KR20060120163A - 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용한 고분자량응집체의 제거 - Google Patents

하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용한 고분자량응집체의 제거 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하여 고분자량 응집체를 함유하는 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체 제제로부터 고분자량 응집체를 제거하는 조합 크로마토그래피 프로토콜에 통합된 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에 관한 것이다.
하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 고분자량 응집체, 항체 제제

Description

하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용한 고분자량 응집체의 제거{Removal of high molecular weight aggregates using hydroxyapatite chromatography}
본원은 2003년 11월 20일자로 출원된 미국 가특허원 제60/523,335호 및 2003년 10월 27일자로 출원된 미국 가특허원 제60/514,018호에 대한 우선권을 주장하며, 이들은 본원에 참고로 인용된다.
본 발명은 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하여 항체 제제로부터 고분자량 응집체를 제거하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양태에 있어서, 최종 제제에 존재하는 고분자량 응집체의 양은 상당히 감소될 수 있는데, 예를 들면, 40%로부터 1% 미만으로 감소될 수 있다.
단백질의 생물학적 활성을 소실시키거나 상당히 감소시키지 않으면서 단백질을 정제하는 유용한 방법을 확인하는 것이 요망된다. 항체 제제가 진단 용도, 치료 용도, 응용 세포 생물학 및 기능 연구에 사용될 수 있기 전에, 항체 제제로부터 오염물은 제거되어야 한다. 하이브리도마 세포주(hybridoma cell line)로부터 수집된 항체 제제는, 예를 들면, 흔히 세포주로부터 생성된 항체의 고분자량 응집 체(HMWA)와 같은 원치않는 성분들을 함유한다. 이러한 응집체의 형성은 투여시 보체 활성화 또는 과민증을 유발함으로써 생성물 안전성에 악영향을 미칠 수 있다. 또한, 응집체 형성은 생성물 수율을 감소시키고 피크를 광역화하고 활성을 상실시킴으로써 제조공정을 저해할 수 있다.
가장 일반적인 단백질 정제방법은 정제될 단백질과 오염물간의 크기, 전하 및 용해도 차이를 근거로 예상된다. 이들 파라미터를 근거로 한 프로토콜은 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 그러나, 이들 크로마토그래피법은 종종 항체들의 응집된 종 또는 다중결합 종(multimeric species)을 분리하는 데 있어서 기술적으로 어렵다. 이온 교환 크로마토그래피와 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 방법은, 예를 들면, 용출 동안 증가된 단백질 농도 또는 완충액 농도 및/또는 pH의 요구되는 변화로 인해 응집체의 형성을 유발할 수 있다. 또한, 몇몇 예에서, 항체들은 등전점 차이가 너무 작아서 이온 교환 크로마토그래피에 의한 분리가 불가능할 수 있다[참조: Tarditi, J. Immunol. Methods 599:13-20 (1992)]. 크기 배제 크로마토그래피는 번거롭고 생성물을 상당히 희석시켜, 효율 기반 대규모 제조공정을 저해한다. 친화성 크로마토그래피 칼럼으로부터 리간드가 누출될 수도 있어, 용출된 생성물의 바람직하지 않은 오염이 초래될 수 있다[참조: Steindl J. Immunol. Methods 235:61-69 (2000)]. 본 출원인은 음이온 교환 크로마토그래피와 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 항-GDF-8 항체 제제로부터 HMWA를 제거하려고 시도했다. 그러나, 이들 방법 모두 항-GDF-8 항체 제제로부터 HMWA를 사 실상 제거할 수 없었다.
하이드록시아파타이트 크로마토그래피는 불용성 하이드록실화 인산칼륨[Ca10(PO4)6(OH)2](이는 매트릭스와 리간드 둘 모두를 형성한다)를 사용하는 단백질 정제방법이다. 작용성 그룹은 양으로 하전된 칼슘 이온의 쌍(C부위)과 음으로 하전된 포스페이트 그룹의 클러스터(P부위)로 이루어진다. 하이드록시아파타이트와 단백질간의 상호작용은 복잡하고 다중 방식이다. 그러나, 하나의 상호작용방법에 있어서, 단백질의 양으로 하전된 아미노 그룹이 음으로 하전된 P부위와 결합하고, 단백질 카복실 그룹은 C부위에 대한 배위 착화(coordination complexation)에 의해 상호작용한다[참조: Shepard, J. of Chromatography 891:93-98 (2000)].
결정성 하이드록시아파타이트가 크로마토그래피에 사용되는 제1 유형의 하이드록시아파타이트였지만, 구조상의 문제에 의해 제한된다. 세라믹 하이드록시아파타이트(cHA) 크로마토그래피가 개발되어, 제한된 유량과 같은 결정성 하이드록시아파타이트와 관련된 몇가지 문제점을 극복하였다. 세라믹 하이드록시아파타이트는 내구성이 높고 단백질 결합 능력이 우수하고, 결정성 하이드록시아파타이트보다 높은 유량 및 압력에서 사용될 수 있다[참조: Vola et al., BioTechniques 14:650-655 (1993)].
하이드록시아파타이트는 단백질, 핵산 및 항체의 크로마토그래피적 분리에 사용되어 왔다. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에서, 저농도의 인산 완충액으로 칼럼을 통상적으로 평형화하고, 샘플을 가한 후, 흡착된 단백질을 농도 구배의 인산염 완충액으로 용출시킨다[참조: Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000)]. 종종 작은 구배의 인산나트륨이 단백질을 용출시키는 데 성공적으로 사용되지만, 다른 예에서는 400nM 이하의 인산나트륨 농도 구배가 성공적으로 사용되었다[참조: Stanker, J. Immunological Methods 76:157-169 (1985)(10mM 내지 30mM의 인산나트륨 용출 구배); Shepard, J. Chromatography 891:93-98 (2000)(10mM 내지 74mM의 인산나트륨 용출 구배); Tarditi, J. Chromatography 599:13-20 (1992)(10mM 내지 350mM 인산나트륨 용출 구배)]. NaCl과 같은 염을 결합 완충액에 혼입시켜 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로 항체를 정제해왔지만[참조: Giovannini, R. Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000)], NaCl과 (NH4)2SO4와 같은 염이 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에서 단백질의 용출에 영향을 미친다는 것은 알려져 있지 않다[참조: Karlsson et al., Ion Exchange Chromatography, in Protein Purification, VCH Publishers, Inc. (Janson and Ryden eds., 1989)].
몇몇 경우에 조사자들은 항체를 하이드록시아파타이트로부터 선택적으로 용출시킬 수 없거나 하이드록시아파타이트 크로마토그래피가 충분히 순수한 생성물을 생성시키지 못한다는 것을 발견했다[참조: Junbauer, J. Chromatography 476:257-268 (1989); Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000)]. 본 출원인은 선행기술 교시내용(도 1)을 근거로 하여 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피와 인산나트륨 용출을 사용하여 항체 제제로부터 고분자량 응집체를 분리하려고 시도하였으나 실패하였다. 또한, 엄격한 용출 조건이 단백질과 매트릭스의 단단한 결합을 파단시키려는 시도에 사용되는 경우, 이는 단백질의 생물학적 활성을 파괴하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 항체의 생물학적 활성을 파괴하지 않으면서 항체 제제로부터 고분자량 응집체와 같은 불순물을 제거하는 효율적인 방법이 여전히 필요하다.
발명의 개요
본 출원인은 놀랍게도 NaCl이 면역글로불린을 정제하고 HMWA를 상이한 원료로부터 제거하기 위한 신규한 하이드록시아파타이트 크로마토그래피법에 사용될 수 있음을 발견하였다(도 2). 따라서, 본 발명은 항체 제제를 하이드록시아파타이트 수지와 접촉시키고 항체를 수지로부터 선택적으로 용출시킴으로써, 고분자량 응집체를 항체 제제로부터 제거하는 방법에 관한 것이다. 다르게는, 당해 항체 제제는 평형화 완충액으로 완충액 교환된 후, 하이드록시아파타이트 수지를 통해 유동할 수 있다. 이들 결합법과 하이드록시아파타이트를 통한 유동 크로마토그래피법(flow-through hydroxyapatite chromatography)의 조합법이 또한 항체 제제를 정제하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 1 내지 20mM 인산나트륨과 0.2 내지 2.5M NaCl을 함유하는 용출 완충액 또는 로딩 완충액(loading buffer)을 특징으로 하며, 여기서 용출 완충액 또는 로딩 완충액은 pH가 6.4 내지 7.6이다.
결합법과 하이드록시아파타이트를 통한 유동 크로마토그래피법의 조합법에서, 본 발명은 1 내지 20mM 인산나트륨, 0.01 내지 2.0M NaCl, 0 내지 200mM 아르기닌 및 0 내지 200mM HEPES를 함유하는 평형화 완충액 및 세척 완충액을 특징으로 하며, 여기서 평형화 완충액 및 세척 완충액은 pH가 6.2 내지 8.0이다.
하나의 양태에 있어서, 정제된 항체는 5% 미만의 고분자량 응집체를 함유한다.
또 다른 양태에 있어서, 정제된 항체는 1% 미만의 고분자량 응집체를 함유한다.
추가의 양태에 있어서, 항체 제제는 하나 이상의 IgG 항체를 함유한다. 보다 구체적으로, 항체 제제는 항-IL-21 수용체, 항-GDF-8, 항-Abeta, 항-CD22, 항-루이스 Y, 항-IL-13 또는 항-IL-22로부터 선택된 하나 이상의 항체를 함유한다.
하나 이상의 정제방법이 본 발명의 하이드록시아파타이트 크로마토그래피와 함께 사용될 수 있다. 이들로 제한되지는 않지만, 단백질 A 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 투석여과(diafiltration), 한외여과(ultrafiltration), 바이러스 제거 여과, 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 각종 정제방법이 사용될 수 있다.
하나의 양태에 있어서, 음이온 교환과 단백질 A 크로마토그래피를 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피와 함께 사용한다. 음이온 교환과 단백질 A 크로마토그래피는, 예를 들면, 항체 제제를 단백질 A 담체(support)와 접촉시키고, 항체를 담체에 흡착시키고, 담체와 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 세척 완충액으로 세척하고, 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 용출 완충액으로 용출시키고, 제제를 이온 교환 담체와 접촉시키고, 항체를 담체를 통해 유동시키고, 담체를 하나 이상의 이온 교환 세척 완충액으로 세척하고, 이온 교환 담체 통과 유동물을 하이드록시아파타이트 수지와 접촉시키고, 이온 교환 담체 통과 유동물을 수지에 흡착시키고, 수지를 하나 이상의 하이드록시아파타이트 세척 완충액으로 세척하고, 정제된 항체를 하나 이상의 하이드록시아파타이트 용출 완충액을 사용하여 수지로부터 용출시킴으로써 함께 사용될 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 음이온 교환과 단백질 A 크로마토그래피는, 예를 들면, 제제를 단백질 A 담체와 접촉시키고, 항체를 단백질 A 담체에 흡착시키고, 단백질 A 담체와 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 세척 완충액으로 세척하고, 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 용출 완충액으로 용출시키고, 단백질 A 용출액을 이온 교환 담체와 접촉시키고, 항체를 이온 교환 담체를 통해 유동시키고, 이온 교환 담체를 하나 이상의 이온 교환 세척 완충액으로 세척하고, 이온 교환 담체 통과 유동물을 1 내지 20mM 인산나트륨과 0.2 내지 2.5M NaCl을 포함하는 로딩 완충액으로 교환하고, 이온 교환 담체 통과 유동물을 하이드록시아파타이트 수지와 접촉시키고, 항체를 하이드록시아파타이트 수지를 통해 유동시키고, 하이드록시아파타이트 수지를 하나 이상의 하이드록시아파타이트 세척 완충액으로 세척함으로써 함께 사용될 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 음이온 교환과 단백질 A 크로마토그래피는 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피와 함께 사용된다. 음이온 교환과 단백질 A 크로마토그래피는, 예를 들면, 항체 제제를 단백질 A 담체와 접촉시키고, 항체를 담체에 흡착시키고, 담체와 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 세척 완충액으로 세척하고, 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 용출 완충액으로 용출시키고, 제제를 이온 교환 담체와 접촉시키고, 항체를 담체를 통해 유동시키고, 담체를 하나 이상의 이온 교환 세척 완충액으로 세척하고, 이온 교환 담체 통과 유동물을 하이드록시아파타이트 수지와 접촉시키고, 이온 교환 담체 통과 유동물을 수지에 흡착시키고, HMWA를 항체 단량체보다 단단하게 결합시키고, 로딩이 계속됨에 따라 결합된 단량체를 HMWA로 치환시키고, 하이드록시아파타이트 수지를 하나 이상의 하이드록시 세척 완충액으로 세척하고, 치환된 항체 단량체를 수집함으로써 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 목적 및 이점은 이어지는 상세한 설명에 일부 기재되어 있고 일부는 상세한 설명으로부터 자명하거나 본 발명의 실시에 의해 알 수 있다. 본 발명의 목적 및 이점은 첨부된 청구의 범위에 특별히 지적된 요소 및 조합을 통해 실현되고 획득될 것이다.
