JP5004586B2 - ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いる高分子量凝集体の取り出し - Google Patents
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Description
この発明は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて、高分子量凝集体を抗体調製物から除去する方法に関する。この発明のある実施形態においては、最終調製物中に存在する高分子量凝集体の量は、実質的に、例えば40%から1%未満に低減されるであろう。
タンパク質の生物学的活性を破壊しないか、またはそれを実質的に低減しない有用なタンパク質精製方法を明らかにすることが望ましい。汚染物は、診断用途、治療用途、応用細胞生物学、および機能研究で用いられるであろう前に、抗体調製物から除去されなければならない。ハイブリドーマ細胞系から採取された抗体調製物は、例えば、しばしば、細胞系によって産生された抗体の高分子量凝集体(HMWA)などの好ましくない成分を含む。凝集体のこの形成は、投与時に、補体の活性またはアナフィラキシーをもたらすことによって、産物の安全性に有害な影響を及ぼすであろう。さらに、凝集体の形成は、産物収率の低減、ピークの広がり、および活性の損失をもたらすことによって、製造プロセスを阻害するであろう。
Tarditi, J. Immunol. Methods 599:13-20 (1992) Steindl, J. Immunol. Methods 235:61-69 (2000) Shepard, J. of Chromatography 891:93-98 (2000) Vola et al., BioTechniques 14:650-655 (1993) Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000) Stanker, J. Immunological Methods 76:157-169 (1985) Tarditi, J. Chromatography 599:13-20 (1992) Karlsson et al., Ion Exchange Chromatography, in Protein Purification, VCH Publishers, Inc. (Janson and Ryden eds., 1989) Junbauer, J. Chromatography 476:257-268 (1989)
出願人は、驚くべきことに、異なる原料から免疫グロブリンを精製し、かつHMWAを除去するための新規ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー方法にNaClを用いることができることを見出した(図2)。したがって、本発明は、抗体調製物をヒドロキシアパタイト樹脂と接触させ、抗体を樹脂から選択的に溶出することよって、高分子量凝集体を該調製物から除去する方法に関する。あるいは、抗体調製物は、平衡緩衝液中に緩衝液交換され、次いでヒドロキシアパタイト樹脂を通過させられるであろう。これらの結合/フロースルーヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー方法の組合せはまた、抗体調製物を精製するのに用いられるであろう。
0.2〜2.5Mを含む負荷緩衝液中に交換する工程、イオン交換フロースルーをヒドロキシアパタイト樹脂と接触させる工程、抗体にヒドロキシアパタイト樹脂を通過させる工程、およびヒドロキシアパタイト樹脂を少なくとも一種のヒドロキシアパタイト洗浄緩衝液で洗浄する工程によって、組合せで用いられるであろう。
A.定義
本発明がより容易に理解されるであろうために、いくつかの用語を、先ず定義する。さらなる定義は、詳細な説明の中で随時示される。
本発明は、高分子量凝集体(HMWA)を、結合方式、フロースルー方式、またはその組合せのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて、抗体調製物から除去するための方法を提供する。本発明は、抗体調製物の大規模精製に適用される。
