JP4718765B2 - 抗癌剤及びそれを含有する飲食品 - Google Patents
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Description
本発明は、ガラクトースとグルコサミン又はその塩とが結合したガラクトシルグルコサミン構造を含むオリゴ糖を有効成分とする抗癌剤及びそれを含有する飲食品に関する。
【0002】
【従来の技術】
厚生労働省の人口動態統計によれば、2000年度の全死亡数96万1653人のうち、29万5484人が、癌が原因で死亡しており、死亡原因の第一位にあがっている。癌の死亡率はここ数年上昇傾向にあるが、医療技術、治療薬の進歩により5年生存率は上昇しており、新しい技術や効果的な治療薬の開発が盛んに望まれている分野である。
【0003】
癌の治療法は、外科的療法、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、生物反応修飾物質によるBRM(biological response modifiers)療法に分類され、これらの作用機序はすべて異なり、これらを併用して治療効果をあげることが有効とされている。化学療法は、術後の補助療法として転移巣の増殖を抑えるのが目的で、標的が定まらないまま薬剤を投与することもあるため、副作用をきたすことが多く、腫瘍細胞と正常細胞の違いにより腫瘍細胞のみを破壊、死滅させる全身療法が期待されている。抗腫瘍薬としては、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗生物質、植物アルカロイド、白金化合物、ホルモンやインターフェロンなどがあり、副作用として急性の自覚的副作用である吐き気、嘔吐、食欲不振などがあり、慢性の多角的副作用として骨髄障害、肺や皮膚の変化、脱毛、臓器障害などがある。特に化学療法では、治療量と中毒量の幅が狭く投与量をコントロールするのが難しいため、副作用の問題が度々生じる。
【0004】
また、血液の癌である白血病の治療法としては、骨髄移植か、白血病細胞増殖抑制作用又は細胞分化誘導作用を持つ薬剤による治療が行われている。例えば、アルキル化薬として、シクロホスファミドやブスルファンがあるが、副作用として出血性膀胱炎や痙攣発作などが起こる。また、代謝拮抗薬としては、シタラビンやメトトレキサートなどがあり、併用により効果増強や腎毒性の作用がある。白血病の治療には、通常、作用機序の異なる薬剤を併用し、症状により適宜薬剤を換えながら治療を行うため、薬剤間による相互作用にとくに注意を払う必要がある。
【0005】
一方、各種のオリゴ糖が抗癌作用を示すことも知られている。例えば下記特許文献1には、β1−6グルコサミンジサッカライドを含む抗癌剤が開示されている。また、下記特許文献2には、マンノース及びガラクトース含有オリゴサッカライドを有効成分とする結腸における発癌の予防剤が開示されている。
【0006】
【特許文献1】
特表平9−505071号公報
【特許文献2】
特表2003−516757号公報
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、従来の抗癌剤は、各種の副作用を伴うので、患者に対する負担や危険性が大きく、投与量をコントロールするのが難しいなどの問題があった。
【0008】
一方、前記のように、各種のオリゴ糖を有効成分とする抗癌剤も提案されているが、癌細胞に対する十分な抑制作用を示す、より有効な抗癌剤の開発が望まれている。
【0009】
したがって、本発明の目的は、副作用が極めて少なく、患者に負担を与えることなく、安全に投与でき、しかも癌細胞に対する抑制作用に優れた抗癌剤及びそれを含有する飲食品を提供することにある。
【0010】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、アミン物質が体の機能に深く関わりがあるという事実、生体内糖鎖の末端のガラクトースが細胞間相互作用に深く関わっているとされる事実に着眼し、アミノ基とガラクトースを有する各種オリゴ糖について試験を行った結果、それらが癌細胞に対して顕著な抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0013】