전술한 일반적인 설명 및 이어지는 상세한 설명은 모두 청구된 본 발명을 예시 및 설명하기 위한 것이지 본 발명을 한정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 작용을 한다.
도 1은 선행기술의 인산염 구배 용출이 항-GDF-8 항체 제제로부터 HMWA를 분리할 수 없음을 입증한다.
도 2는 NaCl 구배 용출을 사용하여 대부분의 HMWA를 항-GDF-8 항체 제제로부터 분리할 수 있음을 입증한다.
도 3은 cHA 크로마토그래피를 사용하여 HMWA를 항-CD22 항체 제제로부터 분리하는 것을 보여준다.
도 4는 cHA 크로마토그래피를 사용하여 HMWA를 항-Abeta 항체 제제로부터 분리하는 것을 보여준다.
A. 정의
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해서, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 기재된다.
용어 "항체"는 면역글로불린 또는 이의 단편(fragment)을 나타내고 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 당해 용어는 다클론, 단클론, 단특이성, 다특이성, 비특이성, 인간화, 인간, 단일 쇄, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이, 이식 및 시험관내 생성된 항체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 용어 "항체" 또한 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 및 항원 결합 기능을 보유하는 기타 항체 단편과 같은 항체 단편을 포함한다. 통상적으로, 이러한 단편은 항원 결합 영역을 포함한다.
또한 본 발명에 의해 정제될 수 있는 항체로는 PEG 처리에 의해 변형된 형태와 같이 화학적으로 변형된 형태 및 면역글로불린 잔기(moiety)를 포함하는 융합 단백질이 있다. 항체 또는 이의 단편은 알려져 있는 항체 동형 및 이들의 입체 형태들, 예를 들면, IgA, IgG, IgD, IgE, IgM 단량체, IgA 이량체, IgA 삼량체 또는 IgM 오량체로부터 선택될 수 있다.
용어 "항체 제제"는 항체 및/또는 이러한 항체의 고분자량 응집체와 같은 목적하지 않은 성분을 함유하는 조성물을 나타낸다.
"세라믹 하이드록시아파타이트" 또는 "cHA"는 고온에서 구형 또는 거대다공성 세라믹 형태로 소결된 화학식 [Ca10(PO4)6(OH)2]의 불용성 하이드록실화 인산칼슘을 나타낸다. 용어 "cHA"는 유형 I 및 유형 II의 세라믹 하이드록시아파타이트를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 달리 명시되지 않는 한, "cHA"는 20, 40 및 80㎛를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 입자 크기를 나타낸다.
용어 "고분자량 응집체" 또는 "HMWA"는 둘 이상의 항체의 결합을 나타낸다. 당해 결합은 공유, 비공유, 디설파이드 또는 비환원성 가교결합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 방법에 의해 일어날 수 있다. 둘 이상의 항체는 동일하거나 상이한 항원에 결합할 수 있다. 둘 이상의 항체의 형태는 항체, 항체 단편 또는 위의 "항체" 정의에서 기재된 기타 형태일 수 있다.
용어 "통과 유동 방식(flow-through mode)"은 제제에 함유되어 있는 하나 이상의 항체를 크로마토그래피 수지 또는 담체를 통해 유동시키는 한편, 하나 이상의 잠재적 오염물 또는 불순물이 크로마토그래피 수지 또는 담체에 결합하는 항체 제제 분리 방법을 나타낸다. 통과 유동 방식은, 예를 들면, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에서 사용될 수 있다.
"결합 방식"은 제제에 함유되어 있는 하나 이상의 항체가 크로마토그래피 수지 또는 담체에 결합하는 한편, 하나 이상의 오염물 또는 불순물이 크로마토그래피 수지 또는 담체를 통해 유동하는 항체 제제 분리 방법을 나타낸다. 결합 방식은, 예를 들면, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에서 사용될 수 있다.
B. 방법의 설명
본 발명은 결합 방식, 통과 유동 방식 또는 이들의 조합 방식으로 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하여 항체 제제로부터 고분자량 응집체(HMWA)를 제거하는 방법을 제공한다. 본 발명은 항체 제제의 대규모 정제에 사용될 수 있다.
결합 방식에서, 당해 방법은 항체 및 HMWA 둘 모두와 결합하는 중성 pH와 낮은 이온 강도의 인산염으로 충전된 하이드록시아파타이트 담체를 사용한다. 이어서, 칼럼을 인산염 완충액으로 세척하여 느슨하게 결합된 불순물을 제거한다. 그 다음, 항체를, 0.2 내지 2.5M NaCl을 함유하고 이온 강도가 높은 약산성 내지 약염기성 pH의 인산염 완충액을 사용하여 선택적으로 용출시킨다. 이어서, HMWA를, 이온 강도가 훨씬 높고 인산염 농도가 높은 중성 pH의 완충액을 사용하여 수지로부터 임의로 세척 제거한다. 마지막으로, 수지를, 수산화나트륨과 인산칼륨 용액을 사용하여 임의로 재생시킨다.
통과 유동 방식에서, 항체 제제를 0.2 내지 2.5M NaCl을 함유하는 약산성 내지 약염기성 pH의 로딩 완충액으로 완충액 교환한다. 이어서, 항체 제제를 하이드록시아파타이트 칼럼을 통해 유동시키는데, 이 때 HMWA와 같은 불순물은 칼럼에 결합한다. 그 다음, 칼럼을 임의로 세척하여 추가의 정제된 항체를 칼럼을 통해 유동시킨다. 마지막으로, 칼럼을 임의로 스트립핑(stripping)한 후, 수산화나트륨과 인산칼륨 용액을 사용하여 재생시킨다.
결합 방식과 통과 유동 방식의 조합 방식에서, 항체 제제를 하이드록시아파타이트 칼럼을 통해 유동시키는데, 항체 단량체와 HMWA 둘 모두 초기에 결합한다. 그러나, 로딩이 계속됨에 따라, 도입된 HMWA가 항체 단량체보다 단단하게 결합할 수 있어서, 결합된 단량체를 치환한다. 그 결과, 치환된 단량체가 칼럼을 통해 유동한다. 그 다음, 칼럼을 임의로 세척하여 치환된 추가의 항체를 칼럼을 통해 유동시킨다. 마지막으로, 칼럼을 임의로 고 염 고 인산염 용액(high salt, high phosphate solution)으로 스트립핑한 후, 수산화나트륨과 인산칼륨 용액을 사용하여 재생시킨다.
본 발명의 하나의 양태에 있어서, 정제된 항체는 5% 미만의 HMWA를 함유하고, 하나의 양태에 있어서는 3% 미만의 HMWA를 함유하고, 또 다른 양태에 있어서는 1% 미만의 HMWA를 함유한다.
1. 항체
본 발명의 항체 제제는 면역시킨 동물의 혈청, 복수, 하이브리도마 또는 골수종 상청액, 항체 분자를 발현시키는 재조합 세포주의 배양으로부터 유도되는 적응용 배지 및 항체 생성 세포의 모든 세포 추출물로부터 유도된 적응용 배지를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다수의 공급원으로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에 있어서, 각종 항체 생성 재조합 세포주의 적응용 세포 배양 배지로부터 항체가 정제된다. 본원에 기재된 바에 근거하여 세포주로부터 세포주로의 변형 및 각종 항체 생성물 중에서의 변형을 기대할 수 있지만, 본 발명을 항체 단백질과 항체 생성용 세포주의 특정 조합에 맞게 변화시키는 것은 당해 기술분야의 숙련인의 권한 내에 있다.
단지 예시를 위해서, 본 발명은 IgG 동형 및 염기성 pl의 수 개의 항체의 정제에 적용된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 미국 가특허원 제60/419,964호에 기재되어 있는 GDF-8에 대한 단클론성 항체(이후, "Myo-29"라고 한다), 미국 특허원 제10/428,894호에 기재되어 있는 CD22 항원에 대해 특이하게 반응하는 단클론성 항체(이후, "항-CD22"라고 한다), 및 국제특허원 제PCT/US01/46587호에 기재되어 있는 Abeta 항원에 대한 단클론성 항체(이후, "항-Abeta"라고 한다)에 적용된다. Myo-29, CD22 및 Abeta 항체 제조용 재조합 시스템의 구성은 위에서 언급한 문헌에 상세화되어 있다.
2. 하이드록시아파타이트 수지
각종 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 수지가 시판되고 있고 모든 시판되는 형태의 재료를 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에 있어서, 하이드록시아파타이트는 결정형이다. 본 발명에 사용하기 위한 하이드록시아파타이트는 응집되어 입자를 형성하고 고온에서 안정한 다공성 세라믹 물질로 소결되는 것들이다.
하이드록시아파타이트의 입자 크기는 달라질 수 있지만, 통상적인 입자 크기의 범위는 직경에 있어서 1 내지 1,000㎛이며, 10 내지 100㎛일 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에 있어서, 입자 크기는 20㎛이다. 본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 입자 크기는 40㎛이다. 본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 입자 크기는 80㎛이다.
다수의 크로마토그래피 담체가 cHA 칼럼 제조시에 사용될 수 있고, 가장 널리 사용되는 담체는 유형 I 및 유형 II의 하이드록시아파타이트이다. 유형 I은 단백질 결합력이 높은데, 산성 단백질에 대한 결합력은 보다 우수하다. 유형 II는 단백질 결합 능력은 낮지만, 핵산 및 특정 단백질의 분해능은 우수하다. 유형 II 재료는 또한 알부민에 대한 친화도가 매우 낮고 다수 종 및 부류의 면역글로불린의 정제에 특히 적합하다. 특정 하이드록시아파타이트 유형의 선택은 당해 기술분야의 숙련인에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 칼럼 또는 연속 애뉴얼 크로마토그래프(continuous annual chromatograph)에 느슨하게 충전된 하이드록시아파타이트 수지와 함께 사용된다. 본 발명의 하나의 양태에 있어서, 세라믹 하이드록시아파타이트 수지를 칼럼에 충전시킨다. 칼럼 치수의 선택은 당해 기술분야의 숙련인에 의해 결정된다. 본 발명의 하나의 양태에 있어서, 0.5cm 이상의 칼럼 직경 및 약 20cm의 층 높이가 소규모 정제용으로 사용될 수 있다. 본 발명의 추가의 양태에 있어서, 약 35cm 내지 약 60cm의 칼럼 직경이 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에 있어서, 60cm 내지 85cm의 칼럼 직경이 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 있어서, 200mM Na2HPO4 용액(pH 9.0) 속의 세라믹 하이드록시아파타이트 수지 슬러리를 약 4cm/분의 일정한 유량으로 또는 중력을 이용해서 칼럼을 충전시키는 데 사용한다.
