JP3261133B2 - 光学的血液止血分析装置および方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願 本願は1990年１月23日付出願、発明の名称「ヘメック
検査器」（HEMECH SCREENER）、発明者ブライアン・エ
ス・ブル（Brian S.Bull）およびラルフ・エイ・コープ
マン（Ralph A.Korpman）の米国特許出願第07/468,594
号の部分継続出願である。

発明の背景 1.発明の分野 本発明は光学的血液止血分析装置および方法、さらに
特に、血液血小板および血液凝固システムの機能容量の
光学的測定装置および方法に関する。

2.関連技術 医学分野において、血液凝固時間および血液血小板機
能を測定し評価すること、およびさらに特に、循環内の
血小板の状態を決定することがしばしば望ましい。たと
えば、血小板機能の状態および凝固時間の研究は、血小
板機能亢進性または血液過凝固性（ハイパーコアギュラ
ビリティー、hypercoagulability）のために血栓症の増
大した危険状態にある患者の同一性確認で有用である。
これらはまた、血液低活性または血液低凝固性のために
出血の危険状態にある患者の同一性確認でも有用なもの
である。それで血液のこれらの性質を測定するための装
置は非常に有用である。循環内の血小板の状態を測定す
る能力は、これが心筋梗塞になる冠状血栓症を形成する
可能性の比較的正確な評価を可能にするので重要であ
る。

別々になっている血液凝固評価装置および血小板機能
評価装置は当該技術分野で知られている。しかしなが
ら、循環内の血小板の状態を決定するための試験装置は
手に入れることができない。血液凝固を評価するための
市場の多数の機械は、凝固終点を検出するために光ビー
ムを用いているが、血漿（赤血球を除去することによっ
て得られる比較的透明の液体）で使用することができる
のみである。非常に僅かの血液凝固評価装置は不透明の
全血および血漿の両方で使用することができるが、これ
らは全て検体との物理的接触を必要とすると信じられ、
それでこれらには感染危険物である部品が含まれ、感染
増殖を避けるために注意深く清浄にしなくてはならな
い。さらに、このような装置は試験性能を再現性よく潜
在的に得るように清浄にすることが困難である。この後
者の種類の機械はしばしば主として機械式終点検出器を
用いており、この理由のために故障しがちである。この
ような装置の一つの例は、金属プローブを用いる線維計
（フィブロメーター、fibrometer、以下同）として知ら
れている。

循環内の血小板の状態を決定することはできないけれ
ども、血小板機能を評価することが可能な装置が存在し
ている。これらの装置の全ては血漿で操作し、単一目的
の装置であると信じられる。これらの機械は一般に血小
板凝集計と呼ばれている。凝集計は一般に37℃（体温）
でインキュベーションした血小板富化血漿（血小板を含
有する血漿）の懸濁液を通して光を透す。懸濁液を通っ
た光輝は一般に動いている血小板表面によって屈折され
る。凝集剤を添加するとき、血小板は大きな凝集体に凝
集する。このことにより、より多くの光が測定チャンバ
ーの向こう側にある受光素子に達し、検出可能な信号を
発生する。

全血で血小板機能研究を行うと称する市販の一つの凝
集計装置がある（クロノログ社（Chronolog Corporatio
n）、ハバースタウン（Haverstown）、ペンシルベニア
州（PA））。この装置は血小板凝集体の形成を測定しな
いで、むしろ既に形成された凝集体の一対の金属線に対
する付着を測定すると信じられる。さらに、この装置は
どのような凝固研究も行うことができない。

血小板の凝結および濃縮および凝集を光学的に表示す
るが、血漿でのみ使用することができる装置を記載した
一つの文献がある（米国特許第4,501,491号参照）。こ
の文献にはまた当該技術分野のその他の多数の文献が引
用されている（第２欄参照）。

それで、全血を用いて血液血小板機能および凝固評価
を分析することができる単一の装置を提供することが望
ましい。このような機械は全血検体と分析要素との間の
物理的な接触を必要としてはならない。結果が、若し血
小板機能を循環内で測定したならば得られたであろう結
果に類似するように循環から取り出した直後に血小板の
機能状態を決定することが可能な装置を提供することも
望ましい。これは、試料に予備的変性を加えることなく
全血中で試験を行うことを必要とする。

発明の開示 本発明の装置は止血の種々の別個の（しかし関連す
る）構成要素、即ち血液血小板および血液凝固システム
の機能容量を測定するために設計されている。さらに、
この装置は循環内の血小板の本来の状態を決定すること
が可能である。本発明の好ましい態様には、１個または
２個以上の光学的終点検出器を有する機械式検体取り扱
い装置が含まれている。この装置は、少量の希釈全血を
体温でインキュベーションし、そして揺動および回転運
動により血液を混合して添加した固体または液体試薬に
血液を均一に露出させる。次いでこれは少なくとも２個
の別の終点で測定する。第一の終点は血液検体内の血小
板の活性の測定である。第二の終点は凝固カスケードの
活性の測定である。幾つかの中間の測定も利用可能であ
る。

本発明の装置の二様式運動の目的は、検体容器の全内
側表面上に検体液のこのような薄いフィルムを維持する
ことである。これにより、この薄いフィルム内の血小板
集塊およびフィブリンポリマーを濃縮することにより終
点検出の感度が増大する。

この装置は血液血小板機能システムと血液凝固システ
ムの両方を測定することができるので、これらの試験の
性能は、この装置が現在広範な用途で４個の別々のスク
リーニング試験の一群に情報等価物を与えることができ
るようにする。これらの現在利用されている試験には、
血小板計数、出血時間、プロトロンビン時間、および活
性化部分トロンボプラスチン時間が含まれる。さらに、
この装置はこの情報を150μリットル（μＬという）の
ように少ない全血で得ることができる。現在、全ての先
行技術の光学的終点検出器は赤血球の存在下で失敗して
いると信じられる。本発明の終点検出の光学的方法は、
それが赤血球の存在下で血小板機能の評価のために有効
に機能する点で、およびそれが赤血球の存在下で凝固終
点の検出で増強される点で独特なものである。結果とし
て、本発明の信号対ノイズ比は光学的血小板機能のため
に有効であり、現在の血液凝固検出器よりも実質的に良
好である。