すなわち、本発明は、下記式(1)又は(2)で示されるオリゴ糖を有効成分とする抗癌剤を提供するものである。
【0014】
Gal−GlcNH2…(1)
Gal−Gal−GlcNH2…(2)
(上記式中、Galはガラクトース、GlcNH2はグルコサミン又はその塩を表す。)
【0015】
また、前記オリゴ糖としては、ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がα1−6結合であるものが好ましい。
【0016】
更に、前記オリゴ糖は、ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がβ1−4結合であるものであってもよい。
【0017】
更にまた、前記オリゴ糖は、ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がβ1−6結合であるものであってもよい。
【0019】
本発明の抗癌剤は、後述する試験例において示されるように、癌化した細胞株に対し、他の中性糖には見られない効果的な増殖抑制効果を示したことから、種々の癌、とくに白血病に対する投与により特異的に作用し、抗癌、抗白血病、抗腫瘍としての薬理効果が期待できる。
【0020】
また、本発明のオリゴ糖は、食品として経口可能な素材を用い、糖加水分解酵素による転移反応から得ているため、得られたオリゴ糖は食品としても経口可能なオリゴ糖であり、人体にも影響が少なく安全性が高い。このため、機能性食品としての利用の可能性が多いにあり、また、医薬品としても患者に負担が少なく、経口投与がしやすいという利点がある。更に、原料が安価であり、一段階のステップで合成でき、精製もイオン交換カラムを用いることにより純品を得ることができるため、製造のコスト面で安価にできるという大きなメリットがある。
【0021】
また、オリゴ糖の結合位置、配向や糖の数、種類のような構造の違いによって、癌細胞の感受性が異なるという結果が得られたことから作用機序を推測すると、オリゴ糖が、癌細胞が有すると予測される受容体に働きかけ、選択的に細胞に取り込まれていると考えることができる。つまり、求める標的細胞や薬効の強さによって、オリゴ糖の構造を変えることで、様々な疾患、とくに癌を抑制する薬剤が創出できるのものと推測される。
【0022】
また、本発明の抗癌剤を各種飲食品に添加することにより、機能性食品、健康食品として利用することもできる。
【0023】
【発明の実施の形態】
以下に本発明について説明する。
【0024】
本発明の抗癌剤の有効成分であるオリゴ糖は、ガラクトースとグルコサミン又はその塩とが結合したガラクトシルグルコサミン構造を含む、前記式(1)又は(2)で示されるオリゴ糖である。
【0025】
すなわち、ガラクトースと、一級アミンを有するグルコサミンとが結合したガラクトシルグルコサミン構造を含むことが条件であり、このガラクトシルグルコサミン構造は、ガラクトースの1位炭素とグルコサミンの3、4、6位のいずれかの炭素が酸素原子を介して結合している。アミンは塩であってもよく、たとえば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩などであってもよい。
【0029】
ガラクトースとグルコサミンの間の結合は、特に限定されないが、好ましくはα型>β型で、より好ましくはα1-6>β1-4>β1-6の順であり、本発明の抗癌剤におけるもっとも好ましいオリゴ糖は、Galα1-6GlcNHClであるメリビオサミン塩酸塩である。
【0030】
ここで、α1-6結合のガラクトシルグルコサミン構造は、下記式(5)であらわされる。
【0031】
【化1】
【0032】
また、β1-4結合のガラクトシルグルコサミン構造は、下記式(6)であらわされる。
【0033】
【化2】
【0034】
更に、β1-6結合のガラクトシルグルコサミン構造は、下記式(7)であらわされる。
【0035】
【化3】
【0036】
