JP4789944B2 - レーザー光散乱（ｌｌｓ）による分子相互作用の測定におけるサブミクロンのパーフルオロポリマーラテックスの使用 - Google Patents

Description

本発明は、粒子表面に吸着されたレセプターとリガンドとの相互作用の、直接的光散乱測定による、単純でかつ効果的な定量測定方法に関する。
具体的には、本発明は、5〜200 nmの直径、好ましくは40〜80 nmの粒子径を有するサブミクロンのポリマー粒子を用いる、レセプターとリガンドとの相互作用の定量測定方法に関する。

リガンドとレセプターとの間の相互作用、すなわち、化学的、生化学的または生物学的な興味のリガンド−レセプターの可逆的な系の結合親和性を測定するために、先行技術においていくつかの方法が提案されている。主な方法の一覧がAngew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2785頁に報告されている。

該既知の方法は、一般的に、適当な平らな表面へのレセプターの固定化およびリガンドと接触した該表面の性質の変化、例えば光学的な変化の測定を含み、該変化はレセプター−リガンド対の形成によって誘導される。

方法の一つのクラスは溶液中でのリガンドのラベル化、すなわち、蛍光性、発光性または放射性の種での共有的リガンド修飾を必要とする。例えば、特許出願US 2004/0014060を参照。しかしながら、リガンド修飾は非常に複雑でかつ長い操作であり、それは顕著に種々雑多のリガンドが用いられるスクリーニング試験ではほとんど使用することができない。さらに、その方法は、遊離のリガンド、すなわちレセプターと相互作用せずかつ測定を妨害するものを洗い流すことによる系からの追加の除去操作を必要とする。

さらに該方法の欠点は、リガンド−レセプター相互作用がラベル化に付随するリガンドの化学的修飾に影響され得ることである。

レセプター−リガンド相互作用、例えば細胞膜表面で起こる相互作用をより効果的にシミュレートする方法のもう一つのクラスは、リガンドをラベル化物質で修飾しないで、レセプター−リガンド対への結合形成によって表面に誘導される変化を直接利用することである。該方法の例は、例えば米国特許第5,313,264号および米国特許第5,374,563号に記載され、Pharmacia Biosensor AB (Uppsala, Sweden)により販売されているBIAコア(core)バイオセンサーを使用する方法である。

このバイオセンサーにおいて、表面プラズモン共鳴（SPR）（J. Homolaら、"Surface Plasmon Resonance Sensors: review", Sensor and Actuators B 54 (1999) 3-15）の原理に基づいて、エバネッセント光学波が銀または金のような伝導物質の薄膜（50 nm）の表面プラズモンと結合し、特定の角度で共鳴現象を生じる。これが金属上に吸着された層の屈折率の変化、例えばリガンド−レセプター対を測定することを可能にする。この変化から、リガンドとレセプター間の結合定数が得られる。

該方法は、実際に非常に使用されているけれども、やや複雑でかつ高価であり、結合定数の測定に常に適しているとは限らない。例えば、刊行物「Peter Schuckによる、Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1997, 26: 541-66頁 "Use of surface plasmon resonace to probe the equilibrium and dynamic aspects of interactions between biological macromolecules"」を参照。

結合定数測定のためのBIAコア法の使用に関する問題は：
１）測定に影響を及ぼすリガンドマス(mass)輸送に依存すること；
２）吸着および脱着定数に影響を及ぼす、リガンド−レセプター対の立体障害（嵩効果）およびセンサー上の結合部位の分布に依存すること。それゆえ、この方法を用いて得られる結合および解離定数は、他の方法で得られるものとはいくらかのオーダーの大きさでしばしば異なる；
３）測定が熱力学的平衡状態で行われない（動的なアプローチ）という事実に依存することである。

それゆえ、リガンドのラベル化および洗浄操作を回避し、表面のリガンド−レセプター相互作用によって誘導される変化を直接用いて、例えばBIAコアのような動的な方法の欠点を避けて、熱力学的平衡状態下で行うことができる、リガンドとレセプターとの相互作用の測定のための利用可能な方法の必要性が感じられた。

以下に記載される方法による熱力学的平衡における分子種の結合親和性の測定を可能にする定量的光学法用いて、上記の欠点を克服することが可能であることを見出したことは驚嘆すべきことであり、予想できなかったことである。