本発明は、循環内の血小板の本来の状態に対し感受性
である様式で血小板機能妥当性の迅速な評価を可能にす
る。さらに、血小板数および血小板機能の両方の減少が
評価されるかもしれない。本発明はまた、血小板凝集剤
および血小板刺激剤（たとえば、アラキドン酸、アデノ
シン二リン酸、リストセチン、エピネフリン、コラーゲ
ン等々）に対応する血小板機能活性の評価、および血小
板機能の転形のために臨床的に使用される抗血小板物質
（たとえば、アスピリン、スルフィンピラゾン、ジピリ
ダモール等々）の効果の研究を可能にする。本発明はま
た、血液凝固反応で（たとえば、ヘパリン、クマジン
（coumadin）および関連抗凝固薬の臨床的使用をモニタ
ーするとき）抗凝固薬の効果を評価するために使用する
こともできる。

血小板活性および／または血液凝固機構を評価するた
めの発出試薬（ジスクローズ試薬、disclosing reagen
t）としてケイソウ土を使用することができる。ケイソ
ウ土に加えて、希釈剤を使用することもできる。全血、
ケイソウ土および／または希釈剤を組み合わせる順序は
種々の試験パラメーターの測定を可能にする。たとえ
ば、全体の血液凝結経路の欠陥について検体（スクリー
ン、screen、以下同）するために、血小板機能および／
または数のアッセイを可能にするために、および／また
は冠状血栓症の形成の可能性を示すために試験を行うこ
とができる。

本発明の装置の好ましい態様は、不透明な全血中の血
液血小板機能および凝結の両方を同時に検査することが
できる。所望ならば、本発明の装置は追加の試験操作
で、血小板刺激剤に対する血小板応答に於ける特定の情
報を提供することができる。

本発明の装置および方法の著しい利点には下記のもの
が含まれる。

1.本発明は血液の微小の試料を用いる（約150μＬ）。

2.本発明は多くの試料調整問題を取り除いて全血で操作
する。

3.本発明は止血機構の血小板および凝固構成要素を同時
に測定する（第XIII因子活性を除く）。

4.本発明は分析要素と血液検体との間の物理的接触を必
要としない。

5.本発明は血小板機能についての第一の単純な完全自動
化日常試験を提供する。これは（アスピリン治療のよう
な）血小板機能を低下させる心臓血管治療養生を評価す
るような用途に有利である。

6.本発明は循環内の血小板の本来の状態を決定するため
に検体を採取した後迅速に血小板機能を測定することが
できる。それでこれは、血小板機能を加減し短い半減期
を有する一酸化窒素およびプロスタサイクリンのような
循環内に存在する非常に不安定な物質の存在に対して感
受性である。

本発明の別の面は、添付する図面と結び付けて考慮す
るとき下記の詳細な記載から明らかになるであろう。し
かしながら、この詳細な記載および特別の実施例は、本
発明の好ましい態様を表すけれども、例示のみの方法に
よって与えられるものであることが理解されるべきであ
る。

図面の簡単な説明 図1aおよび1bは本発明の好ましい態様の概略側面図で
あり、装置の揺動運動の二つの位置を示している。図1c
は図1aに示す装置の概略端面図である。

図２は目視観察により凝集時間、粘着時間および凝固
時間を検出するための構成の一つの態様の概略側面図で
ある。

図3aは本発明と一緒に使用するための自動粘着時間お
よび凝固時間終点検出器の一つの態様の概略側面図であ
る。図3bは図3aに示す装置の概略端面図である。

図４は図３に示す終点検出器と一緒に使用するための
増幅器および信号識別回路の略配線図である。

図５は本発明と一緒に使用するための自動粘着時間お
よび凝固時間終点検出器の一つの態様の概略側面図であ
る。

図６は本発明と一緒に使用するための自動凝集時間終
点検出器の一つの態様の概略側面図である。

図７は図６に示す終点検出器と一緒に使用するための
増幅器および信号識別回路の略配線図である。

種々の図面の類似参照符号は類似要素を指す。

好ましい態様の詳細な記述 概説 血小板機能試験と凝集試験とを結び付けるために本発
明により克服されるべき二つの基礎的な問題点は時間測
定と終点検出であった。凝固機構に必要なトロンビンは
公知の血小板凝集の最も有力な刺激剤であるので、時間
測定が問題点である。それで、若し血小板凝集が完結す
る前に凝固が起こると、凝固の過程で生じたトロンビン
が血小板を急速に凝集するであろう。検出器は血小板凝
集と凝血形成との間を識別することができなくてはなら
ず、理想的には血小板富化血漿を製造する方法によりも
たらされる人工物を避けるために、全血中でこのように
できなくてはならないので、終点検出が問題点である。
（線維計のような）幾つかの機械式検出器および（ある
種の自動活性化凝集タイマーまたは「ACT」のような）
幾つかの磁気式検出器は全血で動作するけれども、共に
異物、即ち、線維計の場合には金属プローブを、そして
自動ACT装置の場合は円筒形磁石を血液中に持ち込む。
さらに、これらの装置の何れも血液凝固の進行中の血小
板凝集を検出することができない。

この時間測定問題は本発明において血液試料を希釈し
て凝固の開始を遅らせ、次いで有機活性化剤で被覆した
ケイソウ土のような活性化マトリックスを使用し（非常
に希釈した試料中でさえも）測定のために目に見える血
小板凝集体を作ることによって解決された。ケイソウ土
は血小板を活性化すると共に凝集が起きていることを容
易に表示するために十分に大きい血小板凝集用のマトリ
ックスを提供する。この活性化および凝集認識の全ては
凝固カスケードからどのようなトロンビンも生じる前に
起こる。本発明のシステムで使用される高度の検体希釈
で、検体容器の内壁上に流される全血の薄い層は、十分
に透明で光学的終点検出を可能にする。これは検体液中
に外来の測定対象物を持ち込まない顕著な利点を有して
いる。これはまた幾つかの先行技術の検出装置で使用さ
れるプローブを洗浄する必要性および１回使用磁石を置
き換える必要性を除外する。