本発明で用いるオリゴ糖は、糖加水分解酵素(ガラクトシダーゼ)による転移反応により合成することができる。例えば下記反応式(8)に示すように、対応するグリコシド結合をもつガラクトオリゴ糖とグルコサミン塩酸塩(N−アセチルグルコサミン)の共存下、酵素添加により、対応するオリゴ糖のガラクトースの部分が分解を受けると同時にグルコサミン塩酸塩が転移することにより、ガラクトースにグルコサミン塩酸塩が付与したオリゴ糖が得られる。
【0037】
【化4】
【0038】
本発明で用いるオリゴ糖のうち、α1-6結合のガラクトシルグルコサミン構造を有するオリゴ糖として、例えばGalα1-6GlcNHCl(メリビオサミン塩酸塩)は、下記反応式(9)によって合成することができる。
【0039】
【化5】
【0040】
また、本発明で用いるオリゴ糖のうち、β1-4結合のガラクトシルグルコサミン構造を有するオリゴ糖として、例えばGalβ1-4GlcNHCl(ラクトサミン塩酸塩)及びGalβ1-4Galβ1-4GlcNHCl(ガラクトシルラクトサミン塩酸塩)は、下記反応式(10)によって合成することができる。
【0041】
【化6】
【0042】
更に、本発明で用いるオリゴ糖のうち、β1-6結合のガラクトシルグルコサミン構造を有するオリゴ糖として、例えばGalβ1-6GlcNHCl(アロラクトサミン塩酸塩)は、下記反応式(11)によって合成することができる。
【0043】
【化7】
【0044】
上記反応式(8)〜(11)において、原料として用いられるオリゴ糖は、末端にガラクトース残基を有していればよく、酵素は、転移能のあるガラクトシダーゼならば種や属によらず何を用いてもよい。
【0045】
また、別の製法として、UDP-ガラクトースとガラクトシルトランスフェラーゼを用いる方法によって合成されたものでもよい。
【0046】
グルコサミン塩酸塩は、キチンの分解により得られ、例えば食品素材として市販されているナチュラルグルコサミン(焼津水産化学工業株式会社製)などを用いることができる。これらオリゴ糖は、アミノ基を有していることから、陽イオン交換カラムなどにより、反応液中から容易に精製することができる。以下に示す細胞試験は、各オリゴ糖の酵素反応液から精製操作を経て高純度品としたオリゴ糖の乾燥粉末を得ることができる。
【0047】
本発明におけるオリゴ糖の癌細胞に対する作用機序はまだよくわからないが、ひとつには、K562細胞の細胞膜上には、メリビオースやメリビオサミン塩酸塩のようなGalα1-6構造を認識する受容体があり、オリゴ糖を細胞内に能動的に取り込む機構の存在が考えられる。オリゴ糖が細胞内部に取り込まれることで、細胞の代謝過程を阻害し、増殖を抑えると考えることができる。あるいは、細胞間の相互作用がオリゴ糖と細胞表面糖鎖との競合によって妨げられることにより増殖できないのか、またアポトーシスが誘導されることも考えられる。
【0048】
本発明に用いるガラクトシルグルコサミン構造を含むオリゴ糖が、白血病細胞の増殖に決定的な損傷を与え、抑制効果を示すことはこれまで知られておらず、生体親和性の高いオリゴ糖を用いた安全かつ選択的で効果的な抗癌剤、特には抗白血病剤、抗腫瘍剤として利用が大いに期待できる。
【0049】
本発明で用いるガラクトシルグルコサミン構造を含むオリゴ糖は、水溶性であり、pH3〜11にて100℃、1時間の煮沸により分解されないことがわかっているため、幅広い範囲のpHで扱うことができ、体内でのpH変化に対して分解を受けないと考えられる。更にαアミラーゼやペプシンにより分解されないことから、継続して経口摂取することにより胃や腸などの消化器系疾患(癌)、血中の白血病などに対し抗癌効果が期待され、癌の治療、補助療法剤、予防薬、あるいは機能性食品として使用できる。経口の場合には、既知の方法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの形態とすることができ、それらの組成物中に一般に使用される結合剤、滑沢剤、賦形剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加物を混合することもできる。また、シロップ剤などの液剤として使用することもでき、液剤には通常用いられる添加剤、保存剤のいずれかを混合することもできる。非経口薬の場合、注射用としては、既知の方法により調整され、安定剤、保存剤などの添加剤を混合することができ、水溶液、懸濁液、溶液のような形態で用いられる。
