JP4960560B2 - 標的核酸配列の検出法 - Google Patents

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Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、標的核酸配列の検出または測定法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＤＮＡ複製、組換え、および修復の忠実度は、ゲノム安定性の維持に必須であり、これら全ての過程が全ての生物に存在する５’→３’エキソヌクレアーゼ酵素に依存する。ＤＮＡ修復には、これらの酵素が損傷フラグメントの切り出しおよび組換えによるミスマッチの修正に必要である。複製には、これらのヌクレアーゼは、ラギング鎖のＤＮＡ合成中の岡崎フラグメントの有効な処理に重要である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでは、この後者の活性は、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）によって得られ、ＰｏｌＩ５’→３’エキソヌクレアーゼドメイン中の不活化変異を有するＥ．ｃｏｌｉ株は、岡崎フラグメントを処理する能力がないために生存不可能である。しかし、真核生物のＤＮＡポリメラーゼは、内因性５’→３’エキソヌクレアーゼドメインを欠き、この重要な活性は、５’ＤＮＡフラップのエンドヌクレアーゼとしても作用する複合作用性構造特異性金属ヌクレアーゼＦＥＮ−１（５’エキソヌクレアーゼ１またはフラップエンドヌクレアーゼ１）によって得られる（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ａ、Ｃｅｌｌ、９５、１３５で概説）。
【０００３】
酵素が標識核酸フラグメントを生成する核酸の検出および／または測定法は当該分野で公知である。
【０００４】
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号は、５’標識標的ＤＮＡをＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離したＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）および所望の切断点で配列にハイブリッド形成することができる部分的相補オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションして標的ＤＮＡ分子を切断する方法を開示している。部分的相補オリゴヌクレオチドにより、所望の切断部位と反対に３’伸長する二重鎖を含む基質構造の形成を介してＴａｑポリメラーゼに標的ＤＮＡが指向されて、オリゴヌクレオチドの非相補領域から３’アームが得られ、基質分子の非アニーリング５’領域から５’アームが得られる。部分的相補オリゴヌクレオチドには、短いヘアピンを形成することができる３’ヌクレオチド伸長が含まれる。標識フラグメントの放出は、Ｔａｑポリメラーゼによる切断後に検出される。
【０００５】
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号は、合成活性および野生型熱安定性ヌクレアーゼ活性をほとんど含まないか該活性が検出不可能な変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの生成を開示している。変異体ポリメラーゼは、５’→３’合成活性を欠くので有用であるといわれている。したがって、合成活性は検出アッセイにおけるＤＮＡ切断と組み合わせた際の望ましくない副作用である。
【０００６】
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号は、合成活性を欠く野生型Ｔａｑポリメラーゼまたは変異体Ｔａｑポリメラーゼはヘアピン構造の３’に結合するプライマーの存在下での熱変性および冷却によって形成された５’末端標識ヘアピン構造の切断によって標識フラグメントを放出することができることを開示している。さらに、米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号は、合成活性を欠く変異体Ｔａｑポリメラーゼはヘアピン構造の３’アームに結合するプライマーの非存在下でもこのヘアピン構造を切断することができることを教示している。
【０００７】
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号はまた、合成活性を欠く変異体Ｔａｑポリメラーゼによってヘパリン構造の３’アームが結合するプライマーの存在下でのこのヘパリン構造の切断により１種類の標識切断産物が得られる一方で、野生型Ｔａｑ酵素の高レベルの合成活性のために野生型Ｔａｑポリメラーゼは複数の切断産物を生成し、ｄＮＴＰの存在下でヘアピンン構造が二本鎖形態に変換されることを開示している。
【０００８】
核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、一定の核酸の複製を減少させることができる。核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の非存在下で核酸切断反応を使用したシグナルの発生法も当該分野で必要とされている。
【０００９】
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号はまた、野生型ではなく合成活性の減少を示す変異体Ｔａｑポリメラーゼは、５’末端標識標的核酸および標的核酸の５’および３’領域がオリゴヌクレオチドとアニーリングせずに一本鎖を維持するように標的核酸の一部にハイブリッド形成している相補オリゴヌクレオチドを含む線状核酸基質の切断により１つの標識フラグメントを放出することができることを開示している。
【００１０】
核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の非存在下で核酸切断反応を使用して、ヌクレアーゼ夾雑物から生成され得るオリゴヌクレオチドフラグメントとは容易に区別することができる別のサイズのシグナルの発生法が当該分野で必要とされている。
【００１１】
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号はまた、天然に存在する二次構造での標識核酸基質の切断法を開示している。この方法によれば、ビオチン標識ＤＮＡ基質をＰＣＲによって調製し、野生型ＴａｑポリメラーゼまたはＣｌｅａｖａｓｅＢＮ（合成活性および野生型５’→３’ヌクレアーゼ活性が減少した変異体Ｔａｑポリメラーゼ）と混合し、９５℃で５秒間インキュベートして基質を変性させ、その後即座に６５℃に冷却し、相補塩基間の鎖内水素結合の形成によってＤＮＡの固有の二次構造を想定する。反応混合物を６５℃でインキュベートして切断し、ビオチン化切断産物を検出する。
【００１２】
切断構造を二次構造領域に含める必要のない核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の非存在下での核酸切断反応を使用したシグナルの発生法が当該分野で必要とされている。
【００１３】
ＦＥＮ−１酵素を使用して標識核酸フラグメントを生成する核酸の検出および／または測定法は当該分野で公知である。
【００１４】
米国特許第５，８４３，６６９号は、合成活性の減少を示す変異体Ｔａｑポリメラーゼの存在下または非存在下で熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼを使用した切断酵素フラグメント長多形分析による多形検出法を開示している。本方法によれば、二本鎖Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ反応において５’末端標識プライマー（ＴＭＲ蛍光色素で標識）を使用して標識する。ＴＭＲ標識ＰＣＲ産物を、９５℃への加熱によって変性し、５５℃に冷却して切断構造を作製する。米国特許第５，８４３，６６９号は、切断構造は二次構造を含む一本鎖核酸基質領域を含むことを開示している。ＣｌｅａｖａｓｅＢＮヌクレアーゼ、古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＦＥＮ−１ヌクレアーゼ、またはその両方の酵素の存在下で切断する。標識反応産物をゲル電気泳動で視覚化し、蛍光画像処理を行う。米国特許第５，８４３，６６９号は、ＣｌｅａｖａｓｅＢＮヌクレアーゼおよびＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＦＥＮ−１ヌクレアーゼにより容易に相互が識別される切断パターンが得られ、両酵素を含む反応由来の切断パターンにはそれぞれの酵素での切断によって得られるパターンのエレメントを含むが各酵素によって得られた単なる切断パターン複合物ではないことを開示する。これは、１つの酵素によって切断されていない（そして、この酵素パターンでのバンドとして認められる）フラグメントのいくつかを、同一の反応混合物で第２の酵素によって切断することができることを示す。
【００１５】
Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらは、標的ＤＮＡ領域に部分的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの重複対を標的ＤＮＡと混合して５’フラップ領域を形成し、熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼによる標識下流プローブの切断によって標識切断産物が得られる、ＤＮＡの検出法を開示している。Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらはまた、切断シグナルを増幅してアトモル以下のレベルで標的ＤＮＡを定量的に検出することができる、下流オリゴヌクレオチドプローブの複数のコピーを熱サイクリングの非存在下で１つの標的配列について切断することができる反応条件を開示している（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７、２９２）。
【００１６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、および同第４，８００，１５９号で開示されている。その最も単純な形態では、ＰＣＲは反対の鎖とハイブリッド形成し、標的ＤＮＡ中の目的の領域に隣接する２つのオリゴヌクレオチドを使用したインビトロでの特異的ＤＮＡ配列の酵素合成法である。テンプレートの変性、プライマーのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングしたプライマーの伸長を含む連続した一連の反応工程により、末端がプライマーの５’末端によって特徴づけられた特定のフラグメントが指数関数的に蓄積される。ＰＣＲにより１０９の特定のＤＮＡ配列の選択的富化が可能であると報告されている。ＰＣＲ法はまた、Ｓａｉｋｉら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、１３５０に記載されている。
【００１７】
ＰＣＲ技術は非常に強力な核酸配列増幅法であるが、増幅物質の検出には標的ＤＮＡが存在するかどうかを同定するためのさらなる操作およびＰＣＲ産物の操作が必要である。増幅物質の検出に現在必要とされるその後の操作工程数を減少させることが望ましい。標的配列が増幅している間にシグナルが発生するアッセイ系では、増幅工程でシグナルを発生しないＰＣＲと比較して増幅物質の検出に必要な操作工程はより少ない。
【００１８】
米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，４８７，９７２号は、増幅すべき核酸、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼ、増幅領域に相補的な領域を含む５’、３’、または５’および３’末端標識プローブ、ならびにさらなる非相補性５’テール領域の存在下でのＰＣＲ反応の増幅工程中にシグナルを発生する工程を包含するＰＣＲベースの標識プローブ放出アッセイを開示している。米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，４８７，９７２号は、Ｔａｑポリメラーゼが重合依存様式（例えば、ｄＮＴＰの存在下）で上流プローブによって標識プローブ付近に位置付けられた場合、このＰＣＲベースのアッセイによりハイブリッド形成プローブの５’標識末端を遊離することができることをさらに開示している。
【００１９】
複数の工程を必要としない標的核酸配列の検出または測定法が当該分野で必要とされている。
【００２０】
増幅処理過程後に複数の工程を必要としない標的核酸配列のＰＣＲ検出または測定処理過程もまた当該分野で必要とされている。
【００２１】
サンプル中の標的核酸配列の同時増幅および検出が可能な標的核酸配列のＰＣＲ検出または測定処理過程もまた当該分野で必要とされている。
【００２２】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼの存在下でＰＣＲ処理を行う標的核酸配列のＰＣＲ検出または測定処理過程もまた当該分野で必要とされている。
【００２３】
（発明の要約）
本発明は、標的核酸配列を含むサンプルと核酸ポリメラーゼとのインキュベーションによって切断構造を形成させる工程と、前記切断構造をＦＥＮヌクレアーゼで切断してシグナルを発生させる工程とを包含し、前記シグナルの発生がサンプルにおける標的核酸配列の存在の指標となる、前記サンプル中の標的核酸配列の存在の指標となるシグナルの発生法を提供する。
【００２４】
本明細書中で使用される、「ＦＥＮヌクレアーゼ」は、本発明の切断構造を切断する酵素をいう。用語「ＦＥＮヌクレアーゼ」には、実質的に５’エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性からなる酵素を含む。本明細書中で使用される、「実質的に〜からなる」は、５’→３’合成活性および３’一本鎖フラップ切断活性（すなわち、ヌクレオチド内部結合分解活性および／または３’ヌクレオチド末端結合分解活性）の一方または両方を実質的に欠き主要な酵素活性が５’ヌクレオチド末端結合分解活性および／またはヌクレオチド内部結合分解活性である酵素をいう。「実質的に欠く」は、野生型酵素（例えば、５’→３’合成活性および３’ヌクレオチド内部結合分解活性および／または３’ヌクレオチド末端結合分解活性については、酵素はこれらの活性を有する野生型ＤＮＡポリメラーゼであり得る）の５％または１０％ほど、好ましくは０．１％、０．５％、または１％未満のＦＥＮヌクレアーゼ活性を有することを意味する。例えば、合成の全方向が５’→３’方向であるようなオリゴヌクレオチドプライマーの成長末端での３’水酸基と次のデオキシヌクレオチドの５’リン酸基との間のリン酸ジエステル結合の形成を含むニックトランスレーションアッセイまたは酵素配列決定反応において、５’→３’合成活性を測定することができる。ＤＮＡ二重鎖の（標識）３’末端は不対であり、二重鎖から切断されるので、ＤＮＡ合成反応で３’フラップ切断を測定することができる。５’エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性「からなる」ＦＥＮヌクレアーゼは、５’→３’合成活性および／または３’一本鎖フラップ切断活性を「欠く」酵素をいう。「欠く」は、ＦＥＮヌクレアーゼが検出可能な活性を有さないか、「微小な」活性（すなわち、野生学酵素活性の１．０％、０．５％、０．１％、または０．０１％未満）しか有さないことを意味する。本明細書中で使用される、「ＦＥＮヌクレアーゼ」は、５’フラップ特異性ヌクレアーゼを含む。
【００２５】
本明細書中で使用される、「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された場合、遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する（すなわち、遺伝子配列を有するかコードし、または酵素の配列または活性を有する）遺伝子または遺伝子産物をいう。
【００２６】
本発明の「５’フラップ特異性ヌクレアーゼ」（本明細書中では「フラップ特異性ヌクレアーゼ」ともいう）は、５’一本鎖として突出する一本鎖フラップを取り除くことができるエンドヌクレアーゼである。本発明のフラップ特異性ヌクレアーゼはまた、偽Ｙ構造を切断することができる。本発明のフラップ特異性ヌクレアーゼの基質は、標的核酸、第２の核酸、標的核酸と特異的にハイブリッド形成するその一部、標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成する第３の核酸由来のプライマー伸長物を含む。
【００２７】
本明細書中で使用される、「切断構造」は、フラップ、ループ、一本鎖バブル、Ｄループ、ニック、またはギャップを含む一本鎖構造を有する少なくとも二重鎖核酸を含むポリヌクレオチド構造（例えば、図１に例示）をいう。したがって、本発明の切断構造は分岐ＤＮＡのフラップ鎖を含むポリヌクレオチド構造を含み、５’一本鎖ポリヌクレオチドフラップはその構造の二本鎖部分との接合部付近の位置から伸長し、好ましくは、フラップは検出可能な標識で標識されている。本発明の切断構造のフラップは、好ましくは、約１〜５００ヌクレオチド、より好ましくは約５〜２５ヌクレオチド、最も好ましくは約１０〜２０ヌクレオチドであり、フラップ鎖の肘部から１ヌクレオチド中央寄りおよび／または１ヌクレオチド離れた位置で切断されることが好ましい。
【００２８】
本発明の切断構造は標的核酸配列を含むことが好ましく、標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドおよびハイブリッド形成オリゴヌクレオチドからのフラップ伸長を含み得る。例えば、本発明の切断構造は、標的核酸配列（例えば、図３のＢ）、標的配列に相補的な上流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＡ）、および標的配列に相補的な下流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＣ）を含み得る。このような切断構造では、下流オリゴヌクレオチドを、３’末端で遮断して下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止することができる。
【００２９】
本発明の切断構造は、核酸ポリメラーゼの合成活性による上流オリゴヌクレオチドの伸長および下流オリゴヌクレオチドの５’末端のその後の部分的置換によって形成される、下流オリゴヌクレオチドから伸長したフラップを含むポリヌクレオチド構造であり得る。
【００３０】
本発明の切断構造を、標的核酸配列にアニーリングする相補領域および標的核酸配列にアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補領域を含むオリゴヌクレオチドと標的核酸配列とのハイブリッド形成により形成することができる。
【００３１】
切断構造はまた、フラップの上流鎖（本明細書中ではフラップ隣接鎖またはプライマー鎖という）が取り除かれた場合に形成される偽Ｙ構造およびギャップまたはニックを含む二本鎖ＤＮＡ基質であり得る。本明細書中で使用される、「切断構造」は、３’一本鎖フラップのみを有する二本鎖核酸構造を含まない。本明細書中で使用される、「切断構造」にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが含まれるで、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。
【００３２】
本発明の切断構造は、標的核酸配列にハブリッド形成することができる上流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＡ）の３’末端が標的化核酸配列にアニーリングする下流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＣ）の１塩基対に相補的である重複フラップであってよく、この重複は一本鎖フラップの伸長点の直接的に下流である。
【００３３】
本発明の切断構造を、１．ａ）上流の伸長可能な３’末端（好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマー）、ｂ）上流プライマーの５０００ヌクレオチド下流以下に存在するオリゴヌクレオチドプライマー、ｃ）標的配列が上流プライマーおよび下流プローブの両方に相補的な適切な標的核酸配列、およびｄ）適切な緩衝液とを核酸配列をオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成可能な条件下でインキュベートする工程と、２．新規に合成された上流オリゴヌクレオチドの３’末端の少なくとも一部（すなわち、少なくとも５〜１０ヌクレオチド）が下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に隣接するか置換するようなポリメラーゼの合成活性によって上流オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長させる工程によって形成する。本発明の方法によれば、緩衝液および伸長温度は本発明の特定の核酸ポリメラーゼによる鎖置換に有利である。好ましくは、下流オリゴヌクレオチドを３’末端で遮断して、下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止する。本発明の別の実施形態では、本発明の切断構造は、標的核酸配列を、該標的核酸配列とはアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補５’領域および該標的核酸配列にアニーリングする相補３’領域とを含むオリゴヌクレオチドと共にインキュベーションして調製することができる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、切断領域を標識する。本発明の標識切断構造を、１．ａ）上流の伸長可能な３’末端（好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマー）、ｂ）標識プローブ（好ましくは、上流プライマーの５０００ヌクレオチド下流以下、より好ましくはは５００ヌクレオチド下流以下に存在する）、ｃ）標的配列がプライマーおよび標識プローブの両方に相補的な適切な標的核酸配列、およびｄ）適切な緩衝液とを、核酸配列がプライマーにハイブリッド形成可能な条件下でインキュベートする工程と、２．新規に合成された上流プライマーの３’末端が下流プローブの５’末端を部分的に置換するようなポリメラーゼの合成活性によって上流プライマーの３’末端を伸長させる工程によって形成する。本発明の方法によれば、緩衝液および伸長温度は本発明の特定の核酸ポリメラーゼによる鎖置換に有利である。好ましくは、下流オリゴヌクレオチドを３’末端で遮断して、下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止する。別の実施形態では、本発明の切断構造は、標的核酸配列を、該標的核酸配列とアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補標識５’領域および該標的核酸配列にアニーリングする相補３’領域とを含むプローブとともにインキュベーションして調製できる。
【００３５】
本明細書中で使用される、「標識」または「シグナルを発生することができる標識部分」は、検出可能な（好ましくは、定量可能な）シグナルの発生に使用することができ、核酸に作動可能に連結することができる任意の原子または分子をいう。標識により、蛍光、放射能、比色定量、重力測定、Ｘ線回折または吸収、磁性、酵素活性、質量分析、結合親和性、ハイブリッド形成高周波などによって検出可能なシグナルを発生させることができる。
【００３６】
本明細書中で使用される、「シグナルの発生」は、サンプル中の標的核酸配列の存在の指標としての放出核酸フラグメントの検出または測定をいう。
【００３７】
本明細書中で使用される、「サンプル」は、目的の核酸（標的核酸配列）を含むか含むと予想されるか、それ自体が目的の標的核酸配列を含むか含むと予想される任意の物質をいう。したがって、用語「サンプル」には、核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）、細胞、生物、組織、流体、または物質（例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、便；皮膚、気管、腸および尿生殖路の外分泌物；唾液、血球、腫瘍、器官、組織、インビトロ細胞培養成分のサンプル、天然の単離物（飲料水、海水、固体物質など）、微生物試料、ならびに核酸トレーサー分子で「標識された」対象物または試料を含むがこれらに限定されない）のサンプルが含まれる。
【００３８】
本明細書中で使用される、「標的核酸配列」または「テンプレート核酸配列」は、複製、増幅、および／または検出すべき核酸領域をいう。１つの実施形態では、「標的核酸配列」または「テンプレート核酸配列」は、増幅に使用する２つのプライマー配列の間に存在する。
【００３９】
本明細書中で使用される、「核酸ポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素をいう。一般に、この酵素は、標的配列にアニーリングするプライマーの３’末端での合成を開始し、テンプレートに沿った５’方向で処理し、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する場合、合成が終結するまで介在するアニーリングプローブを加水分解して標識および非標識プローブフラグメントを放出する。公知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００４０】
本明細書中で使用される、「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性」または「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性」は、モノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが連続的様式でポリヌクレオチドの５’末端から除去され（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩはこの活性を有するがクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗら、１９７０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６５、１６８）フラグメントは有さない（Ｋｌｅｎｏｗら、１９７１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２、３７１））、またはポリヌクレオチドは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に固有に存在し得るヌクレオチド末端結合分解活性によって５’末端から除去される、いくつかのＤＮＡポリメラーゼに伝統的に関連するテンプレート特異性核酸ポリメラーゼ活性（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性）をいう。
【００４１】
本明細書中で使用される、「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を本質的に欠く」は、野生型酵素活性の１０％、５％、１％、０．５％、または０．１％未満であることを意味する。「５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く」または「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く」は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が検出不可能であるか、野生型酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の約１％、０．５％、または０．１％であることを意味する。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を、適切な緩衝液（例えば、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）の存在下、６０℃で３０分間ニック基質を切断する工程と、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルーを含む９５％ホルムアミドの添加よって切断反応を終結させる工程と、ニックまたは非ニック産物を検出する工程を包含するエキソヌクレアーゼアッセイによって測定することができる。