機械装置 本発明の機械的面には、容器をほぼ水平の位置で約37
℃の温度で維持しながら、透明でほぼ円筒形の検体容器
（たとえば、12×75mmのガラス試験管）を回転し且つ揺
動することが共に可能な装置が含まれている。全血、希
釈剤および種々の血小板作動薬をこの容器の開口端内に
入れ次いで装置により混合しそしてインキュベーション
する。

本発明の機械装置の一態様を図1aおよび1bに示す。図
には検体液２が入った検体容器１が示され、検体容器は
１対の回転ローラ３の上でほぼ水平位置に支持されてい
る。図1cは図1aおよび1bに示す装置の端面図である。ロ
ーラ３は、直接または駆動系統（たとえば、ベルト、歯
車または摩擦駆動装置）を介してローラに連結された電
気モータのような全ての便利な装置により回転させるこ
とができる。好ましい態様において、検体容器１は、図
1aと図1bとを比較することによって示されるように、ほ
ぼ中間点の枢軸Ｐの周りに好ましくは約±３゜の角度で
長手方向に揺動される。検体容器１の回転速度は典型的
に約12rpmであり、揺動速度は典型的に１分間当たり約1
5サイクルである。揺動運動はカムまたは全てのその他
の便利な手段により与えてもよい。特定の揺動速度およ
び回転速度は必ずしも決定的ではないが、上記のような
特定の値が有効であることが見出された。

検体容器１の縁の湾曲の小さい半径によって助けら
れ、かつ入っている液体の強い表面張力によって、前方
に傾いたとき小さい直径の検体容器１の開口端から検体
液２が飛び出すことはない。このことは容器の底の全部
の長さを揺動サイクルの間に検体液で覆うことができる
ことを意味する。検体容器の回転のために、検体容器１
の全内表面は、容器１の底で後方および前方に移動する
検体液２のたまりにより容器壁が回転するとき検体液の
薄い層で覆われる。

本発明の装置の二様式運動の目的は、検体容器の全内
表面に亘って検体液の正にこのようなほぼ均一な薄いフ
ィルムを維持することである。このことは薄いフィルム
中の血小板集塊およびフィブリンポリマーを濃縮するこ
とによって終点検出の感度を増加させる。密封した容器
の単純な回転若しくは撹拌またはその開口部に液体保持
縁を有する容器の使用を含む、この目的を達成するため
のどのような匹敵する手段も本発明の範囲内にある。

このプロセスは37℃で最も良く動作するので、検体を
この温度に維持することが望ましい。検体液の温度は、
たとえば、検体容器１の近くに配置され、検体容器１に
隣接または接触した温度センサ６を有するサーモスタッ
ト回路５により制御されたタングステンフィラメント光
電球４により維持することができる。

また、この温度は所望の温度を有するインキュベーシ
ョンチャンバー内に検体容器１を置くことによって維持
することができる。

検体液調製 有機活性化化合物（たとえば、フミン酸、アミノ酸ポ
リマー等）を添加することによってその表面を変性した
または変性しない発出試薬（ディスクロージャー試薬、
disclosure reagent、以下同）が、血小板凝集を開始す
るためにおよび表示するためにも使用される。この発出
試薬は血小板凝集体の最大表面積および表面の種類を表
わす高い軸回転指数を有していなくてはならない。適当
な発出試薬には、ケイソウ土、微細に切断されたガラス
または微細に切断されたガラス繊維が含まれる。当業者
はその他の適当な発出試薬を知り、過度の実験をするこ
となく容易に認識することができるであろう。

発出試薬用に多数の物質を使用することができる。こ
の物質に求められるものの全ては、血小板が容易に目に
見える集塊にまで個々の粒子を一緒に結合できるように
血小板に比して高い軸比（長くて細い）および小さいサ
イズである。ケイソウ土は上記の特徴の全てを有してい
る。これはまた安価で容易に入手することができる。陰
性なものではなく陽性のものであるとき、このケイソウ
土はコラーゲンの特徴の幾つかを有するアミノ酸のポリ
マー（しばしばフミン酸と言われる有機分子）でしばし
ば被覆される。これはコラーゲンが、血小板を認識しそ
れを活性化する分子であるので重要である。残念なが
ら、カリフォルニア州ロンポク（Lompoc）付近の鉱山か
ら取り出された土のような天然のケイソウ土中のフミン
酸の自然の濃度は、正常の血小板の約３分の２のみを適
当に刺激するためには十分に高い。エピネフリン被膜は
この値を正常な血小板の99％を超える刺激速度にまで上
昇させる。

ナイロン繊維等のような物質を発出試薬用に使用する
ことができるが、これらの繊維は血小板作動強化セライ
ト^TM（ロンポク鉱山からのケイソウ土のためのジョーン
ズマンヴィル（Johns Manville）社の商品名）のように
有効であるように適当なアミン酸のポリマーおよび／ま
たは他の血小板作動物質で被覆する必要があったであろ
う。焼成した（鮮紅色にまで加熱した）セライト^TMは有
機成分に欠け、ナイロン繊維のように挙動する。

ケイソウ土の炭酸カルシウム含有量はロット毎に変化
するかもしれないが、これは問題にならない。ケイソウ
土の炭酸カルシウム含有量は、凝結防止した血液中に存
在する全てのクエン酸塩を逆転するために十分なものよ
りも多いカルシウムを希釈剤に添加することができるの
で限定的ではない。

本発明は好ましくは発出試薬、即ちケイソウ土を活性
化するためにある種の血小板作動薬を使用する。アラキ
ドン酸、リストセチンおよびADPドーパミン、ノルアド
レナリンのような他の血小板の作動薬を焼成した物質に
添加することができる。作動薬がないと、含まれる時間
が十分に未焼成血小板作動強化物質についての通常の範
囲外であっても、焼成物質は非常に少数の患者でのみ集
塊および粘着を起こすであろう。作動薬物質に実際に求
められるものの全ては、内生の（endogenous）作動薬
（トロンビン、コラーゲンおよびエピネフリン）に対す
る血小板感度の一般的な高度化である。エピネフリンは
この機能を生理学的に果たし、それでこれを本発明で使
用することが好ましい。露出されたコラーゲン繊維が、
体内の血小板活性化の開始をもたらす通常の刺激剤であ
るので、コラーゲン（フミン酸と類似の結合親和力を有
する）は単純に最も有用な作動薬である。