2. 완충액 조성 및 로딩 조건
하이드록시아파타이트 수지를 항체 제제와 접촉시키기 전에 pH, 이온 강도 및 온도와 같은 파라미터를 조정할 필요가 있거나, 몇몇 경우, 상이한 유형의 물질을 첨가할 필요가 있다. 따라서, 하이드록시아파타이트 매트릭스를 용액(예: pH, 이온 강도 등을 조절하기 위한 완충액 또는 세제 도입용 완충액)으로 세척함으로써 하이드록시아파타이트 매트릭스를 평형화하여 항체 제제의 정제에 필요한 특성을 실현시키는 것은 임의 단계이다.
결합 방식과 통과 유동 방식의 조합 방식의 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에서, 하이드록시 매트릭스는 용액으로 평형화되고 세척되어 항체 제제의 정제에 필요한 특성을 실현한다. 본 발명의 하나의 양태에 있어서, 매트릭스는 0.01 내지 2.0M NaCl을 함유하는 용액(pH 약염기성 내지 약산성)을 사용하여 평형화될 수 있다. 예를 들면, 평형화 완충액은 1 내지 20mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 1 내지 10mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 2 내지 5mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 2mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 5mM 인산나트륨을 함유할 수 있다. 평형화 완충액은 0.01 내지 2.0M NaCl을 함유할 수 있고, 하나의 양태에 있어서는 0.025 내지 0.5M NaCl을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 0.05M NaCl을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 0.1M NaCl을 함유할 수 있다. 로딩 완충액의 pH는 6.2 내지 8.0일 수 있다. 하나의 양태에 있어서, pH는 6.6 내지 7.7일 수 있고, 또 다른 양태에 있어서, pH는 7.3일 수 있다. 평형화 완충액은 0 내지 200mM 아르기닌을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 120mM 아르기닌을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 100mM 아르기닌을 함유할 수 있다. 평형화 완충액은 0 내지 200mM HEPES를 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 20mM HEPES를 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 100mM HEPES를 함유할 수 있다.
항체 제제는 또한 통과 유동 방식의 하이드록시아파타이트 크로마토그래피용으로 제조시 적합한 완충액 또는 로딩 완충액으로 완충액 교환될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에 있어서, 항체 제제는 0.2 내지 2.5M NaCl을 함유하는 로딩 완충액(pH 약산성 내지 약염기성)으로 완충액 교환될 수 있다. 예를 들면, 로딩 완충액은 1 내지 20mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 2 내지 8mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 3 내지 7mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 5mM 인산나트륨을 함유할 수 있다. 로딩 완충액은 하나의 양태에 있어서는 0.2 내지 2.5M NaCl을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 0.2 내지 1.5M NaCl을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 0.3 내지 1.0M NaCl을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에 있어서는 350mM NaCl을 함유할 수 있다. 로딩 완충액의 pH는 6.4 내지 7.6이다. 하나의 양태에 있어서, pH는 6.5 내지 7.0이고, 또 다른 양태에 있어서, pH는 6.8일 수 있다.
결합 방식, 통과 유동 방식 또는 이들의 조합 방식에서, 항체 제제와 하이드록시아파타이트 수지와의 접촉은 충전된 층 칼럼 또는 고상 매트릭스를 함유하는 유동/발포 층 칼럼에서 수행되고/되거나 고상 매트릭스가 특정 시간 동안 용액과 혼합되는 단순 배치식으로 수행될 수 있다.
하이드록시아파타이트 수지를 항체 제제와 접촉시킨 후, 세척 과정을 임의로 수행한다. 그러나, 면역글로불린의 매우 높은 순도가 중요하지 않거나 추가의 통과 유동 항체가 요구되지 않는 몇몇 경우에는 세척 과정이 생략됨으로써 세척 용액 뿐만 아니라 공정 단계도 줄일 수 있다. 사용되는 세척 완충액은 하이드록시아파타이트 수지 및 사용되는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 방식에 좌우되며, 이에 따라 당해 기술분야의 숙련인에 의해 결정될 수 있다. 통과 유동 방식 및 결합 방식과 통과 유동 방식의 조합 방식에서, 칼럼의 임의 세척 후 얻어진 정제된 항체 통과 유동물이 정제된 다른 항체 분획과 혼주(pool)될 수 있다.
결합 방식에서, 항체는 임의 세척 과정 후에 칼럼으로부터 용출될 수 있다. 칼럼으로부터 항체의 용출을 위해서, 본 발명은 약 0.2 내지 2.5M NaCl을 함유하는 높은 이온 강도 인산염 완충액(pH 약산성 내지 약염기성)을 사용한다. 예를 들면, 용출 완충액은 1 내지 20mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에서는 2 내지 8mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에서는 2 내지 6mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에서는 3mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에서는 5mM 인산나트륨을 함유할 수 있다. 용출 완충액은 0.2 내지 2.5M NaCl을 함유할 수 있고, 하나의 양태에 있어서는 0.2 내지 1.5M NaCl을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에서는 0.3 내지 1.1M NaCl을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에서는 1.0M NaCl을 함유할 수 있고, 또 다른 양태에서는 0.35M NaCl을 함유할 수 있다. 용출 완충액의 pH는 6.4 내지 7.6이다. 하나의 양태에 있어서, pH는 6.5 내지 7.3일 수 있고, 또 다른 양태에서는 7.2일 수 있고, 또 다른 양태에서는 6.8일 수 있다. 용출 완충액은 연속 구배 또는 계단식 구배로 항체를 칼럼으로부터 용출시키기 위해서 변형될 수 있다.
결합 방식, 통과 유동 방식 및 이들의 조합 방식에서, 고상 매트릭스는 항체의 용출 또는 통과 유동 후, 임의로 세정, 즉 스트립핑 및 재생될 수 있다. 이러한 과정은 통상적으로 규칙적으로 수행되어 고상 표면에서의 불순물 축적을 최소화하고/하거나 매트릭스를 멸균시켜 미생물에 의한 생성물의 오염을 방지한다.
완충액 성분은 당해 기술분야의 숙력인의 지식에 따라서 조절될 수 있다. 샘플 완충액 조성 범위 및 결합 방식, 통과 유동 방식 및 결합 방식과 통과 유동 방식의 조합 방식에 대한 예가 표 1, 표 2 및 표 3에 각각 제공되어 있다. 완충액 또는 단계 모두가 필수적인 것은 아니며, 단지 설명을 위해서 제공된 것이다. 예를 들면, 2개의 별개의 평형화 단계가 필요 없을 수 있고, 하이드록시아파타이트 수지를 스트립핑하거나 재생시키거나 저장할 필요가 없을 수 있다. 실시예 11에 기재되어 있는 바와 같이 대량 발굴 탐색(high throughput screen)을 사용하여 cHA 칼럼 크로마토그래피에 대한 완충액 조건을 효율적으로 최적화할 수 있다.
결합 방식용으로 예시적인 완충액 조성 범위
완충액 조성 범위 예시 조성
평형화 1 10 내지 500mM 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.4 내지 7.4 0.3M 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.8
평형화 2 1 내지 20mM 인산나트륨 0 내지 200mM NaCl pH 6.4 내지 7.4 5.0mM 인산나트륨 50mM NaCl pH 7.2
세척 1 내지 20mM 인산나트륨 0 내지 200mM NaCl pH 6.4 내지 7.4 5.0mM 인산나트륨 50mM NaCl pH 7.2
용출 1 내지 20mM 인산나트륨 0.2 내지 2.5M NaCl pH 6.4 내지 7.6 5.0mM 인산나트륨 350mM NaCl pH 6.8 또는 3.0mM 인산나트륨 1.0M NaCl pH 7.2
스트립핑 10 내지 500mM 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.4 내지 7.4 0.3M 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.8
재생 0.5 내지 1.0M 인산나트륨 1.0M NaOH 0.5M 인산나트륨 1.0M NaOH
저장 10 내지 50mM NaOH 20mM NaOH
통과 유동 방식용으로 예시적인 완충액 조성 범위
완충액 조성 범위 예시 조성
평형화 1 10 내지 500mM 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.4 내지 7.4 0.3M 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.8
평형화 2 1 내지 20mM 인산나트륨 0.2 내지 2.5M NaCl pH 6.4 내지 7.6 5.0mM 인산나트륨 350mM NaCl pH 6.8
로딩 완충액 1 내지 20mM 인산나트륨 0.2 내지 2.5M NaCl pH 6.4 내지 7.6 5.0mM 인산나트륨 350mM NaCl pH 6.8
세척 1 내지 20mM 인산나트륨 0.2 내지 2.5M NaCl pH 6.4 내지 7.6 5.0mM 인산나트륨 350mM NaCl pH 6.8
스트립핑 10 내지 500mM 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.4 내지 7.4 0.3M 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.8
재생 0.5 내지 1.0M 인산나트륨 1.0M NaOH 0.5M 인산나트륨 1.0M NaOH
저장 10 내지 50mM NaOH 20mM NaOH
결합 방식과 통과 유동 방식의 조합 방식용으로 예시적인 완충액 조성 범위
완충액 조성 범위 예시 조성
평형화 1 10 내지 500mM 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.4 내지 7.4 0.3M 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.8
평형화 2 1 내지 20mM 인산나트륨 0.01 내지 2.0M NaCl 0 내지 200mM 아르기닌 0 내지 200mM HEPES pH 6.2 내지 8.0 2.0mM 인산나트륨 50mM NaCl 100mM 아르기닌 100mM HEPES pH 7.3 또는 5.0mM 인산나트륨 100mM NaCl 120mM 아르기닌 20mM HEPES pH 7.3
세척 1 내지 20mM 인산나트륨 0.01 내지 2.0M NaCl 0 내지 200mM 아르기닌 0 내지 200mM HEPES pH 6.2 내지 8.0 2.0mM 인산나트륨 50mM NaCl 100mM 아르기닌 100mM HEPES pH 7.3 또는 5.0mM 인산나트륨 100mM NaCl 120mM 아르기닌 20mM HEPES pH 7.3
스트립핑 10 내지 500mM 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.4 내지 7.4 0.3M 인산나트륨 1.0M NaCl pH 6.8
재생 0.5 내지 1.0M 인산나트륨 1.0M NaOH 0.5M 인산나트륨 1.0M NaOH
저장 10 내지 50mM NaOH 20mM NaOH
본 발명의 하나의 양태에 있어서, cHA 수지로의 로딩은, 예를 들면, 20mg/ml 이하의 로딩율(loading challenge) 및 40% HMWA 이하의 로딩시 개시 응집물량로 이루어질 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 있어서, 1.8 내지 10.4mg/ml의 로딩율이 약 15%의 로딩시 개시 응집물량과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, cHA 수지는 20mg/ml 이상의 로딩율 및 40% HMWA 이하의 로딩시 개시 응집물량으로 로딩될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 있어서, 30 내지 40mg/ml의 로딩율이 약 27%의 로딩시 개시 응집물량과 함께 사용될 수 있다.