0.2〜2.5Mを含む負荷緩衝液中に、弱酸性〜弱塩基性のpHで緩衝液交換される。抗体調製物は、次いで、ヒドロキシアパタイトカラムを通過させられ、一方HMWAなどの不純物は、カラムに結合する。カラムは、任意に、続いて洗浄されて、さらなる精製抗体が、カラムを通過させられる。最後に、カラムは、任意にストリッピングされ、次いで水酸化ナトリウムおよびリン酸カリウム溶液を用いて再生されるであろう。
本発明の抗体調製物は、限定されることなく、免疫動物の血清、腹水液、ハイブリドーマまたは骨髄腫の上澄み、ならびに組換え細胞系(抗体分子を発現する)の培養、および抗体産生細胞の全細胞抽出液から誘導される調節培地を含む多数の素材から単離されるであろう。本発明の一実施形態においては、種々の抗体産生組換え細胞系の調節細胞培養培地からの抗体が精製される。本明細書の開示に基づいて、細胞系から細胞系への、および種々の抗体産物において、いくらかの変化が予測されるであろうものの、本明細書の本発明を、抗体タンパク質および産生細胞系の特定の組合せに適合させることは、十分に当業者の技術の範囲内にある。
種々のヒドロキシアパタイトクロマトグラフ樹脂が、商業的に入手可能であり、物質のいかなる利用可能な形態も、この発明を実施するに際して用いられるであろう。本発明の一実施形態においては、ヒドロキシアパタイトは、結晶質形態である。この発明で用いるためのヒドロキシアパタイトは、凝集されて粒子を形成し、高温で、安定な多孔質セラミック塊に焼結されるものであろう。
ヒドロキシアパタイト樹脂を抗体調製物と接触させる前に、パラメーター(pH、イオン強度、および温度、ならびにいくつかの場合においては、異なる種類の物質の添加など)を調整することが必要であろう。したがって、ヒドロキシアパタイト母材を、それを溶液(例えば、pH、イオン強度等を調整するための緩衝液、または洗浄剤を導入するためのもの)(抗体調製物を精製するのに必要な特性をもたらす)で洗浄することによって平衡させることは、任意工程である。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、単独で用いられて、上記されるように、モノマーIgGが凝集体から分離されるであろうことが発見されたものの、本発明の精製方法は、他のタンパク質精製技術との組合せで用いられるであろう。本発明の一実施形態においては、ヒドロキシアパタイト工程に先行する一つ以上の工程が、汚染物または不純物の負荷投与を低減するのに望ましいであろう。本発明の他の実施形態においては、ヒドロキシアパタイト工程に続く一つ以上の精製工程が、さらなる汚染物または不純物を除去するのに望ましいであろう。
HMWAの除去に加えて、cHAクロマトグラフィーが、他の不純物を抗体調製物から除去するのに有用であると示された。本発明のcHAクロマトグラフィー方法によって除去されるであろう他の不純物には、限定されることなく、DNA、宿主細胞タンパク質、偶性ウィルス、および先行精製工程からのプロテインA汚染物が含まれる。
次に概略的に述べられる精製処理を、抗GDF−8モノクローナル抗体(本明細書には「Myo−29」として引用される)に対して開発した。Myo−29抗体は、IgG1亜型抗体であり、pI約8.1を有する。精製プロセスは、三種のクロマトグラフ工程(プロテインA親和、アニオン交換、およびヒドロキシアパタイト)、ウィルス不活性化工程、および限外ろ過/ろ過透析工程からなって、産物が、最終緩衝液中に濃縮および交換された。全ての工程を、18〜25℃で行った。但し、プロテインAクロマトグラフィー工程は、2〜8℃で実施された。
Myo−29抗体は、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞中に発現される。これを、攪拌2500Lタンクバイオリアクターで培養した。培養流体を採取するために、細胞を、Prostakマイクロフィルトレーション装置(Millipore、Billerica、MA)を用いて除去した。浄化された調節培地(CCM)を、最初のクロマトグラフ工程(プロテインAクロマトグラフィー)のために収集した。
