同等のマススペクトルを得ることができる。これにより、Ｎ型糖ペプチドに特徴的なトリプレットピークに対応するイオンが開裂することで生成された各種プロダクトイオンを高い感度で検出することができ、ペプチドの同定や構造解析を高い精度で行うことができる。

また、上記課題を解決するためになされた本発明に係るイオントラップ質量分析装置の第二の態様は、分析対象のタンパク質又はペプチドである化合物由来のイオンを捕捉するとともに捕捉したイオンを開裂させるイオントラップを具備し、開裂により生成されたプロダクトイオンを該イオントラップ自体で又は該イオントラップの外側に設けた質量分離器により質量分離して検出するイオントラップ質量分析装置において、
a)前記イオントラップに捕捉したイオンに対し特定のイオンを選択的に残すイオン選別操作を行うことなく所定のプリカーサイオンについての開裂操作を実施するイオン非選択開裂制御部と、
b)前記イオントラップに捕捉したイオンに対しイオン選別操作に引き続き所定のプリカーサイオンについての開裂操作を実施するイオン選択開裂制御部と、
c)ＭＳⁿ⁺¹分析を実施したと仮定したときに、ペプチドのＮ／Ｃ末端配列又はインモニウムイオンを用いたアミノ酸配列組成推定が可能であるプロダクトイオンが、低質量カットオフ以上の質量電荷比範囲に現れる、と推定されるようなプリカーサイオンが、前記イオン選択開裂制御部の制御の下でＭＳⁿ分析（ただしｎは２以上の整数）を実行することで得られたＭＳⁿスペクトルにプロダクトイオンとして検出されるか否か判定する特徴イオン検出部と、
d)前記特徴イオン検出部によりプロダクトイオンが検出された場合に、前記ＭＳⁿ分析と同じイオン選別操作及び開裂操作に引き続き、前記イオン非選択開裂制御部の制御の下で前記プロダクトイオンをプリカーサイオンとした開裂操作を実行してマススペクトルを取得するように前記イオン選択開裂制御部及び前記イオン非選択開裂制御部を制御する分析制御部と、
を備えることを特徴としている。

低質量カットオフのおおよその値はプリカーサイオンの質量電荷比から推定可能であるから、例えばＭＳ²スペクトルにおいて観測されるプロダクトイオンのうち、どの質量電荷比を持つイオンピークに対してプリ開裂操作を行えば、低質量カットオフ以上の質量電荷比範囲に、ペプチドのＮ／Ｃ末端配列又はインモニウムイオンを用いたアミノ酸配列組成推定が可能なプロダクトイオンが現れるかを推定することが可能である。そこで、本発明に係るイオントラップ質量分析装置の第二の態様において、特徴イオン検出部は、そうしたイオンが、実際に得られたＭＳⁿスペクトルにプロダクトイオンとして検出されるか否か判定する。そして、そうしたイオンが存在する場合に、分析制御部は該イオンをプリカーサイオンとするプリ開裂操作を伴うＭＳ^n+PreCID分析を実施する。

これにより、ペプチドのＮ／Ｃ末端配列又はインモニウムイオンを用いたアミノ酸配列組成推定に有用であって、しかも、ＭＳ^n+PreCID分析によって確実に観測されるプロダクトイオンが生成されるようなプリカーサイオンに対してプリ開裂操作を実行することができる。したがって、換言すれば、アミノ酸配列推定ができないような無駄なプリカーサイオンに対するプリ開裂操作を実施することを回避することができる。

本発明に係るイオントラップ質量分析装置の第一及び第二の態様によれば、ＭＳⁿ分析においてプリカーサイオンのイオン選別回数を減らしながら実質的にイオン選別回数を減らさない状態と同等のマススペクトルを得ることができる。そのため、従来手法と同等の感度やＳＮ比などを得るために必要な分析回数が少なくて済み、分析時間の短縮とサンプル消費量の低減を達成することができる。また、従来手法と同程度の分析時間を確保する場合には、マススペクトルの感度やＳＮ比が向上するので、例えば従来であれば観測できなかった低質量電荷比のプロダクトイオンの情報が得られるようになり、ペプチドや糖ペプチドの同定や構造解析の精度向上が図れる。