3. 추가의 임의 단계
하이드록시아파타이트 크로마토그래피가 위에서 언급한 바와 같이 응집물로부터 단량체 IgG를 분리하기 위해서 단독으로 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌지만, 본 발명의 정제방법은 다른 단백질 정제 기술과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에 있어서, 하이드록시아파타이트 단계에 선행하는 하나 이상의 단계가 오염물 또는 불순물의 로딩율을 감소시키기 위해서 요망된다. 본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 하이드록시아파타이트 단계 이후에 하나 이상의 정제단계가 추가의 오염물 또는 불순물을 제거하기 위해서 요망된다.
기재되어 있는 cHA 정제 과정은 단백질 A 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 투석여과, 한외여과, 바이러스 제거 여과 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 기타 정제 단계와 임의로 조합될 수 있다.
하나의 양태에 있어서, cHA 정제 단계 이전에 수집 배지가 먼저 단백질 A 크로마토그래피 단계에 의해 임의로 정제될 수 있다. 예를 들면, 기공 조절 유리(controlled pore glass)에 공유결합된 단백질 A로 이루어진 PROSEP-A™[공급원: 영국에 소재하는 밀리포어(Millipore)]를 유용하게 사용할 수 있다. 다른 유용한 단백질 A 제형으로는 단백질 A Sepharose FAST FLOW™[공급원: 미국 뉴 저지주 피스캐타웨이에 소재하는 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)], TOYOPEARL™650M 단백질 A[공급원: 미국 펜실베니아주 필라델피아에 소재하는 토소하스 캄파니(TosoHaas Co.)] 및 MABSELECT™ 칼럼[공급원: 미국 뉴 저지주 피스캐타웨이에 소재하는 아머샴 바이오사이언시즈]이 있다.
cHA 정제 이전의 임의 단계로서 이온 교환 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 각종 음이온성 또는 양이온성 치환체가 매트릭스에 부착되어 크로마토그래피용 음이온성 또는 양이온성 담체를 형성한다. 음이온성 교환 치환체로는 디에틸아미노에틸(DEAE), 트리메틸아미노에틸 아크릴아미드(TMAE), 4급 아미노에틸(QAE) 및 4급 아민(Q) 그룹이 있다. 양이온성 교환 치환체로는 카복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)가 있다. DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 및 CM-52와 같은 셀룰로즈성 이온 교환 수지는 영국 켄트 메이드스톤에 소재하는 화트만 리미티드(Whatman Ltd.)로부터 입수 가능하다. 세파덱스계 이온 교환제 및 가교결합된 이온 교환제가 또한 알려져 있다. 예를 들면, DEAE-, QEA-, CM- 및 SP-세파덱스 및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-세파로즈, 및 세파로즈 모두 미국 뉴 저지주 피스캐타웨이에 소재하는 아머샴 바이오사이언시즈로부터 입수 가능하다. 또한, DEAE 및 CM 유도된 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체, 예를 들면, TOYOPEARL™DEAE-650S 또는 M 및 TOYOPEARL™CM-650S 또는 M은 미국 펜실베니아주 필라델피아에 소재하는 토소 하스 캄파니로부터 입수 가능하다.
본 발명의 하나의 양태에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피는 결합 방식 또는 통과 유동 방식으로 사용될 수 있다.
특정 양태에 있어서, 단백질 A 크로마토그래피 단계를 먼저 수행하고 음이온 교환 단계를 그 다음에 수행한 후, cHA 단계를 수행한다.
4. 추가 불순물 제거
HMWA 제거 이외에 cHA 크로마토그래피는 항체 제제로부터 기타 불순물을 제거하는 데 유용한 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 cHA 크로마토그래피법으로 제거될 수 있는 기타 불순물로는 DNA, 숙주 세포 단백질, 우발성 바이러스 및 선행 정제 단계로부터의 단백질 A 오염물이 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 하나의 양태에 있어서, 본 발명은 단백질 A를 항체 제제로부터 제거할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 있어서, 최종 제제에 존재하는 단백질 A의 양은 현저하게 감소될 수 있는데, 예를 들면, 300ppm으로부터 1ppm 미만으로 감소된다.
C. 실시예
다음 실시예는 단지 설명을 위해서 제공된다.
실시예 1: 항-GDF-8 항체의 정제
아래에 기재된 정제 공정은 항-GDF-8 단클론성 항체(이후, "Myo-29"라고 한다)를 위해 개발되었다. Myo-29는 IgG1 아형 항체이고 pl이 대략 8.1이다. 정제 공정은 3개의 크로마토그래피 단계(단백질 A 친화도, 이온 교환 및 하이드록시아파타이트), 바이러스 불활성화 단계, 및 생성물을 최종 완충액으로 농축시키고 교환하는 한외여과/투석여과 단계로 이루어진다. 2 내지 8℃에서 수행되는 단백질 A 크로마토그래피 단계를 제외하고는 모든 단계가 18 내지 25℃에서 수행된다.
정제 공정은 특정 규모용으로 정규화될 수 있다. 기재된 선형 유량은 칼럼 직경과 관계가 없고 로딩율은 단위 체적당 질량이다. 단백질 A 크로마토그래피 단계는 배치당 수회 반복되어 수집 생물반응기(bioreactor) 속에 변화량의 세포 배양 역가를 제공할 수 있다. 각각의 주기는 독립된 단위 작업으로 간주되고 용출 풀(elution pool)이 다음 단계를 위해서 보유된다. 단백질 A 단계는 용량이 MabSelect 1ℓ당 대략 35g의 Myo-29이다. 당해 공정의 하류 단계(예: 음이온 교환 크로마토그래피 및 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피)는 음이온 교환 수지 1ℓ당 대략 15g의 Myo-29를 제공하고 세라믹 하이드록시아파타이트 수지 1ℓ당 대략 10g의 Myo-29를 제공하도록 규모가 정해진다.
1. 배양액으로부터 세포 제거
Myo-29 항체를 중국 햄스터 난자(CHO) 세포에서 발현시키고 2500ℓ교반 탱크 생물반응기에서 성장시킨다. 배양액을 수집하기 위해서, 세포를 프로스택 미세여과 장치[Prostak microfiltration device, 제조원: 미국 메사추세츠주 빌레리카에 소재하는 밀리포어]를 사용하여 제거한다. 정화된 적응용 배지(clarified conditioned media; CCM)를 제1 크로마토그래피 단계, 즉 단백질 A 크로마토그래피를 위해서 수집한다.
2. 단백질 A 친화성 크로마토그래피 정제 단계
재조합 단백질 A 수지(공급원: 아머샴 바이오사이언시즈)의 17.7ℓ(직경 30cm ×높이 25cm) 맵셀렉 칼럼(MabSelect column)을 5칼럼 용량의 평형화 완충액(10mM Tris, 100mM NaCl, pH 7.5)으로 평형화한다. CCM을 2.5cm/분의 유량 및 수지 1ℓ당 Myo-29 35g의 로딩율로 칼럼에 가한다. 칼럼을 로딩시킨 후, 5칼럼 용량의 고 염 세척 완충액(20mM Tris, 1.0M NaCl, pH 7.5)으로 세척한 후, 10칼럼 용량의 저 염 세척 완충액(10mM Tris, 100mM NaCl, pH 7.5)으로 세척한다. 6칼럼 용량의 용출 완충액(100mM 아르기닌, 50mM NaCl, pH 3.0)을 가하여 Myo-29를 용출시킨다. 이어서, 용출 풀을 pH 3.6 ±0.5에서 1.5 ±0.5시간 동안 예방법으로서 유지시켜 잠재적인 우발성 바이러스 오염물의 불활성화를 용이하게 한다. 그 다음, 용출 풀을 pH 8.0의 2M HEPES를 사용해서 pH 7.3으로 중화시켜 Myo-29의 산 불안정 잔기의 분해를 방지한다.
칼럼 용출물을 UV 흡광도 및 전도성 크로마토그래피 프로파일의 시각적 검사 및 로딩 역가용 단백질 A HPLC와 용출 풀 농도에 대한 280nm에서의 흡광도를 사용하여 얻어진 생성물 회수율을 포함하는 몇 가지 파라미터로 모니터링한다.
칼럼을 6M 구아니딘 HCl로 스트립핑한 후, 스트립 세척 완충액(10mM Tris, 100mM NaCl, pH 7.5)으로 세척한다. 칼럼을 16% 에탄올 속에 저장한다.
3. 음이온 교환 크로마토그래피 정제 단계
단백질 A 칼럼 용출액을 Q SEPHAROSE FF 수지(공급원: 아머샴 바이오사이언시즈)의 75L 칼럼(직경 80cm ×길이 15cm)에서 음이온 교환 크로마토그래피로 추가로 정제한다. 칼럼을 5칼럼 용량의 제1 평형화 완충액(20mM HEPES, 1000mM NaCl, pH 7.3)으로 평형화한 후, 5칼럼 용량의 제2 평형화 완충액(100mM 아르기닌, 50mM NaCl, 100mM HEPES, pH 7.3)으로 평형화한다. 단백질 A 칼럼 용출액을 2.5cm/분의 유량 및 수지 1ℓ당 Myo-29 15g의 로딩율로 평형화된 칼럼에 가한다. 로딩시킨 후, 칼럼을 5칼럼 용량의 제2 평형화 완충액으로 세척한다. 음이온 교환 칼럼 통과 유동물이 수집된다.
수집된 칼럼 통과 유동물을 UV 흡광도 및 전도성 크로마토그래피 프로파일의 시각적 검사 및 280nm에서의 흡광도를 사용하여 얻은 생성물 수율을 포함하는 몇 가지 파라미터로 모니터링한다.
음이온 교환 칼럼을 스트립 완충액(20mM HEPES, 1M NaCl, pH 7.3)으로 스트립핑하고 재생 완충액(500mM NaOH, 1M NaCl, pH 13.3)으로 재생시킨다. 칼럼을 0.01M NaOH에 저장한다.
4. 바이러스 보유 여과
당해 임의 단계의 목적은 CHO 세포 배양액에 존재할 수 있는 레트로바이러스 유사 입자(retroviral-like particle)를 제거하고 잠재적인 우발성 바이러스 오염물의 제거를 통해 추가의 안전성을 제공하는 것이다. 음이온 교환 칼럼 통과 유동물을 수집하고 35nm 플라노바(Planova) 1회용 필터[공급원: 미국 뉴욕주 뉴욕에 소재하는 아사히-가세이 코포레이션(Asahi-Kasei Corp.)]로 통과시킨다. 모듈에 잔류하는 생성물을, 음이온 교환 칼럼 세척 완충액(100mM 아르기닌, 50mM NaCl, 100mM HEPES, pH 7.3)을 통과시켜 회수한다.
바이러스 보유 여과 후의 생성물 회수율을 종래 성능 데이타(historical performance data)와 비교시 280nm에서의 흡광도 및 플라노바 풀에서의 SDS-PAGE 분석으로 평가한다.