組替え型プロテインA樹脂(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)の17.7L(直径30cm×高さ25cm)MabSelectカラムを、平衡緩衝液(Tris 10mM、NaCl 100mM、pH7.5)5カラム容と平衡させた。CCMを、流速2.5cm/分および負荷投与Myo−29 35g/樹脂リットルでカラムに付した。カラムに負荷した後、それを、高塩洗浄緩衝液(Tris 20mM、NaCl 1.0M、pH7.5)5カラム容で、次いで低塩洗浄緩衝液(Tris 10mM、NaCl 100mM、pH7.5)10カラム容で洗浄した。Myo−29を、溶出緩衝液(アルギニン100mM、NaCl 50mM、pH3.0)6カラム容を加えることによって溶出した。溶出物プールを、次いで、病気予防手段としてpH3.6±0.5で1.5±0.5時間保持して、潜在的な偶性ウィルス汚染物の不活性化を促進した。溶出物プールを、次いで、2M HEPES緩衝液(pH8.0)でpH7.3に中和して、Myo−29の酸不安定種の劣化が防止された。
プロテインAカラム溶出物を、さらに、Q SEPHAROSE FF樹脂(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)の75Lカラム(直径80cm×長さ15cm)のアニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラムを、第一の平衡緩衝液(HEPES 20mM、NaCl 1000mM、pH7.3)5カラム容で、次いで第二の平衡緩衝液(アルギニン100mM、NaCl 50mM、HEPES 100mM、pH7.3)5カラム容で平衡させた。プロテインAカラム溶出物を、流速2.5cm/分および負荷比Myo−29 15g/樹脂リットルで平衡カラムに加えた。負荷した後、カラムを、第二の平衡緩衝液5カラム容で洗浄した。アニオン交換カラムフロースルーを収集した。
この任意工程の目的は、CHO細胞培養物中に存在するであろうレトロウィルス様粒子の除去であり、潜在的な偶性ウィルス汚染物を除去することによるさらなる安全性を提供することであった。アニオン交換カラムフロースルーは、収集され、35nm Planova単使用フィルター(Asahi−Kasei Corp.、New York、NY)を通して送られた。モジュール中の残り産物を、アニオン交換カラム洗浄緩衝液(アルギニン100mM、NaCl 50mM、HEPES 100mM、pH7.3)を装置に通すことによって回収した。
ウィルスろ過溶液を、さらに、cHAタイプII樹脂(粒度40μM)(BioRad、Hercules、CA)を充填されたヒドロキシアパタイトカラム(60cm×20cm)で精製した。カラムを、平衡緩衝液1(リン酸ナトリウム0.3M、NaCl 1.0M、pH6.8)3カラム容で平衡させた。第二の平衡工程を、平衡緩衝液2(リン酸ナトリウム5mM、NaCl 50mM、pH7.2)4カラム容で行った。部分精製培地を、負荷緩衝液1:1(v/v)(リン酸ナトリウム10mM、pH7.2)中、流速2.5cm/分で樹脂上に負荷した。cHAカラムを、洗浄緩衝液(リン酸ナトリウム5mM、NaCl 50mM、pH7.2)3カラム容で洗浄した。Myo−29抗体を、溶出緩衝液(リン酸ナトリウム5mM、NaCl 350mM、pH6.8)6カラム容を用いて、cHA樹脂から溶出した。
cHA溶出物プールを、30,000名目分子量限界を有する複合再生セルロース膜からなるPLCTK Pellicon 2 カセット(Millipore、Billerica、MA)を用いる接線流限外ろ過システムを通して送った。この工程の目的は、cHA産物プールを濃縮し、それを処方緩衝液中に緩衝液交換することであった。cHA産物プールを、50%スクロース溶液で割って(w/v)、スクロースの濃度を2%にした。Myo−29抗体を、約20gL−1に濃縮し、次いで処方緩衝液(L−ヒスチジン0.01M、スクロース2%、pH6.0)≧約9洗浄容でろ過透析した。ろ過透析が完了した際に、産物を、さらに、約60gL−1に濃縮し、重力滴下および空気吹き出しによって、および引続く処方緩衝液による保持物通路のフラッシングによって装置から回収した。薬剤物質Myo−29の濃度目標は、≧35g/Lである。