【0050】
本発明の抗癌剤は、癌や腫瘍を抱えた重度から軽度の患者に投与されるが、健常者でも摂取されることができ、癌の予防に対してもきわめて有効である。すなわち、本発明で用いる上記オリゴ糖は、マクロファージを活性化する可能性が期待でき、特に免疫力が低下している高齢者や患者に対して、免疫賦活による相乗効果が期待できる。また、他の抗癌剤と併用して用いられるとより効果がある。本発明で用いる上記オリゴ糖は経口投与の場合、胃や腸などの消化器系で分解されず、かつ水溶性を示すことから、そのままの形で効率的に吸収されて、血液や各器官に運ばれると考えられる。注射の場合は、例えば皮下、筋肉、体内に静脈注射、点滴などが可能である。
【0051】
本発明の抗癌剤の有効投与量は、年齢、個人差、病状などにより影響されるので範囲外の量を投与する場合もあるが、ヒトの場合の経口投与量は、大人1日体重1kg当たり0.5 〜1,000mg 、好ましくは1〜300mgであり、何回かに分けて摂取するとよい。
【0052】
本発明の抗癌剤に関するオリゴ糖の急性毒性試験は行われていないが、素材が生体の構成成分であるオリゴ糖であるため安全性は高いといえる。例えば、構成糖のグルコサミン塩酸塩は、ラットを用いた急性毒性試験の結果5g/kg体重の単回投与で異常は認められず、変異原生も認められていない。また、本オリゴ糖のメリビオサミン塩酸塩と同じGalα1-6構造であるラフィノースでは、急性毒性試験や変異原生試験においていずれも異常は確認されていない。ラフィノースの最大無作用量は10g/日である。また、マンノースやN−アセチルガラクトサミン、フコースという単糖においてもヒトに対し毒性は見受けられず、異常な量を投与しない限り副作用も見出されていない。これらのことを総合的に考えると、本オリゴ糖のヒトへの毒性は極めて低いものと判断される。
【0053】
本発明の抗癌剤を、機能性食品、健康食品として利用する場合、例えば各種ビタミン類、ミネラル類、甘味料、糖質、酸味料、香料、保存料、果汁、着色料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、調味料、その他添加物一般、他の機能性素材などとともに配合することもできる。また、栄養ドリンク、スープ等の液状の食品への添加および固形食品、粉末食品などの各種食品への添加によって用いることができ、含有量、摂取量は、上記抗癌剤としての医薬品の摂取量に従うことが好ましい。
【0054】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明について、更に具体的に説明する。
(1)オリゴ糖の調整
試験を行ったオリゴ糖は、全11種類であり、そのうち、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ラクトース(Lac:Galβ1-4Glc)、メリビオース(Mel:Galα1-6Glc)、N−アセチルラクトサミン(LacNAc:Galβ1-4GlcNAc)、N-アセチルアロラクトサミン(AlloLacNAc:Galβ1-6GlcNAc)、グルコサミン塩酸塩(GlcNHCl)については市販のものを用いた。
【0055】
ラクトサミン塩酸塩(LacNHCl:Galβ1-4GlcNHCl)、アロラクトサミン塩酸塩(AlloLacNHCl:Galβ1-6GlcNHCl))、メリビオサミン塩酸塩(MelNHCl:Galα1-6GlcNHCl)、ガラクトシルラクトサミン塩酸塩(GalLacNHCl:Galβ1-4Galβ1-4GlcNHCl)、N−アセチルメリビオサミン(MelNAc:Galα1-6GlcNAc)は、糖加水分解酵素(ガラクトシダーゼ)による転移反応により合成した。その詳細は以下の通りである。
【0056】
▲1▼ラクトサミン塩酸塩、ガラクトシルラクトサミン塩酸塩の合成
