JP4693321B2 - 不透明体液中における可溶性フィブリンの迅速定量的測定方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（関連技術についての引用）
Ｂｒｉａｎ Ｓ．ＢｕｌｌおよびＲａｌｐｈ Ａ．Ｋｏｒｐｍａｎによる１９９６年１月２９日出願、標題“光学的血液止血分析装置および方法”である共願の発行特許番号５，７１６，７９６を本文でその全文を参考として引用している。
【０００２】
本出願は、係属中の出願番号０９／０２１，０６２の１９９８年２月９日出願の標題“全血中可溶性フィブリンの迅速定量的測定”の一部継続出願であり、その内容は、本文で参考として引用している。
【０００３】
（技術分野）
本発明は一般的に光学的血液止血分析方法類に関し、特に、全血のような不透明体液中における可溶性フィブリン分子類濃度の定量的測定方法類に関する。
【０００４】
（背景技術）
可溶性フィブリン（ＳＦ）分子類は、トロンビンがフィブリノーゲン分子類のアルファおよびベータポリペプチド鎖類を切断した時に、このフィブリノーゲン分子類から産生される。ＳＦ分子類が血流中に存在することは、初期汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の最も感受性のよい指標のひとつとなっている。ＤＩＣは、大手術時および重度外傷後において患者にとって大きな脅威となる。したがって、全血中可溶性フィブリンレベルの迅速定量的測定技術は、大手術時および重度外傷後において非常に有用であろう。
【０００５】
ＳＦ測定は多年にわたり実施されてきたが、大手術または重度外傷という状況における可溶性フィブリン測定は常に問題となっており、その技術はまれにしか用いられない。ＳＦ測定のために利用可能な技術はすべて、全血よりもむしろ血漿上で手技（procedure）を実施することを必要とする；このような手技は、さらに時間を要する。さらに、非常によく利用される技術は、半定量的（その結果は、（＋−＋＋＋＋）という形となる）である。こうした問題のゆえに、この試験が広く使用されることにはならなかった。利用可能な技術では、ＳＦ沈殿物の検出が光学的に実施されかつ透明な液体媒体がしたがって必須であるために、血漿を使用しなければならない。さらに、こうした技術においては、凝固プロセス試験のために光学的終点が望ましいが、それらが概して全反応チェンバを使い捨てにすることができるからである。全血中ＳＦのための光学的終点は、しかし、全血の不透明性およびＳＦ沈殿物の多様な性質のために、概して有用ではない。したがって、光学的終点を利用するこれまでの技術では、血漿使用を必要としている。
【０００６】
血漿は、全血から遠心分離によって調製される。遠心分離段階では、一般的に、手術室から分析室に試料を運ぶ必要がある。したがって、試験結果に必要な最小時間は、３０分から４５分となる。遠心分離に要する時間と分析時間にこの運搬時間を加味すると、その間に患者状態が実質的に変化する可能性があるので、手術室という状況ではこの試験結果は有用ではない。ＳＦ動態（kinetic）研究のため、血漿調製を必要とする試験の実施は、フィブリノーゲン上でのトロンビンの反応が何秒かで起こることおよびその後のＳＦ検出に干渉しないような抗重合剤を使用しなければこの反応を停止できないため、同様に問題となっている。
【０００７】
ＳＦ検出のために非常に多く利用されている方法類は、＋−＋＋＋＋のような非常に近似的な方法でのみ存在するＳＦ量を定量する。より厳密な定量を行うものでは、
１．ＳＦ沈殿物を除去（removing）し、乾燥しその沈殿物を秤量すること；
２．ＳＦ沈殿物を除去し、それらのたんぱく質含量を分析すること；
３．ＳＦ沈殿物を第２抗体を用いて免疫沈澱させ、その量を定量すること、
のような付加的段階を必要とする。
【０００８】
これらの技術はすべて、ＳＦ分析にさらに多くの時間を付加することになる。
それらは、結果的に、前記試験をより有用性に劣るものとする。
【０００９】
したがって、全血のような不透明懸濁液中でＳＦ試験を実施するための方法を開発する必要がある。このような方法は、それらの光学的終点のゆえに血漿中で実施せねばならない現在利用可能な試験類よりもはるかに優れた用途を有するであろう。実際には、手術室で利用できるのは全血試験のみであり、そこでは、ＳＦ迅速測定により外科医または麻酔医がＤＩＣに至るような状態を正すために迅速手段を講じることができるであろう。