血小板を活性化し、凝集が起きたことを表示し、また
は両方の機能を果たすために発出試薬を使用することが
できる。これはまた、凝集が起きていることを容易に表
示するために十分に大きな集塊になる血小板凝集のため
のマトリックスを提供する。本発明の装置によって与え
られる揺動運動は、発出試薬粒子を懸濁液中に保持して
これを血小板に対して定常的にアクセスできるようにす
るために必要である。血小板は、これが発出試薬粒子に
付着し、そうして目に見える集塊に凝集する速度により
その活性を現す。これらの集塊は最終的に検体容器壁に
対して粘着性で付着性になる。容器の回転によって血小
板集塊は検体液から容器の上部の方に送り出され、そこ
で検体容器中の検体液のたまりの干渉影響無しにこれら
を検出することができる。

検体の調製は好ましくは、食塩水（典型的に450μ
Ｌ）中に懸濁させた凝結防止がされていない全血の少量
の試料（典型的に150μＬ）を検体容器内に入れ、これ
に少量の活性化発出試薬（たとえば、フミン酸またはエ
ピネフリンのような血小板作動薬として機能する有機物
質で被覆したケイソウ土）を、血液試料を再石灰化させ
るに十分なカルシウムイオンと一緒に添加することから
なる。これらの試薬は、血小板機能および血液凝固を同
時に決定する間安定であり再冷凍する必要がないことが
分かった。

血液をカルシウム富化食塩懸濁液に添加した時から血
小板集塊が検体液中で目に見えるようになる時までの時
間を「凝集時間」と言う。血液を食塩懸濁液に添加した
時から血小板集塊が検体容器の壁に粘着する時までの時
間を「粘着時間」と言う。これらの二つの時間は臨床的
に重要であり、両方の時間を測定することが本発明の目
的である。

後者の時間でこのような血液試料において生じる第三
の効果は、再石灰化した懸濁液中のフィブリノーゲンが
重合し、赤血球を捕捉し始めることである。これが起き
たとき、検体容器の内表面は薄い乳白光を出す層で被覆
されるようになり、これは凝集の開始と認めることがで
き、その十分後に大きな凝血が最終的に現れる。検体容
器に血液を添加してからフィブリン網が形成されるまで
の時間を「凝固時間」と言う。

包括的止血機構試験 心臓バイパスまたは肝臓移植のような多数の外科手術
処置において、患者の血小板機能状態および凝集状態を
知ることは重要である。このような知識で、医師は術後
出血の調節のために適当な血液成分を選択することがで
きる。現在、止血機構の検査には典型的に３種の試験を
行うことが必要で、典型的に30分間を要する。試験の最
小の数は、血小板計数、血小板機能評価、および自動化
部分トロンボプラスチン時間のような凝固の試験であ
る。

ケイソウ土を発出試薬として使用するとき、新鮮な全
血を乾燥ケイソウ土と混合し次いでこの混合物に希釈剤
を添加することによって、少量の赤血球消散が生じるこ
とが分かった。これはアデノシン二リン酸（ADP）、即
ち血小板凝集作動薬として機能する物質を放出するから
である。ADPはケイソウ土粒子上で加速された血小板凝
固を起こし、血小板集塊を典型的に50〜60秒間に検体容
器の壁に粘着させる。この時間枠内で検体容器の壁に付
着した血小板集塊の外観は、血小板数が適当であり、存
在する血小板が生理学的作動薬ADPに対して通常応答し
得ることの両方を示している。この混合物中に抗凝固薬
が存在しないので、若し凝結経路が正常であるならば凝
固が約100〜約130秒の間で起こるであろう。かくして、
全血150μＬのみを使用し３分よりも短くて、全止血機
構の包括的検査（血小板数、血小板機能および凝結）が
本発明により行われる。これは、これらの測定値を得る
ために多重の装置および大量の血液を必要とする先行技
術の30分間の時間を超えた顕著な改良である。

また、若し先ずケイソウ土に希釈剤を添加し、新鮮な
全血を湿潤ケイソウ土とのみ接触させるならば、ADPは
放出されず、循環から取り出した後10〜40分間血小板凝
集は血液中で抑制されるので、血小板は直ちに凝集また
は粘着しない。これらの状況下で、第XII因子活性化の
みが起こり、凝結カスケードを目立たせる。しかしなが
ら、若し血液を約10〜40分前に循環から取り出し、コラ
ーゲンまたは基底膜を特徴付けるような血小板臨界（ク
リチカル、critical）アミノ酸配列に発出試薬を存在さ
せるならば、得られる凝集はこのような作動薬に応答す
る血小板に反映する。他の選択、即ち新鮮な全血をそれ
を乾燥ケイソウ土と接触させる前に希釈することによ
り、直ぐ前に記載した二つの交替方法に比較して中間の
効果が得られる。しかしながら、先述したように、好ま
しい実施態様において、凝集と粘着は発出試薬中の血小
板作動薬によって促進される。

ケイソウ土物質はアドレナリン（エピネフリン）、ノ
ルアドレナリン、ドーパミンまたはその他のもののよう
なカテコールアミンで処理することによって活性化する
ことができる。好ましくは、本発明のカテコールアミン
は、エピネフリンが安価であり容易に入手可能であるの
で、エピネフリンである。少量のエピネフリン（アドレ
ナリン）および食塩水をケイソウ土に添加し、次いで凍
結乾燥する。エピネフリンの最終濃度は約0.5ミリモル
である。この乾燥試薬、即ち凍結乾燥したエピネフリン
富化ケイソウ土（LEEDE）は、室温でいつまでも安定で
ある。エピネフリンは、エピネフリン被覆ケイソウ土を
露出した後、血小板が均一に且つ貧欲に凝集するような
血小板刺激剤として作用する。LEEDEの露出の配列は止
血機構の異なった面の分析を許容する。LEEDEは地下堆
積物から入手され、たとえば、カリフォルニア州ロンポ
ク付近の堆積物から採掘することができる。