本発明の目的は、ポリマー粒子がその表面に、両親媒性の非イオン性界面活性剤、レセプターを末端に有する界面活性剤およびそのレセプターと相互作用するリガンドを含み、二つの相互作用分子種の結合定数をレーザー光散乱(LLS)により測定するための、5〜200 nm、好ましくは40〜80 nmの平均直径の粒子を有するパーフッ素化ポリマーのコロイド状水性懸濁液またはラテックスの使用である。
両親媒性の非イオン性界面活性剤およびレセプターを末端に有する界面活性剤は同一であっても異なっていてもよい。

具体的には、本使用は次の工程を含む：
ａ）コロイド状水性懸濁液またはラテックスに、パーフッ素化半晶質または非晶質のポリマーから形成された、5〜200 nm、好ましくは40〜80 nmの平均直径を有する粒子の添加、50重量％〜99.5重量％の両親媒性の非イオン性界面活性剤および0.5重量％〜50重量％のレセプターを末端に有する界面活性剤を含む混合物の水溶液の既知容量の一連を添加し、各添加後に懸濁液により散乱される光の強度をレーザー光散乱(LLS)によって測定し、漸近値(asymptotic value)（I_r)に達するまで、漸次加えられた溶液の容量の関数として図表にそれを示す；

ｂ）工程ａ）で得られた懸濁液にリガンド水溶液の既知容量の一連を添加し、各添加後に懸濁液により散乱される光の強度をレーザー光散乱(LLS)によって測定し、漸近値に達するまで、漸次加えられた溶液の容量（モル濃度［T_o］として表される）の関数として図表にそれを示し、リガンド添加（［T_o］）の関数としての散乱光強度のデータ（Ｉ）を式（１）：

（式中、
I_oは、非被覆粒子によって散乱される光の強度であり、
I_rは、レセプターにより被覆された粒子によって散乱される光の強度（漸近値）であり、
n_wは、溶媒の屈折率であり、
n_pは、非被覆粒子の屈折率であり、
n_lは、リガンドの屈折率であり、
φ_pは、粒子により占有された懸濁液のフラクションの容量であり、
ρ₁は、純粋なリガンドの密度であり、
m₁は、リガンド分子の分子量であり、
［S_o］は、リガンド−レセプター相互作用部位の全モル濃度であり、
［T_o］は、懸濁液に加えられたリガンドの全モル濃度であり、
Kは、結合定数であり、
［S_o］とKは、当てはめることにより得られるただ二つのパラメータである）
に当てはめて、レセプター−リガンド結合定数（K）を得る。

特に、工程ａ）において、0.05重量％〜5重量％、好ましくは0.1重量％〜1重量％の非晶質または半晶質のパーフッ素化ポリマーの長球形粒子を含む、コロイド状水性懸濁液またはラテックスを用いることが好ましい。

リガンド添加（［T_o］）の関数としての、吸着されたレセプターへのリガンドの結合による散乱光強度のデータＩの当てはめは、ラングミュア等温線のための式（例えば、Paul C. Hiemenez "Principles of Colloid and Surface Chemistry", Marcel Dekker, New York, 1997, 287−298頁を参照）と一緒に波長よりもはるかに小さい粒子によって散乱される光の強度のためのレイリーモデル（H.C. van de Hulst "Light Scattering by Small Particles", Dover Publications Inc., New York, 1981）を考慮して行われる。

ラテックスパーフルオロポリマーは、例えば、
１）テトラフルオロエチレンホモポリマー（PTFE）または半晶質のテトラフルオロエチレン（TFE）コポリマー；
２）非晶質TFEコポリマー；
３）パーフッ素化ジオキソール環の非晶質ホモポリマー
から選択される。

好ましくは、ラテックスパーフルオロポリマーは、
１）0.5モル％からその最大限度がコポリマーが半晶質であるような約10モル％までの、例えばパーフルオロ−アルキル−ビニルエーテル（PAVE）、パーフルオロジオキソール、ヘキサフルオロプロペン（HFP）のようなTFEとは異なる一以上のフッ素化モノマーを含む半晶質のテトラフルオロエチレン（TFE）コポリマー；