ラクトース684gとグルコサミン塩酸塩(商品名:ナチュラルグルコサミン、焼津水産化学工業株式会社製)862gを、4Lの脱塩水に溶解し、pHを6.0に調整後、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)起源のβガラクトシダーゼ(商品名「Biolacta」、大和化成株式会社製)1600Uを添加し、30℃にて、撹拌しながら24時間反応を行った。
【0057】
反応液を15分間沸騰水中で加熱することで酵素を失活後、室温まで冷却し、半量を陽イオン交換カラムクロマトグラフィー(25L)(樹脂:商品名:Dowex 50W×4)に供し、0.5N HClにて溶出し、ラクトサミン塩酸塩及びガラクトシルラクトサミン塩酸塩の高純度のフラクションを集め、1N NaOHでpH 5.4に中和、脱塩濃縮後、凍結乾燥により、ラクトサミン塩酸塩の乾燥粉末7.5g及びガラクトシルラクトサミン6.0gを得た。得られた粉末は核磁気共鳴装置により構造が確認された。化学シフト値は以下の通りである。
【0058】
ラクトサミン塩酸塩(Galβ1-4GlcNHCl);
1HNMR(400MHz,D2O),δ5.36(0.55H,H-1α),4.88(0.45H,H-1β), 4.38(1H,H-1'),3.44-3.96(11H),3.25,2.96(1H,H-2α,H-2β),13CNMR(100MHz,D2O),δ103.1(C-1'),92.6(C-1β),89.0(C-1α),78.3, 78.2,75.5,75.1,72.5,71.0,70.8,70.4,68.6,68.4,61.2(C-6'),59.9(C-6β),59.8(C-6α),56.6(C-2β),54.1(C-2α)
ガラクトシルラクトサミン塩酸塩(Galβ1-4Galβ1-4GlcNHCl);
1HNMR(500MHz,D2O),δ5.43(0.65H, H-1α),4.95(0.35H,H-1β),4.59,4.49(2H,H-1',1''),3.54-4.19(17H),3.32,3.03(1H,H-2), 13CNMR(100MHz,D2O),δ105.1(C-1''),103.9(C-1') ,93.5(C-1β), 89.8(C-1α),79.3,79.2,78.2,76.1,76.0,75.5 73.9,73.8,72.4,71.8,71.3,69.6,69.3,61.9,61.8(C-6',6''),60.8(C-6β),60.7(C-6α),57.5(C-2β),55.0(C-2α)
【0059】
▲2▼アロラクトサミン塩酸塩の製造
ラクトース180gとグルコサミン塩酸塩(商品名:ナチュラルグルコサミン、焼津水産化学工業株式会社製)215gを、1Lの脱塩水に溶解し、pHを4.5に調整後、アスペルギルス・オリゼイ(Aspergillus Oryzae)起源のβガラクトシダーゼ(商品名「ラクターゼY-AO」、カルピス工業薬品株式会社製)1600Uを添加し、50℃、撹拌しながら21時間反応を行った。
【0060】
反応液を15分間沸騰水中で加熱することで酵素を失活後、室温まで冷却し、反応液の1/10量を陽イオン交換カラムクロマトグラフィー(4.4cm×90cm )(樹脂:商品名:Dowex 50W×4)に供し、0.5N HClにて溶出した。この操作を繰り返した後、アロラクトサミン塩酸塩の高純度のフラクションを全量集め、1N NaOHでpH 5.4に中和、脱塩濃縮後、凍結乾燥により、アロラクトサミン塩酸塩の乾燥粉末200mgを得た。得られた粉末は核磁気共鳴装置により構造が確認された。化学シフト値は以下の通りである。
【0061】
アロラクトサミン塩酸塩(Galβ1-6GlcNHCl);
1HNMR(500MHz, D2O), δ5.35(0.55H, H-1α), 4.87(0.45H,H-1β), 4.35(1H,H-1'), 3.45-4.14(11H), 3.22,2.93(1H,H-2α,H-2β),13CNMR(125MHz, D2O),δ103.3(C-1'), 92.8(C-1β), 89.2(C-1α), 75.2, 72.6, 71.9, 70.7, 70.6, 69.5, 69.4, 68.6. 68.4(C-6β), 68.3(C-6α), 61.0(C-6'), 56.6(C-2β), 54.2(C-2α)
【0062】
▲3▼メリビオサミン塩酸塩の製造