本発明の一実施例であるイオントラップ質量分析装置の概略構成図。 本実施例のイオントラップ質量分析装置における特徴的な分析動作を示すフローチャート。 第１実測例におけるＭＳ²スペクトル及びＭＳ^2+PreCIDスペクトルを示す図。 第２実測例におけるＭＳ²スペクトル及びＭＳ^2+PreCIDスペクトルを示す図。

本発明の一実施例であるイオントラップ質量分析装置と該装置により実施される特徴的な質量分析方法について、添付図面を参照して説明する。

図１は本実施例のイオントラップ質量分析装置の全体構成図である。このイオントラップ質量分析装置は、目的試料をイオン化するイオン源１と、イオンを保持するとともに質量電荷比に応じて分離する３次元四重極型のイオントラップ２と、イオンを検出する検出部３と、を備える。

イオン源１は例えばＭＡＬＤＩ法を用いたＭＡＬＤＩイオン源であり、図示しないが、パルス状のレーザ光を出射するレーザ照射部、目的化合物を含むサンプルが付着されたサンプルプレート、レーザ光の照射によってサンプルから放出されたイオンを引き出すとともにその引き出し方向を限定するアパーチャ、引き出されたイオンを案内するイオンレンズなどを含む。もちろん、イオン源１はＭＡＬＤＩイオン源に限るものではなく、例えばエレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）法などによる大気圧イオン源を用いることもできる。

イオントラップ２は、円環状の１個のリング電極２１と、これを挟むように対向して配置された、入口側エンドキャップ電極２２及び出口側エンドキャップ電極２４と、からなり、これら３個の電極２１、２２、２４で囲まれた空間がイオン捕捉領域となる。入口側エンドキャップ電極２２の略中央にはイオン入射口２３が穿設され、イオン源１から出射したイオンはイオン入射口２３を経てイオントラップ２内に導入される。一方、出口側エンドキャップ電極２４の略中央にはイオン出射口２５が穿設され、イオン出射口２５を経てイオントラップ２内から排出されたイオンは検出部３に到達して検出される。また、イオントラップ２の内部には、ガス供給部４から適宜のガスが導入されるようになっている。

検出部３は、例えばイオンを電子に変換するコンバージョンダイノードと、コンバージョンダイノードから到来する電子を増倍して検出する二次電子増倍管とからなり、入射したイオンの量に応じた検出信号をデータ処理部５に送る。データ処理部５は、イオントラップ２において質量分離されつつ順次排出されるイオンに対して検出部３で得られる検出信号に基づいてマススペクトル（１以上であるｎに対するＭＳⁿスペクトル）を作成するマススペクトル作成部５１、マススペクトル上で所定の基準に従ってプリカーサイオンを抽出するプリカーサイオン選択部５２、マススペクトル上で予め設定された特徴的な複数のピークからなるピーク群を検出する特徴ピーク検出部５３、マススペクトルから抽出されたピーク情報に基づいてデータベース検索などによりペプチドを同定するペプチド同定部５４、などの機能ブロックを含む。

主電源部７は分析制御部６による制御の下に、イオントラップ２のリング電極２１にイオン捕捉用の高周波電圧を印加する。また、補助電源部８は同じく分析制御部６による制御の下に、イオントラップ２に捕捉されているイオンをＣＩＤ（低エネルギＣＩＤ）する際に該当イオンを共鳴励振させたり、或いは、イオントラップ２からイオンを排出したりするために、エンドキャップ電極２２、２４にそれぞれ小振幅の高周波電圧を印加する。

分析制御部６は、通常ＣＩＤ実行制御部６１、プリＣＩＤ実行制御部６２などの機能ブロックを含み、分析を実行するために、主電源部７、補助電源部８のほか、イオン源１、ガス供給部４、データ処理部５などの各部を制御する。
なお、分析制御部６及びデータ処理部５の一部はパーソナルコンピュータに予めインストールされた専用の処理・制御ソフトウエアを該コンピュータで実行することにより、後述する各機能を実施する構成とすることができる。