【００４２】
本発明で有用な核酸ポリメラーゼには、Ｐｆｕ、エキソＰｆｕ（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕの変異形態）、ＴａｑのＳｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｎ短縮Ｂｓｔ、Ｎ短縮Ｂｃａ、Ｇｅｎｔａ、ＪｄＦ３、エキソ、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔエキソ（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＶｅｎｔの変異形態）、Ｕ１Ｔｍａ、およびシクエナーゼが含まれるが、これらに限定されない。本発明で有用なさらなる核酸ポリメラーゼは、以下の「核酸ポリメラーゼ」の項のものが含まれる。
【００４３】
本明細書中で使用される、「切断」は、切断構造を別の（すなわち、リン酸ジエステル結合によって他のフラグメントまたは核酸と物理的に連結していない）フラグメントまたはヌクレオチドと切断構造から放出されるフラグメントとに酵素によって分離することをいう。例えば、標識切断構造の切断は、本発明の以下に定義の標識切断構造を標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド由来のフラグメントを含む別々のフラグメントへ分離することをいい、また、別のフラグメントの１つは、標的核酸配列由来および／または標識フラグメントに存在する標識部分の検出に適切な当該分野で公知であり本明細書中に記載方法によって検出および／または測定することができる標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド由来の標識核酸フラグメントである。
【００４４】
本明細書中で使用される、「エンドヌクレアーゼ」は、核酸分子内の結合（好ましくは、リン酸ジエステル結合）を切断する酵素をいう。本発明のエンドヌクレアーゼは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに特異的であり得る。
【００４５】
本明細書中で使用される、「エキソヌクレアーゼ」は、ヌクレオチド間の結合（好ましくは、リン酸ジエステル結合）をポリヌクレオチドの末端から１つずつ切断する酵素をいう。本発明のエキソヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の５’または３’末端に特異的であり得るので、本明細書中では５’エキソヌクレアーゼまたは３’エキソヌクレアーゼという。
【００４６】
本明細書中で使用される、「フラップ」は、二本鎖核酸分子から伸長した一本鎖ＤＮＡ領域をいう。本発明のフラップは、好ましくは約１〜５００ヌクレオチド、より好ましくは約５〜２５ヌクレオチド、最も好ましくは約１０〜２０ヌクレオチドである。
【００４７】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
【００４８】
好ましい実施形態では、切断構造は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００４９】
本発明はまた、標的核酸配列を含むサンプルと核酸ポリメラーゼとのインキュベーションによって切断構造を形成させる工程と、前記切断構造をＦＥＮヌクレアーゼで切断して核酸フラグメントを放出させる工程と、前記サンプルにおける標的核酸配列の存在の指標として前記フラグメントの放出を検出および／または測定する工程とを包含する、標的核酸配列の検出または測定法を提供する。
【００５０】
本明細書中で使用される、「標的核酸配列の検出」または「標的核酸配列の測定」は、サンプル中の特定の標的核酸配列の存在の同定またはサンプル中の標的核酸配列の存在の指標としてのサンプル中の特定の標的核酸配列の量の同定をいう。測定または検出することができる標的核酸配列の量は、好ましくは約１分子〜１０２０分子、より好ましくは約１００分子〜１０１７分子、最も好ましくは約１０００分子〜１０１４分子である。本発明によれば、検出される核酸は、本発明の切断構造の下流プローブ（例えば、図３のＣ）の標識５’末端由来であり、これは標的核酸配列が本発明の切断構造の上流プローブ（例えば、図３のＡ）の３’伸長に置換されたものである。本発明によれば、本発明の切断構造を含む下流プローブ（例えば、図３のＣ）の５’末端に標識を結合させる。あるいは、下流プローブの３’末端に標識を結合し、下流プローブの５’フラップにクエンチ剤を結合させる。本発明によれば、本発明の切断構造を含む下流プローブ（例えば、図３のＣ）の３’末端に標識を結合させることができる。
【００５１】
本発明によれば、下流プローブ（例えば、図３のＣ）を内部標識することができる。好ましい実施形態では、本発明の切断構造は、標的核酸配列と、該標的核酸配列にアニーリングしないで５’フラップを形成し得る非相補標識５’領域および前記標的核酸配列にアニーリングする相補３’領域からなるプローブとをインキュベーションして調製することができる。本発明のこの実施形態によれば、検出される核酸は、プローブの標識５’フラップ領域由来である。標的核酸配列の量と切断され検出された核酸によって発生したシグナルとの間に直接的な相関関係が存在することが好ましい。
【００５２】
本明細書中で使用される、「標識フラグメント放出の検出」または「標識フラグメント放出の測定」は、サンプル中の標識フラグメントの存在の同定またはサンプル中の標識フラグメントの量の同定をいう。当該分野で周知であり且つ本明細書中に記載の方法を使用して、標識フラグメントの放出を検出または測定することができる。標識フラグメント放出の検出または測定法は、標識フラグメント上に存在する標識部分の測定または検出で適正に行なわれる。測定または検出することができる放出標識フラグメントの量は、標識プローブの全開始量の好ましくは約２５％、より好ましくは約５０％、最も好ましくは約９５％である。
【００５３】
本明細書中で使用される、「標識フラグメント」は、本発明の標識切断構造由来の切断モノヌクレオチド、小さなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをいい、前記切断オリゴヌクレオチドは、ＦＥＮヌクレアーゼによって切断構造から切断された好ましくは約２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは約５〜５０ヌクレオチド、最も好ましくは約１６〜１８ヌクレオチドであり、当該分野で周知であり且つ本明細書中に記載の方法で検出することができる。
【００５４】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。
【００５６】
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは熱安定性である。
【００５７】
本明細書中で使用される、「熱安定性」は、類似の活性を有する非熱安定性型酵素と比較して、好ましくは約９０〜１００℃、より好ましくは約７０〜９８℃ほどの熱に対して安定且つ活性な酵素をいう。例えば、好温性生物（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、またはＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉなど）由来の熱安定性核酸ポリメラーゼまたはＦＥＮヌクレアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の核酸ポリメラーゼまたは哺乳動物ＦＥＮ酵素と比較して、高温でより安定且つ活性が高い。Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）から単離された体表的な熱安定性核酸ポリメラーゼは、米国特許第４，８８９，８１８号に記載されており、従来のＰＣＲでのその使用法は、Ｓａｉｋｉら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、４８７に記載されている。Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）から単離された別の代表的な熱安定性核酸ポリメラーゼは、Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０８、１〜６に記載されている。さらなる代表的な熱安定性ポリメラーゼには、例えば、好温性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（列挙した他の細菌よりも幾らか低い至適温度を有する）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａまたは好温性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓおよｂＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｖｉｄｕｓから抽出されたポリメラーゼが含まれる。
【００５８】
ＰＣＲサイクル中の高温（約９５℃）への暴露によって二本鎖核酸を変性する熱サイクル過程では温度安定性ポリメラーゼおよびＦＥＮヌクレアーゼが好ましい。
【００５９】
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼはフラップ特異性ヌクレアーゼである。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼは熱安定性である。
【００６１】
別の好ましい実施形態では、シグナルを得ることができる少なくとも１つの標識部分を含む切断構造が形成される。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、標識部分がＦＥＮヌクレアーゼ切断に感受性を示す部位で分離しているので、前記ＦＥＮヌクレアーゼに感受性を示す部位での切断により第２の相互作用的シグナル発生標識部分から第１の相互作用性シグナル発生標識部分を分離するＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性により検出可能なシグナルを発生する、検出可能なシグナルの発生を有効にクエンチするように存在する一対の相互作用的シグナル発生標識部分を含む切断構造が形成される。
【００６３】
別の好ましい実施形態では、一対の相互作用シグナル発生部分はクエンチ剤部分および蛍光部分を含む。
【００６４】
別の好ましい実施形態では、切断構造は少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００６５】
本発明はまた、切断構造を得る工程と、第１のプライマーが標的核酸配列の第１の鎖の領域に相補的な配列を含み、且つ相補ＤＮＡ鎖の合成を開始し、第２のプライマーが標的核酸配列の第２の鎖の領域に相補的な配列を含み、且つ相補ＤＮＡ鎖の合成を開始する１組のオリゴヌクレオチドプライマーを得る工程と、（ｉ）標的核酸配列内に含まれるテンプレート核酸配列に対して増幅に必要なプライマーをアニーリングして切断構造の標的核酸配列への形成に必要なプライマーをアニーリングし、（ｉｉ）核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成してプライマーを伸長し、（ｉｉｉ）前記切断構造からの標識フラグメントの放出用の切断剤としてＦＥＮヌクレアーゼを使用して前記切断構造を切断して検出可能な標識フラグメントを獲得するＰＣＲサイクル工程に許容的な条件下でテンプレート依存性重合剤として前記核酸ポリメラーゼを使用して標的核酸配列を増幅する工程と、（ｄ）サンプル中の標的核酸配列の存在の指標としての標識フラグメントの放出を検出および／または測定する工程とを包含する、サンプル中の標的核酸配列検出のためのポリメラーゼ連鎖反応法を提供する。
【００６６】
本発明は、標的核酸配列の増幅および検出を同時に行う（すなわち、リアルタイム検出）ポリメラーゼ連鎖反応法を提供する。本発明はまた、標的核酸配列の検出前に標的核酸配列の増幅を行う（すなわち、終点検出）を提供する。
【００６７】
本明細書中で使用される、「オリゴヌクレオチドプライマー」は、核酸テンプレートにハイブリッド形成し、第２の核酸鎖の酵素合成を開始させる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をいう。本発明で有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、約１０〜１００ヌクレオチド長、好ましくは約１７〜５０ヌクレオチド長、より好ましくは約１７〜４５ヌクレオチド長である。本発明の切断構造の形成に有用なオリゴヌクレオチドプローブは、約１７〜４０ヌクレオチド長、好ましくは約１７〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは約１７〜２５ヌクレオチド長である。
【００６８】
本明細書中で使用される、「テンプレート依存性重合剤」は、適切な塩、金属陽イオン、適切な安定剤、およびｐＨ緩衝系を含む反応媒体中での適量の４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）または本明細書中に記載のアナログの存在下でオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることができる酵素をいう。テンプレート依存性重合剤は、プライマーおよびテンプレート依存性ＤＮＡ合成を触媒し、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有することが公知の酵素である。好ましくは、本発明のテンプレート依存性重合剤は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠く。
【００６９】
本明細書中で使用される、「増幅」は、ポリメラーゼ連鎖反応法を含む核酸配列のさらなるコピーの作製をいう。
【００７０】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
【００７１】
好ましい実施形態では、上記のポリメラーゼ連鎖反応の工程ｂのオリゴヌクレオチドプライマーは、正方向プライマーが本発明の切断構造の上流に存在し、逆方向プライマーが本発明の切断構造の下流に存在するように配向している。逆方向プライマーは、切断構造の鎖に相補的な正方向プライマーの反対の鎖に相補的である。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは熱安定性である。
【００７４】
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼからなる群から選択される。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼは熱安定性である。
【００７６】
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼはフラップ特異性ヌクレアーゼである。
【００７７】
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼはＡｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ヒト、マウス、またはＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ由来のＦＥＮヌクレアーゼ酵素からなる群から選択される。本発明のＦＥＮヌクレアーゼには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＲＡＤ２７、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＲＡＤ２、ＰｏｌＩ ＤＮＡポリメラーゼ会合５’→３’エキソヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ（Ｂｃａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、およびＦＥＮのファージ機能性ホモログ（Ｔ４ ＲＮアーゼＨ、Ｔ５ ５’→３’エキソヌクレアーゼ、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ、およびＴ３遺伝子６エキソヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない）も含まれる。
【００７８】
好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｆｌ、およびＢｃａ ＦＥＮヌクレアーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼドメインのみを使用する。
【００７９】
別の好ましい実施形態では、標識切断構造を、少なくとも１つのシグナルを発生することができる標識部分の添加によって形成する。
【００８０】
本発明はまた、
（ａ）標的核酸配列の第１の鎖中の領域に相補的な上流オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記標的核酸配列の同一の鎖中の領域に相補的な下流標識プローブを得る工程であって、前記上流プライマーは前記標的核酸配列の第１の鎖中領域に相補的な配列を含み、且つ相補ＤＮＡ鎖の合成を開始し、前記下流プローブは前記標的核酸配列の第２の鎖中領域に相補的な配列を含み、且つ相補ＤＮＡ鎖の合成を開始し、
（ｂ）核酸ポリメラーゼが
（ｉ）標的核酸配列にプライマーをアニーリングし、
（ｉｉ）前記核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成し、前記工程（ａ）のプライマーのプライマー伸長産物が工程（ａ）の下流プローブを部分的に置換して切断構造を形成する工程（ａ）のプライマーを伸長し、
（ｉｉｉ）前記切断構造からの標識フラグメントの放出用の切断剤としてＦＥＮヌクレアーゼを使用して前記切断構造を切断して検出可能な標識フラグメントを獲得するＰＣＲサイクル工程に許容的な条件下でのテンプレート依存性重合剤である、前記標的核酸配列の増幅およびその切断を含む反応で作製された核酸を検出する工程とを包含する、切断構造の形成と、サンプル中の標的核酸配列の増幅と、前記切断構造の切断を同時に行うためのポリメラーゼ連鎖反応法を提供する。
【００８１】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
【００８２】
本発明はまた、（ａ）標的核酸配列を得る工程と、（ｂ）前記標的核酸配列に相補的な上流プライマーを得る工程と、（ｃ）前記標的核酸配列に相補的な下流プライマーを得る工程と、（ｄ）核酸ポリメラーゼを使用して前記上流プライマーの３’末端を伸長する工程と、（ｅ）前記下流プローブの５’末端を置換する工程とを包含する、切断構造の形成法を提供する。
【００８３】
下流プローブは上流プローブから５００ヌクレオチド下流以下に存在することが好ましい。
【００８４】
伸長工程中、上流プライマーの３’末端を、新規に合成した上流プライマーの３’末端が下流プローブの５’末端を部分的に置換するようにポリメラーゼの合成活性によって伸長する。
【００８５】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
【００８６】
本発明の別の実施形態では、本発明の切断構造が、標的核酸配列と、該標的核酸配列とアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補５’領域および該標的核酸配列にアニーリングする相補３’領域からなるプローブをインキュベーションすることによって調製できる。
【００８７】
本発明はまた、（ａ）標的核酸配列を得る工程と、（ｂ）前記標的核酸配列に相補的な上流プライマーを得る工程と、（ｃ）前記標的核酸配列に相補的な下流末端標識プローブを得る工程と、（ｄ）核酸ポリメラーゼを使用して前記上流プライマーの３’末端を伸長する工程と、（ｅ）前記下流プローブの５’末端を置換する工程とを包含する、標識切断構造の形成法を提供する。
【００８８】
好ましくは、下流末端標識プローブは、上流プライマーから５００ヌクレオチド下流以下で存在する。好ましくは、下流オリゴヌクレオチドを３’末端で遮断して下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止する。オリゴヌクレオチドの３’末端水酸基上にリン酸または容易に除去されない他の部分を配置してこのような遮断を行うことができる。
【００８９】
伸長工程中、上流プライマーの３’末端を、新規に合成した上流プライマーの３’末端が下流プローブの５’末端を部分的に置換するようにポリメラーゼの合成活性によって伸長する。本発明の方法によれば、緩衝液および伸長温度は、本発明の特定の核酸ポリメラーゼによる鎖置換に有利である。
【００９０】
本発明の１つの実施形態では、本発明の切断構造が、標的核酸配列と、該標的核酸配列とアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補標識５’領域および該標的核酸配列にアニーリングする相補３’領域からなるプローブとをインキュベーションすることによって調製できる。
【００９１】
本発明はまた、核酸ポリメラーゼ、ＦＥＮヌクレアーゼ、および適切な緩衝液を含む、サンプル中の標的核酸配列の存在の指標となるシグナル発生用のキットを提供する。好ましい実施形態では、本発明はまた、１つまたは複数の核酸ポリメラーゼ、ＦＥＮヌクレアーゼ、および適切な緩衝液を含む、サンプル中の標的核酸配列の存在の指標となるシグナル発生用のキットを提供する。
【００９２】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
【００９３】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは熱安定性である。
【００９４】
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼは熱安定性である。
【００９５】
別の好ましい実施形態では、キットは標的核酸配列に相補的な標識核酸をさらに含む。
【００９６】
本発明はまた、核酸ポリメラーゼおよびＦＥＮヌクレアーゼを含む組成物を提供する。
【００９７】
好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
【００９８】
別の好ましい実施形態では、本発明は、１つまたは複数の核酸ポリメラーゼおよびＦＥＮヌクレアーゼを含む組成物を提供する。
【００９９】
本発明のさらなる特徴および利点を以下に示す。特許請求の範囲に記載の本発明は、シグナル発生がサンプル中の標的核酸の存在の指標である標的核酸を検出および／または測定するためのシグナルの発生法を提供する。特許請求の範囲に記載の本発明の方法は、複数の工程を必要としない。特許請求の範囲に記載の本発明はまた、標的核酸の存在の指標としてシグナルを発生させる工程を包含する標的核酸のＰＣＲベースの検出および／または測定法を提供する。特許請求の範囲に記載の本発明により、標的核酸配列の同時増幅および検出および／または測定が可能である。特許請求の範囲に記載の本発明はまた、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示す核酸ポリメラーゼの非存在下でシグナルを発生させる工程を包含する標的核酸のＰＣＲベースの検出および／または測定法を提供する。
【０１００】
以下の実施形態の記載および図面ならびに特許請求の範囲から本発明のさらなる特徴および利点がより完全に明らかとなる。
【０１０１】
（説明）本発明は、核酸が核酸ポリメラーゼとＦＥＮヌクレアーゼとの組み合わせによって処理される、サンプル中の標的核酸の存在を検出するためのシグナル発生法を提供する。本発明はまた、サンプル中の標的核酸配列の同時増幅、切断、および検出が可能な核酸の検出または測定法を提供する。
【０１０２】
本発明の実施には、他で示さない限り、当業者の知識の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用する。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版；「オリゴヌクレオチド合成」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔら、１９８４）；「核酸ハイブリッド形成」（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｎｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；「分子クローニング実施ガイド」（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４）；およびシリーズＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。本明細書中に記載（上記および下記）の全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中で参考として援用される。
【０１０３】
Ｉ．ＦＥＮヌクレアーゼ。ＦＥＮ−Ｉは、５’一本鎖フラップ鎖の主鎖を特異的に認識し、二重鎖ＤＮＡの２つの鎖が一本鎖アームに隣接する接合点に存在する切断部位でこのアームを捕捉する約４０ｋＤａの二価の金属イオン依存性エキソおよびエンドヌクレアーゼである。ヌクレオチド内部結合分解活性およびヌクレオチド末端結合分解活性は共にフラップまたはニックの最５’位塩基に対して感受性をほとんど示さない。ＦＥＮ−Ｉのヌクレオチド内部結合分解性およびヌクレオチド末端結合分解性基質結合および切断は共に上流オリゴヌクレオチド（フラップ隣接鎖またはプライマー）によって刺激される。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｏｌＩの場合もである。酵素のエンドヌクレアーゼ活性は、５’フラップの長さ（１ヌクレオチドほどの小ささの５’フラップの切断も行なう）から独立している。エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性は、基質の化学的性質に非感受性で、ＤＮＡおよびＲＮＡを切断する。
【０１０４】
ヌクレオチド内部結合分解活性およびヌクレオチド末端結合分解活性は、生理学的範囲の塩濃度で阻害される。０ｍＭＮａＣｌと比較して５０ｍＭ ＮａＣｌでは５０倍エキソヌクレアーゼ活性が阻害される。エンドヌクレアーゼ活性は５０ｍＭ ＮａＣｌで７倍だけ阻害される（Ｌｉｅｂｅｒ １９９、前出で概説）。
【０１０５】
５’−ＯＨが５’フラップ基質に付着するＦＥＮ−１の良好な基質であるにもかかわらず、それが二本鎖ＤＮＡ構造中のニックの一部でなければ非常に不十分な基質としてしか作用しない。末端リン酸塩の静電気的相反がＦＥＮ−１の基質の活性形態を与える基質の偽フラップ配置へのゆらぎに有利なようである。このような説明により、１つの活性部位およびニックのフラップまたは１つの偽フラップ配置の５’ｓｓＤＮＡ末端へのＦＥＮ−１のローディング機構が示される。このモデルは、ニックでの至適活性には塩基の対合を不安定化してニックのフラップへの揺らぎに有利である非常に低いＭｇ２＋および１価の塩濃度が必要であるという所見と一致する。より高いＭｇ２＋および１価の塩濃度は揺らぎに不利であり、フラップへの変換に揺らぎが必要であるニック化またはギャップ化構造の切断を阻害する。安定フラップ構造の切断には中程度のＭｇ２＋レベルが最適であり、Ｍｇ２＋濃度の増加に伴って切断は減少しない。これは、フラップ構造がその構造を達成するために塩基対を融解する必要がないでＭｇ２＋に全く非感受性であるためである。ヌクレオチド内部結合分解活性は１価の塩で減少するが、ヌクレオチド末端結合分解活性で認められる減少ほど急な減少ではない。さらに、１ヌクレオチドフラップは有効な基質であることが以前に示されている。これらの所見の全ては、ＦＥＮ−１がエンドヌクレアーゼとして機能すると解釈される場合、分解産物は１〜数ヌクレオチド長に変化するという事実と一致している。ニックの種々の長さのフラップへの揺らぎは、Ｇ／Ｃ含量に依存する局所配列によって変化すると予想される。まとめると、一過性フラップを形成するニックの揺らぎは、ＦＥＮ−１のヌクレオチド末端結合分解活性がヌクレオチド内部結合分解活性と同一であることを意味する（Ｌｉｅｂｅｒ、１９９７、前出に概説）。