この凍結乾燥方法は血液およびケイソウ土を凍結乾燥
するのではなくて、エピネフリンおよびケイソウ土のみ
を凍結乾燥する。この目的は主として試薬の正確な量を
分散させる際に助けること（ミリグラム範囲で重量を繰
り返し測定するよりも体積を繰り返し測定することの方
が容易である）、および分散した試薬の貯蔵寿命を延ば
すことである。凍結乾燥工程の間に他のトランスフォー
メーションが起きるかも知れず起きないかも知れない。
しかしながら、混合物の活性は一般に混合物を再水和し
たとき保持される。凍結乾燥工程の間に幾らかの活性が
失われる場合には、凍結乾燥工程の前に添加されるエピ
ネフリンの量を増加することによってこれを容易に改善
することができる。

20分〜２時間前に取り出された血液に乾燥LEEDEを添
加するとき、凝結システムは強く活性化され、試料は約
120秒で凝固する。この試験は血液凝結のための全経路
の欠陥のための検査として、有用である。

（20分〜２時間前に取り出された）血液に添加する前
にLEEDEを食塩水に溶解するとき、凝結システム接触因
子複合体はより少なく活性化され、主な効果は血小板上
で見られる。この血小板は互いに、そしてケイソウ土粒
子に、そしてその後ガラス容器の壁に凝集する。それ
で、血液への溶解したLEEDEの添加により、血液が凝固
する前に血小板機能および数の両方のアッセイが可能に
なる。

若しLEEDEを食塩水に溶解し、次いで直ちに循環から
取り出したばかりの血液に添加すると、血小板が凝集す
る前の時間の長さは、循環内の本来の血小板を特徴付け
る抑制の状態の尺度である、と思われる。この抑制はプ
ロスタサイクリンおよび一酸化窒素および多分正常な脈
管内皮から放出されるその他の類似の生物学的エフェク
ター（effector）のような物質を循環するためである。
これらの物質は数分間の短い半減期を有しており、それ
で静脈穿刺後約20分で大部分消失した。上記のように循
環内の血小板の状態を決定する能力は医療診療で大きな
重要性のものである。たとえば、この試験は心筋梗塞に
なる冠状血栓症を形成する可能性を示すことができるで
あろう。この性質の試験は現在利用できない。

本発明の方法および装置についての生データ（ヘメッ
ク（HEMECH、以下同）検査）が得られた。ヘメック検査
についての正常な時間の範囲は、（１）エピネフリン凝
集時間:28.7〜43.1秒；（２）エピネフリン粘着時間:3
6.6〜54.5秒；エピネフリン凝固時間:142.6〜165.1秒で
ある。

一般の終点検出 凝集、粘着および凝固時間の検出は夫々の終点を検出
する種々の手段により可能である。本発明において多数
の異なった形式の終点検出器を使用することができる。
一つは直接目視観察である。第二は、光（可視光または
赤外）のスポットが、その回転軸に平行に透明検体容器
の内側に固定された受光素子列を正常に外すように向け
られるように配列されたフライングスポットスキャナー
（flying spot scanner、以下同）である。粘着血小板
集塊は、光が瞬時に受光素子上に当たり、トランジェン
ト信号を発生するように光スポットの屈折を起こす。凝
固物は透明な容器の内側表面上の薄い層中に分散される
ようになり、光をほぼ絶え間なく屈折させる。受光素子
は増大した比較的安定な照明として凝固物の存在を登録
する。検出器のこの形式の変形は、安定な照明を使用
し、検体容器の軸に沿って装着された受光素子の列を電
子的に走査する。

第三の終点検出器は、（たとえば、振動ミラーの手段
により）透明検体容器の内壁を容器の開口端の直ぐ外側
の位置から拭うようになっている（たとえば、小さい固
体レーザからの）光の細いビームからなっている。フラ
イングスポットスキャナーによるとき、ビームは容器壁
を通過し、外側に置かれた受光素子を外すように向けら
れている。血小板集塊が容器の壁に粘着するので、これ
は光ビームの一部が各集塊の通過に相当する時間変動量
で検出器に当たるように十分に光を屈折させる。凝固は
受光素子に当たる光の安定な増加をもたらす。

第四の装置は血小板凝集のみを検出する。これは光ビ
ームおよび血液自体の揺動表面から血小板集塊の存在を
区別する時間遅延弁別器回路を使用する。集塊が光学的
検出器を通過するとき、これは遅延時間よりも短い検出
結果を作り、揺動する容器内の検体液の滑らかな「スロ
ッシング」から区別可能である。この形式の検出器は、
凝集、粘着および凝固時間を示す全自動光学的分析装置
のために上記の第二または第三の形式の検出器と組み合
わせることができる。

凝集を検出するために本発明の装置で使用される原理
は、血小板機能の検出の他に実質的な長所を有してい
る。検体容器の回転および揺動運動のために、フィブリ
ン重合が始まる前に血小板集塊が検体容器壁の全内表面
に本質的に粘着する。有用な一致は、血小板もフィブリ
ン重合のための生理学的結晶核を形成することである。
かくして、最も早いフィブリンポリマーが形成したとき
（凝固の開始）、これは検体液のたまりに亘って回転す
る血小板集塊により捕捉され、希釈反応混合物をふるい
分ける。本質的に、検体液中の全ての重合したフィブリ
ンは捕捉され、検体容器の壁に「張り付け」られる。こ
の位置で、重合したフィブリンは検体容器壁を通過した
全ての光ビームを遮る赤血球を捕らえる。これは凝固が
起きたとき非常に大きい信号を発生させる。これと比較
して、普通に使用される他の光学的終点検出器は、フィ
ブリンが透明なかさばった反応混合物全体に重合するの
で不透明度の非常にささやかな変化を取り上げる。それ
で本発明は検体容器の壁上のフィブリンの機械的濃縮に
よりバックグラウンドノイズに比較して非常に大きい信
号の生物学的増幅を得、その場合フィブリンを光学的終
点検出器により容易に見ることができる。