メリビオース(和光純薬工業株式会社製)17.1gとグルコサミン塩酸塩(商品名:ナチュラルグルコサミン、焼津水産化学工業株式会社製)21.6gを、20mMの酢酸緩衝液(pH5.5)100mLに溶解し、1mLの純水に溶解したアスペルギルス属(Aspergillus sp)由来のα-ガラクトシダーゼ(商品名「スミチームAGS」、新日本化学工業株式会社製、30000U/g)40mgを添加し、50℃、撹拌しながら23時間反応を行った。
【0063】
反応液を15分間沸騰水中で加熱することで酵素を失活後、室温まで冷却し、全液を陽イオン交換カラムクロマトグラフィー(4.4cm×90cm)(樹脂:商品名:Dowex 50W×4)に供し、0.5N HClにて溶出した。高純度画分を集めて、1N NaOHでpH 5.2に中和し、脱塩濃縮後、凍結乾燥によりメリビオサミン塩酸塩の乾燥粉末0.93gを得た。得られた粉末は核磁気共鳴装置により構造が確認された。化学シフト値は以下の通りである。
【0064】
メリビオサミン塩酸塩(Galα1-6GlcNHCl);
1HNMR(500MHz,D2O),δ5.35(0.6H,H-1α),4.86-4.89(1.4H,H-1', H-1β),3.47-3.98(11H),3.21(0.6H,H-2α),2.92(0.4H, H-2β), 13CNMR(125MHz, D2O),δ98.2(C-1'), 92.8(C-1β), 89.2(C-1α), 74.6, 72.1, 71.0,70.3,69.8,69.5,69.4, 69.2,68.4,65.6(C-6α),65.5(C-6β),61.1(C-6'),56.6(C-2β),54.2(C-2α)
【0065】
▲4▼N-アセチルメリビオサミンの製造
メリビオース(和光純薬工業株式会社製)14.1gとN−アセチルグルコサミン(商品名:マリンスウィート、焼津水産化学工業株式会社製)18.1gを、20mMの酢酸緩衝液(pH5.5)82mLに溶解し、2mLの純水に溶解したアスペルギルス属(Aspergillus sp)由来のα-ガラクトシダーゼ(商品名:スミチームAGS、新日本化学工業株式会社製、30000U/g)33.0mgを添加し、50℃、撹拌しながら24時間反応を行った。
【0066】
反応液を15分間沸騰水中で加熱することで酵素を失活後、室温まで冷却し、全液を活性炭カラムクロマトグラフィー(4.4cm×90cm)に供した。水から20%のイソプロピルアルコール溶液によるグラジエント法にて溶出し試験管に採取した。N−アセチルメリビオサミンの高純度画分を全量集めてエバポレーターにて濃縮し、凍結乾燥によって乾燥粉末1.76gを得た。得られた粉末は核磁気共鳴装置により構造が確認された。化学シフト値は以下の通りである。
【0067】
N-アセチルメリビオサミン(Galα1-6GlcNAc);
1HNMR(500MHz,D2O),δ5.11(0.55H,H-1α),4.88(1H,H-1'), 4.62(0.45H,H-1β),3.42-3.92(12H),1.94(3H,CH3),13CNMR(125MHz, D2O),δ174.7(C=O-β),174.5(C=O-α),98.2(C-1'),95.0(C-1β),90.9(C-1α),74.4,74.0,70.9,70.2,70.0,69.7,69.4,69.2,68.5,68.4,65.9(C-6α),65.8(C-6β),61.1(C-6'),56.6(C-2β),54.0(C-2α),22.2(CH3-β),21.9(CH3-α)
【0068】
(2)癌細胞に及ぼす影響
ヒトの骨髄性白血病細胞(K562)株及びマウス白血病(Friend)細胞を用い、以下に示す方法で、各オリゴ糖添加による細胞の増殖抑制効果を調べた。
【0069】
▲1▼ヒト赤芽球様白血病(K562)細胞
以下の実験において、細胞培養液は、RPMI−1640(supplemented with 10%FCS,2mM L-glutamine,50U/ml penicillin,50μg/ml streptmycin)を用い、被験物質は、50mM Tris−HCl buffer,pH7.5,0.15M NaClに溶解して用いた。
【0070】