【０１０６】
ＦＥＮ−１のエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡおよびＲＮＡを切断し、補助タンパク質の必要がない。しかし、複製フォークでは、ＦＥＮ−１は他のタンパク質（ＤＮＡヘリカーゼおよび増幅細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼδおよびεの進化性因子を含む）と相互作用する。ＰＣＮＡはＦＥＮ−１ヌクレアーゼ内部結合分解活性およびヌクレアーゼ末端結合分解活性を有意に刺激する。
【０１０７】
ＦＥＮ−１酵素は、より小さなバクテリオファージ５’→３’エキソヌクレアーゼ（Ｔ５ ５’エキソヌクレアーゼおよびＴ４ ＲＮアーゼＨ）ならびにより大きな真核生物ヌクレオチド除去修復酵素（ＸＰＧ）（酸化性塩基損傷の転写組み合わせ修復においても作用する）に機能的に関連する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、などの真正細菌では、ＰｏｌＩ５’→３’エキソヌクレアーゼドメインによって岡崎プロセシングが行われる。これらの細菌およびファージ酵素は約７つの保存酸性残基に残基類似性が集中しているＦＥＮ−１との限定された２つの配列相同領域（Ｎ（Ｎ末端）およびＩ（中間）領域と名づける）を共有している。Ｔ４ ＲＮアーゼＨおよびＴ５エキソヌクレアーゼの結晶構造ならびに変異誘発データに基づいて、これらの残基はＤＮＡ加水分解への影響に必要な２つのＭｇ２＋イオンに結合すると提案されているが、各金属が触媒サイクルで果たす役割は、各酵素で微妙に異なり、十分に理解されていない（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ、前出で概説）。
【０１０８】
本発明で有用なＦＥＮ−１酵素をコードするｆｅｎ−１遺伝子には、マウスｆｅｎ−１、ヒトｆｅｎ−１、ラットｆｅｎ−１、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ｆｅｎ−１、および４つの古細菌Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のｆｅｎ−１遺伝子が含まれる。ＦＥＮ−１酵素をコードするｃＤＮＡクローンがヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４１１１およびＬ３７３７４）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３２０）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡ８１９７９３）、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６８１４１およびＵ６４５６３）、およびＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３４９７）から単離されている。Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉフラップエンドヌクレアーゼの完全なヌクレオチド配列もまた決定されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ００５２１５）。ＦＥＮ−１ファミリーには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＲＡＤ２７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ２８１１３、Ｙ１３１３７）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＲＡＤ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７７０４１）も含まれる。Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｌｕｍの古細菌ゲノムもまた配列決定されている。ＦＥＮ−１と原核生物およびウイルス５’→３’エキソヌクレアーゼとの間の配列類似性が低いにもかかわらず、真核生物界内のＦＥＮ−１は、アミノ酸レベルで非常に保存されており、ヒトおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅタンパク質６０％同一であり、且つ７８％類似している。３つの古細菌ＦＥＮ−１たんぱく質はまた、真核生物ＦＥＮ−１酵素と相同性が高い（Ｍａｔｓｕｉら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４、１８２９７、Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ら．、１９９８ｂ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、２７１５４、およびＬｉｅｂｅｒ、１９９７、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、１９、２３３に概説）。
【０１０９】
ヒトと他のＦＥＮ−１ファミリーメンバーとの間の２つの保存ヌクレアーゼドメインの配列類似性は、９２％（マウス）、７９％（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、７７％（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、７２％（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、７６％（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、および７４％（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）である。
【０１１０】
ＦＥＮ−１は、５’一本鎖フラップ鎖の主鎖を特異的に認識し、このフラップアームを二重鎖ＤＮＡの２つの鎖と一本鎖アームとの間の接合点に存在する切断部位へ移動させる。フラップの上流の鎖（フラップ隣接鎖またはプライマー鎖と呼ぶこともある）が取り除かれた場合、得られた構造を偽Ｙ（図１を参照のこと）と名づける。この構造はＦＥＮ−１によって切断されるが、効率は１／２０〜１／１００である。ＦＥＮ−１は３’一本鎖フラップを切断しない。しかし、エキソヌクレアーゼとして作用するＦＥＮ−１は、ギャップまたはニックを含むｄｓＤＮＡ基質を加水分解する（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ａ、前出、Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９９ｂ、前出、およびＬｉｅｂｅｒ、１９９７、前出に概説）。ヌクレオチド末端結合分解的にＦＥＮ−１はｄｓＤＮＡのニック、低効率でギャップ、または５’陥凹末端で作用する。ギャップ構造では、ＦＥＮ−１結合および切断効率は約５ヌクレオチドまでのギャップのサイズの増加に伴って減少し、その後、ｄｓＤＮＡ内の５’陥凹末端に対する活性と等価の切断レベルで安定化する。平滑末端ｄｓＤＮＡ、３’陥凹末端、およびｓｓＤＮＡは切断されない（Ｌｉｅｂｅｒ、１９９７、前出で概説）。
【０１１１】
本発明で有用なＦＥＮヌクレアーゼは、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４１１１およびＬ３７３７４）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３２０）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡ８１９７９３）、酵母（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ２８１１３ Ｙ１３１３７およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７７０４１）、およびＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６８１４１およびＵ６４５６３）を含む種々の生物から単離されている。このような酵素を、当該分野で周知の従来技術を使用してクローン化および過剰発現することができる。
【０１１２】
本発明のＦＥＮヌクレアーゼは、熱安定性であることが好ましい。熱安定性ＦＥＮヌクレアーゼは、４つの古細菌を含む種々の熱安定性生物から単離および特徴づけられている。Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓフラップエンドヌクレアーゼのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３４９７）およびアミノ酸配列（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ａ、前出およびＨｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ）が決定されている。Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉフラップエンドヌクレアーゼの完全なヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ００５２１５）およびアミノ酸配列（Ｍａｔｓｕｉら、前出）もまた決定されている。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂおよびＭａｔｓｕｉら、前出）およびＡ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ）のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列もまた決定されている。
【０１１３】
熱安定性ＦＥＮ１酵素を、当該分野で周知の技術、Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ａ、前出、Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ、Ｋａｉｓｅｒら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４、２１３８７、およびＭａｔｓｕｉら、前出に記載の技術、ならびに本明細書中の実施例２「Ｐｆｕ ＦＥＮ−１のクローニング」に記載の技術を使用してクローン化および過剰発現することができる。
【０１１４】
ＦＥＮ酵素のエンドヌクレアーゼ活性を、以下を含む種々の方法で測定することができる。
【０１１５】
Ａ．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性アッセイ
１．テンプレート（例えば、図２に記載）を使用して、本発明のＦＥＮヌクレアーゼ活性を評価する。
【０１１６】
テンプレート１は、以下の配列を有する５’３３Ｐ標識オリゴヌクレオチド（Ｈｅｌｔｅｓｔ４）である：
５’ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧ３’（配列番号１）。Ｈｅｌｔｅｓｔ４の下線部分は、Ｍ１３ｍｐ１８＋に相補的な領域を示す。切断産物は、配列ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴ（配列番号２）を含む１８ヌクレオチドフラグメントである。
【０１１７】
Ｈｅｌｔｅｓｔ４は、Ｍ１３に結合して相補二本鎖ドメインおよび非相補５’オーバーハングが得られる。この二重鎖により、ヘリカーゼアッセイでも使用されるテンプレート２（図２）が形成される。テンプレート３（図２）はＭ１３に結合し、Ｈｅｌｔｅｓｔ４に直接隣接するさらなるプライマー（ＦＥＮＡＳ）を有する。ＦＥＮＡＳの配列は、５’ＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡ３’（配列番号３）である。テンプレート３の存在下で、ＦＥＮはＨｅｌｔｅｓｔ４の遊離の５’末端に結合し、接合点に移動し、Ｈｅｌｔｅｓｔ４を切断して１８ヌクレオチドフラグメントが得られる。テンプレート１および２はコントロールとして使用するが、テンプレート２はテンプレートとしても使用することができる。
【０１１８】
テンプレートを以下に記載のように調製する。
【０１１９】
テンプレート１ テンプレート２ テンプレート３
Ｈｅｌｔｅｓｔ４ １４μｌ １４μｌ １４μｌ
Ｍ１３ ＊＊ １４μｌ １４μｌ
ＦＥＮＡＳ ＊＊ ＊＊ １４μｌ
Ｈ２Ｏ ２８μｌ １４μｌ ＊＊
１０×Ｐｆｕ緩衝液 ４．６μｌ ４．６μｌ ４．６μｌ。
【０１２０】
１０×Ｐｆｕ緩衝液はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００５３６）から市販されている。本発明の方法によれば、１０×Ｐｆｕ緩衝液を、１×緩衝液の存在下で反応を行えるように希釈する。
【０１２１】
Ｍ１３はＭ１３ｍｐ１８＋鎖であり、２００ｎｇ／μＬの濃度であり、３３Ｐ標識Ｈｅｌｔｅｓｔ４は約０．７ｎｇ／μｌの濃度であり、ＦＥＮＡＳは４．３ｎｇ／μｌの濃度である。これらの濃度に基づくと、Ｈｅｌｔｅｓｔ４およびＭ１３は、およそ等モル量（５×１０−１４）であり、ＦＥＮＡＳは約１０倍モル過剰（６×１０−１３）で存在する。
【０１２２】
テンプレート混合物は、９５℃で５分間加熱し４５分間室温に冷却し、４℃で一晩保存する。
【０１２３】
２μｌのＦＥＮ−１またはコントロールとしてのＨ２Ｏを、以下のように３つのテンプレートと混合する。
【０１２４】
３μｌ テンプレート
０．７μｌ １０×クローン化Ｐｆｕ緩衝液
０．５６μｌ １００ｍＭ ＭｇＣｌ２
２．００μｌ 酵素またはＨ２Ｏ
０．７４μｌ Ｈ２Ｏ
全量７．００μｌ。
【０１２５】
５０℃で３０分間この反応を進行させ、各サンプルへの２μｌのホルムアミド「シークエンシング停止」溶液の添加によって停止させた。サンプルを９５℃で５分間加熱し、６％アクリルアミドの７Ｍ尿素ＣａｓｔＡｗａｙ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ゲルにロードした。
【０１２６】
あるいは、ＦＥＮ活性を、１時間のインキュベーション時間を使用した以下の緩衝液で分析した。
【０１２７】
１０×ＦＥＮ緩衝液
５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１００ｍＭ ＭｇＣｌ２
以下の反応混合物を、２μｌのＦＥＮ、コントロールとしてのＨ２Ｏと混合した。
【０１２８】
３μｌ テンプレート
０．７μｌ １０×ＦＥＮ緩衝液
２．００μｌ 酵素またはＨ２Ｏ
０．３μｌ Ｈ２Ｏ
全量７．００μｌ。
【０１２９】
サンプルを、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ９６加熱トップサーマルサイクラー中、５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止染色溶液の添加後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。サンプルを、１１インチ長の手で分注した２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミドの７Ｍ尿素ゲルにロードする。ゲルを、ブロモフェノールブルーが全距離の約２／３まで移動するまで２０ワットで泳動する。ゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）に１０分間、そして水に１０分間浸す。ゲルをＷｈａｔｍａｎｎ３ｍｍ濾紙に置き、プラスチックラップで覆い、加熱吸引ゲルドライヤー中で２時間乾燥させる。ゲルを、Ｘ線フィルムに一晩感光させる。
【０１３０】
２．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性を、Ｋａｉｓｅｒら（前出）の方法に従って測定することもできる。簡単に述べれば、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１０μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、およびＴａｑＰｏｌおよびＴｈｔＰｏｌには２００ｍＭ ＫＣｌまたは全ての他の酵素には５０ｍＭ ＫＣｌを含む１０μｌの体積中で反応を行う。分析される切断構造に依存して、反応条件を変化させることができる。基質（２μＭ）および種々の量の酵素を、表示（上記）の反応緩衝液と混合し、Ｃｈｉｌｌ−ｏｕｔ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）液体ワックスを重ねる。基質を９０℃で２０秒間加熱変性させて５０℃に冷却し、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２の添加によって反応を開始させ、特定の時間５０℃でインキュベートする。１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０２％メチルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）を含む１０μｌの９５％ホルムアミドの添加によって反応を停止させる。サンプルを９０℃で１分間加熱し、その直後に７Ｍ尿素、４５ｍＭ Ｔｒｉｓホウ酸（ｐＨ８．３）１．４ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液を含む２０％変性アクリルアミドゲル（１９：１架橋）で電気泳動を行う。他で表示しない限り、レーンあたり１μｌの各停止反応物をロードする。ゲルを、５０５ｎｍフィルターを使用したＦＭＢＩＯ−１００蛍光ゲルスキャナー（Ｈｉｔａｃｈｉ）でスキャニングする。ＦＭＢＩＯ分析ソフトウェア（バージョン６．０、Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて未切断および切断基質に対応するバンドの強度から切断産物の画分を同定する。測定値を最初の切断速度に確実に近づけるために、切断産物の画分は２０％を超えるべきではない。切断速度を、酵素濃度および反応時間（分）で割った切断産物の濃度と定義する。各酵素について、３つの測定点使用して、速度および実験誤差を決定する。
【０１３１】
３．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性を、Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９８８ａ（前出）の方法に従って測定することもできる。簡単に述べれば、１３μｌの最終体積中で、種々の量のＦＥＮおよび１．５４ｐｍｏｌの標識切断基質を異なる温度で３０分間インキュベートし、反応を同体積の停止溶液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、９５％脱イオンホルムアミド、および０．００８％ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール）で停止させる。サンプルを変性１５％アクリルアミドゲルで電気泳動し、出発物質および生成物の相対量を、ＭａｃＢＡＳ画像分析ソフトウェアを実行するＩＰＬａｂＧｅｌシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して定量する。ほとんどの反応を、標準アッセイ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中で行うが、一連の実験では、異なる２価の金属およびｐＨレベルの効果を標準緩衝液を変化させて研究する。２価の金属ＭｇＣｌ２を除外し、異なる金属イオンを１０ｍＭの最終濃度で使用する。ｐＨの影響を研究するために、異なる量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、グリシンおよび酢酸ナトリウムを１０ｍＭの最終濃度で使用して、２５℃で広域ｐＨを得る。
【０１３２】
４．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性を、Ｍａｔｓｕｉら、１９９９（前出）の方法に従って測定することもできる。簡単に述べれば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭβ−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、および０．６ｐｍｏｌの標識切断構造を含む１５μｌの反応混合物中で酵素をインキュベートする。６０℃で３０分のインキュベーション後、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルーを含む１５μｌの９５％ホルムアミドの添加により反応を停止させる。サンプルを９５℃１０分間加熱し、７Ｍ尿素および１０×ＴＢＥ（８９ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８９ｍＭ ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を含む１５％ポリアクリルアミドゲル（３５ｃｍ×４２．５ｃｍ）にロードして、２０００Ｖで２時間電気泳動する。反応生成物を視覚化し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量する。サイズマーカーであるオリゴヌクレオチドを、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端標識する。
【０１３３】
至適ｐＨを同定するために、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、および０．６ｐｍｏｌの５’末端標識切断構造を５０ｍＭの以下のいずれかの緩衝液中に含むアッセイ混合物（１５μｌ）中で６０℃で３０分間反応を行う。以下の３つの異なる５０ｍＭの緩衝液を使用して、以下の広域ｐＨを得る：酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．４）。
【０１３４】
Ｂ．ＦＥＮエキソヌクレアーゼ活性アッセイ
本発明のＦＥＮヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性を、Ｍａｔｓｕｉら、１９９９（前出）に記載され、上記でまとめられているＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ活性測定法によって測定することができる。
【０１３５】
あるいは、ＦＥＮ酵素のエキソヌクレアーゼ活性を、Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ（前出）に記載の方法によって分析することができる。簡単に述べれば、エンドヌクレアーゼアッセイで記載の条件と同一の条件下（上記）で、ニック化基質を使用してエキソヌクレアーゼ活性をアッセイする。
【０１３６】
エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ中の正確なＤＮＡ切断位置を、クレノウフラグメントの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を使用した５’３２Ｐ標識テンプレート鎖の部分的消化によって得ることができる。
【０１３７】
本発明の切断構造は、標的核酸配列にアニーリングしたオリゴヌクレオチドの部分置換５’末端を含む。本発明の別の切断構造は、標的核酸配列（例えば、図３のＢ）、標的配列に相補的な上流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＡ）、および標的配列に相補的な下流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＣ）を含む。本発明の切断構造を、上流オリゴヌクレオチドと下流プローブとの間の重複または核酸ポリメラーゼの合成活性による上流オリゴヌクレオチドの伸長およびその後の下流オリゴヌクレオチドの５’末端の部分的置換によって形成することができる。タイトル「切断構造」の項に記載の方法に従ってこの型の切断構造を形成する。
【０１３８】
あるいは、本発明の切断構造を、標的核酸配列にアニーリングする相補領域および標的核酸配列にアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補領域を含むオリゴヌクレオチドへの標的核酸配列のアニーリングによって形成する。本実施形態によれば、切断構造は、オリゴヌクレオチドの非相補領域によって形成された５’フラップを含む。
【０１３９】
本発明の切断構造はまた、標的核酸配列にアニーリングすることができる上流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＡ）の３’末端は標的核酸配列にアニーリングする下流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＣ）の１つ（または複数）の塩基対に相補的である重複フラップを含み、１つ（または複数）の塩基対重複は、一本鎖フラップの伸長点のすぐ下流であり、タイトル「切断構造」の項に記載の方法に従って形成される。
【０１４０】
ＩＩ．核酸ポリメラーゼ
本発明は核酸ポリメラーゼを提供する。好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは熱安定性である。
【０１４１】
公知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【０１４２】
本発明で有用な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く核酸ポリメラーゼには、クレノウおよびクレノウエキソポリメラーゼ、およびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ（シクエナーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
本発明で有用な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く熱安定性核酸ポリメラーゼには、Ｐｆｕ、エキソＰｆｕ（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕの変異形態）、ＴａｑのＳｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｎ短縮Ｂｓｔ、Ｎ短縮Ｂｃａ、Ｇｅｎｔａ、ＪｄＦ３エキソ−、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔエキソ−（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＶｅｎｔの変異形態）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔエキソ−（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤｅｅｐ Ｖｅｎｔの変異形態）Ｕ１Ｔｍａ、およびシクエナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
本発明で有用な核酸ポリメラーゼには、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く天然のポリメラーゼおよびポリメラーゼ変異体が含まれる。本発明で有用な核酸ポリメラーゼは、異なる程度の熱安定性を有し得る。好ましくは、本発明の核酸ポリメラーゼは、核酸プライマーを伸長させることができる温度で鎖置換活性を示す。本発明の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’→３’および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠く。
【０１４５】
本発明で有用な異なる程度の熱安定性を有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くさらなる核酸ポリメラーゼを以下に列挙する。