例示態様 本発明を使用して適当に調製した検体の所望の終点を
検出する一つの手段は手動観察によるものである。図２
は、このような観察のための一つの構成の概略図を示
す。調光した（バッフルした、baffled、以下同）光源2
0を光が検体容器１の上から容器１のみを通過するよう
に置く。容器１の底を観察することを容易にするために
斜めにした鏡22を検体容器１の下に置く。好ましくは、
検体容器１を通過する光がまぶしくなく観察者の目の方
に鏡22によって反射されるように調光した光源20を置
く。検体容器１を下から見るとき、検体容器１の下面に
沿って集められた全ての粒子または容器１の内容物に於
ける全ての変化を見ることができる。このようにして凝
集、粘着および凝固時間を手動により計時することがで
きる。

一般に、所望の終点を自動的に検出することが好まし
い。しかしながら、このような検出は容器が揺動並びに
回転しているという事実により複雑になっている。さら
に、検体液は検体容器の長手に沿って後方および前方に
動くので、血小板集塊は容器に沿った何れの場所にも粘
着し得る。それで、血小板が容器の壁に粘着すると、検
出器は血小板がどこにあってもその存在を示さなくては
ならない。集塊が粘着する前は、集塊は容器の長手に沿
って液体中で移動する。容器に沿ったどこかに固定され
た検出器をまさにこの状態のために使用しながら、一層
包括的な検出システムが好ましい。

自動検出装置からの測定結果は、検体容器の光学的品
質の欠陥のためにおよび赤血球および発出試薬（たとえ
ば、ケイソウ土）が検体容器の内壁に粘着し得るので時
々不正確であることも分かった。人間の観察者はこのよ
うな間違いの源を容易に検出しそれを補償するけれど
も、同様に補償し得る自動検出システムを提供すること
は非常に困難である。それで、光ビームが検体容器の壁
を１回だけ通過し、それによりこのような問題を半減す
るように配置された光源および受光素子システムを使用
することが大半の例で好ましいことが分かった。若し高
い光学的品質を有する検体容器を使用し、および／また
は内壁に粘着する赤血球および発出試薬によりもたらさ
れるバックグラウンド信号「ノイズ」を満足できるレベ
ルにまで低下させることができるならば、この限定は軽
減または除去することができる。

検体液についての粘着時間および凝固時間を検出する
一つの自動検出装置を図3aおよび3bに示す。検出器要素
は、ほぼ検体容器１の長さおよび検体容器１の内径より
も実質的に小さい直径の、透明容器内に配置された一列
の受光素子（たとえば、フォトダイオードまたはフォト
トランジスター）30からなっている。それで受光素子列
30は検体容器１の中に容器１の軸に沿って挿入すること
ができ、そうして検体液２との接触を避けることができ
る。受光素子列30が検体容器１と共に後方におよび前方
に揺動するように、受光素子列30をローラおよび揺動機
構に取り付ける。受光素子列30上のリニアレンズまたは
光バッフル（light baffle）を、受光素子列30への光の
受容角度を約±10゜に制限するために好ましくは用い
る。光源31が検体容器１に隣接して設けられ、細い光線
が検体容器１を通過するが受光素子列30の開口の片側ま
でになるように調光される。この配置は検体容器１の長
さ全体を照明する。容器１が回転するとき血小板集塊が
周りを回転しそれで光線を横切るように血小板集塊が容
器１の壁に粘着した場合、この集塊は光を散乱し、そう
してその幾らかが受光素子列30の調光されていない開口
に入る。

容器の内部はそれが回転するとき常に検体液で被覆さ
れているので、内壁に被覆された検体液に対する血小板
集塊の信号対ノイズ比は所望するほど大きくはない。信
号対ノイズ比を改良するために、多数の放射状スリット
33を含む回転シャッター32を図３に示すように配置し
て、放射状スリット33が線光源を横切るようにする。こ
れは事実上、検体容器１を長手方向に速い速度で走査す
る光の「フライングスポット」に線光源を制限する。こ
の配置で、光のフライングスポットの幅に等しい容器１
の短い長さのみが、どの瞬間でも照明される。ハックグ
ラウンドノイズは比例歴的に減少する。光のスポットが
集塊を照明する時間の間血小板集塊により散乱された光
は影響を受けることなく、血小板集塊が検体容器１の壁
に粘着し始めたとき、バックグラウンドノイズに対する
振幅が十分に大きくて、確実な信号を与えるパルスの列
になる。

血小板集塊の存在を示す信号は今その反復速度が回転
シャッター32のスリット33の数およびその回転速度によ
って決定されるパルスの列からなっているので、フライ
ングスポットの反復速度を制御することができる。これ
は、信号対ノイズ比を共振回路またはランダムパルスと
反復パルス列との間を区別するその他の周波数選択手段
を使用することによって、さらに一層改良することがで
きることを意味している。

上記の配置で、凝固の開始は信号パターンに重要な変
化をもたらす。凝固が起きる前に、信号は、若しフォト
ダイオード検出器から来るものであればDCパルスである
一連のパルス列からなっている。即ち、これは基底線レ
ベルから正の方にまたは負の方に増加する。パルス列の
数は増加し、容器１に粘着した血小板集塊の数が増加し
たとき重なるかも知れないが、パルスの間では信号は基
本的に基底線レベルに戻る。それで検出は、パルス列を
直接、予め定めた閾値電圧によりオフセットされる差動
比較器に与えることによって行うことができる。パルス
がオフセット閾値よりも大きくなったとたんに、比較器
は出力パルスを出すであろう。比較器からの出力パルス
は、血液検体を容器内に入れたとき始動したタイマーを
停止するように設定されている。タイマーにより測定さ
れた時間間隔が粘着時間であり、血小板活性を示す。凝
固が起きたとき、フィブリン網が容器１の壁の上に出現
し、急速に容器の全長を覆う。これは走査する光のスポ
ットが容器１に沿ってどこに位置していても受光素子列
30内へ光を分散させる効果を有している。若しフォトダ
イオード列を受光素子列30として用いるならば、フォト
ダイオード列のDC出力電圧は基底線レベルに戻らない。
これは事実上、血小板集塊からのパルス列によりもたら
される効果とは特徴的に完全に異なるDCオフセット信号
を作る。前者は非常に短い期間のパルスでありそれでそ
の平均DCオフセットは非常に小さい。それで、粘着と凝
固との間を区別するために必要なものの全ては、フォト
ダイオード出力信号をDC緩衝増幅器に与え、次いで二つ
の異なった種類の信号を検出するためにこの増幅器の出
力を二つのチャンネルに分けることである。