２）例えばパーフルオロアルキル−ビニルエーテル（PAVE）、式：

［式中、
YはFまたはOR_f（ここで、R_fは１〜５の炭素原子を有するパーフルオロアルキルである）であり、好ましくはYはOR_fであり；
X₁およびX₂は互いに同一または異なって、-Fまたは-CF₃であり；
好ましくは、式（Ｉ）において、X₁、X₂は-Fであり；R_fは好ましくは-CF₃、-C₂F₅または-C₃F₇であり；より好ましくは、式（Ｉ）のフルオロジオキソールは、YがOR_f（ここで、R_fは-CF₃である）であり、X₁、X₂が-Fである（すなわち、2,2,4-トリフルオロ-5-トリフルオロメトキシ-1,3-ジオキソール（TTD））（例えば欧州特許第633 257号参照）ものである］
のパーフルオロジオキソール；ヘキサフルオロプロペン（HFP）；ポリマー鎖の末端に臭素もしくはヨウ素原子を含む（例えば米国特許第4,745,165号参照）またはヨウ素もしくは臭素原子を含む（例えば米国特許第5,173,553号参照）「硬化−部位(cure-site)」を任意に含んでいてもよい、パーフルオロオキシアルキルビニルエーテル；一般式：

（式中、
R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆は互いに同一または異なって、HまたはC₁-C₅アルキルであり、
Zは、任意に酸素原子を含んでいてもよい、直鎖状もしくは分枝鎖状のC₁-C₁₈アルキレンまたはシクロアルキレン基であり、好ましくは少なくとも部分的にフッ素化されているか、または(パー)フルオロポリオキシアルキレン基である）
を有するビス−オレフィン(例えば米国特許第5,585,449号参照）
のような他のフッ素化モノマーとの非晶質TFEコポリマー；
３）上記の式（Ｉ）のパーフルオロジオキソールの非晶質ホモポリマー
から選択される。

TFEのコノマーとしてのクラス２）において、式（Ｉ）のパーフルオロジオキソールに代わって、米国特許第4,910,276号に記載されている酸素原子を含むビス−オレフィン性モノマーの環化に由来するジオキソール環が用いられ得る。例として、次のモノマー：
CF₂=CFOCF₂CF=CF₂、
CF₂=CFOCF₂CF₂CF=CF₂、
CF₂=CFOCF₂CF(CF₃)CF=CF₂、
CF₂=CFOCF₂OCF₂CF=CF₂、
CF₂=CFO(CF₂)₂CF=CF₂CF₃、
CF₂=CFOCF₂CF(CF=CF₂)CF₂CF=CF₂
が挙げられ得る。

より好ましくは，ラテックスパーフロオロポリマーは、非晶質パーフルオロポリマーである。特に、好ましくはパーフルオロ−メチルビニルエーテル、パーフルオロエチルビニルエーテル、パーフルオロプロピル−ビニルエーテルから選択される、一以上のパーフルオロアルキルビニル−エーエルを20モル％〜50モル％含む非晶質TFEコポリマーである。好ましいコポリマーのもう一つのクラスは、式（Ｉ）のパーフルオロジオキソール、特に前記のTTDを20モル％〜80モル％含むTFEの非晶質コポリマーを含むものである。

工程ａ）で示された平均粒子径を有するパーフルオロポリマー粒子を含む水性ラテックスは、ここに参照として組み込まれる、米国特許第4,864,006号、米国特許第4,789,717号、欧州特許第250,766号、米国特許第6,297,334号および刊行物"Polymerization of fluorinated monomers in perfluoropolyether microemulsion", Giannett E., Chittofrati A., Sanguineti A., La chimica e l'industria, Ottobre 1997, RICHMAC Magazineの記載に従って、(パー)フルオロポリオキシ−アルキレンのマイクロエマルジョンの存在下、水性エマルジョン中のモノマー重合により製造され得る。

両親媒性非イオン性界面活性剤として、ラテックス粒子上に自己集合した単層を生じるものが用いられる。該単層は、末端にレセプターを有する界面活性剤を添加せずに、両親媒性非イオン性界面活性剤のみを用いることによる本発明の方法の工程ａ）を行うことによって得られ、図表の漸近値に達することが観察される。

さらに、該両親媒性非イオン性界面活性剤は、特定の相互作用を有してはならない、すなわち、それらは分析されるリガンドと結合を形成してはならない。そのような相互作用の不存在は、末端にレセプターを有する界面活性剤を添加せずに、両親媒性非イオン性界面活性剤のみを用いることによる本発明の方法の工程ａ）を行い、次いで工程ｂ）を行うことにより実証され、散乱光強度に変化がないことで確認され得る。

本発明で使用可能な両親媒性非イオン性界面活性剤として、例えば：
ａ）次の構造を有する非イオン化合物：
CH₃-(CH₂)_n-(OCH₂CH₂)_mOH
（ここで、nおよびmは、6＜n＜18および3＜m＜12の整数である）、
例えば、市販の化合物Brij56(Fluxa, cas. No. 9004-95-9)（ここで、n=15およびmは平均で約10である）；