【０１４６】
Ａ．バクテリアファージＤＮＡポリメラーゼ（３７℃でのアッセイに有用）
バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が別のポリペプチドによってコードされるので当該活性を欠く。適切なＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｔ４、Ｔ７、およびφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。市販の酵素は、Ｔ４（多数の供給源（例えば、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）から市販されている）およびＴ７（多数の供給源（例えば、３’→５’エキソ−Ｔ７「シークエンス」ＤＮＡポリメラーゼの未修飾およびＵＳＢについてはＥｐｉｃｅｎｔｒｅ）から市販されている）である。
【０１４７】
Ｂ．古細菌ＤＮＡポリメラーゼ
古細菌で同定されたＤＮＡポリメラーゼには以下の２つの異なるＤＮＡポリメラーゼクラスが存在する：１．ファミリーＢ／ｐｏｌα型（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｕのホモログ）および２．ｐｏｌＩＩ型（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＰ１／ＤＰ２サブユニットポリメラーゼのホモログ）。両クラス由来のＤＮＡポリメラーゼは、関連する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然に欠き、３’→５’エキソヌクレアーゼ（校正）活性を有することが示されている。適切なＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌαまたはｐｏｌＩＩ）は、所望のアッセイ温度に類似の至適成長温度を有する古細菌に由来し得る。適切な古細菌の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：
１．熱不安定性（３７℃でのアッセイに有用）−例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ。２．熱安定性（非ＰＣＲアッセイで有用）−例えば、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ。適切な古細菌は、８０〜８５℃以下の最大成長温度または７０〜８０℃以下の至適成長温度を示すと評価されている。
【０１４８】
３．熱安定性（ＰＣＲアッセイで有用）−例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ類（ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ＧＢ−Ｄ類、ＫＯＤ１株、Ｗｏｅｓｉｉ、ａｂｙｓｉｉ、ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ類（ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、９°Ｎｏｒｔｈ−７類、ＪＤＦ−３類、ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ、およびＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ。適切な古細菌は、８０〜８５℃以上の最大成長温度または７０〜８０℃以上の至適成長温度を示すと評価されている。古細菌ｐｏｌαＤＮＡポリメラーゼ由来の適切なＰＣＲ酵素は市販されており、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、およびＰｗｏ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）が含まれる。
【０１４９】
上記で列挙された古細菌に関連するさらなる古細菌は、以下の引例に記載されている：「古細菌：実験マニュアル」（Ｒｏｂｂ，Ｆ．Ｔ．ａｎｄ Ｐｌａｃｅ，Ａ．Ｒ．編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９５および好温性細菌（Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、１９９２。
【０１５０】
Ｃ．真正細菌ＤＮＡポリメラーゼ
３つのクラスの真正細菌ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ）が存在する。Ｐｏｌ１ＤＮＡポリメラーゼファミリーの酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、一定のメンバーはまた３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示す。ＰｏｌＩＩＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然に欠くが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示す。ＰｏｌＩＩＩＤＮＡポリメラーゼは、細胞の主要な複製ＤＮＡポリメラーゼを代表し、複数のサブユニットから構成されている。ｐｏｌＩＩＩ触媒サブユニットは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、同一のポリペプチド中に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が存在する場合がある。
【０１５１】
真正細菌のｐｏｌＩＩおよびｐｏｌＩＩＩＤＮＡポリメラーゼは市販されていない。種々の市販のＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼが存在し、そのいくつかは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が減少しているか消滅するように改変されている。ｐｏｌＩＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の消失に使用されている方法には、以下が含まれる：
−変異誘発（Ｘｕら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６８、２８４およびＫｉｍら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ、７、４６８）、
−タンパク質分解消化によるＮ短縮（Ｋｌｅｎｏｗら、１９７１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２、３７１）、または
−Ｃ末端フラグメントのクローニングおよび発現によるＮ短縮（Ｌａｗｙｅｒら、１９９３、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．、２、２７５）。
【０１５２】
古細菌供給源については、アッセイ温度要件を決定し、以下の真正細菌（中温菌、好熱菌、超好熱菌）を本発明で有用なＤＮＡポリメラーゼの供給源として使用すべきである。
【０１５３】
１．中温菌／熱不安定性菌（３７℃でのアッセイに有用）
ｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然で実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ：中温真正細菌（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ類（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ｌｅｐｒａｅ）など）由来のｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩ触媒サブユニット。
【０１５４】
ｉｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ変異体：Ｎ短縮または変異誘発のためのＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼを、上記の中温真正細菌から単離することができる（Ｃｉ）。市販の真正細菌ＤＮＡポリメラーゼｐｏｌＩフラグメントは、クレノウフラグメント（Ｎ短縮Ｅ．ｃｏｌｉｐｏｌＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。
【０１５５】
２．熱安定性菌（ＰＣＲアッセイに有用）
ｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然で実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ：好熱真正細菌（例えば、Ｂａｃｃｉｌｕｓ類のｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ）由来のＰｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩ触媒サブユニット。
【０１５６】
ｉｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ変異体：Ｎ短縮または変異誘発のための適切なＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼを、上記の好熱真正細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ類など）から単離することができる。Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼｐｏｌＩの熱安定性Ｎ短縮フラグメントは市販されており、商標名Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ巨大フラグメント（Ｂｉｏ−ＲａｄおよびＩｓｏｔｈｅｒｍＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ））として販売されている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ ｐｏｌＩのＣ末端フラグメントは、Ｐａｎｖｅｒａ（商標名Ｌａｄｄｅｒｍａｎとして販売）から入手可能である。
【０１５７】
３．熱安定性菌（ＰＣＲアッセイに有用）
ｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然で実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ：Ｔｈｅｒｍｕｓ類（ａｑｕａｔｉｃｕｓ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ｆｌａｖｕｓ、ｒｕｂｅｒ、ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、ｂｒｏｋｉａｎｕｓ）またはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ類由来のＰｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩ触媒サブユニット。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の触媒ｐｏｌＩＩＩサブユニットは、Ｙｉ−Ｐｉｎｇら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、４８、７５６およびＭｃＨｅｎｒｙら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７２、１７８に記載されている。
【０１５８】
ｉｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ変異体：Ｎ短縮または変異誘発のための適切なＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼを、Ｔｈｅｒｍｕｓ類およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（上記）を含む種々の好熱性真正細菌から単離することができる。Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼｐｏｌＩ（Ｔａｑ）の熱安定性フラグメントは市販されており、商標名ＫｌｅｎＴａｑ１（Ａｂ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、およびＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）として販売されている。Ｃ末端フラグメントに加えて、５’→３’エキソヌクレアーゼ−Ｔａｑ変異体（ＴａｑＦＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）など）もまた市販されている。Ｔａｑの５’→３’エキソヌクレアーゼ−異形に加えて、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＮＡポリメラーゼＩのＮ短縮異形もまた市販されている（商標名ＵｌＴｍａ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）。
【０１５９】
上記の細菌に関連するさらなる真正細菌は、「好熱細菌」（Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、１９９２に記載されている。
【０１６０】
Ｄ．真核生物５’→３’エキソヌクレアーゼ−ＤＮＡポリメラーゼ（３７℃でのアッセイに有用）。真核生物から同定されたいくつかのＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌα（複製／修復）、δ（複製）、ε（複製）、β（修復）、およびγ（ミトコンドリア複製）を含む）が存在する。真核生物ＤＮＡポリメラーゼは、当該活性が別のポリペプチド（例えば、哺乳動物ＦＥＮ−１または酵母ＲＡＤ２）によってコードされるので、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。適切な熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼを、種々の真核生物（酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、ショウジョウバエを含むが、これらに限定されない）および真核ウイルス（例えば、ＥＢＶ、アデノウイルス）から単離することができる。
【０１６１】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くことに加えて、３’−５’エキソヌクレアーゼ（校正）活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ＦＥＮベースの検出ストラテジーにおいて改良された能力を示すことが可能である。例えば、固有の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の減少および消滅は、標識プローブの非特異的ヌクレオチド末端結合分解の減少によってバックグラウンドシグナルを低減することができる。３つの３’→５’エキソヌクレアーゼモチーフが同定されており、これらの領域の操作により、クレノウ、Φ２９、Ｔ４、Ｔ７、およびＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、酵母Ｐｏｌα、Ｐｏｌβ、およびＰｏｌγ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐｏｌ ＩＩＩの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を消滅されることが示されている（Ｄｅｒｂｅｙｓｈｉｒｅら、１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６２、３６３に概説）。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性か減少または消滅したさらなるＤＮＡポリメラーゼ変異体の調製法は、当該分野で周知である。
【０１６２】
５’→３’および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く市販の酵素には、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（エキソ−Ｔ７；ＵＳＢ）、Ｐｆｕエキソ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、エキソ−Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、エキソ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、エキソ−クレノウフラグメント（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｓｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｕｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、Ｌａｄｄｅｒｍａｎ（Ｐａｎｖｅｒａ）、ＫｌｅｎＴａｑ１（Ａｂ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）、およびＴａｑＦＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）が含まれる。
【０１６３】
Ｐｆｕ以外のポリメラーゼを使用する場合、本発明の特定のポリメラーゼによって至適活性が得られるように緩衝液および伸長温度を選択する。本発明のポリメラーゼに有用な緩衝液および伸長温度は当該分野で公知であり、製造供給元の仕様書から決定することもできる。
【０１６４】
ＩＩＩ．核酸
Ａ．本発明で有用な核酸配列。本発明は、標的核酸配列の検出または測定法を提供し、本発明の切断構造形成用のオリゴヌクレオチド、プライマー、およびプローブならびにテンプレート核酸配列の増幅用のプライマーも利用する。本明細書中で使用される、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、プライマー、プローブ、および検出すべきオリゴマーフラグメントをいい、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンもしくはピリミジン塩基または改変プリンもしくはピリミジン塩基（非塩基性部位を含む）のＮグリコシドである他の任意の型のポリヌクレオチドの総称である。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」の間の長さに意図する差は存在せず、これらの用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。従ってこれらの用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡが含まれる。
【０１６５】
本明細書中で使用される、核酸配列の相補は、一方の配列の５’末端を他の配列の３’末端とが対合するように核酸配列を整列させた場合に「逆行性会合」するオリゴヌクレオチドをいう。
【０１６６】
オリゴヌクレオチドは、必ずしも任意の現存または天然の配列に物理的に由来しないが、任意の様式（化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはその組み合わせを含む）で作製することができる。用語「オリゴヌクレオチド」または「核酸」は、その合成起源または操作によって（１）天然で会合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に会合していない、そして／または（２）天然で連結しているもの以外のポリヌクレオチドに連結しているゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドが意図される。
【０１６７】
１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がリン酸ジエステル結合を介して一方向でその隣接物の３’酸素に結合するようにモノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを作製するので、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結しない場合、オリゴヌクレオチド末端を「５’末端」といい、その３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結しない場合、「３’末端」という。本明細書中で使用される、「核酸配列」はまた、より大きなオリゴヌクレオチドの内部であったとしても、５’および３’末端を有するということができる。
【０１６８】
２つの異なる非重複オリゴヌクレオチドが同一の線状相補核酸配列の異なる領域にアニーリングし、一方の３’末端が他方の５’末端に向いている場合、前者を「上流」オリゴヌクレオチドと呼び、後者を「下流」オリゴヌクレオチドと呼ぶことができる。
【０１６９】
天然の核酸中で一般的には見出されない一定の塩基は、本発明の核酸に含むことができ、例えば、イノシンおよび７−デアザグアニンが含まれる。相補性は完全でなくてよく、安定な二重鎖は、ミスマッチ塩基対または非マッチ塩基を含み得る。核酸科学技術分野の当業者は、多数の変数（例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレチドの塩基組成および配列、イオン強度、ならびにミスマッチ塩基対の発生率を含む）を経験的に考慮して二重鎖安定性を決定することができる。
【０１７０】
核酸二重鎖の安定性を、融解温度（すなわち、「Ｔｍ」）によって測定する。特定の条件下での特定の核酸二重鎖のＴｍは、塩基対の半分が解離する温度である。
【０１７１】
Ｂ．本発明で有用なプライマーおよびプローブ。本発明は、テンプレート核酸配列の増幅および本発明の切断構造の形成のための核酸の検出または測定に有用なオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを提供する。
【０１７２】
用語「プライマー」は、１つを超えるプライマーをいうことができ、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれた場合に相補鎖に沿った合成の開始点として作用することができる、天然に存在するか、精製制限消化物としてか、合成されたオリゴヌクレオチドをいう。このような条件には、適切な緩衝液（「緩衝液」には、補助因子であるかｐＨ、イオン強度などに影響を与える成分が含まれる）中の４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸および重合誘導剤（ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素など）の存在および適切な温度が含まれる。最大の増幅効率のためには、好ましくはプライマーは一本鎖である。
【０１７３】
本発明で有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレート核酸配列とハイブリッド形成し、第２の核酸鎖の酵素合成を開始させる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。プライマーは、核酸分子のプール中に存在する標的分子の一部に相補的である。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを化学的または酵素的合成法によって調製することが意図される。あるいは、このような分子またはそのフラグメントは天然に存在し、その天然の供給源から単離するか、供給業者から購入する。オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、５〜１００ヌクレオチド長、理想的には１７〜４０ヌクレオチド長であるが、異なる長さのプライマーおよびプローブが有用である。増幅用プライマーは、好ましくは約１７〜２５ヌクレオチドである。本発明の切断構造の作製用のプライマーは、好ましくは１７〜４５ヌクレオチドである。本発明で有用なプライマーを、融点評価法によって特定の融点（Ｔｍ）を有するようにも設計する。市販のプログラム（ＯｌｉｇｏＴＭを含む）、Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ、およびインターネットで利用可能なプログラム（Ｐｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含む）を使用して、本発明で有用な核酸配列の融点を計算することができる。好ましくは、例えばＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによって計算した場合、本発明で有用な増幅プライマーのＴｍは、約４５℃と６５℃との間、より好ましくは約５０℃と６０℃の間である。好ましくは、本発明で有用なプローブのＴｍは、対応する増幅プライマーのＴｍより７℃高い。
【０１７４】
本明細書中で使用される、「プローブ」は、本発明の切断構造の調製に有用な標識プライマーをいう。一本鎖ＤＮＡプライマー対を標的核酸配列内の配列にアニーリングすることができ、これを使用して標的核酸配列の増幅ＤＮＡ合成を開始させることができる。
【０１７５】
典型的には、２つの核酸配列が実質的に相補的である場合（少なくとも１４〜２５ヌクレオチドに対して少なくとも約６５％相補的、好ましくは少なくとも７５％相補的、より好ましくは少なくとも約９０％相補的）、選択的ハイブリッド形成が起こる。Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２、２０３（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。結果として、プライミング部位での一定のミスマッチ度が許容されると予想される。このようなミスマッチは小さいであろう（モノ、ジ、またはトリヌクレオチド）。あるいは、ミスマッチ領域は、連続する一連の４つまたはそれ以上のヌクレオチド中にミスマッチが存在する領域と定義されるループを含み得る。
【０１７６】
多数の因子がプライマーの第２の核酸分子へのハイブリッド形成の効率および選択性に影響を与える。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの設計にはこれらの因子（プライマー長、ヌクレオチド配列および／または組成、ハイブリッド形成温度、緩衝液の組成、およびハイブリッド形成に必要なプライマー領域における立体障害の潜在性）を考慮する。
【０１７７】
プライマー長とプライマーが標的配列にアニーリングする効率および精度との間に正の相関が存在する。特に、より長い配列は短い配列よりも高い融点（Ｔｍ）を有し、これは所与の標的配列内で反復されそうにないので、ハイブリッド形成のばらつきを最小にする。高ＧＣ含量又は回文構造配列を含むプライマー配列はその意図する標的部位においてハイブリッド形成するのと同じようにして自己ハイブリッド形成する傾向があり、これは二分子よりもむしろ一分子のハイブリッド形成速度が一般に溶液中で有利であるからである。しかし、ＡとＴとの塩基対が標的配列に結合する場合に認められる２つのよりもむしろ各Ｇ−Ｃ対が３つの水素結合で結合してより固く強力な結合が形成されるので、十分なＧ−Ｃヌクレオチド対合数を含むプライマーを設計することが重要でもある。ハイブリッド形成温度は、プライミング反応物またはハイブリッド形成混合物中に含み得る有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の濃度と同様にプライマーアニーリング効率と反比例して変化する一方で、塩濃度の増加は結合を促進する。ストリンジェントなアニーリング条件下では、より長いハイブリッド形成プローブまたは合成プライマーは、より短いものよりも効率的にハイブリッド形成し、より許容的な条件下で十分である。ストリンジェントな条件には、約１Ｍ未満、より通常に約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度が含まれる。ハイブリッド形成温度は、０℃ほどの低さから２２℃を超えるか、約３０℃を超えるか、（最も頻繁には）約３７℃を超える範囲である。より長いフラグメントは、特異的ハイブリッド形成により高いハイブリッド温度が必要であり得る。いくつかの因子が、ハイブリッド形成のストリンジェンシーに影響を与え、パラメータの組み合わせが１つの因子の絶対的基準よりも重要である。