これを完遂するための一つのこのような回路を図４に
示す。好ましい態様において、緩衝増幅器は演算増幅器
40である。演算増幅器40の出力は分けられる。一部分は
直接、電位差計42を介してその他方の入力にかけられる
オフセット閾値電圧を有する第一差動比較器41に進む。
電位差計42は適当な閾値を第一比較器41に設けることを
可能にする。出力信号の他の部分は単純低域フィルタ
（抵抗器44およびキャパシタ45）を経て第二差動比較器
43に進み、第一比較器41に到達する比較的高周波数のパ
ルスが第二比較器43には到達しないことを確実にする。
こうして第二比較器43は凝固の開始を示すフィブリン網
の形成により作られるDCオフセットに対してのみ感受性
である。第一比較器41および第二比較器43の出力はタイ
マー（図示せず）を停止するために使用され、それぞれ
検体についての粘着時間および凝固時間を与える。

図４に示す態様の代替物として、安定した線光源を用
いることができ、受光素子列を電子的に走査することが
でき、それによって上記のフライングスポット装置の効
果を真似ることができる。

検体容器１の内側に受光素子を有することに幾つかの
欠点が存在する。一つの欠点は、検体容器１を本発明の
装置内で端に載せ（end−load）なくてはならないこと
である。第二の欠点は、受光素子列30が容器１内の検体
液２に非常に近く近接しており、汚染されるようになる
かも知れないことである。それで受光素子を検体容器の
外側に配置することがより望ましい。

容器を開口端の方に下方に故意に傾けることによっ
て、粘着の開始を検体容器１の開口端付近で誘導させる
ことができることが実験的に見出された。容器１の縁の
湾曲の半径によって助けられ、かつ中に入っている液体
の強い表面張力は、こぼれ防止をする。検体容器１を開
口端の方に傾けたとき、実際に先ず開口端付近で粘着が
規則的に起きたことが観察された。この現象は、光源を
使用して検体容器の開口端を通して検体容器１の内側を
走査し、そうして光が検体容器１の一つの壁のみを通過
することを可能にする。受光素子を検体容器１の外側に
置いて、検体容器１を通過する光を検出する。こうし
て、検体容器１の欠陥および検体容器１の内壁へ粘着す
る赤血球および発出試薬の薄い層への分散光影響は、感
光システムへの最小の影響を有する。

図５はこの配置を実施する一つの装置を示す。強い平
行光源50（たとえば、小さい固体レーザ）を装着してこ
れを検体容器１と共に揺動させる。光源50は、その開口
端を通り検体容器の内表面を走査するための光ビームを
生じる振動ミラー51（たとえば、ミラー検流計）に対し
て向けられた小さい直径（たとえば、1mm）の光ビーム
を発光する。走査速度は限定されず、60Hzが十分に速い
ことが分かった。光ビームは検体容器１の水平中間平面
に向けられ、そうしてこれは検体液２を通過しない。所
望するとき、光ビームは検体容器１の一つの壁のみを通
過し、改良された信号対ノイズ比を与える。

受光素子または受光素子列52は検体容器１に隣接して
外側に設けられている。若し血小板集塊が検体容器１の
内表面にその開口端付近で粘着していないと、光ビーム
は受光素子52のそばを通り過ぎ、そうして受光素子52に
出力は発生しない。血小板集塊が内表面に粘着したと
き、光ビームは散乱され、幾らかが受光素子52に当た
る。この配置は低角分散に対する散乱量および捕集面積
が大きいので有効である。光ビームは非常に強く、それ
で出力が大きく、そうして装置が比較的非感受性であり
電気的干渉を外すことを確実にする。

この配置は欠点無しに前記の内部受光素子装置の利点
を有している。血小板集塊が光ビームにより走査された
とき血小板集塊により作られる短いパルス、および検体
液２が凝固し始めたとき検体容器１の内壁に降ろされた
フィブリン網により作られるDCオフセット信号のため
に、粘着時間と凝固時間との間の同じ識別を得ることが
できる。

図６は本発明の概念を含むが凝集時間終点を検出する
ためのさらに他の装置を示す。図６に示す装置におい
て、光源60からの平行光がスリット隔板61を通り検体容
器１の頂部を通って照るように作られている。光ビーム
は検体液２および検体容器１の下壁を通ってフォトダイ
オードのような受光素子62に下方に通過する。検体容器
１は回転および揺動の両方を行い、そうして検体液２は
波状運動で容器１内で前後に動いている。しかしなが
ら、赤血球および発出試薬粒子は非常に小さいので、血
小板集塊が形成されるまで、容器１内に目に見える粒子
は本質的に無い。血小板集塊が形成されると直ぐ、これ
らは発出試薬粒子に含まれ、色が黒ずんで見える明らか
に目に見える集塊を形成する。これらの集塊は検体液２
の中でなお移動可能であり、光ビームの前後に揺れる。
非常に複雑な信号が受光素子62から出てくる。受光素子
62信号の変動は多数の要因、即ち血小板／発出試薬粒子
集塊の存在、装置が揺動および回転するとき光路内の検
体液２の変化する深さ、検体容器１の欠陥、並びに検体
容器１の内壁の周りに運ばれる赤血球および発出試薬に
起因する光の幾らかの分散に起因する。

しかしながら、この複雑な信号の異なった部分の大部
分は、これが異なった周波数特性を有しているので分離
することができることが分かった。検体容器１の回転お
よび揺動に伴う影響から生じた信号は非常に低い周波数
を有している。検体容器１の内部にくっついた非常に小
さい粒子により生じた信号は高い周波数を有している。
血小板集塊により生じた信号は中間の周波数を有してい
る。若し高品質の検体容器を使用するならば、検体容器
の光学的欠陥は出力信号の中間の周波数への減少を生ず
る。それで、適当な信号処理をして、検体液２の凝集時
間を検出するためにこの方法を使用することができる。