ｂ）次の構造を有するアルキルグリコシド：
RO-(CH₂)_n-CH₃
（ここで、nは6＜n＜12の整数であり、Rはグルコースまたはマルトース残基、例えば、Aldrichより市販化合物のn-ドデシル-β-D-マルトシドである）
が挙げられ得る。

レセプターを末端に有する界面活性剤は、先行技術の既知の方法により、上記の界面活性剤とレセプターとの反応により製造される。
レセプター−リガンド対は、幾分安定な結合を作ることができる親和性を有する、例えば蛋白質、核酸、糖蛋白質、炭水化物、ホルモンのような分子対として定義される。特に、抗体／抗原、酵素／阻害剤、炭水化物／炭水化物、蛋白質／DNA、DNA／DNA、ペプチド／ペプチドが挙げられ得る。

工程ａ）およびｂ）において、散乱光強度の測定は、熱力学的平衡状態下、すなわち、懸濁液を安定化するために、一般に4〜6分おきに添加して行われる。
本発明の系は熱力学的平衡にすぐに達することが見出された。それゆえ、行われる測定は、吸着脱着動力学には依存しない。したがって、マス(mass)輸送により影響されない。

サブミクロ粒子を有するコロイド系の幾何学的形態は、平らな表面を利用する系と比較して大きな表面積を利用でき、溶液の容積が固定される。ラテックスのミリリッターに対してリガンドが利用可能な表面積は、一般的に500〜2000 cm²である。
本発明の方法は、先行技術の最も感度のよい手法のオーダーである0.04ナノグラム／mm²の表面積に対する吸着質量の感度限界に相当する、ミリリッター当たり3マイクログラムの物質まで検出可能である。

光散乱(LS)が、本発明の方法によるレセプターとリガンド間の相互作用を確認して測定するのに有効な結果となったことは驚嘆すべきことであり、かつ予想できなかったことである。事実、希溶液中のリガンドとレセプターの相互作用はLSにより測定できない。レセプターの多様性を担持することのできるサブミクロ粒子の使用は、リガンド−レセプター相互作用を測定するためにLSの使用を可能にする。

一方、一つのリガンドと異なる粒子上に担持された多くのレセプターとの相互作用（ここでは、多価相互作用(polyvalent interactions)として示される）の存在が、本発明の方法を適用できなくすることは注目に値する。いくつかの多価相互作用の場合、ラテックスは凝固し得る。該多価相互作用の存在は、動的レーザー光散乱(DLLS)法により、工程ａ）とｂ）の間の粒子径を測定することにより確認され得る。動的DLLS法は、散乱強度と散乱粒子の緩和時間に関する自己相関曲線の登録(registration)に基づく。したがって、この方法において、緩和速度デルタГを引き出すことは可能であり、それは散乱種の散乱係数Ｄに比例する：
Г＝Ｄ×ｑ²
［ここで、qは次の式：
ｑ＝（４πｎ_D／λ）ｓｉｎ（θ／２）
（ここで、ｎ_Dは媒体屈折率であり、λは波長であり、θは測定が行われる、前もって決められた散乱角度である）
を有する波動ベクトルを表わす］。

散乱係数Ｄも、ストークス−アインシュタイン式：
Ｄ＝ｋＴ／３πηφ
（ここで、Ｋはボルツマン定数、Ｔは温度、ηは懸濁液（ラテックス）の粘度でφは散乱物の直径である）
により散乱物の直径と相関がある。それゆえ、この式から粒子の直径が計算され得る。多価相互作用の不存在下において、ポリマー粒子の直径は実質的に一定である。直径の変化は、界面活性剤により、レセプターによりおよびリガンドにより形成される単分子層に起因する。

多価相互作用が存在しても凝固がないときは、直径変化の制御が特に重要である。この場合、リガンド−レセプター相互作用の測定は有効でない。それゆえ、レセプターとリガンドの相互作用は、多価相互作用であってはならない。一般に、多価相互作用がないことに対する直径変化は、約40 nmの直径を有する担持ポリマー粒子当たり約数ナノメーター（例えば1〜10 nm）のオーダーである。

約40 nmの直径を有する担持ポリマー粒子を用いることにより、約80 nmの粒子が見られるとき、多価相互作用が存在する。
いくつかの実施例は、本発明を限定する目的ではなく、説明するために示される。