【０１７８】
これらの検討材料を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、以下の方法に従って合成することができる。
【０１７９】
１．オリゴヌクレアーゼプライマー設計ストラテジー
配列決定、ＰＣＲ、または本発明の切断構造の調製を目的とする特定のオリゴヌクレオチドプライマーの設計には、標的配列を認識することができるが最小の推定二次構造を有する配列の選択が含まれる。オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列の１つの部位のみに結合する。さらに、オリゴヌクレオチドのＴｍをオリゴヌクレオチドの長さおよびＧＣ含量の分析によって至適化する。さらに、ゲノムＤＮＡの増幅に有用なＰＣＲプライマーを設計する場合、選択されたプライマー配列はＧｅｎＢａｎｋデータベース（または他の利用可能なデータベース）中の配列と有意に適合しない。
【０１８０】
上記のいくつかのパラメータおよびプライマー配列の至適化の評価を支援するために開発された容易に利用可能なコンピュータプログラムの使用によってプライマーの設計を容易にする。このようなプログラムの例は、ＤＮＡＳｔａｒＴＭソフトウェアパッケージの「ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ」（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｏｓｎ、ＷＩ）、ＬＩＧＯ ４．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）、ＰＲＩＭＥＲ、オリゴヌクレオチド選択プログラム、ＰＧＥＮ、およびＡｍｐｌｉｆｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５「分子生物学ショートプロトコル」、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓに記載）である。１つの実施形態では、（例えば、ＰＣＲ産物を配列決定するための）さらなる増幅用の標的として使用する末端上の配列が既知のＰＣＲ産物を作製するように他のプライマーの標的として作用する配列を使用してプライマーを設計する。多数の異なる標的核酸配列が共通の「テール配列」を共有する特異的プライマーで増幅された場合、これらの識別可能な遺伝子由来のＰＣＲ産物を１つのプライマー組を使用してその後配列決定することができる。あるいは、増幅配列のその後のクローニングを容易にするために、その５’末端に付加された制限酵素部位配列を使用してプライマーを設計する。したがって、プライマーの全ヌクレオチドは、制限酵素部位を形成するために必要ないくつかのヌクレオチドを除いて標的核酸配列または標的核酸配列に隣接する配列由来である。このような酵素および部位は当該分野で周知である。標的核酸配列ゲノム配列および標的核酸配列の読み取り枠の配列は公知であり、特定のプライマーの設計は十分に当業者の知識の範囲内である。
【０１８１】
オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合することができるように、オリゴヌクレオチドを一定の化学的および／または捕捉部分を使用して合成することができることが当業者に周知である。適切な捕捉部分には、ビオチン、ハプテン、タンパク質、ヌクレオチド配列、または化学反応性部分が含まれるが、これらに限定されない。このようなオリゴヌクレオチドを、溶液中で最初に使用後固体支持体に捕捉するか、固体支持体に最初に結合後検出反応で使用することができる。後者の例は、下流プローブ分子の５’末端が蛍光クエンチ剤を含むように下流プローブ分子に固体支持体を結合させることである。この下流プローブ分子はまた、ＦＥＮヌクレアーゼ切断が蛍光発生団からクエンチ剤を物理的に分離するような位置に蛍光発生団を含む。例えば、標的核酸は固相下流プローブオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができ、液相上流プライマーはまた標的分子とハイブリッド形成することができるので、固体支持体でＦＥＮ切断反応が起こって複合体から５’クエンチ剤部分が遊離する。これにより、固体支持体結合蛍光発生団を検出することができるので、適切に標識されるか同定される固体支持体上で切断事象の存在が明らかとなる。異なる下流プローブ分子を、アレイ上の異なる位置に結合させることができる。アレイ上の位置によりプローブ分子を同定し、プローブ分子がハイブリッド形成することができるテンプレートの存在が示される。
【０１８２】
２．合成
当該分野での周知の技術を使用して、プライマー自体を合成する。特異的配列のオリゴヌクレオチドの調製法が当該分野で公知であり、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限消化ならびに直接的化学合成が含まれる。一旦設計されると、例えば、Ｎａｒａｎｇら、１９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８，９０に記載のリン酸トリエステル法、Ｂｒｏｗｎら、１９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ、６８、１０９に開示のリン酸ジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２、１８５９に開示のジエチルホスホロアミデート法、および米国特許第４，４５８，０６６号に開示の固体支持体法、または市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機（市販）またはＶＬＳＩＰＳＴＭ技術のいずれかを使用した他の化学的方法を含む適切な化学合成法によってオリゴヌクレオチドを調製する。
【０１８３】
Ｃ．プローブ
本発明は、本明細書中で定義の標識切断構造の形成に有用なプローブを提供する。本発明の標識切断構造の調製法を、以下のタイトル「切断構造」の項に記載している。
【０１８４】
本明細書中で使用される、用語「プローブ」は、プローブ中の少なくとも１つの配列が標的領域中の配列と相補的であるために標的核酸中の配列と二重鎖構造を形成する標識オリゴヌクレオチドをいう。プローブは、プライマー伸長で使用する配列に相補的な配列を含まないことが好ましい。一般に、プローブの３’末端を「ブロック」してプライマー伸長産物へのプローブの組み込みを抑止する。非相補塩基の使用または最後のヌクレオチドの３’水酸基へのビオチンまたはリン酸基などの化学的部分の添加により「ブロッキング」を行うことができ、これは、選択部分に依存して、標識に結合した核酸のその後の検出または捕捉用の標識としての作用によって二重の目的を果たし得る。３’−ＯＨの除去またはジデオキシヌクレオチドなどの３’−ＯＨを欠くヌクレオチドの使用によってブロッキングを行うこともできる。
【０１８５】
本発明のプローブの標識法および適切な標識を、以下のタイトル「切断構造」の項に記載する。
【０１８６】
Ｄ．核酸の産生
本発明は、標的核酸配列の増幅および切断構造の形成のために検出または測定される核酸を提供する。
【０１８７】
本発明は、核酸（ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態、および混合ポリマーを含む）を利用する。本発明には、核酸のセンスおよびアンチセンス鎖が含まれる。本発明によれば、核酸は化学的または生化学的に改変され得、非天然もしくは誘導ヌクレオチド塩基を含み得る。このような改変には、例えば、標識、メチル化、１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドのアナログとの置換、ヌクレオチド間改変（無電荷結合（例えば、リン酸メチル、ホスホロジチオエートなど）、懸垂部分（例えば、ポリペプチド）、挿入物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、および改変結合（例えば、αアノマー核酸など）など）が含まれる。水素結合および他の化学的相互作用を介した設計配列への結合能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。このような分子は当該分野で公知であり、例えば、分子の主鎖のリン酸結合をペプチド結合に置換された分子が含まれる。
【０１８８】
１．ＤＮＡを含む核酸
ａ．クローニング。ＤＮＡを含む核酸を、当業者に周知のクローニング法（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）によってｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから単離することができる。簡単に述べれば、特定の核酸配列を含むＤＮＡクローンの単離は、組換えＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよび所望の配列を含むクローンの同定をふくむ。クローニングは、以下の工程を含む。特定のライブラリーのクローンをプレートに広げ、適切なスクリーニング用基質に移し、変性し、特定の核酸の存在を探索する。ハイブリッド条件および標識プローブの作製法を、以下に記載する。
【０１８９】
所望のクローンを、核酸プローブへのハイブリッド形成または抗体によって検出することができるタンパク質の発現によって同定することが好ましい。あるいは、所望のクローンを、下記の方法に従った特定のプライマー組によって定義される配列のポリメラーゼ連鎖増幅によって同定する。
【０１９０】
適切なライブラリーの選択は、豊富な所望の配列の供給源である組織または細胞株の同定を含む。さらに、目的の核酸が調節配列またはイントロン配列を含む場合、ゲノムライブラリーをスクリーニングする（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）。
【０１９１】
ｂ．ゲノムＤＮＡ
本発明の核酸配列を、ゲノムＤＮＡから増幅する。以下の方法に従って、ゲノムＤＮＡを組織または細胞から単離する。
【０１９２】
特定の組織由来の遺伝子の変形形態の検出を容易にするために、周囲の正常な組織から該組織を単離する。哺乳動物組織からゲノムＤＮＡを単離するために、組織を細かく刻んで液体窒素中で凍結する。凍結組織を予め冷却した乳鉢および乳棒で微粉に挽き、１００ｍｇの組織あたり１．２ｍｌの消化緩衝液で、消化緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中に懸濁する。哺乳動物組織培養細胞からゲノムＤＮＡを単離するために、５００×ｇで５分間の遠心分離によって細胞をペレット化し、１〜１０ｍｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁し、５００×ｇで５分間の遠心分離によって再ペレット化し、１体積の消化緩衝液中に再懸濁する。
【０１９３】
消化緩衝液中のサンプルを、５０℃で１２〜１８時間（震盪しながら）インキュベートし、同体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出する。遠心分離工程（１７００×ｇで１０分間）後に層が分離しない場合、別の体積の消化緩衝液（プロテイナーゼＫを含まない）を添加して、遠心分離工程を繰り返す。厚い白色の物質が二層の境界で認められた場合、有機抽出工程を繰り返す。上部を抽出後、水層を、１／２体積の７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２体積の１００％エタノールを添加した新規のチューブに移す。核酸を１７００×ｇで２分間の遠心分離でペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に１ｍｇ／ｍｌで再懸濁する。０．１％ＳＤＳおよび１μｇ／ｍｌの無ＤＮアーゼＲＮアーゼの存在下で、３７℃で１時間のサンプルのインキュベーションおよび抽出およびエタノール沈殿工程の反復によって残りのＲＮＡを除去した。本方法によるゲノムＤＮＡの収率は、約２ｍｇ／１ｇ細胞または組織と予想される（Ａｕｓｕｂｅｌ ら．、前出）。本方法によって単離したゲノムＤＮＡを、本発明に従ったＰＣＲ分析に使用することができる。
【０１９４】
ｃ．（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの）制限消化
特定の標的核酸配列を含む所望のｃＤＮＡまたはゲノムクローンの同定後、制限酵素での消化によってこれらのクローンから本発明の核酸を単離することができる。
【０１９５】
制限酵素消化技術は当業者に周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）。制限酵素消化に有用な試薬は、他の供給源と同様にＳｔｒａｔａｇｅｎｅを含む供給業者から用意に利用することができる。
【０１９６】
ｄ．ＰＣＲ
本発明の核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってゲノムＤＮＡまたは他の天然の供給源から増幅することができる。ＰＣＲ法は、当業者に周知である。
【０１９７】
ＰＣＲにより、目的の標的配列を増幅するための熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される複数のＤＮＡ複製サイクルの使用による特定のＤＮＡ配列の迅速な増幅法が得られる。ＰＣＲには、増幅すべき標的核酸配列、増幅すべき配列に隣接する２つの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液、および塩が必要である。
【０１９８】
Ｍｕｌｌｉｓ ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５、３５５（本明細書中で参考として援用される）に記載のようにＰＣＲを行う。
【０１９９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、および同第４，８００，１５９号に開示されている。その最も単純な形態では、ＰＣＲは反対の鎖とハイブリッド形成し、標的ＤＮＡ中の目的の領域に隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、特異的ＤＮＡ配列のインビトロ酵素合成法である。テンプレートの変性、プライマーアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングプライマーの伸長を含む一連の連続反応により、末端がプライマーの５’末端によって定義される特異的フラグメントが指数関数的に蓄積される。ＰＣＲにより、１０９倍の特異的ＤＮＡ配列を選択的に富化することができると報告されている。ＰＣＲ法はまた、Ｓａｉｋｉら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、１３５０に記載されている。
【０２００】
テンプレートＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ、より通常には１〜１００ｎｇ）および少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲを行う。典型的な反応混合物は、２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの適切な緩衝液、０．４マイクロｌの１．２５μＭ ｄＮＴＰ、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および脱イオン水を水で２５μｌにしたものを含む。鉱物油で重層し、プログラム可能なサーマルサイクラーを使用してＰＣＲを行う。
【０２０１】
ＰＣＲサイクルの各工程の長さおよび温度ならびにサイクル数を、有効なストリンジェンシー要件に従って調整する。プライマーがテンプレートにアニーリングすると予想される効率および許容されるミスマッチの程度によってアニーリング温度およびタイミングを決定する。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを至適化する能力は、十分に当業者の知識の範囲内である。３０℃と７２℃との間のアニーリング温度を使用する。通常、９２℃と９９℃との間で４分間テンプレート分子を最初に変性後、変性（９４〜９９℃で１５秒間〜１分間）、アニーリング（上記での考察によって決定した温度で１〜２分間）、および伸長（７２℃で１分間）からなる２０〜４０サイクルを行う。一般に、７２℃で４分間の最終伸長工程を行い、その後４℃での不確定（０〜２４時間）の工程を行うことができる。
【０２０２】
一般に、標準的ＰＣＲ技術で使用される検出法は、ハイブリッドアッセイでの増幅ＤＮＡに標識した標識プローブを使用する。好ましくは、例えば３２Ｐ、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などでプローブを標識して、ハイブリッド形成の検出を行う。
【０２０３】
他の検出手段には、フラグメント長多形（ＰＣＲ ＦＬＰ）の使用、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブへのハイブリッド形成（Ｓａｉｋｉら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ，３２４、１６３）、またはジデオキシ法による直接的配列決定（クローン化ＤＮＡよりもむしろ増幅ＤＮＡを使用する）が含まれる。標準的ＰＣＲ技術は、２つのプライマーの間に存在するＤＮＡ配列の複製、主要な反応産物としての各鎖の５’末端でプライマーで終結した個別の長さのＤＮＡ配列の獲得によって（本質的に）操作する。したがって、プライマー間の挿入および欠失により、ＰＣＲ−ＦＬＰでの産物のサイズ決定により検出することができる異なる長さの産物配列が得られる。ＡＳＯハイブリッド形成の例では、一連の「ドットブロット」において増幅ＤＮＡをナイロンフィルター（例えば、ＵＶ照射による）に固定し、ストリンジェントな条件下でＨＲＰで標識したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成する。洗浄後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）および過酸化水素を添加する。ＨＰＲは過酸化水素を酸化して（すなわち、ＴＭＢを青色沈殿に酸化する）、ハイブリッド形成プローブを呈示する。
【０２０４】
本発明の核酸の検出または測定用のＰＣＲアッセイは、タイトル「使用法」の項に記載されている。
【０２０５】
２．ＲＮＡを含む核酸
本発明はまた、ＲＮＡを含む核酸を提供する。
【０２０６】
ＲＮＡを含む核酸を、当該分野で周知の方法に従って精製することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）。当該分野で周知であり（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）、且つ以下に記載の方法に従って、細胞または組織から全ＲＮＡを単離することができる。
【０２０７】
以下の方法に従って哺乳動物組織からＲＮＡを精製する。目的の組織を取り出した後、２ｇ以下の組織片を切断して、液体窒素中で急速凍結してＲＮＡの分解を防止する。適量（例えば、２ｇの組織あたり２０ｍｌのグアニジニウム溶液）のグアニジニウム溶液の添加の直後、組織サンプルを組織噴霧器により２または３回の１０秒間のバーストで挽く。組織グアニジウム溶液（１Ｌ）を調製するために、５９０．８ｇのグアニジウムイソチオシアネートを約４０ｍｌのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解する。２５ｍｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（最終濃度０．０５Ｍ）および２０ｍｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ（最終濃度０．０１Ｍ）を添加し、溶液を一晩撹拌し、体積を９５０ｍｌに調整し、５０ｍｌの２−ＭＥを添加する。
【０２０８】
ホモゲナイズした組織サンプルを、１２，０００×ｇ、１２℃で１０分間の遠心分離に供する。得られた上清を０．１体積の２０％Ｓａｒｋｏｓｙｌの存在下、６５℃で２分間インキュベートし、９ｍｌの５．７ＭＣｓＣｌ溶液（０．１ｇ ＣｓＣｌ／ｍｌ）で重層し、２２℃、１１３，０００×ｇで一晩の遠心分離によって分離する。慎重な上清の除去後、チューブを反転して排出を行う。チューブの底（ＲＮＡペレットを含む）を、５０ｍｌのプラスチック製チューブに入れ、３ｍｌの組織再懸濁緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｓａｒｋｏｓｙｌ、５％（ｖ／ｖ）２−ＭＥ）の存在下、４℃で一晩インキュベートして、ＲＮＡペレットを完全に再懸濁する。得られたＲＮＡ溶液を２５：２４：１フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、２４：１クロロホルム／イソアミルアルコールで連続的に抽出し、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２．５体積の１００％エタノールの添加によって沈殿させ、ＤＥＰＣ水に再懸濁する（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８、５２９４）。
【０２０９】
あるいは、１工程プロトコールに従って、哺乳動物組織からＲＮＡを単離する。１００ｍｇの組織あたり１ｍｌの変性溶液（４Ｍグアニジニウムチオ硫酸、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ２−ＭＥ、０．５％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン）中でのガラステフロン（登録商標）ホモジナイザーでの均質化によって目的の組織を調製する。ホモジネートを５ｍｌポリプロピレンチューブに移した後、０．１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、１ｍｌの水飽和フェノール、および０．２ｍｌの４９：１クロロホルム／イソアミルアルコールを連続的に添加する。各成分の添加後にサンプルを混合し、全成分の添加後に０〜４℃で１５分間インキュベートする。サンプルを４℃、１０，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって分離し、１ｍｌの１００％イソプロパノールの添加によって沈殿させ、−２０℃で３０分間インキュベートし、４℃、１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化する。得られたＲＮＡペレットを、０．３ｍｌの変性溶液に溶解し、微量遠心管に移し、−２０℃で３０分間の０．３ｍｌの１００％イソプロパノール添加によって沈殿させ、４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離する。ＲＮＡペレットを７０％エタノール中で洗浄し、乾燥し、１００〜２００μｌのＤＥＰＣ処理水またはＤＥＰＣ処理０．５％ＳＤＳに再懸濁する（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２、１５６）。
【０２１０】
インビトロ転写法に従って、ＲＮＡを含む核酸を作製することができる。
【０２１１】
インビトロ転写技術は当業者に周知である。簡単に述べれば、目的の遺伝子をＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７プロモーターを含むベクターに挿入する。ベクターを、コード配列の下流に存在する１つの部位でベクターを消化する適切な制限酵素で線状化する。フェノール／クロロホルム抽出後、ＤＮＡをエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、滅菌水に再懸濁する。転写緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭスペルミジン、２５０ ＮａＣｌ［Ｔ７またはＴ３］、または２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭスペルミジン［ＳＰ６］）、ジチオスレイトール、ＲＮアーゼインヒビター、それぞれ４つのリボヌクレオシド三リン酸、ＳＰ６、Ｔ７、またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼのいずれかと線状化ＤＮＡとの３７℃で３０分間のインキュベーションによって、インビトロ転写反応を行った。ＲＮＡを含む放射性標識ポリヌクレオチドを調製するために、非標識ＵＴＰを省略し、３５Ｓ−ＵＴＰを反応混合物に含める。ＤＮＡテンプレートをＤＮアーゼＩとのインキュベーションにより取り除く。エタノール沈殿後、放射性標識ＲＮＡのアリコートを、シンチレーションカウンターで計数してｃｐｍ／μｌを決定する（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）。
【０２１２】
あるいは、ＲＮＡを含む核酸を、固相ホスホラミダイド（上記）などの化学合成技術によって調製する。
【０２１３】
３．オリゴヌクレオチドを含む核酸
オリゴヌクレオチドを含む核酸を、市販されているオリゴヌクレオチド合成機の使用によって作製することができる（上記）。
【０２１４】
ＩＶ．切断構造
本発明は、ＦＥＮヌクレアーゼで切断することができる切断構造を提供するので、切断構造の調製法を教示する。本発明はまた、標識切断構造および標識切断構造の調製法を提供する。
【０２１５】
Ａ．切断構造の調製
本発明の切断構造を、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成する条件下（例えば、９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）での、ａ）上流、好ましくは伸長可能な３’末端、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ）上流プライマーの５０００ヌクレオチド下流以下に存在するオリゴヌクレオチドプローブ、ｃ）標的配列が両プライマーに相補的な適切な標的核酸配列、およびｄ）適切な緩衝液（例えば、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｅａｃｏｎＰＣＲコア緩衝液（カタログ番号６００５００）またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから市販されている１０×Ｐｆｕ緩衝液（カタログ番号２００５３６））のインキュベーションによって形成する。至適温度は、特異的プローブ、プライマー、およびポリメラーゼに依存して変化する。本発明の好ましい実施形態では、切断構造は、標的核酸配列にハイブリッド形成することができる上流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＡ）の３’末端が標的核酸配列にアニーリングする下流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＣ）の１つまたは複数の塩基対に相補的であり、１つの塩基対の重複が一本鎖フラップの伸長点のすぐ下流である重複フラップを含む。
【０２１６】