5. cHA 크로마토그래피 정제 단계
바이러스 여과된 용액을 cHA 유형 II 수지[입자 크기: 40㎛, 공급원: 미국 캘리포니아주 허큘즈에 소재하는 바이오래드(BioRad)]로 충전된 하이드록시아파타이트 칼럼(60cm ×20cm)으로 추가로 정제한다. 당해 칼럼을 3칼럼 용량의 평형화 완충액 1(0.3M 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)로 평형화시킨다. 제2 평형화 단계는 4칼럼 용량의 평형화 완충액 2(5mM 인산나트륨, 50mM NaCl, pH 7.2)을 사용하여 수행된다. 부분 정제된 배지를 1:1(v/v) 로딩 완충액(10mM 인산나트륨, pH 7.2) 속에서 수지에 2.5cm/분의 유량으로 로딩시킨다. cHA 칼럼을 3칼럼 용량의 세척 완충액(5mM 인산나트륨, 50mM NaCl, pH 7.2)으로 세척한다. 6칼럼 용량의 용출 완충액(5mM 인산나트륨, 350mM NaCl, pH 6.8)을 사용하여 Myo-29 항체를 cHA 수지로부터 용출시킨다.
cHA 정제 단계를 UV 흡광도 및 전도성 크로마토그래피 프로파일의 시각적 검사, 280nm에서의 흡광도에 의한 생성물 회수율, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석으로 측정된 HMWA 제거율 및 경쟁적 효소 면역 측정법(ELISA)으로 모니터링한다.
cHA 칼럼을 스트립핑 완충액(0.3M 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)으로 스트립핑하고 재생 완충액(0.5M 인산칼륨, 1.0M NaOH, pH 13.3)으로 재생시킨다. 칼럼을 0.02M NaOH 속에 저장한다. 표 4는 cHA 크로마토그래피가 HMWA 불순물을 항체 제제로부터 효과적으로 제거함을 입증한다. 또한, cHA 크로마로크래피는 단백질 A와 같은 기타 불순물도 제거할 수 있다.
HMWA 제거율 및 항체 단량체 수율
샘플 HMWA(%) 로딩 HMWA(%) 피크 단백질 A(ppm) 로딩 단백질 A 피크
1 14.6 1.0 17 BLOQ*
2 16.4 0.7 20 BLOQ
3 15.1 1.6 23 BLOQ
4 16.0 0.9 13 BLOQ
*BLOQ = 정량 한계 1ng/ml 미만
6. 한외여과/투석여과 및 최종 여과
30,000 공칭 분자량 한계를 갖는 복합 재생 셀룰로즈 막으로 이루어진 PLCTK 펠리컨 2 카세트(공급원: 밀리포어)를 사용하여 cHA 용출 풀을 접선류 한외여과 시스템으로 통과시킨다. 당해 단계의 목적은 농축시키는 것과 cHA 생성물 풀을 제형 완충액으로 완충액 교환하는 것이다. cHA 생성물 풀을 50% 수크로스 용액(w/v)으로 스파이킹(spiking)하여 수크로스 농도를 2%로 되도록 한다. Myo-29 항체를 대략 20gL-1로 농축시킨 후, 대략 9세척 용량 이상의 제형 완충액(0.01M L-히스티딘, 2% 수크로스, pH 6.0)으로 투석여과한다. 투석 종결시 생성물을 대략 60gL-1로 추가로 농축시키고, 중력 배수 및 공기 취입 저하에 의해 장치로부터 회수한 후, 보전물 채널을 제형 완충액으로 플러싱한다. 의약 물질 중의 Myo-29의 농도 표적은 35g/L 이상이다.
Myo-29 의약 물질을 마지막으로 0.22㎛ 필터로 여과하고, 제형 완충액(0.01M L-히스티딘, 2% 수크로스, pH 6.0)으로 평형화한 후, 병에 분취하여 -80℃에서 저장한다.
실시예 2: 유형 I 수지를 사용하는 항-GDF-8 항체 제제의 cHA 정제
3.1ℓ칼럼에 충전된 유형 I cHA 수지(입자 크기: 40㎛)를 사용하여 Myo-29 항체를 또한 성공적으로 정제한다. 칼럼을 3칼럼 용량의 평형화 완충액 1(0.3M 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)로 평형화한다. 제2 평형화 단계를 4칼럼 용량의 평형화 완충액 2(5mM 인산나트륨, 50mM NaCl, pH 7.2)를 사용하여 수행한다. 음이온 교환 정제단계로부터 부분적으로 정제된 배지를 로딩율 35mg/ml 및 유량 1.5cm/분으로 수지에 로딩시킨다. cHA 칼럼을 3칼럼 용량의 세척 완충액(5mM 인산나트륨, 50mM NaCl, pH 7.2)으로 세척한다. Myo-29 항체를 6칼럼 용량의 용출 완충액(3mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 7.2)을 사용하여 cHA 수지로부터 용출시킨다.
cHA 칼럼을 스트립 완충액(0.3M 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)으로 스트립핑하고 재생 완충액(0.5M 인산칼륨, 1.0M NaOH, pH 13.3)으로 재생시킨다. 칼럼을 0.02M NaOH 속에 저장한다.
cHA 정제 단계를 UV 흡광도 및 전도성 크로마토그래피 프로파일의 시각적 검사, 280nm에서의 흡광도에 의한 생성물 회수율, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석으로 측정된 HMWA 제거율 및 경쟁적 효소면역측정법(ELISA)으로 측정된 단백질 A 제거율에 의해 모니터링한다. 표 5에 제시되어 있는 바와 같이, 유형 I 수지를 사용하여 cHA 정제하는 경우, HMWA가 제1 주기에서는 27%에서 0.9%로 감소되고 제2 주기에서는 0.6%로 추가로 감소된다. 또한, 유형 I 수지는 유형 II 수지보다 높은 로딩율을 나타내면서 충분한 단량체 수율을 이룬다. 마지막으로, 유형 I 수지를 사용하여 cHA 정제하는 경우, 단백질 A 불순물의 양을 감소시킬 수 있다.
유형 I 수지를 사용하여 얻어지는 HMWA 제거율 및 항체 단량체 수율
샘플 HMWA(%) 단량체 수율(%) 단백질 A(ppm)
cHA 로딩 27.0 N/A 169
cHA 피크(제1 주기) 0.9 86.6 BLOQ*
cHA 피크(제2 주기) 0.6 86.6 BLOQ
*BLOQ = 정량 한계 1ng/ml 미만
실시예 3: 유형 I 수지를 사용하여 항-CD22 항체 제제 및 항-Abeta 항체 제제의 cHA 정제
실시예 2에서 기재한 cHA 정제방법은 항-CD22 및 항-Abeta 항체 제제로부터 HMWA를 또한 충분히 제거할 수 있다. 사용되는 방법은 실시예 2에서 기재한 바와 유사한데, 단 정제된 항체 단량체를 15칼럼 용량의 용출 완충액(3mM 인산나트륨, 1.5M NaCl, pH 7.2)으로 구배 용출시킨다.
표 6에서 입증되는 바와 같이, 유형 I 수지를 사용하여 cHA 정제하는 경우, 항-CD22 항체 제제에서는 HMWA를 0.5%로 감소시킬 수 있고 항-Abeta 항체 제제에서는 HMWA를 검출 한계 미만으로 감소시킬 수 있다. 또한, cHA 정제 단계는 단백질 A 오염물을 항체 제제로부터 제거할 수 있다.
항-CD22 및 항-Abeta 항체 제제의 정제시 유형 I 수지를 사용하여 얻어지는 HMWA 제거율 및 항체 단량체 수율
샘플 HMWA(%) 단량체 수율(%) 단백질 A(ppm)
항-CD22 로딩 3.7 N/A 30
항-CD22 피크 0.5 87 BLOQ*
항-Abeta 로딩 1.87 N/A 40
항-Abeta 피크 0.0 89 BLOQ
*BLOQ = 정량 한계 1ng/ml 미만
실시예 4: 항-GDF-8 항체의 통과 유동 방식 cHA 정제
통과 유동 방식의 cHA 정제 프로토콜을 사용하여 Myo-19 항체를 또한 성공적으로 정제한다. 1.6 ×20cm 밴티지(Vantage) 칼럼(공급원: 밀리포어)을 200mM 2가 인산나트륨(pH 9.0) 속에서 마크로-프렙 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 II(Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type II, 입자 크기: 40㎛, 공급원: 바이오래드)으로 충전시킨다. 칼럼을 3칼럼 용량의 평형화 완충액 1(300mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)과 3칼럼 용량의 평형화 완충액 2(350mM NaCl, 5mM 인산나트륨, pH 6.8)로 평형화한다. Myo-29 항체 제제를 350mM NaCl과 5mM 인산나트륨을 함유하는 로딩 완충액(pH 6.8)으로 완충액 교환한 후, cHA 칼럼에 로딩시킨다. 칼럼을 세척 완충액(350mM NaCl, 5mM 인산나트륨, pH 6.8)으로 세척하고, 스트립 완충액(300mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)으로 스트립핑한 후, 재생 완충액(500mM 인산칼륨, 1.0M NaOH, pH 13.3)으로 재생시킨다. 모든 유량은 2.5 내지 3cm/분에서 유지시킨다. 칼럼 용출액을 HPLC 시스템을 사용하여 SEC-HPLC로 분석한다.
Myo-29의 회수율 및 HMWA의 항체 제제로부터의 제거율을 표 7에 요약하여 제시한다. 제제는 초기에 14.4% HMWA(로딩시)를 함유하고 있는데, 이는 본 발명의 cHA 정제방법을 사용함으로써 0.2% HMWA(통과 유동 후)로 감소되었다.
Myo-29 회수율 및 HMWA 제거율
샘플 Myo-29 회수율(%) 샘플 중의 HMWA(%)
로딩 N/A 14.4
통과 유동 79.6 0.2
세척 12.2 1.9
후세척 1.5 5.6
스트립핑 10.3 84.3
실시예 5: 유형 I 수지를 사용하여 실시된 항-GDF-8 항체의 통과 유동 방식 cHA 정제
1.1 ×21cm 밴티지 칼럼(공급원: 밀리포어)을 200mM 2가 인산나트륨(pH 9.0) 속에서 마크로-프렙 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I(Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I, 입자 크기: 40㎛, 공급원: 바이오래드)로 충전시킨다. 칼럼을 3칼럼 용량의 평형화 완충액 1(300mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)과 3칼럼 용량의 평형화 완충액 2(1.0M NaCl, 3mM 인산나트륨, pH 7.2)로 평형화한다. Myo-29 항체 제제를 1.0M NaCl과 3mM 인산나트륨을 함유하는 로딩 완충액(pH 7.2)으로 완충액 교환한 후, cHA 칼럼에 로딩율 26mg/ml로 로딩시킨다. 칼럼을 세척 완충액(1.0M NaCl, 3mM 인산나트륨, pH 7.2)으로 세척하고, 스트립 완충액(300mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)으로 스트립핑한 후, 재생 완충액(500mM 인산칼륨, 1.0M NaOH, pH 13.3)으로 재생시킨다. 유량은 로딩 및 세척의 경우 90cm/시에서 유지시키고 나머지 정제 공정의 경우에는 240cm/시 미만으로 유지시킨다. 칼럼 용출액을 HPLC 시스템을 사용하여 SEC-HPLC로 분석한다.
항체 제제는 초기에 27.2% HMWA(로딩시)를 함유하는데, 이는 6.1HMWA(통과 유동 후)로 감소된다. 또한, 항체 단량체의 회수율은 72%이다.
실시예 6:항-CD22 항체 제제의 cHA 정제
세라믹 HA 크로마토그래피 정제는 항-CD22 항체 제제를 정제하는 데도 유용한 것으로 밝혀졌다. 1.6 ×20cm 밴티지 칼럼(공급원: 밀리포어)을 200mM 2가 인산나트륨(pH 9.0) 속에서 마크로-프렙 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 II(입자 크기: 40㎛, 공급원: 바이오래드)으로 충전시킨다. 칼럼을 3칼럼 용량의 평형화 완충액 1(300mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)과 3칼럼 용량의 평형화 완충액 2(50mM NaCl, 5mM 인산나트륨, pH 6.8)로 평형화한다. 항-CD22 항체 제제를 50mM NaCl과 5mM 인산나트륨을 함유하는 완충액(pH 6.8)으로 완충액 교환한 후, cHA 칼럼에 로딩시킨다. 칼럼을 세척 완충액(50mM NaCl, 5mM 인산나트륨, pH 6.8)으로 세척한 후, 15칼럼 용량의 완충액(5mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)으로 구배 용출시킨다. 칼럼을 스트립 완충액(300mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)으로 스트립핑한 후, 재생 완충액(500mM 인산칼륨, 1.0M NaOH)으로 재생시킨다. 모든 유량은 2.5 내지 3cm/분에서 유지시킨다. 칼럼 용출액을 HPLC 시스템을 사용하여 SEC-HPLC로 분석한다.