Myo−29抗体はまた、成功裡に、3.1Lカラム中に充填されたタイプIcHA樹脂(40μM粒度)を用いて精製された。カラムを、平衡緩衝液1(リン酸ナトリウム0.3M、NaCl 1.0M、pH6.8)3カラム容で平衡させた。第二の平衡工程を、平衡緩衝液2(リン酸ナトリウム5mM、NaCl 50mM、pH7.2)4カラム容で行った。アニオン交換精製工程からの部分精製培地を、負荷投与35mg/mlおよび流速1.5cm/分で樹脂上に負荷した。cHAカラムを、洗浄緩衝液(リン酸ナトリウム5mM、NaCl 50mM、pH7.2)3カラム容で洗浄した。Myo−29抗体を、溶出緩衝液(リン酸ナトリウム3mM、NaCl 1.0M、pH7.2)6カラム容を用いて、cHA樹脂から溶出した。
実施例2に記載されるcHA精製処理はまた、HMWAを抗CD22および抗Abetaの両抗体調製物から十分に除去可能であった。用いられた処理は、精製抗体モノマーが、溶出緩衝液(リン酸ナトリウム3mM、NaCl 1.5M、pH7.2)15カラム容で勾配溶出されたことを除いて、実施例2に記載されたものと類似であった。
Myo−29抗体はまた、成功裡に、フロースルー方式のcHA精製プロトコルを用いて精製された。1.6×20cmのVantageカラム(Millipore、Billerica、MA)を、Macro−Prep Ceramic Hydroxyapatite Type II(粒度40μmの樹脂)(BioRad、Hercules、CA)を用いて、200mMリン酸ナトリウム(二塩基、pH9.0)中で充填した。カラムを、平衡緩衝液1(リン酸ナトリウム300mM、NaCl 1.0M、pH6.8)3カラム容、および平衡緩衝液2(NaCl 350mM、リン酸ナトリウム5mM、pH6.8)3カラム容で平衡させた。Myo−29抗体調製物を、負荷緩衝液(NaCl 350mM、リン酸ナトリウム5mM、pH6.8)中に緩衝液交換し、次いでcHAカラムに負荷した。カラムを、洗浄緩衝液(NaCl 350mM、リン酸ナトリウム5mM、pH6.8)で洗浄し、ストリッピング緩衝液(リン酸ナトリウム300mM、NaCl 1.0M、pH6.8)でストリッピングし、次いで再生緩衝液(リン酸カリウム500mM、NaOH 1.0M、pH13.3)で再生した。全流速を、2.5〜3cm/分で保持した。カラム流出物を、HPLCシステムを用いるSEC−HPLCによって分析した。
1.1×21cmのVantageカラム(Millipore、Billerica、MA)を、Macro−Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I(粒度40μmの樹脂)(BioRad、Hercules、CA)を用いて、200mMリン酸ナトリウム(二塩基、pH9.0)中で充填した。カラムを、平衡緩衝液1(リン酸ナトリウム300mM、NaCl 1.0M、pH6.8)3カラム容、および平衡緩衝液2(NaCl 1.0M、リン酸ナトリウム3mM、pH7.2)3カラム容で平衡させた。Myo−29抗体調製物を、負荷緩衝液(NaCl 1.0M、リン酸ナトリウム3mM、pH7.2)中に緩衝液交換し、次いで負荷投与26mg/mlでcHAカラムに負荷した。カラムを、洗浄緩衝液(NaCl 1.0M、リン酸ナトリウム3mM、pH7.2)で洗浄し、ストリッピング緩衝液(リン酸ナトリウム300mM、NaCl 1.0M、pH6.8)でストリッピングし、次いで再生緩衝液(リン酸カリウム500mM、NaOH 1.0M、pH13.3)5カラム容で再生した。流速を、負荷および洗浄に対しては90cm/時間未満で、精製処理の残りに対しては240cm/時間未満で保持した。カラム流出物を、HPLCシステムを用いるSEC−HPLCによって分析した。
セラミックHAクロマトグラフィー精製はまた、抗CD22抗体調製物を精製する際に有用であると示された。1.6×20cmのVantageカラム(Millipore、Billerica、MA)を、Macro−Prep Ceramic Hydroxyapatite Type II(粒度40μmの樹脂)(BioRad、Hercules、CA)を用いて、pH9.0で200mMリン酸ナトリウム(二塩基)中で充填した。カラムを、平衡緩衝液1(リン酸ナトリウム300mM、NaCl 1.0M、pH6.8)3カラム容、および平衡緩衝液2(NaCl 50mM、リン酸ナトリウム5mM、pH6.8)3カラム容で平衡させた。