上流オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を、新規に合成された上流オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端が下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に部分的に置換されるような本発明のポリメラーゼの合成活性によって伸長する。Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎＰＣＲコア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液中で７２℃で１５秒間伸長させることが好ましい。本発明の１つの実施形態では、本発明の切断構造を、標的核酸配列と、３’相補領域が標的核酸配列にアニーリングし標的核酸配列にアニーリングしない非相補５’領域が５’フラップを形成するような部分的に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーとのインキュベーションによって調製することができる。適切な緩衝液（１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎコア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液等）の存在下、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリッド形成する条件下（例えば、例えば、９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）で、アニーリングを行うことが好ましい。
【０２１７】
Ｂ．標識切断構造の調製法
本発明では、標識を切断構造を含むオリゴヌクレオチドプライマーに結合させてプローブを形成する。したがって、フラップ特異性ヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性によって切断された切断モノヌクレオチドまたは小さなオリゴヌクレオチドを検出することができる。
【０２１８】
本発明の標識構造を、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成する条件下（例えば、約９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）での、ａ）上流の伸長可能な３’末端、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ）上流プライマーの５００ヌクレオチド下流以下に存在する標識プローブ、ｃ）標的配列がオリゴヌクレオチドに相補的な適切な標的核酸配列、およびｄ）適切な緩衝液（例えば、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎコア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液）のインキュベーションによって形成する。本発明の切断構造はまた、標的核酸配列にハイブリッド形成することができる上流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＡ）の３’末端が、標的核酸配列にアニーリングする下流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＣ）の１つまたは複数の塩基対に相補的であり、１つの塩基対の重複が一本鎖フラップの伸長点のすぐ下流である重複フラップを含む。上流プライマーの３’末端を、新規の合成された上流プライマーの３’末端が下流プローブの標識５’末端に部分的に置換されるようなポリメラーゼの合成活性によって伸長する。１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎコア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液中で７２℃で１５秒間伸長させることが好ましい。本発明の切断構造を、標的核酸配列とともに、該標的核酸配列にアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補標識５’領域および該標的核酸配列にアニーリングする相補３’領域とを含むプローブをインキュベーションして調製することができる。適切な緩衝液（例えば１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎコア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液）の存在下、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリッド形成する条件下（例えば、９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）で、アニーリングを行うことが好ましい。
【０２１９】
次いで、任意のいくつかのストラテジーを使用して、非切断標識核酸とその切断フラグメントを区別することができる。この様式では、本発明により、標的核酸配列を含むこれらのサンプルの同定が可能である。
【０２２０】
オリゴヌクレオチドプローブを、下記のように、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、酵素、または化学的手段によって検出可能な部分の組み込みによって標識する。オリゴヌクレオチドプローブへの標識の連結または抱合法は、勿論、使用した標識の型およびプローブ上の標識の位置に依存する。好ましくは、プローブを５’末端で標識するが、３’末端で標識したプローブまたはプローブ全体に標識したプローブもまた、本発明の特定の実施形態で有用である。
【０２２１】
本発明での使用に適切な種々の標識ならびにプローブの封入法が当該分野で公知であり、互いに相互作用して、シグナルを増加、変化、または減少させることができる酵素（例えば、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ）および酵素基質、放射性原子、蛍光染料、発色団、化学発光標識、電気化学発光標識（ＯｒｉｇｅｎＴＭ（Ｉｇｅｎ）など）が含まれるが、これらに限定されない。勿論、標識分子をサーマルサイクラー装置を使用して行うＰＣＲベースのアッセイで使用する場合、標識は、この自動化処理過程に必要な温度サイクリングに耐えることができなければならない。
【０２２２】
放射性原子のうち、３３Ｐまたは３２Ｐが好ましい。核酸への３３Ｐまたは３２Ｐの導入法は当該分野で公知であり、例えば、キナーゼでの５’標識またはニック翻訳による無作為挿入が含まれる。「特異的結合パートナー」は、例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体のように、高い特異性でリガンド分子に結合することができるタンパク質をいう。他の特異的結合パートナーには、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡならびに当該分野公知の多数のレセプター−リガンド結合が含まれる。上記は、同一の標識がいくつかの異なる様式で作用することができるように、種々の標識を明確なクラスに分類することを意味しない。例えば、１２５Ｉは、放射性標識または電子密度試薬として作用することができる。ＨＲＰは、酵素またはモノクローナル抗体の抗原として作用することができる。さらに、所望の効果のために種々の標識を組み合わせることができる。例えば、ビオチンでプローブを標識し、１２５Ｉで標識したアビジンまたはＨＲＰで標識した抗ビオチンモノクローナル抗体でプローブの存在を検出することができる。他の置換および可能性は、当業者に容易に明らかであり、本発明の範囲内の等価物とみなされる。
【０２２３】
本発明の標識プローブの構築における標識用の蛍光発生団には、ローダミンおよび誘導体（テキサスレッドなど）、フルオレセインおよび誘導体（５−ブロモメチルフルオレセインなど）、ルシフェルイエロー、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ２Ｎ−クマリン−４−アセテート、７−ＯＨ−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセテート、７−ＮＨ２−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセテート、モノブロモビメイン、ピレントリスルホナート（カスケードブルーなど）、およびモノブロモリメチル−アンモニオビメインが含まれる。一般に、モノクロメーターよりもむしろフィルターを有する蛍光光度計を使用し、検出効率を増大させるために広範なストークスシフトの蛍光発生団が好ましい。
【０２２４】
蛍光発生団で標識したプローブを、本発明の標識プローブを含む切断構造のＦＥＮ媒介切断に容易に使用することができる。標識がプローブの末端に存在する場合、ＦＥＮによって得られた標識フラグメントを、当該分野で周知の手順によって無傷のハイブリッド形成プローブから分離する。次いで、放出標識の蛍光を、標的に結合したままの標識と比較する。プローブが通常５’末端で蛍光発生団およびクエンチ剤（通常、色素の約２０ヌクレオチド下流）で合成された場合、ＦＥＮの存在下での切断後にＦＥＮによって得られたフラグメントおよび標的に結合したままのプローブを分離する必要はない。無傷の場合、色素からの発光がクエンチ剤によってクエンチされるので、このような二重標識プローブは蛍光を発生しない。したがって、無傷のプローブによって発生する任意の蛍光は、バックグラウンド蛍光であるとみなされる。標識プローブがＦＥＮヌクレアーゼで切断された場合、色素およびクエンチ剤が分離して放出フラグメントが蛍光を発する。蛍光の量は、サンプル中に存在する核酸標的配列の量に比例する。
【０２２５】
いくつかの状況では、オリゴヌクレオチド加水分解中に標識が分離可能なオリゴヌクレオチド上の標識の適切な間隔の維持を熟考した１つのオリゴヌクレオチド上の２つの相互作用標識を使用することができる。本発明で有用な好ましい相互作用標識には、ローダミンおよび誘導体、フルオレセインおよび誘導体、テキサスレッド、クマリンおよび誘導体、クリスタルバイオレットが含まれるが、これらに限定されず、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡ、およびＮＴＢ（ニトロチアゾールブルー）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２６】
本発明の別の実施形態では、加水分解標識プローブの検出を、例えば、蛍光偏光、分子回転に基づいた巨大分子と小分子とを区別する技術を使用して行うことができる。巨大分子（すなわち、無傷の標識プローブ）は、溶液中で小分子よりもさらによりゆっくりと回転する。蛍光部分の目的の分子への結合の際（例えば、標識プローブの５’末端）、この蛍光部分を分子回転に基づいて測定（および区別）することができるので、無傷のプローブと消化プローブを測定することができる。
【０２２７】
さらに別の実施形態では、それぞれ二本鎖標的配列の別の鎖の別の領域に相補的であるが、互いには相補的ではないので標識核酸が各プライマーの下流にアニーリングする２つの標識核酸を使用する。例えば、２つのプローブの存在により、シグナル標識から発生するシグナルの強度は潜在的に２倍になり、ＰＣＲ増幅でしばしば起こるように産物の鎖の再アニーリングが減少するようにさらに作用し得る。プライマーが結合する位置に隣接する位置（下流）でプローブが結合するようにプローブを選択する。
【０２２８】
他の利点を得るために本発明の複数のプローブを使用することもできる。例えば、サンプル中の任意の数の病原性物質を、単に反応混合物中に所望の数のプローブと投入してテストしてよく、検出を容易にするために、プローブはそれぞれ異なる標識を含み得る。
【０２２９】
例えば、異なるＴｍを有するプローブの使用および１つのみのプローブ／対立遺伝子二重鎖に特異的な温度でのアニーリング／切断により、本発明の複数のプローブを使用して対立遺伝子特異的または種特異的識別を行うこともできる。１つのみのプローブの使用および得られた切断産物の型の試験によって対立遺伝子特異的識別を行うこともできる。本発明のこの実施形態では、１つの対立遺伝子の少なくとも５’末端領域に正確に相補的であるが他の対立遺伝子には相補的ではないようにプローブを設計する。他の対立遺伝子に関しては、プローブの５’末端領域でプローブがミスマッチして、プローブが正確に相補的な対立遺伝子とハイブリッド形成する場合に得られる切断産物と比較して、異なる切断産物が得られる。
【０２３０】
重要な利点が得られるようにプローブ配列を選択することができるにもかかわらず、プローブ標識の選択によって重要な利点が認識することもできる。標識を、種々の技術によって直接または間接的にオリゴヌクレオチドに結合させることができる。使用した標識の正確な型に依存して、シグナル相互作用を促進するために、標識をプローブの５’または３’末端に位置付けるか、プローブ内部に位置付けるか、種々のサイズのスペーサーアームおよび組成物に結合させることができる。市販のホスホラミダイド試薬を使用して、適切に保護したホスホラミダイドを介して５−または３末端のいずれかで官能基（例えば、チオールまたは１価のアミン）を含むオリゴマーを作製し、例えば「ＰＣＲプロトコール：方法および応用ガイド」、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｄ．、１９９０に記載のプロトコールを使用して標識することができる。
【０２３１】
オリゴヌクレオチドプローブ配列の典型的には５’末端への１つまたは複数のスルフヒドリル、アミノ、または水酸部分を導入するためのオリゴヌクレオチド官能化試薬導入法は、米国特許第４，９１４，２１０号に記載されている。ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−３２Ｐ−ＡＴＰまたはγ−３３Ｐ−ＡＴＰの使用によって、放射線同位元素として５’リン酸基を導入して、レポーター基を得ることができる。アミノチミジン残基または合成中に導入された６−アミノヘキシル残基のビオチンのＮヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によってビオチンを５’末端に添加することができる。３’末端の標識は、所望の部分（例えば、コルダイセピン３５Ｓ−ｄＡＴＰおよびビオチン化ｄＵＴＰなど）を添加するためにポリヌクレオチド末端トランスメラーゼを使用することができる。
【０２３２】
オリゴヌクレオチド誘導体はまた、利用可能な標識である。例えば、エテノ−ｄＡおよびエテノ−Ａは、核酸プローブに組み込むことができる公知の蛍光アデニンヌクレオチドである。同様に、エテノ−ｄＣまたは２−アミノプリンデオキシリボシドは、プローブ合成に使用することができる別のアナログである。このようなヌクレオチド誘導体を含むプローブを加水分解して、フラップ特異的ヌクレアーゼ活性によってさらにより強力に蛍光モノヌクレオチドを放出することができる。
【０２３３】
Ｃ．切断構造の切断およびシグナルの発生。本発明の切断構造を、上記の項（タイトル「ＦＥＮヌクレアーゼ」）に記載の方法によって切断することができる。
【０２３４】
Ｄ．放出標識フラグメントの検出
標識フラグメントの変形形態の検出を、当該分野で周知の種々の方法によって行うことができ、これは標識切断構造を含む標識部分の特徴に依存し得る。
【０２３５】
１つの実施形態では、放出標識フラグメントを含む反応産物を、サイズ分析に供する。標識フラグメントサイズの同定法は当該分野で公知であり、例えば、ゲル電気泳動、勾配沈殿法、ゲル排除クロマトグラフィー、質量分析、およびホモクロマトグラフィーが含まれる。
【０２３６】
増幅中および増幅後、例えば、ＰＣＲ混合物からの放出標識フラグメントの分離を、例えばＰＣＲと固相抽出溶媒（ＳＰＥ）との接触によって行うことができる。例えば、標識された非切断核酸が結合し、短い標識フラグメントが結合しない条件下で、サイズ、電荷、核酸塩基との相互作用に基づく核酸結合能力を有する物質をＰＣＲ混合物に添加することができる。このようなＳＰＥ物質には、イオン交換樹脂およびビーズ（市販の結合粒子であるＮｅｎｓｏｒｂ（ＤｕＰｏｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、Ｎｕｃｌｅｏｇｅｎ（Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ）、ＰＥＩ、ＢａｋｅｒＢｏｎｄＴＭＰＥＩ、Ａｍｉｃｏｎ ＰＡＥ１，０００、ＳｅｌｅｃｔａｃｅｌＴＭＰＥＩ、３’リボースプローブを含むＢｏｒｏｎａｔｅ ＳＰＥ、プローブの３’末端に相補的な配列を含むＳＰＥ、およびハイドロキシアパタイトなどが含まれる。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ感受性切断サイトによって５’標識から分離された３’ビオチン標識を含む二重標識オリゴヌクレオチドをシグナル手段として使用する場合、反応混合物（例えば、ＰＣＲ増幅混合物）を、特異的結合パートナー（アビジンまたはストレプトアビジンなど）またはビオチンに対する抗体もしくはモノクローナル抗体を含む物質と接触させることができる。このような物質には、特異的結合パートナーで被覆したビーズおよび粒子を含み、磁性粒子も含み得る。
【０２３７】
反応混合物（例えば、ＰＣＲ混合物）をＳＰＥと接触する工程の後、ＳＰＥ物質を濾過、沈殿、または磁力によって除去して、残余の非切断標識オリゴヌクレオチドを含まない標識フラグメントが検出に用いられる。
【０２３８】
ＩＶ．使用法
本発明は、標的核酸配列と核酸ポリメラーゼとのインキュベーションによって標識切断構造を形成する工程と、ＦＥＮヌクレアーゼで切断構造を切断する工程とを包含する、サンプル中の標的核酸配列の存在の指標となるシグナルの発生法を提供する。本発明の方法を、下記のＰＣＲベースのアッセイで使用することができる。
【０２３９】
上流オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、図３のＡ）、５’末端標識下流オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、図３のＣ）、および標的核酸配列（例えば、図３のＢ）を含む標識切断構造を、上記のタイトル「切断構造」の項に記載のように形成した。簡単に述べれば、標的核酸配列、上流プライマー（例えば、図３のＡ）、標識下流プローブ（例えば、図３のＣ）、標的核酸配列に特異的な複数の増幅プライマー、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼ、ＦＥＮヌクレアーゼおよびＰＣＲ反応に適切な緩衝液（例えば、１０×Ｐｆｕ緩衝液、Ｓｔｒａｇｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５３６）の存在下で、以下の熱サイクルパラメータ（９５℃で２分間ならびに９５℃で１５秒間（変性工程）、６０℃で６０秒間（アニーリング工程）、および７２℃で１５秒間（伸長工程）を４０サイクル）を使用して切断構造を形成し、切断する。この反応中、上流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＡ）が標的核酸配列（例えば、図３のオリゴヌクレオチドＣ）にアニーリングする下流オリゴヌクレオチドの５’標識末端を置換するようにオリゴヌクレオチドが伸長され、得られた標識構造は、本発明のＦＥＮヌクレアーゼで切断される。
【０２４０】
本発明の方法を、標的を固体支持体上で固定することができるような非ＰＣＲベース処理で使用して、標的核酸配列を検出することができる。固体支持体上の核酸配列の固定法は当該分野で公知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭら「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ Ｉｎｃ．および製造者が供給しているプロトコール（例えば膜についてはＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、磁性ビーズについてはＤｙｎａｌ、培養プレートについてはＣｏｓｔａｒ、Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ、本発明で有用な他の支持体についてはＣＰＧ，Ｉｎｃ．）に記載されている。本発明で有用な固体支持体には、シリカベースの物質、膜ベースの物質、および表面（スチレンラテックス、またはシリカベースの物質および他のポリマーが含まれるが、これらに限定されない）を含むビーズが含まれる。磁性ビーズも本発明で有用である。上記の製造者および他の公知の製造者から固体支持体を得ることができる。
【０２４１】
本発明はまた、溶液中の標的核酸配列の検出用の非ＰＣＲベースのアッセイを提供する。本発明の方法を使用して、溶液中の天然に存在する標的核酸配列（細胞、組織、単細胞生物、細菌、またはウイルスから単離または精製したＲＮＡおよびＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない）を検出することができる。本発明の方法を使用して、溶液中の合成標的（ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない）を検出することもできる。非ＰＣＲアッセイには、３’→５’合成活性によって合成された核酸の量が一次関数または指数関数的に増加する等温直線的又は指数的増幅を含む検出アッセイが含まれるが、これらに限定されず、ＦＥＮヌクレアーゼを使用して、合成中の置換鎖を切断する。このような例の１つは、ローリングサークル増幅を利用する。
【０２４２】
固定核酸標的配列または溶液中の標的核酸配列と、標的核酸配列に相補的な上流オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、図３のＡ）および標的核酸配列に相補的な下流オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、図３のＣ）、ＦＥＮヌクレアーゼ、および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼとのインキュベーションによって、固定されているか溶液中に存在する核酸標的配列の検出を行うことができる。下流プローブは、５’または３’末端で末端標識されたものであるか、内部標識されている。放出標識フラグメントの検出には、プローブに組み込まれる特異的標識に適切な同位体、酵素、または比色法が含まれる。本発明で有用な標識および本発明で有用な標識の検出法は、タイトル「切断構造」の項に記載されている。あるいは、下流プローブは、プローブが無傷の場合に検出可能なシグナルの発生がクエンチされるように存在する相互作用性シグナル発生標識部分の対（例えば、色素およびクエンチ剤）を含み、相互作用シグナル発生部分の対はＦＥＮヌクレアーゼ切断サイトによって隔離されている。ＦＥＮヌクレアーゼでの切断の際、２つのシグナル発生部分が互いに分離し、検出可能なシグナルが発生する。本発明の方法での固定核酸標的配列または溶液中の核酸標的配列の検出に有効な核酸ポリメラーゼには、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く中温性、好熱性、または超好熱性ＤＮＡポリメラーゼが含まれる（タイトル「核酸ポリメラーゼ」の項に記載）。
【０２４３】
非ＰＣＲベースの方法によれば、検出することができる標的核酸配列の量は、好ましくは約１ｐｇ〜１μｇ、より好ましくは約１ｐｇ〜１０ｎｇ、最も好ましくは約１ｐｇ〜１０ｐｇである。あるいは、この非ＰＣＲベースの方法により、好ましくは約１分子〜１０２０分子、より好ましくは約１００分子〜１０１７分子、最も好ましくは約１０００分子〜１０１４分子を測定または検出することができる。
【０２４４】
本発明はまた、タイトル「切断構造」に記載のように切断配列を形成し、非ＰＣＲベースの方法（等温法（例えば、ローリングサークル、自律配列複製増幅（３ＳＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ））および非等温法（例えば、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ））が含まれるが、これらに限定されない）によって標的核酸配列を増幅する、サンプル中の標的核酸配列の検出法を提供する。非ＰＣＲ増幅法に有用なＦＥＮヌクレアーゼは、使用される特定の増幅法に適切な温度範囲で活性である。
【０２４５】
以下に記載の増幅プロトコールでは、標的を定量するために調製する必要があるサンプルには、サンプル、非テンプレートコントロール、および検量線作成用反応物（規定の標的量を含めて１０６オーダーの希釈液を含む）が含まれる。
【０２４６】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、制限酵素がその認識部位のヘミホスホロチオエート形態の非改変鎖にニックを形成する能力に基づく。適切なＤＮＡポリメラーゼは、このニックで複製を開始し、下流非テンプレート鎖を置換する（Ｗａｋｅｒ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、３９２、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、３、１〜６、１９９３）。ＳＤＡ法で使用されるポリメラーゼ（ＢｃａおよびＢｓｔ）を、本発明のＦＥＮ指向性切断に使用することもできる。本発明の方法によれば、分子標識を４２℃で活性なＦＥＮヌクレアーゼおよび本発明の切断構造を含む切断プローブに置換する。
【０２４７】
分子標識（Ｍｂ）は、溶液中でステム−ループ構造を形成する蛍光発生プローブである。典型的には：５’ステム領域（５〜７ｎｔ）、ループ領域（標的に相補的、２０〜３０ｎｔ）、３’ステム領域（５’ステム領域に相補的）、およびクエンチ剤（例えば、ＤＡＢＣＹＬ）に結合した５’蛍光色素（例えば、ＦＡＭ）。標的が存在しない場合、ＭＢはステムを形成して色素およびクエンチ剤を近接させて蛍光を発しない。ＭＢはその標的に結合した場合、ステムが開いて色素がクエンチ剤から分離し、プローブが蛍光を発する（Ｔｙａｇｉ Ｓ． ａｎｄ Ｋｒａｍｅｒ ＦＲ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４、３０３〜３０８、１９９６および米国特許第５，９２５，５１７号）。
【０２４８】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）を、本質的にＳｐａｒｇｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、１０、２４７〜２５６、１９９６に記載のように行う。使用した酵素には、制限エンドヌクレアーゼＢｓｏＢＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＤＮＡポリメラーゼ５’−エキソ−Ｂｃａ（Ｐａｎ Ｖｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれる。標的は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）ゲノムに見出される挿入様エレメント（ＩＳ６１１０）である。使用したプライマーは、Ｂ１：ｃｇａｔｃｇａｇｃａａｇｃｃａ（配列番号４）、Ｂ２：ｃｇａｇｃｃｇｃｔｃｇｃｔｇ（配列番号５）、Ｓ１：ａｃｃｇｃａｔｃｇａａｔｇｃａｔｇｔｃｔｃｇｇｇｔａａｇｇｃｇｔａｃｔｃｇａｃｃ（配列番号６）およびＳ２：ｃｇａｔｔｃｃｇｃｔｃｃａｇａｃｔｔｃｔｃｇｇｇｔｇｔａｃｔｇａｇａｔｃｃｃｔ（配列番号７）である。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡを、ヒト胎盤ＤＮＡ中で連続希釈する。０〜１０００Ｍｔｂゲノム等価物、５００ｎｇヒト胎盤ＤＮＡ、１６０単位のＢｓｏＢ１、８単位の５’−エキソ−Ｂｃａ、１．４ｍＭの各ｄＣＴＰαＳ、ＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、３５ｍＭ Ｋ２ＰＯ４（ｐＨ７．６）、０．１ｍｇ／ｍｌアセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１１ｍＭ ＮａＣｌ、０．３ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭＫＣｌ、４％グリセロール、０．００８ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｎＭプライマーＳ１およびＳ２ならびに５０ｎＭプライマーＢ１およびＢ２（ＫＣｌ、グリセロールおよびＥＤＴＡは、ＢｓｏＢ１保存溶液の成分である）を含む５０μｌのサンプル中でＳＤＡを行う。サンプル（３５μｌ）を、煮沸した水浴中で３分間加熱後、ＢｓｏＢ１および５’−エキソ Ｂｃａ（１０．７単位／μｌ ＢｓｏＢ１および０．５３単位／μｌ ５’−エキソＢｃａを含む１５μｌのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓの緩衝液２（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）を添加した。インキュベーションは６０℃で１５分間、その後煮沸水浴中で５分間である。