도 3에 도시되어 있는 바와 같이, cHA 정제는 HMWA를 항-CD22 항체 제제로부터 제거하는 데도 성공적이다. 로딩시 HMWA 농도는 1.7%이었지만, cHA 용출물 속의 HMWA 농도는 0.0%이다.
실시예 7: 항-Abeta 항체의 cHA 정제
세라믹 HA 크로마토그래피 정제는 항-Abeta 항체 제제를 정제하는 데도 유용한 것으로 밝혀졌다. 1.6 ×20cm 밴티지 칼럼(공급원: 밀리포어)을 200mM 2가 인산나트륨(pH 9.0) 속에서 마크로-프렙 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 II(입자 크기: 40㎛, 공급원: 바이오래드)으로 충전시킨다. 칼럼을 3칼럼 용량의 평형화 완충액 1(300mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)과 5칼럼 용량의 평형화 완충액 2(50mM NaCl, 5mM 인산나트륨, pH 6.8)로 평형화한다. 항-Abeta 항체 제제를 50mM NaCl과 5mM 인산나트륨을 함유하는 완충액(pH 6.8)으로 완충액 교환한 후, 칼럼에 로딩시킨다. 칼럼을 5칼럼 용량의 세척 완충액(50mM NaCl, 5mM 인산나트륨, pH 6.8)으로 세척한 후, 15칼럼 용량의 완충액(5mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)으로 구배 용출시킨다. 칼럼을 스트립 완충액(300mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)으로 스트립핑한 후, 재생 완충액(500mM 인산칼륨, 1.0M NaOH)으로 재생시킨다. 모든 유량은 2.5 내지 3cm/분에서 유지시킨다. 칼럼 용출액을 HPLC 시스템을 사용하여 SEC-HPLC로 분석한다.
도 4에 도시되어 있는 바와 같이, cHA 정제는 HMWA를 항-Abeta 항체 제제로부터 제거하는 데도 성공적이다. 로딩시 HMWA 농도는 2.6%였지만, cHA 용출물 속의 HMWA 농도는 0.0%이다.
실시예 8: 정제된 Myo-29 항체의 활성 평가
실시예 1에 기재된 방법에 따라서 정제된 항-GDF-8 항체 Myo-29를 경쟁적 효소면역측정법(ELISA)을 사용하여 결합 활성에 대해 평가한다. 경쟁적 ELISA는 정제된 다른 항체의 결합 활성을 시험하기 위해 변형될 수 있다[참조: Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]. A GDF-8 수용체, ActRIIβ.Fc(2㎍/ml)을 96웰 마이크로적정 플레이트에 100㎕/웰의 용량으로 흡착시킨다. 그 다음, 플레이트를 2 내지 8℃에서 밤새 항온처리한다. 플레이트를 세척 완충액(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.05% Tween 20)으로 세척하고 4% 소 혈청 알부민(BSA) 용액으로 차단하여 비특이성 결합을 최소화한다. 플레이트를 실온에서 1.5 내지 3.0시간 동안 항온처리하고 세척 완충액(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.05% Tween 20)으로 2회 세척한다.
Myo-29 항체 참조 표준물을 연속적으로 분석 희석제(0.5% BSA, 137mM NaCl, 2.7mM KCl)로 4배 희석하여 총 8개의 표준점을 생성시킨다. 시험 샘플은 단백질 A 크로마토그래피 단계에 의해 정제된 Myo-29 항체 분획 및 추가의 cHA 정제 단계 후 정제된 분획을 함유한다. 이들 시험 샘플을 또한 연속적으로 분석 희석제로 2배 희석하여 표준 곡선 범위에 속하는 8개의 점을 생성시킨다. 표준물과 시험 샘플을 적합한 분석 웰에 50㎕/웰로 가한다. 바이오티닐화 경쟁자, 비오틴 표지된 GDF-8(50ng/ml)을 각각의 웰에 50㎕/웰로 가한다. 플레이트를 실온에서 플레이트 진탕기 위에서 밤새 항온처리한다.
플레이트를 세척 완충액(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.05% Tween 20)으로 4회 세척하고, 스트렙타비딘(streptavidin) 공액 당근 퍼옥시다제(1:5,000; 공급원: 미국 알라바마주 버밍엄에 소재하는 서든 바이오텍(Southern Biotech))를 100㎕/웰로 가하여 결합하고 있는 비오틴 표지된 GDF-8을 검출한다. 플레이트를 실온에서 플레이트 진탕기에서 50 내지 70분 항온 처리한 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘[공급원: 미국 매릴랜드주 오윙즈 밀즈에 소재하는 바이오에프엑스(BioFX)]을 100㎕/웰로 가하여 전개시킨다. 각각의 웰에 대한 흡광도를 450nm에서 ELISA 플레이트 판독기[공급원: 미국 캘리포니아주 서니베일에 소재하는 몰레귤러 디바이시즈(Molecular Devices)]를 사용해서 측정한다. 시험 샘플 속의 활성 Myo-29의 양은 분석시 생성된 신호에 반비례한다. 0.18M H2SO4 100㎕/웰을 가하여 반응을 중단시킨다.
시험 샘플 속의 비오티닐화 GDF-8에 결합할 수 있는 Myo-29의 농도는 4파라미터 논리식을 사용하여 작성된 표준 곡선으로부터 내삽된다. 이어서, 활성 단백질 농도(ELISA로 측정)를 총 단백질 농도(A280으로 측정)로 나누고 당해 비에 100을 곱하여 시험 샘플의 생활성치(활성 단백질(%))를 계산한다. 동일한 샘플을 별개의 배치로 정제하는 경우, 평균 생활성치가 계산화된다. 생활성치를 표 8에 보고한다.
항-GDF-8 항체 결합 활성(활성 단백질(%))
샘플 단백질 A 후정제 cHA 후정제
1 88 108
2 86 104
3 94 108
표 8에서 입증되는 바와 같이, Myo-29는 실시예 1에서 기재한 방법에 의해 정제된 후 GDF-8 결합능을 보유한다. 정제된 Myo-29의 결합 활성은 단백질 A 정제로부터 얻어진 피크 용출물 분획에서 다소 낮다. 그러나, 결합 활성은 실시예 1에서 기재한 추가의 cHA 정제 단계 이후에는 참조용 My0-29 항체를 초과한다.
실시예 9: 항-GDF-8 항체의 결합 방식과 통과 유동 방식의 조합 방식 cHA 정제
결합방식과 통과 유동 방식의 조합 방식의 세라믹 HA 크로마토그래피 정제가 또한 항-GDF-8 항체 제제를 정제하는 데 유용한 것으로 밝혀졌다. 아래 상술된 실험을 AKTA FPLC 시스템[공급원: 제너럴 일렉트릭(General Electric)]에서 수행한다. 1.1 ×21cm 밴티지 칼럼(공급원: 밀리포어)을 200mM 2가 인산나트륨(pH 9.0) 속에서 마크로-프렙 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 II(입자 크기: 40㎛, 공급원: 바이오래드)으로 충전시킨다. 칼럼을 3칼럼 용량의 평형화 완충액 1(300mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)과 5칼럼 용량의 평형화 완충액 2(50mM NaCl, 2.0mM 인산나트륨, 100mM 아르기닌, 100mM HEPES, pH 7.3)로 평형화한다. 항-GDF-8 항체 제제를 칼럼에 로딩율 20mg/ml로 로딩시킨다. 칼럼을 평형화 완충액 2로 세척하고, 스트립 완충액(300mM 인산나트륨, 1.0M NaCl, pH 6.8)으로 스트립핑한 후, 재생 완충액(500mM 인산칼륨, 1.0M NaOH, pH 13.3)으로 재생시킨다. 로딩 및 세척시 유량은 1.5cm/분이다. 칼럼 용출액을 HPLC 시스템을 사용하여 SEC-HPLC로 분석한다.
결과는 결합 방식과 통과 유동 방식의 조합 방식으로 cHA 유형 II 수지가 HMWA를 항체 제제로부터 제거하는 데 효과적으로 작용함을 입증한다. 제제는 초기에 27% HMWA(로딩시)를 함유하는데, 이는 본 발명의 cHA 정제방법을 사용하는 경우 1.1% HMWA(통과 유동 후)로 감소된다.
실시예 10: 유형 I 수지를 사용하여 항-GDF-8 항체의 결합 방식과 통과 유동 방식의 조합 방식의 cHA 정제
유형 I cHA 수지를 유형 II cHA 수지 대신에 사용하여 실시예 9에서 기재한 과정을 반복한다. 완충액 조건은 실시예 9에서 사용된 조건과 동일한데, 단 평형화 완충액 2가 5.0mM 인산나트륨, 100mM NaCl, 120mM 아르기닌 및 20mM HEPES로 이루어지고 pH가 7.3이다.
표 9에 나타낸 바와 같이, 결합 방식과 통과 유동 방식의 조합 방식의 cHA 유형 I 수지는 항체 단량체 수율을 유지하면서 HMWA를 항체 제제로부터 제거하는 데 효과적으로 작용한다. 또한, 결합 방식과 통과 유동 방식의 조합 방식은 단백질 A 불순물을 제거하는 데 효과적이다. 마지막으로, 유형 I cHA 수지는 증가된 로딩율 55mg/ml를 허용한다.
결합 방식과 통과 유동 방식과의 조합 방식으로 작동된 cHA 유형 I 수지로부터 얻어진 HMWA 제거율 및 항체 단량체 수율
샘플 HMWA(%) 단량체 수율(%) 단백질 A(ppm)
시행 1 로딩 27.0 NA 236
피크 0.9 75 3.3
시행 2 로딩 27.2 NA -
피크 0.7 78 -
실시예 11: cHA 완충액 조건의 대량 발굴 탐색
cHA 유형 I 수지를 사용하여 Myo-029 항체를 정제하는 데 사용되는 완충액 조건을 최적화하기 위해서 대량 발굴 탐색을 수행한다. 검색은 cHA-유형 1 수지에서의 인산나트륨, 염화나트륨, 아르기닌 및 Myo-029의 농도를 변화시키고 Myo-029와 고분자량 응집체(HMWA)의 수지에 대한 결합 정도를 조사한다.
cHA 유형 I 수지(50㎕)를 96웰 필터 플레이트의 각각의 웰에 가한다. 표 10 내지 표 12에서 A1, A2...H11, H12로 표지된 각각의 웰을 20mM HEPES(pH 7.2)와 인산염(표 10), 염화나트륨(표 11) 및 아르기닌(표 12)의 특별한 배합물로 이루어진 평형화 완충액으로 평형화시킨다.