分析対象の試料は例えば糖タンパク質を含むタンパク質由来のペプチド混合物であり、本実施例のイオントラップ質量分析装置は該試料を分析して収集されたデータを処理することで、試料に含まれるペプチドや糖鎖を同定したりその化学構造を推定したりする。図２はこの際に実施される特徴的な分析動作を示すフローチャートである。図２に従って、本実施例のイオントラップ質量分析装置における特徴的な分析動作を説明する。

分析が開始されると、まず、分析制御部６の制御の下で、目的試料に対しＣＩＤを実施しない通常の質量分析が実施され、データ処理部５のマススペクトル作成部５１ではＭＳ¹スペクトルが作成される（ステップＳ１）。より詳しく説明すると、分析制御部６の制御の下に、イオン源１において目的試料にレーザ光が照射され、該試料中の目的化合物がイオン化される。生成されたイオンはイオン入射口２３を通してイオントラップ２内に導入され、主電源部７からリング電極２１に印加される電圧によって形成される高周波電場の作用でイオンはイオントラップ２内に捕捉される。なお、このとき、ガス供給部４から供給されるクーリングガスの作用により、イオンはイオントラップ２の捕捉領域の中心近傍に収束される。

そのあと、捕捉されているイオンは、補助電源部８からエンドキャップ電極２２、２４に印加される高周波電圧によって質量電荷比の順に励振され、イオン出射口２５を経て排出される。検出部３は排出されたイオンを順次検出し、イオン量に応じた検出信号を生成してデータ処理部５へと送る。マススペクトル作成部５１は受け取った検出信号に基づき、所定の質量電荷比範囲のＭＳ¹スペクトルを作成する。このＭＳ¹スペクトルデータは図示しないデータ格納部に格納される。

プリカーサイオン選択部５２はまずｎの値を初期値である２に設定し（ステップＳ２）、ＭＳ^n-1スペクトルを解析し所定の基準に照らしてＭＳⁿ分析のためのプリカーサイオンを検出する（ステップＳ３）。即ち、ステップＳ２の直後にステップＳ３が実施される場合には、最初に得られたＭＳ¹スペクトルに現れたピークの中で、例えば信号強度が所定閾値以上であるピークに対応するイオンをＭＳ²分析のためのプリカーサイオンとして検出する。最初のプリカーサイオン選択のための所定の基準はこれに限らず適宜に定めることができる。また、選択されるプリカーサイオンの数も適宜に定めることができる。そのあと、ＭＳⁿ分析のためのプリカーサイオンが少なくとも一つ検出できたか否かを判定し（ステップＳ４）、検出できなければそのまま処理を終了する。

一方、ＭＳⁿ分析のためのプリカーサイオンが一つ以上検出されれば、プリカーサイオン選択部５２は該プリカーサイオン情報を分析制御部６の通常ＣＩＤ実行制御部６１に送る。すると、通常ＣＩＤ実行制御部６１は検出されたプリカーサイオンのうちの一つを次のＭＳⁿ分析のプリカーサイオンとして設定し（ステップＳ５）、通常の、つまり設定されたプリカーサイオンを選択的にイオントラップ２に残すイオン選別操作を伴うＣＩＤ操作を実施することで、目的試料に対するＭＳⁿ測定を実行する。ｎが２である条件の下ではＭＳ²測定が実施され、それにより得られたデータに基づいてマススペクトル作成部５１はＭＳⁿスペクトルを作成する（ステップＳ６）。このときに作成されるＭＳⁿスペクトルは、ステップＳ５で設定された特定のプリカーサイオンをＣＩＤにより開裂させて生成されるプロダクトイオンの信号強度を示すスペクトルである。