【０２４９】
５μｌの２連の各サンプルを検出用に取り出す。各反応物は、１×クローン化Ｐｆｕ緩衝液、３．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５単位のエキソＰｆｕ、２３ｎｇ Ｐｆｕ ＦＥＮ−１、１ｎｇ ＰＥＦ、３００ｎＭ各上流プライマー：ａａｇｇｃｇｔａｃｔｃｇａｃｃｔｇａａａ（配列番号８）、および蛍光発生プローブ（例えば、ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）：ａｃｃａｔａｃｇｇａｔａｇｇｇｇａｔｃｔｃ（配列番号９）を含む。反応物をサーマルサイクラーの以下の１サイクルに供する：９５℃で２分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間。次いで、蛍光プレートリーダー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＦｌｕｏｒＴｒａｃｋｅｒまたはＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００配列検出システム（プレート読み出しモード）など）で蛍光を同定する。
【０２５０】
核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）によれば、分子標識を、リアルタイム分析におけるＮＡＳＢＡ ＲＮＡアンプリコンの定量に使用する（Ｌｅｏｎｅら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２６、２１５０）。本発明の方法によれば、分子標識プローブが、本発明の切断構造を含むＦＥＮヌクレアーゼ切断プローブおよび４１℃で活性なＦＥＮヌクレアーゼにより置換されるＮＡＳＢＡを行うことができる。
【０２５１】
本質的にＬｅｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２６、２１５０〜２１５５、１９９８に記載のようにＮＡＳＢＡ増幅を行う。ジャガイモハマキウイルス（ＰＬＲＶ）由来のゲノムＲＮＡ形態を、ＰＤ４１５またはＰＤ４１６（アンチセンス）およびＰＤ４１７（センス）プライマーを使用して増幅する（Ｌｅｏｎｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６６、１９〜２７（１９９７）に詳述）。各ＮＡＳＢＡ反応は、６μｌの滅菌水、４μｌの５×ＮＡＳＢＡ緩衝液（５×ＮＡＳＢＡ緩衝液は２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、６０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ各ＡＴＰ、ＵＴＰ，およびＣＴＰ、７．５ｍＭ ＧＴＰ、および２．５ｍＭＩＴＰ）、４μｌの５×プライマーミックス（７５％ＤＭＳＯおよび１Ｍの各アンチセンスおよびセンスプライマー）のプレミックスを含む。プレミックスを１４μｌのアリコートに分け、これに１μｌのＰＬＲＶ標的を添加する。６５℃で５分間のインキュベーションおよび４１℃で５分間の冷却後、５μｌの酵素ミックスを添加する（反応あたり３７５ｍＭソルビトール、２．１μｇＢＳＡ、０．０８単位のＲＮアーゼＨ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、３２単位をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、および６．４単位のＡＭＶ−ＲＴ（Ｓｅｉｇａｋａｋｕ））。増幅は４１℃で９０分間である。
【０２５２】
５μｌの２連の各サンプルを検出用に取り出す。各反応は、１×クローン化Ｐｆｕ緩衝液、３．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５単位のエキソＰｆｕ、２３ｎｇ Ｐｆｕ ＦＥＮ−１、１ｎｇ ＰＥＦ、３００ｎＭ各上流プライマーＰＤ４１５またはＰＤ４１６、および蛍光発生プローブ（例えば、ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）：ｇｃａａａｇｔａｔｃａｔｃｃｃｔｃｃａｇ（配列番号１０）を含む。反応物をサーマルサイクラーの以下の１サイクルに供する：９５℃で２分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間。次いで、蛍光プレートリーダー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＦｌｕｏｒＴｒａｃｋｅｒまたはＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００配列検出システム（プレート読み出しモード）など）で蛍光を同定する。
【０２５３】
一般に、非ＰＣＲベースの方法によって増幅されるこれらの方法によれば、ＦＥＮヌクレアーゼの存在下で増幅を行うことができ、ＦＥＮヌクレアーゼにより増幅および切断が同時に起こる。タイトル「切断構造」の項に記載のように放出標識フラグメントの検出を行い、この検出は増幅と同時（リアルタイム）または増幅および切断過程の完了後（終点）に行うことができる。
【０２５４】
終点アッセイを使用して、ＦＥＮヌクレアーゼ（上記）の存在下での増幅工程を行う非ＰＣＲベースの方法によって得られた増幅標的を定量することができる。
【０２５５】
終点アッセイには、以下が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５６】
Ａ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１、１０７７およびＢａｒａｎｙ、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、１、５〜１６（１９９１）に記載のライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）。本発明で有用なＬＣＲ産物は、上流プライマーおよび標識下流プローブがＦＥＮヌクレアーゼによって有効に切断される８ヌクレオチドを超えるギャップによって分離される程十分に長い。
【０２５７】
Ｂ．Ｆａｈｙら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１、２５〜３３、１９９１に記載の自律配列複製増幅（３ＳＲ）。自律配列複製増幅（３ＳＲ）は、ＮＡＳＢＡに類似の技術である。Ｅｈｒｉｃｈｔ Ｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、４６９７〜４６９９、１９９７は、３ＳＲ手順を同時結合インビトロ増幅系（ＣＡＴＣＨ）に発展させた。したがって、ＣＡＴＣＨでは、分子標識プローブを、ＲＮＡアンプリコンのリアルタイム分析に使用する。増幅した合成標的は、配列：ｃｃｔｃｔｇｃａｇａｃｔａｃｔａｔｔａｃａｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｔｃｔｇｃａｃｇｔａｔｔａｇｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａｔａｇｇａａａｃａｃｃａａａｇａｔｇａｔａｔｔｔｃｇｔｃａｃａｇｃａａｇａａｔｔｃａｇｇ（配列番号１１）を有する。３ＳＲ反応は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、１ｎＭの二本鎖標的、２μＭ Ｐ１：ｃｃｔｃｔｇｃａｇａｃｔａｃｔａｔｔａｃ（配列番号１２）およびＰ２：ｃｃｔｇａａｔｔｃｔｔｇｃｔｇｔｇａｃｇ（配列番号１３）、５ｍＭ ＤＴＴ，２ｍＭスペルミジン、６単位／μｌ Ｈｉｓタグ化ＨＩＶ−１逆転写酵素、３単位／μｌ Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ、および０．１６単位／μｌ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＨを含む。１００μｌの反応物を、４２℃で３０分間インキュベートする。
【０２５８】
５μｌの２連の各サンプルを検出用に取り出す。各反応物は、１×クローン化Ｐｆｕ緩衝液、３．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５単位のエキソＰｆｕ、２３ｎｇ Ｐｆｕ ＦＥＮ−１、１ｎｇ ＰＥＦ、３００ｎＭ各上流プライマーＰ１および蛍光発生プローブ（例えば、ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）：ｔａｇｇａａａｃａｃｃａａａｇａｔｇａｔａｔｔｔ（配列番号１４）を含む。反応物をサーマルサイクラーの以下の１サイクルに供する：９５℃で２分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間。次いで、蛍光プレートリーダー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＦｌｕｏｒＴｒａｃｋｅｒまたはＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００配列検出システム（プレート読み出しモード）など）で蛍光を同定する。
【０２５９】
Ｃ．ローリンサークル増幅は、米国特許第５，８５４，０３３号および関連する分岐伸長増幅法（ＲＡＭ）（米国特許第５，９４２、３９１号）に記載されている。本発明に適合させたローリングサークル増幅は、以下の実施例３に記載されている。
【０２６０】
リアルタイムアッセイを使用して、増幅工程をＦＥＮヌクレアーゼ（上記）の存在下で行う非ＰＣＲベースの方法によって得られた増幅標的を定量することもできる。ローリングサークル増幅（米国特許第５，８５４，０３３号）を、ＦＥＮヌクレアーゼおよび本発明の切断構造を含む切断プローブと共に増幅および検出用の二次プライマーを含むように適応させ、５０℃〜６０℃の温度で行う。
【０２６１】
ＤＮＡプライマーを完全にアニーリングさせない場合は、ＦＥＮヌクレアーゼの切断パターンを、プライマーの５’末端由来の１〜１５ヌクレオチドの間の任意の位置に存在する１つのミスマッチ塩基の存在によって変化させることができる。典型的には、完全にアニーリングされた基質では、ＦＥＮヌクレアーゼは、最５’端ヌクレオチドをヌクレオチド末端結合分解によって切断する。しかし、５’末端から１５ヌクレオチド以内の１つのヌクレオチドミスマッチにより、ヌクレオチド内部結合分解性切断が促進される。これは、ミスマッチによりミスマッチを除去するヌクレアーゼ作用が促進される５’校正処理過程によりもたらされる。したがって、ＦＥＮヌクレアーゼ切断機構は、１つのミスマッチ塩基対の存在により、主にヌクレオチド末端結合分解性切断から主にヌクレオチド内部結合分解性切断に変えられる。この変化はおそらくミスマッチにより短いフラップが作製されるために起こるのであろう（Ｒｕｍｂａｕｇｈら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４、１４６０２）。
【０２６２】
本発明の方法を使用して、標的核酸配列中の配列変形形態の存在の指標となるシグナルを発生させることができ、ここでは、標的核酸配列と核酸ポリメラーゼ（タイトル「切断構造」の項に記載）とのインキュベーションによって完全にアニーリングしたＤＮＡプライマーを含む標識切断構造が形成され、ＦＥＮヌクレアーゼで該標識切断構造を切断して、エキソヌクレアーゼ切断産物を含む標的フラグメント放出が配列変形形態の存在の指標となる。放出した標識フラグメントを、タイトル「切断構造」の項に記載のように検出する。
【０２６３】
Ｖ．サンプル
本発明は、本明細書中で定義したサンプル中の標的核酸配列の検出または測定法を提供する。本明細書中で使用される、「サンプル」は、目的の核酸（標的核酸配列）を含むか含むと予想されるか、それ自体が目的の標的核酸配列を含むか含むと予想される標的核酸配列である、任意の物質をいう。したがって、用語「サンプル」には、標的核酸配列（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）、細胞、生物、組織、流体または物質（例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、便；皮膚、気管、腸および尿生殖路の外分泌物；唾液、血球、腫瘍、器官、組織、インビトロ細胞培養成分のサンプル、天然の単離物（飲料水、海水、固体物質など）、微生物試料、ならびに核酸トレーサー分子で「標識された」対象物または試料を含むがこれらに限定されない）のサンプルが含まれる。
【０２６４】
（実施例）
本発明を、以下に記載の材料および方法を使用した非限定的な実施例によって例示する。以後引用した各文献の開示全体が本明細書中で参考として援用される。
【０２６５】
（実施例１）
標的核酸配列を、以下の方法によって検出および／または測定することができる。ＦＥＮヌクレアーゼの添加前に、（ａ）標的核酸配列（図３のＢ）を含むサンプルと、（ｂ）標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成する上流オリゴヌクレオチド（図３のＡ）、および（ｃ）オリゴヌクレオチドＡのハイブリッド形成領域の下流に存在する標的核酸配列領域と特異的にハイブリッド形成する下流の５’末端標識オリゴヌクレオチド（図３のＣ）を９５℃で５分間の加熱および約５０〜６０℃への冷却して標識切断構造を形成する。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが３’→５’ＤＮＡ合成活性を有するポリメラーゼ酵素ａ）Ｙａｑエキソ−（Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、１０７４）を改変するためにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット、カタログ番号２００５１８を使用した変異誘発によって調製）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼの変異形態である、ｂ）Ｐｆｕ、またはｃ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼの変異形態（エキソ−Ｐｆｕ）などを添加し、オリゴヌクレオチドＣの５’末端を部分的に置換するようにポリメラーゼがオリゴヌクレアーゼＡを伸長する条件下（例えば、１×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で７２時間）で５分〜１時間インキュベートする。オリゴヌクレオチドＣの置換領域により、ＦＥＮヌクレアーゼの添加によって切断される５’フラップを形成する。
【０２６６】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが３’→５’ＤＮＡ合成活性を有するＴａｑポリメラーゼの変異形態は、以下の変異を含む：Ｄ１４４Ｓ／Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ（Ｄ１４４Ｓは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を消去し、Ｆ６６７ＹはｄｄＮＴＰ組み込みを改良する）。
【０２６７】
ＰｏｌＩポリメラーゼのエキソ−変異体を、Ｘｕら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６８、２８４の方法に従って調製することができる。
【０２６８】
本発明の標識切断構造を、ＰｆｕＦＥＮ−１の調製物（すなわち、以下の実施例２に記載のように調製したクローン化Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓＦＥＮ−１）で切断する。以下を含む７μｌの反応混合物への２μｌのＰｆｕＦＥＮ−１の添加により切断を行う。
【０２６９】
３μｌ 切断構造（１０ｎｇ〜１０μｇ）
０．７μｌ １０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液（１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液は５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）
２．００μｌ ＰｆｕＦＥＮ−１酵素またはＨ２Ｏ
１．３μｌ Ｈ２Ｏ
全量７．００μｌ
サンプルを、Ｒｏｂｏｃｙｌｅｒ９６加熱トップサーマルサイクラー中、５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止染色溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｙｃｌｉｓｔ ＤＮＡ配列決定キット、カタログ番号２００３２６、実施例３に記載）の添加後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。サンプルを、１１インチ長の手で分注した２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミドの７Ｍ尿素ゲルにロードする。ゲルを、ブロモフェノールブルーが全距離の約２／３まで移動するまで２０ワットで泳動する。ゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）に１０分間、そして水に１０分間浸す。ゲルをＷｈａｔｍａｎｎ ３ｍｍ濾紙に置き、プラスチックラップで覆い、加熱吸引ゲルドライヤー中（約８０℃）で２時間乾燥させる。ゲルを、Ｘ線フィルムに一晩感光させて、標的核酸配列の存在の指標であるシグナルの存在を検出する。
【０２７０】
（実施例２）
Ｐｆｕ ＦＥＮ−１のクローニング。本発明で有用な熱安定性ＦＥＮヌクレアーゼ酵素を、以下の方法に従って調製することができる。
【０２７１】
熱安定性ＦＥＮヌクレアーゼ遺伝子を、当該分野で周知のＰＣＲクローニング法に従ってＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＡＴＣＣ番号４３５８７）由来のゲノムＤＮＡから単離することができる。クローン化ＰｆｕＦＥＮ−１を、当該分野で周知であり且つ下記の方法に従って細菌細胞中で過剰発現させることができる。
【０２７２】
以下のｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫクローニングオリゴヌクレオチドを合成および精製した：
ａ．５’ＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＧＧＴＧＡＧＡＴＴＡＴＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧ３’（配列番号１５）および、
ｂ．５’ＧＧＡＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＴＣＣＡＣＴ３’（配列番号１６）。
【０２７３】
Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）タンパク質発現および精製システムを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手し、製造者のプロトコールに従って使用した。
【０２７４】
増幅
インサートＤＮＡを、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫベクター一本鎖テールに相補的な５’末端に１２および１３ヌクレオチド配列を含むので定方向クローニングが可能な遺伝子特異的プライマー（オリゴヌクレオチドａおよびｂ、上記）を使用したＰＣＲ増幅によって調製した。ＦＥＮ−１配列を、
５０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
７．５μｌ ＰｆｕゲノムＤＮＡ（約１００ｎｇ／μｌ）
７．５μｌ ＰｆｕＴｕｒｂｏ（２．５ｕ／μｌ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６００２５０）
１５μｌ 混合プライマー対（各１００ｎｇ／μｌ）（オリゴヌクレオチドａおよびｂ、上記）
４μｌ １００ｍＭ ｄＮＴＰ
４１６μｌ Ｈ２Ｏ
合計５００μｌ
を含む増幅反応物の調製によってＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のゲノムＤＮＡから増幅し、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ９６加熱トップサーマルサイクラーを使用して以下の条件下で増幅を行った
Figure 0004960560
【０２７５】
５つそれぞれの反応物由来のＰＣＲ産物を、１つのチューブで合わせ、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ ＰＣＲを使用して精製し、５０μｌの１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨｃＬ（ｐＨ８．６）中で溶出した。ＦＥＮ−１ ＰＣＲ産物を、ゲルで分析し、約１０００ｂｐと同定された。
【０２７６】
ｆｅｎ−１遺伝子を含むＰＣＲ産物を、ライゲーション依存性クローニング末端（ＬＩＣ）の作製、ｆｅｎ−１遺伝子を含むＰＣＲ産物のｐＣＡＬｎＥＫＬＩＣベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へのアニーリング、および以下の方法によるアニーリング混合物での細胞の形質転換によってｐＣＡＬｎＥＫＬＩＣベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化した。簡単に述べれば、ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物を精製し、ｄＡＴＰの存在下でＰｆｕＤＮＡポリメラーゼで処理する（Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）タンパク質発現および精製システム、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００３２６に含まれるマニュアルに従う）。ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰの非存在下で、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により、ＰＣＲ産物の各３’末端で少なくとも１２および１３ヌクレオチドが除去される。この活性は、最初のアデニンに遭遇し、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫベクターの一本鎖テールに相補的な５’伸長一本鎖テールを有するＤＮＡフラグメントが得られるまで持続する。
【０２７７】
ＬＩＣ末端の作製
ＬＩＣ末端を以下の混合物の調製によって作製した。
【０２７８】
４５μｌ 精製ＰＣＲ産物（約０．５μｇ／μｌ）
２．５μｌ １０ｍＭ ｄＡＴＰ
５μｌ １０×ｃＰｆｕ緩衝液
１μｌ ｃＰｆｕ（２．５ｕ／μｌ）
０．５μｌ Ｈ２Ｏ
ｃＰｆｕおよびｃＰｆｕ緩衝液をＳｔｒａｔａｇｅｎｅから得ることができる（ｃＰｆｕ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００１５３おおびｃＰｆｕ緩衝液、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５３２）。
【０２７９】
サンプルを７２℃で２０分間インキュベートし、産物を室温に冷却した。各サンプルに４０ｎｇの調製ｐＣＡＬｎＥＫＬＩＣベクター（調製ベクターはＳｔｒａｔａｇｅｎｅからＡｆｆｉｎｉｔｙＬＩＣクローニングおよびタンパク質精製キット（２１４４０５）で販売されている）を添加した。ベクターおよびインサートＤＮＡを合わせ、室温でアニーリングし、形質転換受容性の高い細菌宿主細胞に形質転換する（Ｗｙｂｏｒｓｋｉら、１９９７、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、１０、１）。
【０２８０】
ＦＥＮ産生用細胞の調製
２リットルのＬＢ−ＡＭＰに２０ｍｌのＦＥＮ−１クローン（クローン３）の一晩の培養物を接種した。約１１時間成長を進行させ、この時点で細胞ＯＤ６００＝０．９７４に達していた。細胞を１ｍＭＩＰＴＧで一晩（約１２時間）誘導処理した。遠心分離によって細胞を回収し、得られた細胞ペーストを−２０℃で保存した。
【０２８１】
タグ化ＦＥＮ−１の精製
細胞を２０ｍＭカルシウム結合緩衝液に再懸濁した。
【０２８２】
ＣａＣｌ２結合緩衝液
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１５０ｍＭ ＮａＣｌ
１．０ｍＭ ＭｇＯＡｃ
２ｍＭ ＣａＣｌ２
サンプルをミクロチップを使用したブランソン超音波処理器で超音波処理した。出力設定を５にし、負荷サイクルは９０％であった。サンプルを３回超音波処理し、処理の合間は氷上に静置した。超音波処理物を２６，８９０×ｇで遠心分離した。明澄化した上清を５０ｍｌコニカルチューブ中で１ｍｌの洗浄した（ＣａＣｌ２結合緩衝液中の）カルモジュリンアガロース（ＣＡＭアガロース）と混合し、低温室（４℃）で５時間ゆっくりと回転したホイール上でインキュベートした。ＣＡＭアガロースを低速の遠心分離（卓上型遠心分離機で５０００ｒｐｍ）によって回収した。
【０２８３】
上清の除去後、ＣＡＭアガロースを５０ｍｌ ＣａＣｌ２結合緩衝液で洗浄し、使い捨てドリップカラムに移した。元のコンテナおよびピペットを完全にリンスして、残りのアガロースを除去した。カラムを約２００ｍｌのＣａＣｌ２結合緩衝液でリンスした。
【０２８４】
１０ｍｌの５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭＥＧＴＡ）で溶出を行った。０．５ｍｌの画分を回収した。１Ｍ ＮａＣｌ溶出緩衝液で第２の溶出を行い、０．５ｍｌの画分を回収した。
【０２８５】
精製タグ化ＦＥＮ−１の評価
１Ｍ ＮａＣｌ中に溶出されたＣＢＰタグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１を含む画分を、ＳＤＳ中でボイルし、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅで染色した４〜２０％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図４）。
【０２８６】
非切断ＦＥＮ−１のタンパク質濃度は、約１５０ｎｇ／μｌと同定された（下記）。
【０２８７】
精製ＦＥＮ−１のエンテロキナーゼプロテアーゼ（ＥＫ）切断
フラクション３〜９を、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、および２ｍＭ ＣａＣｌ２に対して４℃で一晩透析した。
【０２８８】
透析ＦＥＮ−１において、不透明で非常に細かい沈殿が認められた。サンプルを１／２０で希釈し、沈殿を除去した。サンプルを１／３希釈すると、依然としての不溶物質が検出された。１／３の希釈物質を３７℃で２分間加熱し、Ｔｗｅｅｎ２０と混合して、最終濃度を０．１％とした。Ｔｗｅｅｎ２０の添加の直後に「ストリング」およびより粗大な固体が形成され、これは、溶液を１Ｍ ＮａＣｌに調整した後でさえも逆効することができなかった。
【０２８９】
基質として１／２０に希釈したサンプルおよび１×ＥＫ緩衝液での透析バッグのリンスによって調製した希釈サンプルを使用して、ＥＫ切断を行った。室温で一晩（約１６時間）の１×ＥＫ（１ｕ／μｌ）の添加によってＥＫ切断を行った。
【０２９０】
１００μｌのＣＡＭアガロースと組み合わせた１００μｌのＳＴＩアガロースを、１０ｍｌの１×ＳＴＩ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回リンスした。ＮａＣｌを２つのＥＫサンプルに添加して、最終濃度を２００ｍＭ ＮａＣｌにした。２つのサンプルを合わせ、リンスしたアガロースに添加した。サンプルを４℃のホイール上で３時間ゆっくりと回転させ、卓上型遠心分離機での低速の遠心分離によって分離した（上記）。上清を除去し、樹脂を５００μｌ×ＳＴＩで２回リンスした。２つのリンス物を合わせ、元の上清から分離しておく。サンプルを４〜２０％のゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０２９１】
約５０ｎｇ／ｍｌの濃度でＰｆｕ標準との比較によって同定したところ、消化産物の濃度は約２３ｎｇ／μｌであった。