実施例１
バンコマイシン塩酸塩水和物（リガンド）とペプチド配列L-Lys-D-Ala-D-Ala（レセプター）との間の結合定数の測定
工程ａ）
平均直径78 nmを有する粒子0.1重量％を含み、パーフルオロメチルビニルエーテル40モル％を含むTFEコポリマーよりなるコロイド状水性懸濁液に、n-ドデシル-β-D-マルトシドを99重量％および細菌細胞壁の特徴的配列のペプチド配列L-Lys-D-Ala-D-Alaを末端に有する非イオン性界面活性剤Brij56を1重量％含む混合物の水溶液を、各6マイクロリッターずつ、5分間隔で10ミリモル加えた。

各添加後、混合物を30秒撹拌し、1分間平衡を保ち、散乱光強度を5ミリワットHe-Neレーザーおよび散乱光を電気的信号に変換する光電子増倍管を用いて測定した。
光強度を10秒間、連続6回記録し、次いで、試料中に多分存在する粉末によるノイズを最小にするために最も低い値を選択した。

測定された強度値（図１中の点）は、図１に示された曲線を与える、添加された溶液の容積の関数として図表に表される。
用いられた混合物から覆われて進展する粒子は、散乱光の強度の変化に顕著である。完全な被覆は、散乱光強度の漸近値の達成により明瞭に示される。

工程ｂ）
工程ａ）で得られた懸濁液に、漸近値に達するときに、バンコマイシン塩酸塩水和物（Aldrichにより販売、cas. No. 861987）の水溶液を、各6マイクロリッターずつ、5分間隔で0.4ミリモル加える。
各添加後に、混合物を30秒撹拌し、1分間平衡を保ち、散乱光を工程ａ）のように測定した。

測定された強度値（図１中の三角形）は、溶液の容積の関数として図表に表わされ、工程ａ）の図表の曲線に加えられる。
バンコマイシン／L-Lys-D-Ala-D-Ala対の形成は、レセプター部位のバンコマイシンによる飽和を示す漸近値に達するまでの散乱光強度の増加から明らかになる。

バンコマイシン添加の関数としての散乱光強度のデータに、ラングミュアの吸収式を当てはめることにより、レセプター−リガンド結合定数が得られる。
得られた結合定数は、1.5×10⁶ moles^-1である。
凝集工程の不存在を確認するため、DLLS手法を用いることにより、サブミクロ粒子の直径が実質的に一定のままであるように連続的に制御された。

実施例２
平均直径40 nmを有する粒子を0.1％で、2,2,4-トリフルオロ-5-トリフルオロメトキシ-1,3-ジオキソール(TTD)30モル％を含むTFEコポリマーよりなる水性コロイド状懸濁液を用いる以外は、実施例１が繰り返された。

工程ａ）において、実施例１と同じ混合物が12マイクロリッターずつ加えられた。
工程ｂ）において、バンコマイシンの0.9ミリモル混合物が6マイクロリッターずつ加えられた。
得られた結合定数は、1.1×10⁶ moles^-1である。

添加された溶液の容積に対する散乱光の強度の変化を示した図である。

Claims (9)

1. ポリマー粒子がその表面に、両親媒性の非イオン性界面活性剤、リガンドと相互作用するレセプターを末端に有する界面活性剤を含み、該両親媒性の非イオン性界面活性剤およびレセプターを末端に有する界面活性剤は同一であっても異なっていてもよく、前記リガンド−レセプターの結合定数をレーザー光散乱(LLS)により測定するための、5〜200 nmの平均直径の粒子を有するパーフッ素化ポリマーのコロイド状水性懸濁液またはラテックスの使用。
2. 次の工程：
   ａ）コロイド状水性懸濁液またはラテックスに、パーフッ素化ポリマーから形成された、5〜200 nmの平均直径を有する粒子の添加、50重量％〜99.5重量％の両親媒性の非イオン性界面活性剤および0.5重量％〜50重量％のレセプターを末端に有する界面活性剤を含む混合物の水溶液の既知容量の一連を添加し、各添加後に懸濁液により散乱される光の強度をレーザー光散乱(LLS)によって測定し、漸近値（I_r)に達するまで、漸次加えられた溶液の容量の関数として図表にそれを示すこと；
   ｂ）工程ａ）で得られた懸濁液にリガンドを含む水溶液の既知容量の一連を添加し、各添加後に懸濁液により散乱される光の強度をレーザー光散乱(LLS)によって測定し、漸近値に達するまで、漸次加えられた溶液の容量（モル濃度［T_o］として表される）の関数として図表にそれを示し、リガンド添加（［T_o］）の関数としての散乱光強度のデータ（Ｉ）を式（１）：
   