こうして得られたＭＳⁿスペクトルについて、特徴ピーク検出部５３は予め定められた特徴的なピーク又はピーク群が存在するか否かを調べる。具体的には、以下の（１）〜（５）のいずれか一つ又は複数の特徴的なピーク又はピーク群の存在を調べる。
（１）ペプチドからのアミノ酸残基中の特定結合部位の開裂により生じたピーク群であり、アミノ酸２個以上の配列がＭＳⁿスペクトル上のピーク間隔から推定可能である複数のピークを含むピーク群。
（２）糖鎖のニュートラルロスにより生じたピーク群であり、２個以上の糖鎖又はその環開裂断片がＭＳⁿスペクトル上のピーク間隔から推定可能である複数のピークを含むピーク群。
（３）Ｎ型糖ペプチドに特徴的なトリプレットピーク（３本のピークからなるピーク群）。
（４）タンパク質に含まれる硫黄を用いたジスルフィド結合（Disulfide bond）により結合した複数のペプチドに特徴的である３２Da又は３４Da間隔で並ぶトリプレットピーク。
（５）着目しているピークをプリカーサイオンとしたＭＳⁿ⁺¹分析を実施したと仮定したときに、ペプチドのＮ／Ｃ末端配列又はインモニウムイオンを用いたアミノ酸配列組成推定が可能であるプロダクトイオンがそのときの低質量カットオフ以上の質量電荷比範囲に現れる、と推定されるようなプリカーサイオンに対応するピーク。

上記（１）〜（４）のピーク群はペプチド又は糖ペプチドの主要な構造を有するイオンに対応するピークである可能性が高い。一方、上記（５）のピークはペプチド又は糖ペプチドの主要な構造を有するイオンに対応するピークである可能性が高く、しかもそれを開裂させたときに生成されるプロダクトイオンは検出可能である可能性が高い。したがって、こうしたピークは次の段（ｎの数を１つ増加したときの）のＭＳⁿ分析のプリカーサイオンとして有用であると考えられるものの、イオン選別操作を行うとプリカーサイオンの量自体が減ってプロダクトイオンが検出できなくなる（厳密に言えば、検出できないほど量が少なくなる）おそれがある。そこで、ここでは、上記のように抽出された特徴的なピーク群又はピークに対しＣＩＤ操作に先立つイオン選別を実施しないプリＣＩＤを実行するプリＣＩＤ候補とする（ステップＳ７）。

そして、分析制御部６においてプリＣＩＤ候補があるか否かが判定され（ステップＳ８）、プリＣＩＤ候補があると判定されると、目的試料に対し、ステップＳ５、Ｓ６で実施したプリカーサイオンについてのイオン選別及びＣＩＤ操作が行われたあとに、プリＣＩＤ実行制御部６２による制御の下で、プリＣＩＤ候補である１又は複数のイオンに対するプリＣＩＤ操作が実行され、それによって生成されたプロダクトイオンが検出される。それにより得られたデータに基づいてマススペクトル作成部５１はＭＳ^n+PreCIDスペクトルを作成する（ステップＳ９）。ｎが２である場合には、ステップＳ９においてＭＳ^2+PreCIDスペクトルが作成される。

プリＣＩＤ操作はＣＩＤ操作に先立つイオン選別操作が省略される以外は、通常のＣＩＤ操作と同じである。即ち、プリＣＩＤ実行制御部６２による制御の下に補助電源部８はエンドキャップ電極２２、２４に所定の高周波電圧を印加し、プリＣＩＤ候補とされた１又は複数のイオンをプリカーサイオンとして選択的に共鳴励振させ、ＣＩＤガスに衝突させる。これにより、該イオンは開裂してプロダクトイオンが生成される。このとき、プリカーサイオン以外のイオンは共鳴励振されないので開裂を生じないので、プリＣＩＤ操作後には、プリＣＩＤ操作により生じたプロダクトイオンとそれ以前から捕捉されていたプリＣＩＤ候補以外のイオンとが共に捕捉されることになる。