抗CD22抗体調製物を、(NaCl 50mM、リン酸ナトリウム5mM、pH6.8)中に緩衝液交換し、次いでcHAカラムに負荷した。カラムを、洗浄緩衝液(NaCl 50mM、リン酸ナトリウム5mM、pH6.8)3カラム容で洗浄し、次いで(リン酸ナトリウム5mM、NaCl 1.0M、pH6.8)15カラム容で勾配溶出した。カラムを、ストリッピング緩衝液(リン酸ナトリウム300mM、NaCl 1.0M、pH6.8)でストリッピングし、次いで再生緩衝液(リン酸カリウム500mM、NaOH 1.0M)で再生した。全流速を、2.5〜3cm/分で保持した。カラム流出物を、HPLCシステムを用いるSEC−HPLCによって分析した。
セラミックHAクロマトグラフィー精製はまた、抗Abeta抗体調製物を精製する際に有用であると示された。1.6×20cmのVantageカラム(Millipore)を、Macro−Prep Ceramic Hydroxyapatite Type II(粒度40μmの樹脂)(BioRad、Hercules、CA)を用いて、pH9.0で200mMリン酸ナトリウム(二塩基)中で充填した。カラムを、平衡緩衝液1(リン酸ナトリウム300mM、NaCl 1.0M、pH6.8)3カラム容、および平衡緩衝液2(NaCl 50mM、リン酸ナトリウム5mM、pH6.8)5カラム容で平衡させた。抗Abeta抗体調製物を、(NaCl 50mM、リン酸ナトリウム5mM、pH6.8)中に緩衝液交換し、次いでカラムに負荷した。カラムを、洗浄緩衝液(NaCl 50mM、リン酸ナトリウム5mM、pH6.8)5カラム容で洗浄し、次いで5mM(リン酸ナトリウム5mM、NaCl 1.0M、pH6.8)15カラム容で勾配溶出した。カラムを、ストリッピング緩衝液(リン酸ナトリウム300mM、NaCl 1.0M、pH6.8)でストリッピングし、次いで再生緩衝液(リン酸カリウム500mM、NaOH 1.0M)で再生した。全流速を、2.5〜3cm/分で保持した。カラム流出物を、HPLCシステムを用いるSEC−HPLCによって分析した。
実施例1に記載された方法にしたがって精製された抗GDF−8抗体(Myo−29)を、拮抗酵素結合免疫吸着剤検定(ELISA)を用いて、結合活性について検定した。拮抗ELISAは、他の精製抗体の結合活性を試験するのに用いられるであろう。Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい。GDF−8レセプター(ActRllβ.Fc)(2μg/ml)を、容積100μl/ウェルの96ウェル微小力価プレート上に吸着した。プレートを、次いで、2〜8℃で終夜培養した。プレートを、洗浄緩衝液(Tris−HCl 50mM、pH8.0、Tween 20 0.05%)で二回洗浄し、ウシ血清アルブミン(BSA)の4%溶液でブロックして、非特定結合が最少にされた。プレートを、室温で1.5〜3.0時間培養し、洗浄緩衝液(Tris−HCl 50mM、pH8.0、Tween 20 0.05%)で二回洗浄した。
結合/フロースルー組合せ方式のセラミックHAクロマトグラフィー精製はまた、抗GDF−8抗体調製物を精製するのに有用であると示された。次に詳述される実験を、AKTA FPLCシステム(General Electric)で実施した。1.1×21cmのVantageカラム(Millipore)を、Macro−Prep Ceramic Hydroxyapatite Type II(粒度40μmの樹脂)(BioRad、Hercules、CA)を用いて、pH9.0で200mMリン酸ナトリウム(二塩基)中で充填した。カラムを、平衡緩衝液1(リン酸ナトリウム300mM、NaCl 1.0M、pH6.8)3カラム容、および平衡緩衝液2(NaCl 50mM、リン酸ナトリウム2.0mM、アルギニン100mM、HEPES 100mM、pH7.3)5カラム容で平衡させた。抗GDF−8抗体調製物を、負荷投与20mg/mlでカラム上に負荷した。カラムを、洗浄緩衝液2で洗浄し、ストリッピング緩衝液(リン酸ナトリウム300mM、NaCl 1.0M、pH6.8)でストリッピングし、次いで再生緩衝液(リン酸カリウム500mM、NaOH 1.0M、pH13.3)で再生した。負荷および洗浄に対する流速は、1.5cm/分であった。精製処理の残りに対する流速を、2.5〜3.0cm/分で保持した。カラム流出物を、HPLCシステムを用いるSEC−HPLCによって分析した。