24ウエルディッシュに、K562 cellsを2.7〜4.4×104 cells/ml含む懸濁液720μlを分注し、次いで、被験物質を加え、培養液の最終量が800μlになるように培養液又は緩衝液を加えた。なお、糖非添加の系をコントロールとした。
【0071】
37℃、5.0% CO2の条件下で72時間培養した後、各被験物質を添加したウエルの単位当たりの細胞数をトーマの血球計算板でカウントし、対象を100%として増殖率(%)を下記式によって求めた。すべての試料はトリプレットで行った。
【0072】
増殖率(%) = [試料中の細胞数(/ml)/対象の細胞数(/ml)]×100
ヒトの骨髄性白血病細胞(K562)株を用い、各オリゴ糖添加による細胞の増殖抑制効果を調べた。培養条件は、37℃、5.0%CO2で3日間培養した。オリゴ糖を添加しない系をコントロールとした。また、各オリゴ糖に対してトリプレットで実験を行った。
【0073】
図1は、コントロールと、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、グルコサミン塩酸塩(GlcNHCl)、ラクトース(Lac)、N−アセチルラクトサミン(LacNAc)、ラクトサミン塩酸塩(LacNHCl)、メリビオサミン塩酸塩(MelNHCl)、ガラクトシルラクトサミン塩酸塩(GalLacNHCl)の7種のオリゴ糖を各5mM濃度で添加した系で培養した細胞の細胞数をグラフに表したものである。
【0074】
図1に示されるように、GlcNAc、Lac、LacNAcのようなフリーのアミノ基のない中性糖添加系では、コントロールと比較し増殖にあまり影響しないのに対し、GlcNHCl、LacNHCl、MelNHCl、GalLacNHClのようなフリーのアミノ基(グルコサミン残基)を有するオリゴ糖は致命的に細胞増殖を抑制した。その中でもMelNHClは効果的に増殖を抑制した。
【0075】
そこで、次に、これらオリゴ糖の添加濃度を1mM、2mM、3mMと変えて、細胞の増殖を見たところ、図2に示すように、濃度依存的に細胞増殖を抑制しているのが確認された。
【0076】
また、MelNHClは、GlcNHClよりも強力な抑制を示した。このように、これら4種のオリゴ糖においても抑制効果に差が見られ、結合位置や配向、結合している糖の違いにより抑制効果に差があることが示された。このことから、K562細胞の増殖抑制が、構造依存的、すなわちアミノ基をもつオリゴ糖が受容体などを介して特異的に作用することで、細胞の生育機構を阻害しているということが示唆された。
【0077】
更に、ガラクトシルグルコサミンのα結合体とβ結合体で比較を行った結果を図3に示す。その結果、α1-6結合のMelNHClが、コントロールの9.7%と効果的に抑制したのに対し、β1-6結合のAlloLacNHClは94%とあまり影響を及ぼさず、α1-6体が明らかな増殖抑制効果を示した。これによりグリコシド結合の配向により抑制効果が異なることが示された。
【0078】
更に、アミノ基の影響を調べるため、アミノ基をアセチル基に変換したMelNAcを合成し、同様な実験を行った結果を図4に示す。その結果、MelNAcは抑制効果を示さず、メリビオースも抑制しなかったことから、アミノ基の関与性が示された。
【0079】
そこで、次に、最も活性の強かったMelNHClと同じGalα1-6骨格を有するメリビオースを予め培養系に添加し、後からMelNHClを添加する実験を行ったところ、予めメリビオースを添加した系と添加しなかった系では、増殖抑制に差があらわれた。すなわち、コントロール(オリゴ糖非添加)及びMel単独の場合は、初期細胞数に比べ470%の増殖を示し、MelNHCl単独の場合は初期細胞数の80%の抑制を示したのに対し、予めMelを加えて一時間後にMelNHClを添加して培養した系では、10%の抑制という結果となり、抑制効果が大幅に弱まった。このことから、K562細胞には、メリビオースやメリビオサミン塩酸塩に共通して見られるGalα1-6の構造を認識する受容体が存在し、細胞の代謝過程に関与している
ことが示唆された。
【0080】
▲2▼マウス白血病(Friend)細胞