作成されるＭＳ^2+PreCIDスペクトルは、ＭＳ²スペクトル上で観測された特定のピークに相当するイオンがＣＩＤにより開裂されて生成されたプロダクトイオンの信号強度を示すスペクトルである。したがって、２回目のＣＩＤ操作の前にイオン選別がなされていないので「ＭＳ^2+PreCIDスペクトル」となっているが、ＣＩＤ操作回数、つまりは開裂により生じたプロダクトイオンの世代からいえば実質的にはＭＳ³スペクトルである。一方、イオン選別は１回目のＣＩＤ操作の前にしか行われていないので、ＭＳ^2+PreCIDスペクトル上で観測されるプロダクトイオンの量はＭＳ²スペクトルに近い。このため、ＭＳ^2+PreCIDスペクトルには、ペプチド又は糖ペプチドの主要な構造の推定に有用なプロダクトイオンが高い感度で観測される。
なお、ステップＳ８においてプリＣＩＤ候補がないと判定された場合には、プリＣＩＤ操作する対象が存在しないので、ステップＳ９をスキップしてステップＳ１０へ進む。

ステップＳ９においてＭＳ^2+PreCIDスペクトルが得られたならば、或いはプリＣＩＤ候補が見つからなかった場合には、ステップＳ３で検出された全てのプリカーサイオンについてステップＳ５〜Ｓ９の測定及び処理がなされたか否かが判定され（ステップＳ１０）、未だ測定及び処理がされていないプリカーサイオンがある場合にはステップＳ５へと戻る。これにより、ステップＳ３で検出された全てのプリカーサイオンについてＭＳ²測定が実施され、ＭＳ²スペクトル上に特徴的なピーク群があればＭＳ^2+PreCIDスペクトルが取得される。そして、ステップＳ１０でＹｅｓと判定されたならば、次にｎが予め設定された所定上限値であるか否かが判定される（ステップＳ１１）。例えば所定上限値が２であれば、ステップＳ１１でＮｏと判定されることはなく、その時点で処理は終了する。
一方、所定上限値が３以上であれば、ステップＳ１１において少なくとも１回はＮｏと判定され、ｎの値がインクリメントされて（ステップＳ１２）ステップＳ３へと戻る。そうして、さらに多段のＭＳⁿ分析について同様の測定及び処理を実行する。

以上のようにして、本実施例のイオントラップ質量分析装置では、ＭＳⁿスペクトルにペプチドや糖鎖に特徴的であるピーク群又はピークが検出された場合に、プリＣＩＤ操作を実施してＭＳ^n+PreCIDスペクトルが得られる。一つの目的試料に対して得られたＭＳ¹スペクトル上で複数のプリカーサイオンが検出された場合には、そのプリカーサイオン毎のＭＳⁿスペクトルについてそれぞれＭＳ^n+PreCIDスペクトルが得られる可能性がある。上述したようにＭＳ^n+PreCIDスペクトルにはペプチド又は糖ペプチドの主要な構造の推定に有用なプロダクトイオンが高い感度で観測される可能性が高い。そこで、ペプチド同定部５４は上述したように収集されたマススペクトル上で観測されるピークの情報を抽出し、このピーク情報をデータベース検索に供することで又はデノボシーケンシング法を用いることにより、目的試料中のペプチドや糖鎖を同定したりその構造を推定したりする。

以下、本実施例のイオントラップ質量分析装置を利用した、幾つかの実測例について説明する。

［実測例１］
実測例１において、目的試料はラビットのグリコーゲンホスホリラーゼ（Rabbit Glycogen phosphorylase B）のトリプシン消化物ペプチドである。
図３（ａ）はトリプシン消化物ペプチド中のアミノ酸配列［ＬＬＳＹＶＤＤＥＡＦＩＲ］(m/z 1441)をプリカーサイオンに設定して得られたＭＳ²スペクトルである。なお、データの積算回数は４０回である。図示するように、ＭＳ²スペクトル中には質量電荷比がm/z750、m/z635、m/z506である３本のピークが観測され、それらピークの間隔はタンパク質の構成要素であるアスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ）に相当する。そのため、この複数のピークは上記（１）の特徴的なピーク群であると推定される。なお、このＭＳ²スペクトルから抽出したピーク情報をタンパク質データベース検索に供してもペプチドを同定することはできなかった。