【００１０】
（発明の開示）
本発明の目的は、大手術およびＤＩＣが突如起こりうる重度外傷の存在下という条件下にある手術室で前記試験を有用とするために、全血の不透明懸濁液中可溶性フィブリンを光学的に迅速定量するための方法を提供することである。
【００１１】
これらの目的類および利点類は、本発明の方法によって達成される。本発明の態様類によれば、前記方法は、下記の段階を含む。
（ａ）透明容器中で、可溶性フィブリンを沈殿させる条件下で前記不透明試料の一部を十分量の沈殿試薬と混合すること；
（ｂ）沈殿物を前記不透明試料液体中で検出可能とするため、前記容器のある領域中で可溶性フィブリン沈殿物を凝集させかつ濃縮させること；
（ｃ）前記沈殿物を光学的に検出すること；
（ｄ）前記不透明試料液体中で前記沈殿物が最初に光学的に検出可能となった時間を記録すること、ここで沈殿試薬添加から凝集沈殿物検出までに経過した時間は、不透明試料液体中に存在する可溶性フィブリン量の逆数（inverse measure）である。
【００１２】
本発明による方法は、いくつかの利点を付与する。下記でより詳細に説明するように、本発明の方法は、限定するわけではないが全血のような不透明体液中における可溶性フィブリンの迅速定量的測定値を提供する。特に、本発明の方法は、全血中ＳＦ測定に光学的終点を使用することを可能とする。当該技術において、光学的終点は、それらが一般的に全反応チェンバを使い捨て可能とするので、凝固プロセスの試験類には望ましいことが公知となっている。しかし、本発明以前において、全血中ＳＦのための光学的終点は、全血の不透明性およびＳＦ沈殿物の多様な性質のゆえに、概して有用ではない。本発明は、ＳＦが沈殿物を形成し少量の予測可能部分の反応混合物中に集まることができるようにし、それらを容易に光学的に検出できるようにする。ＳＦ沈殿物が高濃度で集められると、不透明全血媒体を排除し、外部の反応チェンバから光学的に検出可能となる。本発明の方法は、血漿調製段階類を省き、迅速かつ有効なＳＦ測定値を提供し、それらは、大手術および急激ＤＩＣが突然起こりうる重度外傷の存在下という条件下にある手術室で容易に使用可能である。本発明は、不透明試料液体中において可溶性フィブリン量を正確に検出かつ測定できるので、本発明は、初期汎発性血管内凝固症候群検出の有効な手段を提供する。
【００１３】
本発明の方法は、大手術の間、重度外傷の後および汎発性血管内凝固症候群が最大の脅威となる類似状況類における使用に非常に適している。本発明の方法は、可溶性フィブリンを迅速かつ定量的に測定することによって、ＤＩＣを効果的に検出できる。
【００１４】
本発明を付属の請求の範囲でその全容を定義し、下記の好適な態様類で説明する。
【００１５】
本発明の上記および他の特徴およびそれらを得るための方法は、添付図面と合わせて下記の説明を参考にすれば、より明らかにかつよりよく理解されるであろう。これらの図面では本発明の典型的態様のみを図示しており、したがって、その範囲を限定するものではない。それらは、具体性と詳細を付加するために役立っている。
【００１６】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、第１に、不透明試料液体中に含まれる可溶性フィブリンの存在と量を決定する方法を提供する。本発明の態様によれば、前記方法は、下記の段階からなる。
（ａ）透明容器中で、可溶性フィブリンを沈殿させる条件下で前記不透明試料の一部を十分量の沈殿試薬と混合すること；
（ｂ）沈殿物を前記不透明試料液体中で検出可能とするため、前記容器のある領域中で可溶性フィブリン沈殿物を凝集させかつ濃縮させること；
（ｃ）前記沈殿物を光学的に検出すること；
（ｄ）前記不透明試料液体中で前記沈殿物が最初に光学的に検出可能となった時間を記録すること、ここで沈殿試薬添加から凝集沈殿物検出までに経過した間は、不透明試料液体中に存在する可溶性フィブリン量の逆数である。
【００１７】