次に、マウスの白血病(フレンド)細胞を用い、各種のオリゴ糖について、同様の増殖実験を行った。
【0081】
培地(粉末)としては、RPMI-1640培地(日水製薬株式会社製、商品名「ニッスイ」▲1▼粉末、Code 05911)を用いた。
【0082】
血清は、GIBCO BRL、Fetal Bovine Serum(以下、FBS)(Cat. No. 26140-087)を用いた。
【0083】
培養は全て小シャーレ(CORNING社:35mm×10mm)を用いて行った。
また、使用する試薬のモル濃度に応じて、以下のように添加量を変えた。
【0084】
1)原液が100mMの時:
最終濃度を5mMとした場合は、106μl添加。
最終濃度を10mMとした場合は、223μl添加。
【0085】
2)原液が50mMの時:
最終濃度を5mMとした場合は、222μl添加。
最終濃度を5mMとした場合は、500μl添加。
【0086】
使用培地:5%FBS含有RPMI-1640培地
細胞を1.0×105個/ml × 2.0mlでシャーレにまき、直後に所定量の各オリゴ糖を添加した。3日間培養後、ピペッティングで細胞を撹拌し、エッペンドルフチューブに0.1mlとり、等量(0.1ml)のトリパンブルー試薬を加え染色し、血球計算盤で細胞数及び生存率を下記式に基づいて算出した。
【0087】
(細胞数の算出)
・1ml中の生細胞数=血球計算盤上の4区画の合計生細胞数/4×2×104=(1区画の平均生細胞数)×(トリパンブルーによる希釈換算)×(1ml中への体積換算)
【0088】
(生存率の算出方法)
・生存率(%=生細胞数/全細胞数 × 100
この結果を図5に示す。図5に示されるように、やはりアミノ基を持つオリゴ糖が効果的に増殖を抑制することがわかった。特に、MelNHClは極めて強力であり、GlcNHClに比べ80倍も抑制効果を示した。
【0089】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、2〜6糖のオリゴ糖であって、該オリゴ糖鎖の内部又は末端に、ガラクトースとグルコサミン又はその塩とが結合したガラクトシルグルコサミン構造を含むオリゴ糖を有効成分とすることにより、既知の中性糖に比べて飛躍的に白血病細胞の増殖を抑制する効果が得られ、これにより生体との親和性が高く安全性の高いオリゴ糖を用いた抗癌剤、特には抗白血病剤、抗腫瘍剤を提供することができ、死亡率の高い癌の抑制に大きく寄与することができる。また、本発明の抗癌剤を各種飲食品に添加することにより、機能性食品、健康食品として利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 K562細胞に及ぼす各オリゴ糖の影響を調べた結果を示す図表である。
【図2】 K562細胞に及ぼす各オリゴ糖の濃度の影響を調べた結果を示す図表である。
【図3】 K562細胞に及ぼす各オリゴ糖の影響を調べた結果を示す図表である。
【図4】 K562細胞に及ぼすオリゴ糖のアミノ基による影響を調べた結果を示す図表である。
【図5】 フレンド細胞に及ぼすオリゴ糖の影響を調べた結果を示す図表である。
Claims (5)
- 下記式(1)又は(2)で示されるオリゴ糖を有効成分とする抗癌剤。
Gal−GlcNH2…(1)
Gal−Gal−GlcNH2…(2)
(上記式中、Galはガラクトース、GlcNH2はグルコサミン又はその塩を表す。) - ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がα1−6結合である請求項1記載の抗癌剤。
- ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がβ1−4結合である請求項1記載の抗癌剤。
- ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がβ1−6結合である請求項1記載の抗癌剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の抗癌剤を含有する飲食品。
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