上述したように３本のピークは特徴的なピーク群であると推定されるため、これらがプリＣＩＤ候補となる。そして、この中で、アミノ酸残基ＤＥ又はＥを含むと推定されるプロダクトイオンm/z 750とm/z 635とをプリカーサイオンとしてプリＣＩＤ操作を伴うＭＳ^2+PreCID分析を実施した結果、図３（ｂ）に示すようなＭＳ^2+PreCIDスペクトルが得られた。このときの低質量カットオフは約１００である。図３（ｂ）に示すように、ＭＳ²スペクトルでは観測されなかった低質量電荷比領域に多数のプロダクトイオンが観測される。特に、m/z 175にピークが確認され、これはアルギニン（Ｒ）のｙ1イオンであることから、分析対象分子のＣ末端のアミノ酸残基はアルギニンであると推定される。
図３（ａ）、（ｂ）に示したＭＳ²スペクトル及びＭＳ^2+PreCIDスペクトルからそれぞれ得られたピークリストを統合したピーク情報をタンパク質データベース検索に供して同定処理を行った結果、ペプチドは正しく同定された。

上記実測例１ではＭＳ²スペクトル上のピーク間隔から部分的なアミノ酸配列を推定したが、目的化合物はＮ型又はＯ型糖ペプチドであってもよく、３本以上のピーク間隔から抽出される情報は特定の糖鎖又は特定の糖の環開裂によるニュートラルロスであってもよい。即ち、この場合、この複数のピークは上記（２）の特徴的なピーク群であると推定される。このような場合には、そうしたニュートラルロス由来であると推定された複数のピークの中で質量電荷比が最小であるピーク、又はその複数のピークの中でピーク強度が一定以上であり且つ質量電荷比が最小であるピークに対応するイオンを対象としてプリＣＩＤを実行すればよい。

目的化合物がＮ型糖ペプチドであって、ＭＳ²スペクトル上で観測される複数のピークが上記（３）の特徴的なピーク群であると推定される場合には、そのトリプレットピークのいずれか一つ以上のピークに対応するイオンを対象としてプリＣＩＤを実行すればよい。トリプレットピークからプリＣＩＤ対象を決める際には、各ピークの質量電荷比のほか、ピーク強度やトリプレットピーク間の質量電荷比順位、相対強度、相対強度順位などを基準とすればよい。また、ＭＳ²スペクトル上で観測される複数のピークが上記（４）の特徴的なピーク群であると推定される場合においても、そのトリプレットピークのいずれか一つ以上のピークに対応するイオンを対象としてプリＣＩＤを実行すればよく、トリプレットピークからプリＣＩＤ対象を決める際には、各ピークの質量電荷比のほか、ピーク強度やトリプレットピーク間の質量電荷比順位、相対強度、相対強度順位などを基準とすればよい。

図３（ｂ）の例では、ＭＳ²スペクトルでは観測できなかったｙ1イオンをＭＳ^2+PreCIDスペクトルにおいて検出することができた。このときの低質量カットオフの大きさはプリカーサイオンの質量電荷比等によって定められていることから、ＭＳ²スペクトルで観測される複数のプロダクトイオンの中で、どの質量電荷比を持つイオンをプリＣＩＤすれば低質量カットオフがペプチドのＮ／Ｃ末端配列又はインモニウムイオンを用いたアミノ酸配列組成推定が可能な質量以下となるのか、を見積もることが可能である。ここで使用した装置では低質量カットオフがプリカーサの質量電荷比の約２０％となるから、特徴的なピーク群の中で質量電荷比がm/z 506.635であるイオンを対象にプリＣＩＤを実施することにより、トリプシン消化物に特有のアルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）をｙ1イオン（それぞれm/z 175、m/z 147）として検出可能である。