本発明の目的のためには、前記不透明試料液体は、可溶性フィブリンを含む体液であれば、いかなるものであってもよい。しかし、本発明は、特に、全血、血液性滲出物、血液性脳脊髄液等のような不透明体液類に適用される。好適には、前記試料液体は、全血である。本発明の一態様において、全血は希釈される。この全血は、食塩水溶液のような希釈剤によって希釈できる。
【００１８】
沈殿試薬は、可溶性フィブリン含有試料体液から沈殿物を沈殿させることができればいかなる試薬であってもよい。沈殿試薬の例には硫酸プロタミン、ポリブレン等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、前記沈殿試薬は、硫酸プロタミンである。
【００１９】
沈殿試薬の量は、もしそれが試料液体中に含まれる実質的に全ての可溶性フィブリンを前記液体から沈殿させることができるならば、十分である。当業者は、本開示からして、過度な実験を行うことなく用いるべき沈殿試薬の量を容易に決定できる。
【００２０】
不透明試料液体の一部を、可溶性フィブリンを沈殿させる条件下で沈殿試薬と混合する。本発明の一態様において、前記混合は、約５．９以下のｐＨで約３７℃の温度で行うことができる。
【００２１】
本発明の態様によれば、透明容器に入れられた前記可溶性フィブリン沈殿物は、前記透明容器を本発明の装置に入れることによって、この容器の限定領域に凝集させかつ濃縮させることができる。本発明で用いる装置は、前記装置が極めて限定された部分の反応混合物にＳＦ沈殿物を凝集させかつ濃縮させそれらを希釈全血のような不透明媒体中で可視できるようにするように、前記反応混合物中において水流パターンを形成する特性を有していなければならない。本発明の一態様において、米国特許第５，１８４，１８８号に記載されたような光学血液止血分析装置が提供され、その関連内容を本文でその全文を参考として引用している。
【００２２】
一般に、光学血液止血分析装置は、透明で、およそ円筒状の試料容器（たとえば、１２×７５ｍｍのガラス試験管）をほとんど水平位置におよそ３７℃の温度に保持しつつ、その容器を回転させかつ揺動させることができる。試料液体および沈殿試薬は、前記容器の開放端から導入され、前記装置によってその後混合インキュベーションされる。
【００２３】
米国特許第５，１８４，１８８号に記載されているように、本発明の機械装置の一態様を図１ａおよび図１ｂに示したが、それらは、試料液体２を含む試料容器を示しており、それが、１対の回転ローラ３上でほとんど水平位置に保持されている。図１ｃは、図１ａおよび図１ｂに示した装置の末端図である。ローラ３は、直接または駆動トレイン（例 ベルト、ギア類または摩擦ドライブ）によって前記ローラに結合させた電気モータのようなあらゆる便利な手段によって回転させることができる。好適な態様において、前記試料容器は、図１ａを図１ｂと比較して示したように、好適には約±３°の角度によっておよそ中点ピボットＰの周りに縦方向に揺動する。試料容器１の回転速度は典型的には１２ｒｐｍであり、揺動速度は典型的にはおよそ１５サイクル／分である。前記の揺動動作は、カムまたは他の便利ないかなる手段によっても付与することができる。前記特定の揺動および回転速度類は必ずしも非常に重大というわけではないが、上記の特定の値が効果的であることがわかった。
【００２４】
試料液体２は、含有液体の強力な表面張力のゆえに前方に傾けても、前記容器１辺縁のわん曲が小さい半径であることにも助けられ、小直径の試料容器１の開放端から流れ出ることがない。回転および揺動時において、沈殿試薬は、希釈全血に含まれる可溶性フィブリンを溶液から沈殿させる。沈殿反応が起こっていると、前記の揺動および回転動作が、全試料中のＳＦが集合するであろう領域にまだ可視化されていないフィブリンモノマー（ＳＦ）凝集物（clump）を動かす。それらがこの好適な領域に到達すると、この凝集物が既にそこにあるＳＦ物質と相互作用し、光学的にはまだ小さすぎて検出できないＳＦ集合物（accumulation）はその位置に引きつけられる。もしＳＦ量が十分に多いと、ＳＦ沈殿物は、内部試験管表面に固着し、反応混合物から遊離するようになる。
【００２５】