実施例9に記載される手順を、タイプIIcHA樹脂の代わりにタイプIcHA樹脂を用いて繰返した。緩衝液条件は、平衡緩衝液2が、pH7.3で、リン酸ナトリウム5.0mM、NaCl 100mM、アルギニン120mM、HEPES20mMからなっていることを除いて、実施例9で用いられたものと同じであった。
高処理量スクリーンを、緩衝液条件(cHA−タイプI樹脂を用いて、Myo−029抗体調製物を精製するのに用いられる)を最適化するために行った。スクリーンは、cHA−タイプI樹脂上のリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、アルギニン、およびMyo−029のレベルを変動させ、Myo−029および高分子量凝集体(HMWA)の樹脂への結合程度を決定した。
Claims (22)
- 少なくとも一種の抗体を、高分子量凝集体を含む抗体調製物から精製するための方法であって、
(a)抗体調製物をヒドロキシアパタイト樹脂と接触させ、ここで前記樹脂はホスフェート1〜20mMおよびNaCl 0〜200mMを含む平衡緩衝液で平衡化されており、そして精製抗体を、高イオン強度のホスフェート1〜20mMおよびNaCl 0.2〜2.5Mを含む少なくとも一種の溶出緩衝液で樹脂から溶出させる工程、または
(b)ヒドロキシアパタイト樹脂を、高イオン強度のホスフェート1〜20mMおよびNaCl 0.2〜2.5Mを含む負荷緩衝液中で抗体調製物と接触させ、精製抗体に前記樹脂を通過させる工程、を含む、少なくとも一種の抗体の精製方法。 - 前記精製抗体は、高分子量凝集体5%未満を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記精製抗体は、高分子量凝集体1%未満を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液または負荷緩衝液は、pH6.4〜7.6を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液または負荷緩衝液は、高イオン強度のホスフェート3mMまたは5mMを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液または負荷緩衝液は、NaCl 1Mまたは0.35Mを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記溶出緩衝液または負荷緩衝液は、pH6.8または7.2を有する、請求項4に記載の方法。
- 前記抗体は、IgG、IgA、IgD、IgE、またはIgM抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、またはそれらの断片である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体は、抗IL−21レセプター、抗GDF−8、抗Abeta、抗CD22、抗ルイスY、抗IL−13、または抗IL−22抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体は、塩基性pIを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記樹脂は、セラミックヒドロキシアパタイトのタイプIまたはタイプIIである、請求項1に記載の方法。
- 前記樹脂は、セラミックヒドロキシアパタイトのタイプIである、請求項12に記載の方法。
- 前記精製抗体は、プロテインA300ppm未満を含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも一種の抗体を、高分子量凝集体を含む抗体調製物から精製するための方法であって、抗体調製物を、(a)プロテインA親和クロマトグラフィー、(b)イオン交換クロマトグラフィー、および(c)ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付す工程を含み、ここで、