［実測例２］
この実測例２では、目的試料はウシフェチュイン由来の三分岐糖ペプチドである三分岐Ｎ結合型糖ペプチド（m/z 6536.72(Ave.)）である。この三分岐糖ペプチドのシアル酸脱離イオン（m/z 5662.9(Ave.)）に対するＭＳ²スペクトルから特定糖やその環開裂によるニュートラルロスに由来するプロダクトイオンを抽出し、これを対象としたプリＣＩＤを実施した。さらに、それによって得られたＭＳ^2+PreCIDスペクトルにおいてＮ型糖ペプチドに特徴的なトリプレットピークを検出し、そのいずれか一つ以上をプリカーサイオンとしたＭＳ³分析を実施した。

図４（ａ）は三分岐Ｎ結合型糖ペプチドに対するＭＳ²スペクトルである。このＭＳ²スペクトルにおいて、六炭糖やＨｅｘＮＡｃなど、糖鎖のニュートラルロスにより生じたプロダクトイオンがラダー状に並んでいることが確認された。次に、これらの糖鎖ニュートラルロス由来であると確認されたピークの中でピーク強度が最大であるm/z 3103のイオンを対象としたプリＣＩＤを実施した結果、図４（ｂ）に示すようなＭＳ^2+PreCIDスペクトルが得られた。図４（ｂ）に示すように、ＭＳ²スペクトルでは検出されなかったＮ型糖ペプチドに特徴的であるトリプレットピーク（m/z 1114、m/z 1197、m/z 1317：ピーク間隔は低質量電荷比側から８３Da、１２０Da）が観測された。この結果から、ペプチドの質量電荷比はm/z 1114であると推定された。また、このトリプレットピークのいずれか一個以上を対象としてＭＳ³分析を行い、その結果を利用して糖鎖結合部位の同定が可能であった。

以上のように、本実施例のイオントラップ質量分析装置によれば、従来は同定や構造解析が困難であったペプチドや糖ペプチドについても、同定や構造解析が可能となる可能性が高まる。また、プリＣＩＤではイオン選別を行わない分だけ分析時間が短くて済むので、ペプチドや糖ペプチドの同定作業の効率を向上させることができる。

なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願請求の範囲に包含されることは当然である。

１…イオン源
２…イオントラップ
２１…リング電極
２２、２４…エンドキャップ電極
２３…イオン入射口
２５…イオン出射口
３…検出部
４…ガス供給部
５…データ処理部
５１…マススペクトル作成部
５２…プリカーサイオン選択部
５３…特徴ピーク検出部
５４…ペプチド同定部
６…分析制御部
６１…通常ＣＩＤ実行制御部
６２…プリＣＩＤ実行制御部
７…主電源部
８…補助電源部

Claims (7)