沈殿物が最初に光学検出可能となる時点を、第１終点と定義する。沈殿物が試験管に固着し試験管とともに回転する時点を、第２終点と定義する。このプロセス開始から第１終点および第２終点時点までに要する時間を測定する。この時間測定値は、標準曲線によってそれぞれＳＦ量に相関させることができる。ＳＦ標準曲線は、未処理全血に既知量のＳＦを添加して生成した混合物を分析することによって、作成する。
【００２６】
試料液体中ＳＦ量の決定目的のため、前記の時間測定値のいずれかまたはその両者を用いて標準曲線によりＳＦ量を決定することもできる。前記プロセス開始から第２終点までの時間は測定がより容易である。しかし、ＳＦレベルが低いと唯一第１終点しか得られないが、その理由は、前記沈殿物が第２終点に至るほど十分に濃縮できないからである。この場合、ＳＦ量決定に第１終点時間測定値を用いるのが好適である。この目標達成のためのいかなる匹敵する手段も本発明の範囲にあり、密封容器の単純回転または攪拌、または、その開放部に液体保持辺縁を有する容器を使用することが含まれる。
【００２７】
前記プロセスは３７℃で最適に作用するので、前記試料をその温度に保持することが望ましい。前記試料液体の温度は、たとえば、前記試料容器１の近くに配置したタングステンフィラメント電球４によって保持され、前記試料容器１に隣接させまたはそれに接触させた温度センサ６を有する恒温回路５によって制御される。これとは別に、前記温度は、所望の温度を有するインキュベーションチェンバ中に前記試料容器１を配置することによって、保持することもできる。
【００２８】
前記プロセス開始から前記終点類までの時間は、前記終点類を検出する種々の手段によって測定できる。いくつかの異なる種類の終点検出器を本発明で使用できる。終点検出器類の種類の例には、視覚による直接観察；飛点走査スキャナー；電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、透明試料容器の内壁を前記容器の開放端のすぐ外部の位置から（たとえば、発振ミラーによって）掃引させることによる（例 小型のソリッドステートレーザーからの）狭いビームの光で構成される検出器；および光ビームおよび可溶性フィブリン沈殿物の存在を血液それ自体の揺動表面から識別する時間遅れディスクリミネータ回路を用いる検出器が含まれるが、それらに限定されない。上記検出器類は、米国特許第５，１８４，１８８号に十分に記載されており、その内容は、本文で参考として引用されている。
【００２９】
上述の光学的血液止血分析装置は、本発明の特定の態様と機能を説明すると言う目的のためにのみ選択したということを理解されたい。他の種類の光学装置も、その装置が上記と同一の機能を遂行できる限りにおいて、使用することができる。この開示をみれば、当業者には適切な装置が明白であろう。
【００３０】
本発明の一態様において、前記測定段階類を第２の沈殿試薬で繰り返す。この態様によれば、前記測定方法は、さらに、前記不透明試料液体のさらに一部を第２の沈殿試薬と混合する段階および経過時間の第２時間測定値を得るために上記段階（ａ）から（ｄ）を繰り返す段階が含まれる。その後、第１の時間測定値および第２の時間測定値を、それぞれ第１および第２の沈殿試薬で作成したそれぞれの標準曲線と関連させる。前記不透明試料に存在する可溶性フィブリンの量は、前記測定値２個の平均によって決定される。本発明の目的のため、前記第１および第２沈殿試薬類は、異なる濃度の同一試薬であってもよいし、または、異なる２種の試薬であってもよい。
【００３１】
不透明試料液体部分は、２つ以上の測定値を得るために、２種以上の異なる濃度の沈殿試薬とそれぞれ混合することができ、この試料液体に含まれるＳＦ量は、前記測定値を平均することで決定することができる。これとは別に、不透明試料液体の部分は、２種以上の異なる種類の沈殿試薬とそれぞれ混合することができ、同一結果を達成することができる。
【００３２】
（実施例）
実施例Ｉ
全血中ＳＦ生成動態
本発明の可溶性フィブリン定量方法を用いて、トロンビン処理全血試料中のＳＦ量を測定し、前記反応の動態を決定する。全血２ｍｌをトロンビン０．０１ＮＩＨ単位とゼロ時間で混合し、記載の時点でアリコット１５０μｌを取り出した。各アリコットを約４５０μｌのｐＨ５．０食塩水に懸濁後、沈殿試薬の硫酸プロタミン約２０μｌとともに試料容器に入れた。沈殿出現時間を測定し、ＳＦ単位で記録した。結果を表１にまとめた。