適当な信号処理回路を図７に示す。受光素子はフォト
ダイオードセンサ70からなり、これは緩衝増幅器71に接
続されている。緩衝増幅器71の出力は二つのチャンネル
に分けられ、これは２個の時間遅延回路72、73または適
当な帯域フィルタに供給される。時間遅延回路の出力は
差動増幅器74の入力に供給され、これから最終信号が得
られる。若しフォトダイオードセンサ70からの変動する
信号の周期が十分に小さくて２個の時間遅延回路72、73
が実質的に等しい出力を出すと、差動増幅器74はその反
転および非反転入力で等しい信号を受け取るであろう。
差動増幅器74の同相分排除能力のために、出力で信号は
現れないであろう。しかしながら、若し血小板集塊の小
さいサイズおよび急速通過のためにフォトダイオードセ
ンサ70により突然信号スパイク（sudden signal spik
e）が発生し、一方の時間遅延回路72が他方の時間遅延
回路73よりも僅かに短い時間遅延を有するならば、第二
時間遅延回路73の出力で信号が現れるよりも前に第一時
間遅延回路72の出力で信号が現れるであろう。これは差
動増幅器74への入力の平衡を破り、出力に信号が出され
ることになる。これに続いて第二時間遅延回路73からの
信号が差動増幅器74の入力に到達したとき反対極性の出
力があり、そして第一時間遅延回路72からの信号は停止
するであろう。２個の時間遅延回路72、73間の30ミリ秒
の差が良好な集塊検出を与えることが分かった。74から
の信号の周波数および振幅は、血小板集塊の成長速度お
よびサイズの両方を表示する。

こうして、図６に示す検出装置を図３または図５に示
す装置と組み合わせると、検体液についての凝集時間、
粘着時間および凝固時間を検出する全自動装置になる。

実施例１ 種々の試験条件下で凝集、粘着および凝固時間を、正
常並びにある種の異常患者検体について測定した。得ら
れた典型的な値を表１に示す。この表に記載した値は通
常それぞれの実験室でおよびそれぞれ新しいロットの試
薬で再測定された。表１に示すように、値は、乾燥セラ
イト単独またはリストセチン、ADP、アラキドン酸およ
びコラーゲンと組み合わせた乾燥セライトを使用する試
薬試験により測定したとき種々の患者状態について与え
られる。

これらの試験の夫々は前記のようにして行った。要す
るに、血液をセライトと混合し、種々の粘着、凝集およ
び凝固工程が認められるまで揺動することおよび傾ける
ことが可能な装置に置く。追加の血小板作動薬の一種を
用いるとき、これを試験の開始時に乾燥セライト混合物
に添加する。典型的に、患者試料は、患者の状態を決定
するために与えられた試料を評価する際に全部で５個の
試験プロトコルを用いて試験した。

本発明をその特別の態様と結び付けて記載したけれど
も、当業者に自明である追加の態様、応用および修正
が、本発明の精神および範囲内に含まれる。たとえば、
本発明の装置は２個以上の検体容器を一時に回転および
揺動するために適合させることができる。発光ダイオー
ド、ハロゲン光源等々を含む異なった光源を使用するこ
とができる。使用する光は可視波長または非可視波長
（たとえば、赤外）であってよい。別の増幅および識別
回路を使用することができる。検体液が容器の壁の実質
的な部分を被覆する限り、検体容器に異なった運動を与
えることができる。それで、本発明は本明細書に記載し
例示した特別の態様に限定されるべきではなく、下記の
請求の範囲により限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コープマン ラルフ エー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サ ン バーナーディノ ピーオーボックス 6406 (56)参考文献 特開 昭60−30618（ＪＰ，Ａ) 特公 昭50−10925（ＪＰ，Ｂ１) 特表 平２−501115（ＪＰ，Ａ) 特表 昭58−501096（ＪＰ，Ａ) 米国特許5184188（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/52 G01N 33/58 - 33/98 G01N 1/36 G01N 21/27 G01N 21/47 G01N 21/82

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】透明容器内の全血液中に、（ａ）希釈剤
   と、（ｂ）血小板作動薬と、（ｃ）血小板に特異的に結
   合できる小さいサイズでかつ長軸比を有する分子からな
   る発出試薬（disclosure reagent）と、を有する混合物
   を添加する工程と、 前記全血液と前記混合物とを前記透明容器内で混合する
   工程と、 特定の光学的測定装置を用いて、前記全血液中に前記混
   合物を添加したときから血小板集塊が目視可能になると
   きまでの凝集時間を測定する工程と、 前記光学的測定装置を用いて、前記全血液中に前記混合
   物の添加したときから血小板集塊が前記透明容器の内壁
   に粘着するときまでの粘着時間を測定する工程と、 前記光学的測定装置を用いて、前記透明容器に前記全血
   液を添加したときから前記透明容器の内壁に前記全血液
   中の赤血球を捕捉し凝血が現れるまでの凝固時間を測定
   する工程と、 を有する光学的血液止血分析方法。
2. 【請求項２】希釈剤が食塩水である請求の範囲第１項記
   載の方法。
3. 【請求項３】血小板作動薬がカテコールアミンである請
   求の範囲第１項記載の方法。
4. 【請求項４】全血液は、凝固防止され、混合前に発出試
   薬が添加される請求の範囲第１項記載の方法。
5. 【請求項５】更に、可溶性カルシウム塩を含有する溶液
   を混合物に添加する工程を含む請求の範囲第１項記載の
   方法。
6. 【請求項６】前記希釈剤は、全血液を混合物に添加する
   前に、発出試薬に最初に混合されている請求の範囲第４
   項記載の方法。
7. 【請求項７】前記発出試薬は、ケイソウ土である請求の
   範囲第１項記載の方法。
8. 【請求項８】前記ケイソウ土は、フミン酸を含有する請
   求の範囲第７項記載の方法。
9. 【請求項９】前記カテコールアミンは、エピネフリン又
   はノルアドレナリンである請求の範囲第３項記載の方
   法。
10. 【請求項１０】前記全血液は、請求の範囲第８項記載の
    ケイソウ土が混合される請求の範囲第４項記載の方法。
11. 【請求項１１】前記血小板作動薬は、更にフミン酸から
    なる請求の範囲第３項記載の方法。
12. 【請求項１２】前記発出試薬は凍結乾燥される請求の範
    囲第１項記載の方法。