각 웰의 포스페이트 농도
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1mM 1mM 1mM 6mM 5mM 4mM 1mM 1mM 1mM 3mM 2mM 1mM
B 1mM 1mM 1mM 6mM 5mM 4mM 1mM 1mM 1mM 3mM 2mM 1mM
C 1mM 1mM 1mM 6mM 5mM 4mM 1mM 1mM 1mM 3mM 2mM 1mM
D 1mM 1mM 1mM 6mM 5mM 4mM 1mM 1mM 1mM 3mM 2mM 1mM
E 2mM 3mM 4mM 8mM 10mM 16mM 2mM 3mM 4mM 5mM 6mM 8mM
F 2mM 3mM 4mM 8mM 10mM 16mM 2mM 3mM 4mM 5mM 6mM 8mM
G 2mM 3mM 4mM 8mM 10mM 16mM 2mM 3mM 4mM 5mM 6mM 8mM
H 2mM 3mM 4mM 8mM 10mM 16mM 2mM 3mM 4mM 5mM 6mM 8mM
각 웰의 NaCl 농도
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 25mM 25mM 25mM 25mM 25mM 25mM 750mM 625mM 500mM 500mM 400mM 300mM
B 25mM 25mM 25mM 25mM 25mM 25mM 750mM 625mM 500mM 500mM 400mM 300mM
C 50mM 100mM 200mM 50mM 100mM 200mM 1,250mM 1,750mM 2,500mM 600mM 800mM 1,000mM
D 50mM 100mM 200mM 50mM 100mM 200mM 1,250mM 1,750mM 2,500mM 600mM 800mM 1,000mM
E 25mM 25mM 25mM 25mM 25mM 25mM 750mM 625mM 500mM 500mM 400mM 300mM
F 25mM 25mM 25mM 25mM 25mM 25mM 750mM 625mM 500mM 500mM 400mM 300mM
G 50mM 100mM 200mM 50mM 100mM 200mM 1,250mM 1,750mM 2,500mM 600mM 800mM 1,000mM
H 50mM 100mM 200mM 50mM 100mM 200mM 1,250mM 1,750mM 2,500mM 600mM 800mM 1,000mM
각 웰의 아르기닌 농도
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 350mM 300mM 200mM 12mM 12mM 12mM 12mM 12mM 12mM 75mM 50mM 25mM
B 450mM 500mM 600mM 40mM 120mM 200mM 40mM 120mM 200mM 125mM 150mM 300mM
C 350mM 300mM 200mM 12mM 12mM 12mM 12mM 12mM 12mM 75mM 50mM 25mM
D 450mM 500mM 600mM 40mM 120mM 200mM 40mM 120mM 200mM 125mM 150mM 300mM
E 350mM 300mM 200mM 12mM 12mM 12mM 12mM 12mM 12mM 75mM 50mM 25mM
F 450mM 500mM 600mM 40mM 120mM 200mM 40mM 120mM 200mM 125mM 150mM 300mM
G 350mM 300mM 200mM 12mM 12mM 12mM 12mM 12mM 12mM 75mM 50mM 25mM
H 450mM 500mM 600mM 40mM 120mM 200mM 40mM 120mM 200mM 125mM 150mM 300mM
특별한 평형화 완충액을 각각의 웰에 가한 후, Myo-029와 응집체와의 혼합물을 각각의 웰에 가하다. 해당 로딩율에서의 응집체 농도는 25%이다. 완충액 구성요소는 평형화 동안의 농도와 동일한 농도로 유지된다. 물질을 20분 동안 진탕시켜 평형에 이르도록 한다. 상청액을 필터플레이트의 각각의 웰로부터 제거한다. 항체 제제의 첨가 단계를 한번 더 수행하고, 플레이트를 진탕시키고, 상청액을 제거한다. 7개 이하의 단계가 수행된다. 각 단계에서 결합하지 않은 단백질을 분석하여 전체 단백질 농도를 (280nm에서의 흡광도에 의해) 측정한다. 단량체와 응집체의 양을 크기 배제 HPLC로 측정한다. 응집체의 감소는 정제에 이바지하는 조건을 나타낸다. 표 13과 표 14는 첫번째 4개 단계의 풀에서의 웰당 응집체와 단량체의 농도를 나타낸다.
응집체 농도(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 8% 6% 3% 4% 7% 16% 3% 3% 3% 5% 3% 3%
B 12% 15% 17% 3% 3% 5% 3% 4% 4% 6% 5% 5%
C 7% 6% 3% 4% 4% 3% 5% 4% 4% 6% 6% 4%
D 13% 14% 14% 6% 4% 7% 5% 6% 4% 8% 8% 7%
E 11% 10% 6% 4% 19% 11% 5% 6% 7% 9% 8% 6%
F 15% 19% 20% 4% 3% 10% 6% 8% 10% 10% 10% 17%
G 10% 9% 6% 6% 3% 7% 8% 14% 17% 10% 16% 22%
H 16% 18% 20% 4% 5% 17% 9% 15% 17% 10% 17% 18%
단량체 회수율(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 51% 44% 24% 3% 3% 2% 43% 34% 25% 53% 32% 11%
B 64% 70% 78% 4% 24% 43% 42% 40% 38% 57% 42% 44%
C 49% 43% 27% 4% 6% 23% 60% 62% 62% 58% 60% 48%
D 65% 68% 75% 5% 35% 54% 61% 64% 64% 63% 63% 62%
E 61% 58% 44% 3% 3% 5% 58% 62% 64% 66% 65% 63%
F 70% 76% 88% 5% 33% 63% 59% 63% 68% 67% 68% 74%
G 57% 57% 50% 4% 7% 65% 72% 82% 85% 70% 80% 83%
H 71% 75% 85% 5% 48% 75% 69% 82% 88% 71% 80% 87%
대량 발굴 탐색은 칼럼 정제 계획에서의 단량체 회수율 및 HMWA 제거율을 정량적으로 예측할 수 있다. 예를 들면, 웰 C8로부터 얻어진 조건(20mM HEPES, 1mM 인산염, 1750mM NaCl 및 12mM 아르기닌, pH 7.2)을 cHA 유형 I 수지로 충전된 칼럼에서 시험한다. 칼럼 정제 후, 응집체량은 2.5%로 감소했고 단량체 수율은 72%였다. 웰 D5로부터 얻어진 조건(20mM HEPES, 5mM 인산염, 100mM NaCl 및 120mM 아르기닌, pH 7.2)을 cHA 유형 I 수지로 충전된 칼럼에서 시험한다. 칼럼 정제 후, 응집체량은 0.7%로 감소했고 단량체 수율은 73%였다. 마지막으로, 웰 C3에 해당하는 조건(100mM HEPES, 1mM 인산염, 120mM NaCl 및 200mM 아르기닌, pH 7.2; 여기서, 높은 수준의 HEPES는 NaCl과 유사하게 이온 강도에 기여한다)을 cHA 유형 I 수지로 충전된 칼럼에서 시험한다. 칼럼 정제 후, 응집체량은 4%로 감소했고 단량체 회수율은 69%였다. 이들 결과는 대량 발굴 탐색이 단량체 회수율과 HMWA 제거율에 의해 측정된 칼럼 성능을 과소평가함을 입증한다. 그러나, 대량 발굴 탐색은 수율과 순도를 정량적으로 예측할 수 있다.
본원에 언급된 모든 참조문헌은 각각의 개별 공보 또는 특허 또는 특허원이 모든 목적용으로 구체적이고 개별적으로 참고로 인용되는 것처럼 동일한 정도로 모든 목적용으로 본원에 참고로 인용된다. 참고로 인용된 공보 및 특허 또는 특허원이 명세서에 포함된 기재내용을 반박할 정도로 명세서는 이러한 반박 내용을 능가하여 우위를 점한다.
본 명세서와 청구의 범위에서 사용되는 성분의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 수는 용어 "약"에 의해 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 수적인 파라미터는 본 발명에 의해 얻고자 하는 목적하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 어쨌든, 각각의 수적인 파라미터는 청구의 범위에 대한 등가물의 원칙의 적용을 제한하려는 시도로서가 아니라 유효한 아라비아 숫자와 통상의 선회 근사(rounding approach) 면에서 이해되어야 한다.
당해 기술분야의 숙련인에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 본 발명의 다수의 변경 및 변형이 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 특정 양태들은 단지 예로서 제공된 것이지 어떤 식으로든 제한하려는 의미는 없다. 명세서 및 실시예는 단지 예시로서 간주되어야 하며, 본 발명의 진정한 범위 및 정신은 다음 청구의 범위에 나타내고자 한다.

Claims (117)

  1. (a) 항체 제제를 하이드록시아파타이트 수지와 접촉시키고, 정제된 항체를, 1 내지 20mM 인산나트륨과 0.2 내지 2.5M NaCl을 포함하는 하나 이상의 용출 완충액으로 용출시키거나,
    (b) 1 내지 20mM 인산나트륨과 0.2 내지 2.5M NaCl을 포함하는 로딩 완충액 속에서 하이드록시아파타이트 수지를 항체 제제와 접촉시키고, 정제된 항체를 칼럼을 통해 유동시킴을 포함하여, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 5% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 1% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 용출 완충액 또는 로딩 완충액(loading buffer)이 pH가 6.4 내지 7.6인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 용출 완충액 또는 로딩 완충액이 3mM 또는 5mM 인산나트륨을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 용출 완충액 또는 로딩 완충액이 1M 또는 0.35M NaCl을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 용출 완충액 또는 로딩 완충액이 pH가 6.8 내지 7.2인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 항체가 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 항체가 단클론성, 다클론성, 키메라, 인간화 항체 또는 이들의 단편인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 항체가 항-IL-21 수용체, 항-GDF-8, 항-Abeta, 항-CD22, 항-루이스 Y, 항-lL-13 또는 항-IL-22 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제 제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 항체가 염기성 pl을 갖는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I 또는 유형 II인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 정제된 항체가 300ppm 미만의 단백질 A를 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  15. 항체 제제를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(a), 이온 교환 크로마토그래피(b) 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(c)에 적용함을 포함하여, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법으로서,
    (i) 정제된 항체를, 1 내지 20mM 인산나트륨과 0.2 내지 2.5M NaCl을 포함하 는 하나 이상의 용출 완충액을 사용하여 하이드록시아파타이트 수지로부터 용출시키거나,
    (ii) 1 내지 20mM 인산나트륨과 0.2 내지 2.5M NaCl을 포함하는 로딩 완충액 속에서 하이드록시아파타이트 수지를 항체 제제와 접촉시키고, 정제된 항체를 칼럼을 통해 유동시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 먼저 수행되고 하이드록시아파타이트 크로마토그래피가 마지막으로 수행되는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 5% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 1% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  19. 제15항에 있어서, 용출 완충액 또는 로딩 완충액이 pH가 6.4 내지 7.6인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 용출 완충액 또는 로딩 완충액이 3mM 또는 5mM 인산나트륨 을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 용출 완충액 또는 로딩 완충액이 1M 또는 0.35M NaCl을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 용출 완충액 또는 로딩 완충액이 pH가 6.8 또는 7.2인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  23. 제15항에 있어서, 항체가 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  24. 제15항에 있어서, 항체가 단클론성, 다클론성, 키메라, 인간화 항체 또는 이들의 단편인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  25. 제15항에 있어서, 항체가 항-IL-21 수용체, 항-GDF-8, 항-Abeta, 항-CD22, 항-루이스 Y, 항-lL-13 또는 항-IL-22 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  26. 제15항에 있어서, 항체가 염기성 pl을 갖는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  27. 제15항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I 또는 유형 II인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  29. 제15항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  30. 제15항에 있어서, 정제된 항체가 300ppm 미만의 단백질 A를 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  31. (a) 항체 제제를 단백질 A 담체(support)와 접촉시키고,
    (b) 항체를 단백질 A 담체에 흡착시키고,
    (c) 단백질 A 담체와 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 세척 완충액으로 세척하고,
    (d) 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 용출 완충액으로 용출시키고,
    (e) 단백질 A 용출액을 이온 교환 담체와 접촉시키고,
    (f) 항체를 담체를 통해 유동시키고,
    (g) 이온 교환 담체를 하나 이상의 이온 교환 세척 완충액으로 세척하고,
    (h) 이온 교환 담체 통과 유동물을 하이드록시아파타이트 수지와 접촉시키고,
    (i) 항체를 수지에 흡착시키고,
    (j) 수지를 하나 이상의 하이드록시아파타이트 세척 완충액으로 세척하고,
    (k) 정제된 항체를, 1 내지 20mM 인산나트륨과 0.2 내지 2.5M NaCl을 포함하는 하나 이상의 하이드록시아파타이트 용출 완충액으로 수지로부터 용출시킴을 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 5% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 1% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  34. 제31항에 있어서, 하나 이상의 하이드록시아파타이트 용출 완충액이 pH가 6.4 내지 7.6인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 하나 이상의 하이드록시아파타이트 용출 완충액이 3mM 또는 5mM 인산나트륨을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 하나 이상의 하이드록시아파타이트 용출 완충액이 0.35M 또는 1.0M NaCl을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  37. 제34항에 있어서, 하나 이상의 하이드록시아파타이트 용출 완충액이 pH가 6.8 또는 7.2인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  38. 제31항에 있어서, 항체가 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  39. 제31항에 있어서, 항체가 단클론성, 다클론성, 키메라, 인간화 항체 또는 이들의 단편인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  40. 제31항에 있어서, 항체가 항-IL-21 수용체, 항-GDF-8, 항-Abeta, 항-CD22, 항-루이스 Y, 항-lL-13 또는 항-IL-22 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  41. 제31항에 있어서, 항체가 염기성 pl을 갖는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  42. 제31항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I 또는 유형 II인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  44. 제31항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방 법.