   

   （式中、
   I_oは、非被覆粒子によって散乱される光の強度であり、
   I_rは、レセプターにより被覆された粒子によって散乱される光の強度（漸近値）であり、
   n_wは、溶媒の屈折率であり、
   n_pは、非被覆粒子の屈折率であり、
   n_lは、リガンドの屈折率であり、
   φ_pは、粒子により占有された懸濁液のフラクションの容量であり、
   ρ₁は、純粋なリガンドの密度であり、
   m₁は、リガンド分子の分子量であり、
   ［S_o］は、リガンド−レセプター相互作用部位の全モル濃度であり、
   ［T_o］は、懸濁液に加えられたリガンドの全モル濃度であり、
   Kは、結合定数であり、
   ［S_o］とKは、当てはめることにより得られるただ二つのパラメータである）
   に当てはめて、レセプター−リガンド結合定数（K）を得ること
   を含む、請求項１に記載の使用。
3. 工程ａ）において、コロイド状水性懸濁液またはラテックスが、0.05重量％〜5重量％の非晶質または半晶質のパーフッ素化ポリマーの長球形粒子を含む、請求項２に記載の使用。
4. パーフッ素化ポリマーが、
   １）テトラフルオロエチレンホモポリマー（PTFE）または半晶質のテトラフルオロエチレン（TFE）コポリマー；
   ２）非晶質TFEコポリマー；
   ３）パーフッ素化ジオキソール環の非晶質ホモポリマー
   から選択される、請求項１〜３のいずれか一つに記載の使用。
5. パーフッ素化ポリマーが、
   １）0.5モル％からその最大限度がコポリマーが半晶質である10モル％までの、パーフルオロ−アルキル−ビニルエーテル（PAVE）、パーフルオロジオキソール、ヘキサフルオロプロペン（HFP）から選択されるTFEとは異なる一以上のフッ素化モノマーを含む半晶質のテトラフルオロエチレン（TFE）コポリマー；
   ２）パーフルオロアルキル−ビニルエーテル（PAVE）、式：
   

   

   ［式中、
   YはFまたはOR_f（ここで、R_fは１〜５の炭素原子を有するパーフルオロアルキルである）であり；
   X₁およびX₂は互いに同一または異なって、-Fまたは-CF₃である］
   のパーフルオロジオキソール；ヘキサフルオロプロペン（HFP）；ポリマー鎖の末端に臭素もしくはヨウ素原子またはヨウ素もしくは臭素原子を含む「硬化−部位」を任意に含んでいてもよい、パーフルオロオキシアルキルビニルエーテル；一般式：
   

   

   （式中、
   R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆は互いに同一または異なって、HまたはC₁-C₅アルキルであり、
   Zは、任意に酸素原子を含んでいてもよい、直鎖状もしくは分枝鎖状のC₁-C₁₈アルキレンまたはシクロアルキレン基、または少なくとも部分的にフッ素化されているかもしくは(パー)フルオロポリオキシアルキレン基である）
   を有するビス−オレフィン
   から選択される、他のフッ素化モノマーとの非晶質TFEコポリマー；
   ３）上記の式（Ｉ）のパーフルオロジオキソールの非晶質ホモポリマー
   から選択される、請求項４に記載の使用。
6. 式（Ｉ）のパーフルオロジオキソールに代わって、クラス２）のTFEのコモノマーとして、酸素原子を含むビス−オレフェン性モノマーの環化に由来する一つのジオキソール環が用いられる、請求項５に記載の使用。
7. パーフッ素化ポリマーが非晶質パーフルオロポリマーである、請求項４または５に記載の使用。
8. パーフッ素化ポリマーが、パーフルオロメチルビニルエーテル、パーフルオロエチルビニルエーテル、パーフルオロプロピルビニルエーテルから選択される一以上のパーフルオロアルキリビニルエーテルを20モル％〜50モル％含む非晶質TFEコポリマーである、請求項７に記載の使用。
9. パーフッ素化ポリマーが、式（Ｉ）のパーフルオロジオキソールを20モル％〜80モル％含むTFEの非晶質コポリマーである、請求項７に記載の使用。

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