【０２９２】
（実施例３）
ＦＥＮヌクレアーゼ活性。実施例２に記載のように調製したＦＥＮヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性およびＦＥＮヌクレアーゼの切断構造の要件を、タイトル「ＦＥＮヌクレアーゼ」の項または以下のいずれかに記載の方法にしたがって同定することができる。
【０２９３】
簡単に述べれば、３つのテンプレート（図２）を使用して、本発明のＦＥＮヌクレアーゼ活性を評価する。テンプレート１は以下の配列を有する５’３３Ｐ標識オリゴヌクレアーゼ（Ｈｅｌｔｅｓｔ４）である：
５’ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧ３’（配列番号１）。
【０２９４】
Ｈｅｌｔｅｓｔ４の下線部分は、Ｍ１３ｍｐ１８＋に相補的な領域を示す。切断産物は、配列ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴ（配列番号２）を有する１８ヌクレオチドフラグメントである。Ｈｅｌｔｅｓｔ４は、Ｍ１３に結合して相補二本鎖ドメインおよび非相補５’オーバーハングが得られる。この二重鎖により、テンプレート２（図２）が形成される。テンプレート３（図２）はＨｅｌｔｅｓｔ４に直接隣接するＭ１３に結合したさらなるプライマー（ＦＥＮＡＳ）を有する。ＦＥＮＡＳの配列は、５’ＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡ３’（配列番号３）である。テンプレート３の存在下で、ＦＥＮヌクレアーゼはＨｅｌｔｅｓｔ４の遊離の５’末端に結合し、接合点に移動し、Ｈｅｌｔｅｓｔ４を切断して１８ヌクレオチドフラグメントが得られる。得られた切断産物を、６％アクリルアミドの７Ｍ尿素シークエンシングゲルで分離する。
【０２９５】
テンプレートを下記のように調製する。
【０２９６】
Figure 0004960560
Ｐｆｕ緩衝液を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから得ることができる（カタログ番号２００５３６）。
【０２９７】
テンプレート混合物を、９５℃で５分間加熱し、室温に４５分間冷却し、４℃で一晩保存する。酵素サンプルを以下に示す。
【０２９８】
Ａ． Ｈ２Ｏ（コントロール）
Ｂ． ２μｌ未希釈非切断ＦＥＮ−１（約４４５ｎｇ／μｌ）
Ｃ． ２μｌ 非切断ＦＥＮ−１の１／１０希釈（約４４．５ｎｇ／μｌ）
Ｄ． ２μｌエンテロキナーゼプロテアーゼ（ＥＫ）切断ＦＥＮ−１（約２３ｎｇ／μｌ）
反応混合物を、以下の３つのテンプレートと混合する。
【０２９９】
３μｌ テンプレート１、テンプレート２又はテンプレート３
０．７μｌ １０×クローン化Ｐｆｕ緩衝液
０．６μｌ １００ｍＭ ＭｇＣｌ２
２．００μｌ ＦＥＮ−１またはＨ２Ｏ
０．７μｌ Ｈ２Ｏ
全量７．００μｌ
５０℃で３０分間この反応を進行させ、各サンプルへの２μｌのホルムアミド「シークエンシング停止」溶液の添加によって停止させた。サンプルを９５℃で５分間加熱し、６％アクリルアミドの７Ｍ尿素ＣａｓｔＡｗａｙ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ゲルにロードした。
【０３００】
あるいは、ＦＥＮヌクレアーゼ活性を、１時間のインキュベーション時間を使用した以下の緩衝液で分析した。
【０３０１】
１０×ＦＥＮ緩衝液
５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１００ｍＭ ＭｇＣｌ２。
【０３０２】
反応混合物を以下に示す：
３μｌ テンプレート１、テンプレート２又はテンプレート３
０．７μｌ １０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液
２．００μｌ ＦＥＮ−１またはＨ２Ｏ（上記のＡ〜Ｄ）
１．３μｌ Ｈ２Ｏ
全量７．００μｌ
サンプルを、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ９６加熱トップサーマルサイクラー中、５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノール、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）染色溶液の添加後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。サンプルを、１１インチ長の手で分注した２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミドの７Ｍ尿素ゲルにロードする。ゲルを、ブロモフェノールブルーが全距離の約２／３まで移動するまで２０ワットで泳動する。ゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）に１０分間、そして水に１０分間浸す。ゲルをＷｈａｔｍａｎｎ ３ｍｍ濾紙に置き、プラスチックラップで覆い、加熱吸引ゲルドライヤー中（８０℃）で２時間乾燥させる。ゲルを、Ｘ線フィルムに一晩感光させる。
【０３０３】
テンプレート１、２、および３（上記のように調製）を、
Ａ．Ｈ２Ｏ
Ｂ．２μｌのＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１
Ｃ．２μｌのＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１希釈物（１：１０）
Ｄ．２μｌのＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１
の添加によって切断しＦＥＮ−１ヌクレアーゼアッセイのオートラジオグラフィーを図５に示す。
【０３０４】
レーンを以下に示す。レーン１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄは、それぞれＨ２Ｏ、未希釈のＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１、ＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１の１：１０希釈物、ＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１で切断したテンプレート１を示す。レーン２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、それぞれＨ２Ｏ、未希釈のＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１、ＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１の１：１０希釈物、ＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１で切断したテンプレート２を示す。レーン３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄは、それぞれＨ２Ｏ、未希釈のＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１、ＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１の１：１０希釈物、ＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１で切断したテンプレート３を示す。
【０３０５】
タグ化ＰｆｕＦＥＮ−１は、Ｎ末端ＣＢＰ親和性精製タグを含む。ＦＥＮ−１のタグ化と非タグ化変形形態との間の任意の活性の差はタンパク質濃度差により（酵素サンプルの濃度は上記）、これは、タグ化と非タグ化ＦＥＮ−１の量が等しくないからである。タグ化および非タグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１が共に切断活性を示す。
【０３０６】
図５は、ＦＥＮ−１の非存在下での切断のバックグラウンドレベルを示す（レーン１Ａ、２Ａ、および３Ａ）。さらに、この図は、タグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１がテンプレート１と比較してテンプレート２を多数切断することを示す。特に、未希釈のタグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１の存在下で最も大量のテンプレート２が切断される（レーン２Ｂ）。テンプレート３の分析は、未希釈のタグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１によって最も大量のテンプレート３が切断され、希釈タグ化ＦＥＮ−１によって最も少量のテンプレート３が切断されることを示す。標識プローブは、４０〜４３ヌクレオチドバンドとして移動する。ＦＥＮ−１は、テンプレート２よりもテンプレート３（上流プライマーを含む）を優先的に切断する。切断産物バンドは、１６〜２０ヌクレオチドで移動する主要なバンドである。標識基質（使用前にゲル精製していない）が不均一なので、標識切断産物も不均一である。
【０３０７】
（実施例４）
ＦＥＮ−１ヌクレアーゼおよび５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼの存在下でのβアクチンのＰＣＲ増幅および検出。
【０３０８】
ＰＣＲアッセイを使用して標的核酸配列を検出する。このアッセイの方法によれば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ（例えば、Ｙａｑエキソ−）、熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼ（例えば、実施例２に記載のように調製したＰｆｕ ＦＥＮ−１）の存在下でＰＣＲ反応を行う。蛍光標識フラグメントの放出検出により、標的核酸配列の存在が示される。
【０３０９】
１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎコア緩衝液、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ（約１．４５Ｕ）、Ｐｆｕ ＦＥＮ−１（約２３ｎｇ）、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓβアクチンプライマー（各３００ｎＭ）（カタログ番号６００５００）、およびβアクチン特異的蛍光発生プローブ（２００ｎＭ、５’ＦＡＭ−３’ＴＡＭＲＡ−ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｐ／Ｎ４０１８４６）を含む二連のＰＣＲ反応物を調製した。１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、各反応における標的核酸配列として使用した。この反応を５０μｌの体積で行った。Ｐｆｕ ＦＥＮ−１のみ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼのみ、またはヒトゲノムＤＮＡテンプレート以外の全ての成分を含むネガティブコントロール反応混合物を調製した。２．５単位のＴａｑ２０００を含むポジティブコントロール反応も調製した。分光蛍光光度サーモサイクラー（ＡＢＩ７７００）で反応物をアッセイした。サーモサイクリングパラメータは、９５℃で２分間ならびに９５℃で１５秒、６０℃で６０秒、および７２℃で１５秒を４０サイクルであった。アニーリング工程の間サンプルを調査した。
【０３１０】
図６に示すように、Ｐｆｕ ＦＥＮ−１のみまたは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼのみのいずれかの存在下ではシグナルを発生しなかった。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼおよびＰｆｕ ＦＥＮ−１の両方の存在下では、限界サイクル（Ｃｔ）２６および１２，０００単位の最終蛍光強度（ＦＩ）でシグナルを発生した。Ｔａｑ２０００（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ）（Ｔａｑｍａｎ）の存在下では、Ｃｔ２３および１７，０００のＦＩでシグナルを発生した。
【０３１１】
これらの結果は、ＰＣＲアッセイによってβアクチンＤＮＡ配列を検出することができ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼおよび熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼの存在下でシグナルを発生することを示す。さらに、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼでは存在しない５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、Ｐｆｕ ＦＥＮ−１の添加によってトランスで修復することができる。
【０３１２】
（実施例５）
ＦＥＮ−１ヌクレアーゼおよび５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼの存在下でのβアクチンのＰＣＲ増幅および検出
ＰＣＲアッセイを使用して標的核酸配列を検出する。このアッセイの方法によれば、Ｐｆｕポリメラーゼ（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然に欠く）、さらに３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼ（例えば、エキソ−Ｐｆｕ）、および熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼ（Ｐｆｕ ＦＥＮ−１）の存在下でＰＣＲ反応を行う。蛍光標識フラグメントの放出検出により、標的核酸配列の存在が示される。
【０３１３】
１×クローン化Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５３２から入手可能）、３．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く５単位のＰｆｕポリメラーゼ、タグ化または非タグ化ＰｆｕＦＥＮ−１（約２３ｎｇ）、ＰＥＦ（１ｎｇ）（ＷＯ９８／４２８６０に記載）、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓβアクチンプライマー（各３００ｎＭ）（カタログ番号６００５００）、および蛍光発生プローブ（２００ｎＭ、５’ＦＡＭ−３’ＴＡＭＲＡ−ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｐ／Ｎ４０１８４６）を含む二連のＰＣＲ反応物を調製した。１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、各反応における標的核酸配列として使用した。反応を５０μｌの体積行った。５’→３’および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼのみを含むか、ヒトゲノムＤＮＡテンプレート以外の全ての成分を含むネガティブコントロール反応混合物を調製した。２．５単位のＴａｑ２０００を含む反応混合物をポジティブコントロールとして使用した。分光蛍光光度サーモサイクラー（ＡＢＩ７７００）で反応物をアッセイした。サーモサイクリングパラメータは、９５℃で２分間ならびに９５℃で１５秒、６０℃で６０秒、および７２℃で１５秒を４０サイクルであった。
【０３１４】
図７に示すように、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然に欠くＰｆｕポリメラーゼのみの存在下ではシグナルを発生しなかった。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼおよびタグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１の両方の存在下では、限界サイクル（Ｃｔ）２３および２０，０００単位の最終蛍光強度（ＦＩ）でシグナルを発生した。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼおよび非タグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１の存在下では、Ｃｔ２１および２０，０００のＦＩでシグナルを発生した。Ｔａｑ２０００の存在下では、Ｃｔ２１および１９，０００のＦＩでシグナルを発生した。
【０３１５】
これらの結果は、ＰＣＲアッセイによってβアクチン標的の存在を検出することができ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼおよび熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼの存在下でシグナルを発生することを示す。このシグナルはＦＥＮ−１の非存在下でのＴａｑ２０００の存在下で発生したシグナルに類似する。さらに、Ｐｆｕポリメラーゼでは存在しない５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、Ｐｆｕ ＦＥＮ−１の添加によってトランスで修復することができる。
【０３１６】
（実施例６）
標準的な手順によってバフィーコートから抽出したヒトＤＮＡで検出されるヒトオルニチントランスカルバモイラーゼ遺伝子を標的として使用してローリングサークル増幅を含む本発明のアッセイを行う。標的（４００ｎｇ）は、９７℃で４分間熱変性し、２つの５’リン酸化オリゴヌクレオチド（オープンサークルプローブおよび１つのギャップオリゴヌクレオチド）の存在下のライゲーション条件下でインキュベートする。オープンサークルプローブは、配列：ｇａｇｇａｇａａｔａａａａｇｔｔｔｃｔｃａｔａａｇａｃｔｃｇｔｃａｔｇｔｃｔｃａｇｃａｇｃｔｔｃｔａａｃｇｇｔｃａｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｔｔｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｇａａｃａｃ（配列番号１７）を有し、野生型配列のギャップヌクレオチドは：ｔａｇｔｇａｔｃ（配列番号１８）である。図８および９は、ローリングサークルプローブおよびローリングサークル増幅を示す。反応緩衝液（４０μｌ）は、５単位／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｍＭ ＡＴＰ、８０ｎＭオープンサークルプローブ、および１００ｎＭギャップオリゴヌクレオチドを含む。３７℃２５分間のインキュベーション後、２５μｌを取り出し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００ｎＭの各ｄＴＴ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、０．２μＭローリングサークル増幅プライマー：ｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃ（配列番号１９）、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（１６０ｎｇ／５０μｌ）を含む２５μｌの溶液に添加する。サンプルを３０℃で３０分間インキュベートする。
【０３１７】
ＲＮＡを、以下の試薬濃度を得るために希釈した代替緩衝液（ストック溶液または濃縮物）の添加によってオープンサークルプローブ中に存在するＴ７プロモーターから作製する：３５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、２ｍＭスペルミジン、１８ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＧＭＰ、１ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、３３３μＭ ＵＴＰ、６６７μＭビオチン−１６−ＵＴＰ、０．０３％ Ｔｗｅｅｎ２０、２単位／μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。米国特許第５，８５８，０３３号に記載のようにＲＮＡ作製を行った。３７℃で９０分間インキュベーションを進行させる。
【０３１８】
５μｌの２連の各サンプル（実際の試験サンプル、（−）リガーゼコントロールサンプル、（−）ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼコントロール、および（−）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼコントロール）を検出用に取り出す。逆転写過程は、本発明に従って、（Ａ）オープンサークルのライゲーション、Ｂ）ローリングサークル鎖ＤＮＡの合成、Ｃ）ＲＮＡの作製（オープンサークルプローブ中に存在するＴ７プロモーターより）、Ｄ）ＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡの作製、およびＥ）ＦＥＮ切断構造を検出するためのプライマーおよびプローブを使用したｃＤＮＡのＰＣＲ増幅の工程を含む。逆転写には、製造者が推奨する同量のＹａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＴａｑ２０００ＤＮＡポリメラーゼへの置換以外はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｓｉｎｇｌｅ−チューブＲＴ−ＰＣＲコア試薬キット（カタログ番号６００５０５）から得られる試薬およびプロトコールを使用する。各反応物は、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ＲＴ−ＰＣＲコア緩衝液、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５単位のエキソ−Ｐｆｕ、２３ｎｇ Ｐｆｕ ＦＥＮ−１、１ｎｇＰＥＦ、５００ｎＭの各上流プライマー：ａａｇｔｔｔｃｔｃａｔａａｇａｃｔｃｇｔｃａｔ（配列番号２０）、逆プライマー：ａｇｇｃａｇａａｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔ（配列番号２１）、および蛍光発生プローブ（例えば、ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）:ａｇｃｔｔｃｔａａｃｇｇｔｃａｃｔａａｔａｃｇ（配列番号２２）を含む。４５℃で３０分間、９５℃で３分間、その後のサーマルサイクラー中で１サイクル：９５℃で２分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間のインキュベーションに反応を供する。蛍光プレートリーダー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＦｌｕｏｒＴｒａｃｋｅｒまたはＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００配列検出システム（プレート読み出しモード）など）で蛍光を同定した。
【０３１９】
ローリングサークル増幅ＲＮＡ産物中のビオチン−１６−ＵＴＰの組み込みにより検出効率の照合が可能である。反応物のアリコートを、固定捕捉プローブを使用して、ガラススライド（あるいは、マイクロウェルプレート）に捕捉する。捕捉ＲＮＡアンプリコンの検出は、米国特許第５，８５４，０３３号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０３２０】
（他の実施形態）
他の実施形態が当業者に明白である。明確にするために前記の詳細な説明を提供し、ただの例示であると理解すべきである。本発明の精神および範囲は上記実施例に限定されないが、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はＦＥＮヌクレアーゼ切断構造を示す図である。
【図２】 図２はＦＥＮヌクレアーゼ活性の検出に使用することができる３つのテンプレート（標識１、２、および３）を示す図である。
【図３】 図３は本発明のシグナルを発生させるための合成および切断反応を示す図である。
【図４】 図４はＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ１タンパク質を示すシプロオレンジ染色ポリアクリルアミドゲルである。
【図５】 図５はＦＥＮ−１ヌクレアーゼアッセイのオートラジオグラフである。
【図６】 図６はＦＥＮ−１および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼの存在下での蛍光標識βアクチンプローブを使用したゲノムＤＮＡ中のβアクチン配列の検出を示すグラフである。
【図７】 図７はＦＥＮ−１および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼの存在下での蛍光標識βアクチンプローブを使用したゲノムＤＮＡ中のβアクチン配列の検出を示すグラフである。
【図８】 図８はローリングサークル増幅用の開環プローブを示す図である。
【図９】 図９はローリングサークル複製を示す図である。

Claims (9)

  1. ポリメラーゼ連鎖反応方法であって、
    （ａ）標的核酸配列の上流の一領域に相補的な核酸配列を有する上流オリゴヌクレオチドプライマーと、
    該標的核酸配列の下流の一領域と相補的な核酸配列を有する領域と、該標的核酸配列と非相補的な核酸配列を有する５’領域と、標識部分と、該標識からのシグナルをクエンチするクエンチ剤部分とを含み、該標識部分又は該クエンチ剤部分は５’末端に存在し、且つ該標識部分は、ＦＥＮヌクレアーゼ切断が該標識部分から該クエンチ剤部分を物理的に分離するような位置に存在する、下流標識プローブ、
    を用意する工程、
    （ｂ）該上流オリゴヌクレオチドプライマー及び該下流標識プローブを、該標的核酸にアニールする工程、
    （ｃ）５’→３’エキソヌクレアーゼ欠失核酸ポリメラーゼを使用して、該上流オリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、該下流標識プローブの該５’末端を含む領域を置換して切断構造を形成する工程、及び
    （ｄ）ＦＥＮヌクレアーゼを使用して、該下流標識プローブの該５’末端を含むフラグメントを切断し、それによってシグナルを発生する工程、
    を含む方法。
  2. 該標識部分が蛍光発生団を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記核酸ポリメラーゼが熱安定性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記核酸ポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ欠失ＴａｑポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記切断構造が５’フラップ構造であり、ＦＥＮヌクレアーゼがフラップ特異性ヌクレアーゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記ＦＥＮヌクレアーゼが熱安定性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記ＦＥＮヌクレアーゼが、アルカエグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコッカス・ジャンナスキ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｔａｑ、Ｔｆｌ、およびＢｃａ由来のＦＥＮヌクレアーゼ酵素からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 上流オリゴヌクレオチドプライマー、下流標識プローブ、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠失核酸ポリメラーゼ、ＦＥＮヌクレアーゼ、および緩衝液を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法で使用するためのキット。
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