【００３３】
【表１】

【００３４】
図２は、全血中ＳＦ産生動態プロットである。矢印で示した時点で、トロンビンを反応混合物に添加する。本発明を用いて、１分から３０分間隔で分析を行う。少量のトロンビン添加後３分から４分の初期において、ＳＦ濃度力価が上昇する。産生された初期ＳＦ分子類はフィブリノーゲンに担持され、可視可能なフィブリンクロットとして重合するのを妨げられている。約３分後に最大濃度に到達した後、フィブリノーゲンの担持能以上にＳＦが存在すると、可視可能なフィブリンクロットとなって前記混合物から沈殿し、その後３０分にわたって、ＳＦレベルは約５０％ほど低下する。前記ＳＦレベルは、その後の時間にわたってわずかに減少したが、２時間を越える期間において本質的に安定である。
【００３５】
図２に示したように、本反応の動態は、何分かで完了できる試験を必要として、したがって、前記試験を全血中で行う必要がある。
【００３６】
実施例ＩＩ
全血中ＳＦ測定値
本システムの第２の試験において、１連の全血試料１５０μｌを３０分間隔で肝移植を受けた患者から取り出した。これらの試料を約４５０μｌの食塩水に懸濁させ、沈殿試薬の硫酸プロタミン約２０μｌとともに試料容器に入れた。全血試料は、手術開始時点およびその後は３０分おきに患者から採取し、移植プロセスの重要再潅流相においては試料をより近接した間隔とした。硫酸プロタミンと全血の混合物を、約３７℃の温度において米国特許第５，１８４，１８８号に記載の止血分析装置に入れ、沈殿物が形成され内部試験管表面に固着するまで、前記混合物を反応させた。前記プロセス開始から第１終点までおよび第２終点までの時間をその後測定し、前記測定値を標準曲線によってＳＦ量と相関させた。
【００３７】
同一試料のさらに一部を遠心分離し血漿を回収し、冷蔵し、翌日フィブリン分解産物類（ＦＤＰｓ）、Ｄ−ダイマーレベルおよびフィブリノーゲンレベルの追加アッセイを実施できるようにした。これらの４種のアッセイ類は、図３ａおよび図３ｂにプロットし、結果を合わせて示した。
【００３８】
図３ａは、肝移植を受けた患者由来試料で行った１連のフィブリノーゲン測定値である。図３ｂは、同一患者で行った他の３種のアッセイ類を示しており、肝移植時点と関連させたＤ−ダイマー、フィブリン分解産物類（ＦＤＰｓ）および可溶性フィブリン（ＳＦ）の測定値類である。実際の手術時においてはＳＦ試験のみを実施した。残りの試験類は翌日実施したが、残りの試験類は全て全血試料からの血漿調製を必要とし、かつ、患者の状態が急激に変化しておりその値が手術外科医にとって有用でないからであった。４種の試験方法すべての種々の測定値が緊密に相関していることは、試料を採取した時点から何分かでＳＦアッセイによって得られる情報が非常に不安定な患者の維持に有用であることを示唆している。
【００３９】
相関係数を表２にまとめた。表２から、４種のアッセイ全てが高い相関をしていること−−−フィブノーゲンが患者循環から消失するとともに、ＳＦおよび種々の量のフィブリノーゲン／フィブリン分解物（ＦＤＰ、Ｄ−ダイマー）が現れ始めるという視覚的印象が確認できる。
【００４０】
【表２】

【００４１】
上記は本発明の範囲を示すことを意図しており、限定するものではない。実際、当業者は、本文の教示に基づき過度な実験を行うことなく、さらなる態様を想定しかつ作製できる。
【００４２】
本発明は、その必須の特性から逸脱することなく、他の特定形状で具現できる。記載の態様は、全ての観点において例示のためのみであり限定するためではないと見なされるべきである。本発明の範囲は、したがって、上記明細書よりもむしろ添付の特許請求の範囲によって示される。本請求の範囲の均等物の意味と範囲内の変更はすべて、それらの範囲内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 本発明の一態様の側面図であり、本装置の揺動中の位置を示している。
【図１ｂ】 本発明の一態様の側面図であり、本装置の揺動中の他の位置を示している。
【図１ｃ】 図１ａ中に示した装置の図である。
【図２】 全血中ＳＦ産生動態のプロットである。
【図３ａ】 肝移植を受けた患者由来の試料で行ったフィブリノーゲン測定値群を示している。