1. 分析対象のタンパク質又はペプチドである化合物由来のイオンを捕捉するとともに捕捉したイオンを開裂させるイオントラップを具備し、開裂により生成されたプロダクトイオンを該イオントラップ自体で又は該イオントラップの外側に設けた質量分離器により質量分離して検出するイオントラップ質量分析装置において、
   a)前記イオントラップに捕捉したイオンに対し特定のイオンを選択的に残すイオン選別操作を行うことなく所定のプリカーサイオンについての開裂操作を実施するイオン非選択開裂制御部と、
   b)前記イオントラップに捕捉したイオンに対しイオン選別操作に引き続き所定のプリカーサイオンについての開裂操作を実施するイオン選択開裂制御部と、
   c)前記イオン選択開裂制御部の制御の下でＭＳⁿ分析（ただしｎは２以上の整数）を実行することで得られたＭＳⁿスペクトルにおいて、タンパク質又は糖タンパク質に特徴的であるピーク群を検出する特徴ピーク群検出部と、
   d)前記特徴ピーク群検出部によりピーク群が検出された場合に、前記ＭＳⁿ分析と同じイオン選別操作及び開裂操作に引き続き、前記イオン非選択開裂制御部の制御の下で前記ピーク群をプリカーサイオンとした開裂操作を実行してマススペクトルを取得するように前記イオン選択開裂制御部及び前記イオン非選択開裂制御部を制御する分析制御部と、
   を備えることを特徴とするイオントラップ質量分析装置。
2. 請求項１に記載のイオントラップ質量分析装置であって、
   前記タンパク質又は糖タンパク質に特徴的であるピーク群は、ペプチドからのアミノ酸残基中の特定結合部位の開裂により生じたピーク群であり、アミノ酸２個以上の配列がスペクトル上のピーク間隔から推定可能である複数のピークを含むことを特徴とするイオントラップ質量分析装置。
3. 請求項１に記載のイオントラップ質量分析装置であって、
   前記タンパク質又は糖タンパク質に特徴的であるピーク群は、糖鎖のニュートラルロスにより生じたピーク群であり、２個以上の糖鎖又はその環開裂断片がスペクトル上のピーク間隔から推定可能である複数のピークを含むことを特徴とするイオントラップ質量分析装置。
4. 請求項１に記載のイオントラップ質量分析装置であって、
   前記タンパク質又は糖タンパク質に特徴的であるピーク群は、糖鎖のニュートラルロスにより生じたピーク群であり、Ｎ型糖ペプチドに特徴的なトリプレットピークであることを特徴とするイオントラップ質量分析装置。
5. 請求項１に記載のイオントラップ質量分析装置であって、
   前記タンパク質又は糖タンパク質に特徴的であるピーク群は、ジスルフィド結合により結合した複数のペプチドに特徴的である３２Da又は３４Da間隔で並ぶトリプレットピークであることを特徴とするイオントラップ質量分析装置。
6. 請求項３に記載のイオントラップ質量分析装置であって、
   前記分析制御部は、前記ＭＳⁿ分析と同じイオン選別操作及び開裂操作に引き続き、前記イオン非選択開裂制御部の制御の下で前記ピーク群をプリカーサイオンとした開裂操作を実行して取得したマススペクトルに対しＮ型糖ペプチドに特徴的なトリプレットピークを検出し、該特徴的なトリプレットピークが検出された場合には該トリプレットピークをプリカーサイオンとしたＭＳⁿ⁺¹分析を実行するように前記イオン選択開裂制御部及び前記イオン非選択開裂制御部を制御することを特徴とするイオントラップ質量分析装置。
7. 分析対象のタンパク質又はペプチドである化合物由来のイオンを捕捉するとともに捕捉したイオンを開裂させるイオントラップを具備し、開裂により生成されたプロダクトイオンを該イオントラップ自体で又は該イオントラップの外側に設けた質量分離器により質量分離して検出するイオントラップ質量分析装置において、
   a)前記イオントラップに捕捉したイオンに対し特定のイオンを選択的に残すイオン選別操作を行うことなく所定のプリカーサイオンについての開裂操作を実施するイオン非選択開裂制御部と、
   b)前記イオントラップに捕捉したイオンに対しイオン選別操作に引き続き所定のプリカーサイオンについての開裂操作を実施するイオン選択開裂制御部と、
   c)ＭＳⁿ⁺¹分析を実施したと仮定したときに、ペプチドのＮ／Ｃ末端配列又はインモニウムイオンを用いたアミノ酸配列組成推定が可能であるプロダクトイオンが、低質量カットオフ以上の質量電荷比範囲に現れる、と推定されるようなプリカーサイオンが、前記イオン選択開裂制御部の制御の下でＭＳⁿ分析（ただしｎは２以上の整数）を実行することで得られたＭＳⁿスペクトルにプロダクトイオンとして検出されるか否か判定する特徴イオン検出部と、
   d)前記特徴イオン検出部によりプロダクトイオンが検出された場合に、前記ＭＳⁿ分析と同じイオン選別操作及び開裂操作に引き続き、前記イオン非選択開裂制御部の制御の下で前記プロダクトイオンをプリカーサイオンとした開裂操作を実行してマススペクトルを取得するように前記イオン選択開裂制御部及び前記イオン非選択開裂制御部を制御する分析制御部と、
   を備えることを特徴とするイオントラップ質量分析装置。

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