(i)前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付す工程は、ヒドロキシアパタイト樹脂を抗体調製物に接触させる工程を含み、ここで前記樹脂はホスフェート1〜20mMおよびNaCl 0〜200mMを含む平衡緩衝液で平衡化されており、そして精製抗体は、高イオン強度のホスフェート1〜20mMおよびNaCl 0.2〜2.5Mを含む溶出緩衝液を用いて、ヒドロキシアパタイト樹脂から溶出されるか、または
(ii)ヒドロキシアパタイト樹脂を、高イオン強度のホスフェート1〜20mMおよびNaCl 0.2〜2.5Mを含む負荷溶出緩衝液中で抗体調製物と接触させ、精製抗体に、前記樹脂を通過させる、少なくとも一種の抗体の精製方法。 - 前記プロテインA親和クロマトグラフィーが、先ず行われ、前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、最後に行われる、請求項15に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーである、請求項15に記載の方法。
- 少なくとも一種の抗体を、高分子量凝集体を含む抗体調製物から精製するための方法であって、
(a)前記調製物をプロテインA基体と接触させる工程、
(b)前記抗体を、前記プロテインA基体に吸着させる工程、
(c)前記プロテインA基体および吸着された抗体を、少なくとも一種のプロテインA洗浄緩衝液で洗浄する工程、
(d)前記吸着された抗体を、少なくとも一種のプロテインA溶出緩衝液で溶出する工程、
(e)前記プロテインA溶出物を、イオン交換基体と接触させる工程、
(f)前記抗体を、前記イオン交換基体に通す工程、
(g)前記イオン交換基体を、少なくとも一種のイオン交換洗浄緩衝液で洗浄する工程、
(h)前記イオン交換フロースルーを、ヒドロキシアパタイト樹脂と接触させる工程、ここで前記ヒドロキシアパタイト樹脂はホスフェート1〜20mMおよびNaCl 0〜200mMを含む平衡緩衝液で平衡化されており、
(i)前記抗体を、前記樹脂に吸着させる工程、
(j)前記樹脂を、少なくとも一種のヒドロキシアパタイト洗浄緩衝液で洗浄する工程、および
(k)精製抗体を、高イオン強度のホスフェート1〜20mMおよびNaCl 0.2〜2.5Mを含む少なくとも一種のヒドロキシアパタイト溶出緩衝液で、前記樹脂から溶出する工程、を含む、少なくとも一種の抗体の精製方法。 - 前記イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーである、請求項18に記載の方法。
- 前記イオン交換フロースルーを、前記ヒドロキシアパタイト樹脂に付す前にろ過し、それによりウィルス汚染物を低減する工程をさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアパタイト溶出物を、限外ろ過またはろ過透析の少なくとも一種に付す工程をさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも一種の抗体を、高分子量凝集体を含む抗体調製物から精製するための方法であって、
(a)前記調製物をプロテインA基体と接触させる工程、
(b)前記抗体を、前記プロテインA基体に吸着させる工程、
(c)前記プロテインA基体および吸着された抗体を、少なくとも一種のプロテインA洗浄緩衝液で洗浄する工程、
(d)前記吸着された抗体を、少なくとも一種のプロテインA溶出緩衝液で溶出する工程、
(e)前記プロテインA溶出物を、イオン交換基体と接触させる工程、
(f)前記抗体を、前記イオン交換基体に通す工程、
(g)前記イオン交換基体を、少なくとも一種のイオン交換洗浄緩衝液で洗浄する工程、
(h)前記イオン交換フロースルーを、高イオン強度のホスフェート1〜20mMおよびNaCl 0.2〜2.5Mを含む負荷緩衝液中に交換する工程、
(i)前記イオン交換フロースルーを、ヒドロキシアパタイト樹脂と接触させる工程、
(j)前記抗体に、前記ヒドロキシアパタイト樹脂を通過させる工程、および
(k)前記ヒドロキシアパタイト樹脂を、少なくとも一種のヒドロキシアパタイト洗浄緩衝液で洗浄する工程、
を含む、少なくとも一種の抗体の精製方法。
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