【図３ｂ】 同一患者について行った３種の他のアッセイ類を示している；肝移植時点と関連させたＤ−ダイマー、フィブリン分解産物類（ＦＤＰ）および可溶性フィブリン（ＳＦ）の測定値類である。

Claims (17)

1. 下記のステップを含む不透明試料液体中に含まれる可溶性フィブリンの存在と量を決定する方法であって、
   （ａ）透明容器中で、可溶性フィブリンを沈殿させる条件下で前記不透明試料の一部を十分量の沈殿試薬と混合するステップと、
   （ｂ）沈殿物を前記不透明試料液体中で光学的に検出するため、前記容器中で凝集した可溶性フィブリン沈殿物を濃縮させるステップと、
   （ｃ）前記沈殿物を光学的に検出するステップと、
   （ｄ）前記混合するステップから、（ｉ）前記不透明試料液体中で前記沈殿物が最初に光学的に検出、（ｉｉ）凝集した沈殿物が前記容器へ付着したことを光学的に検出、の少なくとも一方の発生を検出するまでの時間を監視することにより、前記不透明試料液体に存在する可溶性フィブリンの量を測定するステップと、を有する方法。
2. 前記ステップ（ｂ）がさらに、
   （ａ）前記混合物を含む透明容器を揺動および回転動作に供することができる装置内に、前記容器を入れるステップと、
   （ｂ）可溶性フィブリン沈殿物を凝集させるために前記装置内に入れられた容器中に含まれる混合物を揺動および回転動作に供し、前記容器に凝集した前記可溶性フィブリン沈殿物を濃縮させるステップと、
   を含む請求項１記載の方法。
3. 可溶性フィブリンの量を測定するステップは、可溶性フィブリン含量公知の試料により測定した標準参考曲線と前記検出時間を関連付け、前記不透明試料液体中に含まれる可溶性フィブリン濃度を決定するステップをさらに含む請求項１記載の方法。
4. 前記混合するステップは第１沈殿試薬を用いて行う工程であって、前記測定するステップ（ｄ）は可溶性フィブリンの第１測定値を得るものであって、請求項１記載の方法はさらに、前記不透明試料液体のさらに一部を第２沈殿試薬と混合し、請求項１のステップ（ａ）から（ｄ）までを繰り返し、可溶性フィブリンの第２測定値を得るステップをさらに含む請求項１記載の方法。
5. 可溶性フィブリンの前記第１測定値および第２測定値をそれぞれの沈殿試薬で作成したそれぞれの標準曲線類と比較し、前記不透明試料中に存在する可溶性フィブリン量の平均値を決定するステップは、可溶性フィブリンの前記２個の測定値の平均によって決定される請求項４記載の方法。
6. 前記第１沈殿試薬および第２沈殿試薬が、同一沈殿試薬の２種の異なる濃度である請求項４記載の方法。
7. 前記第１沈殿試薬および第２沈殿試薬が異なる請求項４記載の方法。
8. 前記不透明試料液体が、可溶性フィブリンを含み、ヒト由来の不透明体液である請求項１記載の方法。
9. 前記不透明試料が、全血、血液性滲出物、血液性脳脊髄液から構成される群から選択される請求項１記載の方法。
10. 前記不透明試料液体が、希釈全血である請求項９記載の方法。
11. 前記沈殿試薬が硫酸プロタミンまたはポリブレンである請求項１記載の方法。
12. 前記不透明試料液体の一部が、約５．９以下のｐＨでかつ温度約３７℃において前記沈殿試薬と混合される請求項１記載の方法。
13. 前記沈殿試薬類が硫酸プロタミンまたはポリブレンである請求項６記載の方法。
14. 前記第１沈殿試薬が硫酸プロタミンであり、前記第２沈殿試薬がポリブレンである請求項７記載の方法。
15. 前記不透明試料液体における可溶性フィブリンの量を測定するステップは、前記検出時間と可溶性フィブリンの量との間の逆数の関係を用いて行われることを特徴とする請求項１記載の方法。
16. 前記不透明試料液体における可溶性フィブリンの量を測定するステップは、最初に凝集した沈殿物を検出した時間を測定することによって行われることを特徴とする請求項１記載の方法。
17. 前記不透明試料液体における可溶性フィブリンの量を測定するステップは、凝集した沈殿物が前記容器へ付着したことを検出した時間を測定することによって行われることを特徴とする請求項１記載の方法。

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