  45. 제31항에 있어서, 하이드록시아파타이트 수지에 가하기 전에 이온 교환 담체 통과 유동물을 여과하여 바이러스 오염물을 감소시킴을 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  46. 제31항에 있어서, 하이드록시아파타이트 용출액을 한외여과 및 투석여과 중의 하나 이상에 적용함을 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  47. 제31항에 있어서, 정제된 항체가 300ppm 미만의 단백질 A를 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  48. (a) 항체 제제를 단백질 A 담체와 접촉시키고,
    (b) 항체를 단백질 A 담체에 흡착시키고,
    (c) 단백질 A 담체와 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 세척 완충액으로 세척하고,
    (d) 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 용출 완충액으로 용출시키고,
    (e) 단백질 A 용출액을 이온 교환 담체와 접촉시키고,
    (f) 항체를 이온 교환 담체를 통해 유동시키고,
    (g) 이온 교환 담체를 하나 이상의 이온 교환 세척 완충액으로 세척하고,
    (h) 이온 교환 담체 통과 유동물을 1 내지 20mM 인산나트륨과 0.2 내지 2.5M NaCl을 포함하는 로딩 완충액으로 치환하고,
    (i) 이온 교환 담체 통과 유동물을 하이드록시아파타이트 수지와 접촉시키고,
    (j) 항체를 하이드록시아파타이트 수지를 통해 유동시키고,
    (k) 하이드록시아파타이트 수지를 하나 이상의 하이드록시아파타이트 세척 완충액으로 세척함을 포함하여, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 5% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 1% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  51. 제48항에 있어서, 로딩 완충액이 pH가 6.4 내지 7.6인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 로딩 완충액이 5mM 인산나트륨을 함유하는, 고분자량 응집 체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 로딩 완충액이 350mM NaCl을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  54. 제51항에 있어서, 로딩 완충액이 pH가 6.8인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  55. 제48항에 있어서, 항체가 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  56. 제48항에 있어서, 항체가 단클론성, 다클론성, 키메라, 인간화 항체 또는 이들의 단편인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  57. 제48항에 있어서, 항체가 항-IL-21 수용체, 항-GDF-8, 항-Abeta, 항-CD22, 항-루이스 Y, 항-lL-13 또는 항-IL-22 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  58. 제48항에 있어서, 항체가 염기성 pl을 갖는, 고분자량 응집체를 함유하는 항 체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  59. 제48항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I 또는 유형 II인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  61. 제48항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  62. 제48항에 있어서, 하이드록시아파타이트 수지에 가하기 전에 이온 교환 담체 통과 유동물을 여과하여 바이러스 오염물을 감소시킴을 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  63. 제48항에 있어서, 하이드록시아파타이트 통과 유동물을 한외여과 및 투석여과 중의 하나 이상에 적용시킴을 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  64. 제48항에 있어서, 정제된 항체가 300ppm 미만의 단백질 A를 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  65. (a) 하이드록시아파타이트 수지를, 1 내지 20mM 인산나트륨과 0.01 내지 2.0M NaCl을 포함하는 하나 이상의 평형화 완충액으로 평형화시키고,
    (b) 항체 제제를 단량체와 고분자량 응집체를 결합시키는 조건하에 하이드록시아파타이트 수지와 접촉시키고,
    (c) 고분자량 응집체를 항체 단량체보다 단단하게 결합시키고, 로딩이 계속됨에 따라 고분자량 응집체가 결합된 단량체를 치환하고,
    (d) 치환된 단량체를 수집함을 포함하여, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 5% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  67. 제65항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 1% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  68. 제65항에 있어서, 평형화 완충액이 pH가 6.2 내지 8.0인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 평형화 완충액이 2mM 또는 5mM 인산나트륨을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  70. 제68항에 있어서, 평형화 완충액이 50mM 또는 100mM NaCl을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  71. 제68항에 있어서, 평형화 완충액이 pH가 7.3인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  72. 제68항에 있어서, 평형화 완충액이 200mM 이하의 아르기닌 또는 HEPES를 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  73. 제68항에 있어서, 평형화 완충액이 100mM 또는 120mM 아르기닌과 20mM HEPES를 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  74. 제65항에 있어서, 항체가 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 항체인, 고분자량 응 집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  75. 제65항에 있어서, 항체가 단클론성, 다클론성, 키메라, 인간화 항체 또는 이들의 단편인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  76. 제65항에 있어서, 항체가 항-IL-21 수용체, 항-GDF-8, 항-Abeta, 항-CD22, 항-루이스 Y, 항-lL-13 또는 항-IL-22 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  77. 제65항에 있어서, 항체가 염기성 pl을 갖는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  78. 제65항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I 또는 유형 II인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  80. 제65항에 있어서, 정제된 항체가 300ppm 미만의 단백질 A를 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  81. 항체 제제를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(a), 이온 교환 크로마토그래피(b) 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(c)에 적용함을 포함하여, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법으로서,
    (i) 하이드록시아파타이트 수지를, 1 내지 20mM 인산나트륨과 0.01 내지 2.0M NaCl을 포함하는 하나 이상의 평형화 완충액으로 평형화시키고,
    (ii) 항체 제제를 단량체와 고분자량 응집체를 결합시키는 조건하에 하이드록시아파타이트 수지와 접촉시키고,
    (iii) 고분자량 응집체를 항체 단량체보다 단단하게 결합시키고, 로딩이 계속됨에 따라 고분자량 응집체가 결합된 단량체를 치환하고,
    (iv) 치환된 단량체를 수집하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 먼저 수행되고 하이드록시아파타이트 크로마토그래피가 마지막으로 수행되는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  83. 제81항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 5% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  84. 제81항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 1% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  85. 제81항에 있어서, 평형화 완충액이 pH가 6.2 내지 8.0인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 평형화 완충액이 2mM 또는 5mM 인산나트륨을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  87. 제85항에 있어서, 평형화 완충액이 100mM 또는 50M NaCl을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  88. 제85항에 있어서, 용출 완충액 또는 로딩 완충액이 pH가 7.3인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  89. 제85항에 있어서, 평형화 완충액이 200mM 이하의 아르기닌 또는 HEPES를 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  90. 제85항에 있어서, 평형화 완충액이 100mM 또는 120mM 아르기닌과 100mM 또는 20mM HEPES를 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  91. 제81항에 있어서, 항체가 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  92. 제81항에 있어서, 항체가 단클론성, 다클론성, 키메라, 인간화 항체 또는 이들의 단편인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  93. 제81항에 있어서, 항체가 항-IL-21 수용체, 항-GDF-8, 항-Abeta, 항-CD22, 항-루이스 Y, 항-lL-13 또는 항-IL-22 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  94. 제81항에 있어서, 항체가 염기성 pl을 갖는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  95. 제81항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I 또는 유형 II 인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  97. 제81항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  98. 제81항에 있어서, 정제된 항체가 300ppm 미만의 단백질 A를 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  99. (a) 항체 제제를 단백질 A 담체와 접촉시키고,
    (b) 항체를 단백질 A 담체에 흡착시키고,
    (c) 단백질 A 담체와 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 세척 완충액으로 세척하고,
    (d) 흡착된 항체를 하나 이상의 단백질 A 용출 완충액으로 용출시키고,
    (e) 단백질 A 용출물을 이온 교환 담체와 접촉시키고,
    (f) 항체를 이온 교환 담체를 통해 유동시키고,
    (g) 이온 교환 담체를 하나 이상의 이온 교환 세척 완충액으로 세척하고,
    (h) 하이드록시아파타이트 수지를, 1 내지 20mM 인산나트륨과 0.01 내지 2.0M NaCl을 포함하는 하나 이상의 평형화 완충액으로 평형화시키고,
    (i) 이온 교환 담체 통과 유동물을 단량체와 고분자량 응집체를 결합시키는 조건하에 하이드록시아파타이트 수지와 접촉시키고,
    (j) 고분자량 응집체를 항체 단량체보다 단단하게 결합시키고 로딩이 계속됨에 따라 고분자량 응집제가 결합된 단량체를 치환하고,
    (k) 하이드록시아파타이트 수지를 하나 이상의 하이드록시 세척 완충액으로 세척하고,
    (l) 치환된 단량체를 수집함을 포함하여, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  100. 제99항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 5% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  101. 제99항에 있어서, 정제된 항체가 고분자량 응집체를 1% 미만으로 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  102. 제99항에 있어서, 평형화 완충액이 pH가 6.2 내지 8.0인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  103. 제102항에 있어서, 평형화 완충액이 2mM 또는 5mM 인산나트륨을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  104. 제102항에 있어서, 평형화 완충액이 100mM 또는 50M NaCl을 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  105. 제102항에 있어서, 평형화 완충액이 pH가 7.3인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  106. 제102항에 있어서, 평형화 완충액이 200mM 이하의 아르기닌 또는 HEPES를 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  107. 제102항에 있어서, 평형화 완충액이 100mM 또는 200mM 아르기닌과 100mM 또는 20mM HEPES를 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  108. 제99항에 있어서, 항체가 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  109. 제99항에 있어서, 항체가 단클론성, 다클론성, 키메라, 인간화 항체 또는 이들의 단편인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  110. 제99항에 있어서, 항체가 항-IL-21 수용체, 항-GDF-8, 항-Abeta, 항-CD22, 항-루이스 Y, 항-lL-13 또는 항-IL-22 항체인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  111. 제99항에 있어서, 항체가 염기성 pl을 갖는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  112. 제99항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I 또는 유형 II인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  113. 제112항에 있어서, 수지가 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 I인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  114. 제99항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피 인, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  115. 제99항에 있어서, 하이드록시아파타이트 수지에 가하기 전에 이온 교환 담체 통과 유동물을 여과하여 바이러스 오염물을 감소시킴을 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  116. 제99항에 있어서, 하이드록시아파타이트 용출액을 한외여과 및 투석여과 중의 하나 이상에 적용함을 추가로 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
  117. 제99항에 있어서, 정제된 항체가 300ppm 미만의 단백질 A를 함유하는, 고분자량 응집체를 함유하는 항체 제제로부터 하나 이상의 항체를 정제하는 방법.
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