JP4677208B2

JP4677208B2 - 共焦点顕微鏡

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Inventors: 竜男中田
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Description

本発明は、試料に対して点光源からの光を２次元走査し、試料からの光を検出する共焦点顕微鏡に関するものである。

共焦点顕微鏡は、点光源からの光を対物レンズにより試料上に集光させ、その集光点をスキャナを用いて光学的に２次元走査し、試料からの光（特に蛍光）を対物レンズを通して光検出器で検出し、２次元の情報を得る。

ところで、このような共焦点顕微鏡では、蛍光色素や蛍光タンパクで標識された試料を、標識に対応した励起波長を用いて励起する。

このため、点光源として、レーザ光源を用いる場合、励起波長域毎にレーザ光源を用意する必要がある。そして、複数のレーザ光源からのレーザ光を走査光学系に導入し、それぞれ励起波長域毎にコリメートレンズを介して対物レンズにより試料上に集光させる。

この場合、各コリメートレンズにより試料上の焦点位置を調整する。また、走査光学系には、各コリメートレンズより出射したそれぞれの波長領域毎のレーザ光を対物レンズに導入するため、これらのレーザ光をダイクロイックミラーなどを用いて合成する光線方向変換エレメントなどが設けられている。
特開平１１−２３１２２２号公報特開平９−１２７４２４号公報

ところが、各波長領域毎にコリメートレンズを有する光学系が用いられると、仮に、これら光学系にばらつきがあると、これらのばらつきにより、試料上の焦点位置にＸＹ方向、さらにはＺ方向のズレが発生することがある。このため、これら試料上の焦点位置のズレを調整するのに精密な調整が必要となり、多大な手間と時間がかかる。また、レーザ光を合成するための光線方向変換エレメントを用いることは、価格的にも高価になるという問題がある。

特許文献１では、複数のレーザ光源からのレーザ光を混合して１本の光ファイバに入射し、光ファイバからの出射光をコリメートレンズを介して対物レンズにより試料上に集光させている。

この場合、光ファイバには、コアとグラッドとのわずかな屈折率差を利用して、コア中に光を閉じ込めて光伝搬させるシングルモードファイバが用いられている。ところが、このようなシングルモードファイバは、シングルモード伝搬させるためのカットオフ周波数があり、次式の制約を受ける。

Ｖ＝ｋｆ・ａ・ＮＡ
ここで、Ｖは、シングルモード伝搬させるための値であり、Ｖ＜2．405である必要がある。ｋｆは、ｋｆ＝２π／λで表わされ、ファイバに入れる波長λによって変わる。ａは、コアの半径を表している。さらに、ＮＡは、ファイバに取り込める開口数である。

このようにシングルモードファイバは、波長依存性があり、波長域に応じたファイバが必要となる。この傾向は、短波長域になればなるほど顕著で、波長依存性が大きくなるため、例えば、短波長域の４００ｎｍをシングル伝搬すると、長波長域の波長は、５５０ｎｍ程度しか使用できない。

このことは、一般に、共焦点顕微鏡では、励起光用光源として、ＵＶレーザを始め、ＶＩＯＬＥＴレーザ、可視域レーザ、近赤外波長以上のレーザなど幅広い波長域のレーザ光が用いられるが、このような場合、特許文献１に開示された考えのものでも、適用する波長域の広さによっては、ファイバが複数本必要になってしまい、上述したと同様な問題点を依然生じる。

一方、特許文献２には、シングルモードファイバを利用して、異なる発光色のＬＥＤの光を光伝搬する方法が開示されている。

しかし、このような方法に用いられるファイバについても、上述したシングルモード伝搬の式に当てはめると、コア径が数μｍになる。このため、このように非常に小さなコア径のファイバに光源からの光を導入しようとすると、カップリング効率が悪くなり、必要とするシングルモードの光を得るのが困難になる。ちなみに、一般に利用されるレーザ光のBeam Diameterは、０．５〜２程度、Beam Divergenceは、０．２〜２程度である。

この問題を解決するためには、レーザ光の発光点をファイバのコア径のとほぼ同程度にする必要があるが、このことは、光学的に困難になるという問題を生じる。また、ファイバのコア径を大きくすることも考えられるが、これでは、共焦点顕微鏡で必要なシングルモード動作が困難になってしまう。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、広波長帯域の光伝搬を可能としたファイバを用いることで、波長帯域毎の光学系およびそれぞれの光学調整を不要にできる共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の局面に係る共焦点顕微鏡は、波長の異なる光を発生する少なくとも２つの光源を有する光源ユニットと、前記光源ユニットからの光を試料上に集光させる対物レンズと、前記光源ユニットからの光を前記試料上で２次元走査する光走査手段と、前記光源ユニットと前記光走査手段との間に配置され、前記光源ユニットから導入される光を前記走査手段側に伝搬する一つのフォトニック結晶ファイバと、前記フォトニック結晶ファイバから出射した光をコリメートして前記光走査手段へ導くコリメート手段と、前記光走査手段による２次元走査により前記試料上から発生する蛍光を共焦点観察する蛍光観察手段と、前記光源ユニットからの光を用いてＤＩＣ観察を行うＤＩＣ観察手段とを具備し、前記光源ユニットにより発生する光は、波長４０５ｎｍ付近の光と波長６３５ｎｍ付近の光を含み、かつ偏光特性を有する光であり、前記フォトニック結晶ファイバは、コアの周囲に設けられるクラッドに配置された複数のエアーホールを有するとともに、このエアーホールの配置が鉛直方向と水平方向で異なることにより偏波特性を維持した光伝播を可能にしたことを特徴とする。

本発明の実施の形態によれば、広波長帯域の光伝搬を可能としたファイバを用いることで、波長帯域毎の光学系およびそれぞれの光学調整を不要にできる共焦点顕微鏡を提供できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る共焦点顕微鏡共焦点顕微鏡の概略構成を示す図である。図１に示す共焦点顕微鏡は、顕微鏡ユニットＭ、走査ユニットＳＵ、光源ユニットとしてのレーザユニットＬにより構成されている。

レーザユニットＬは、近赤外波長以上のレーザ１ａ、可視域レーザ１ｂ、ＶＩＯＬＥＴレーザ１ｃ、及びＵＶレーザ１ｄなどを備えている。

近赤外波長以上のレーザ１ａからのレーザ光の光路上には、反射ミラー２が配置されている。また、可視域レーザ１ｂからのレーザ光の光路上には、反射ミラー２で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー３が配置されている。ダイクロイックミラー３は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、反射ミラー２で反射されるレーザ光を透過し、可視域レーザ１ｂからのレーザ光を反射する。

ＶＩＯＬＥＴレーザ１ｃからのレーザ光の光路上には、ダイクロイックミラー３で合成された光との交点上にダイクロイックミラー４が配置されている。ダイクロイックミラー４は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、ダイクロイックミラー３で合成されたレーザ光を透過し、ＶＩＯＬＥＴレーザ１ｃからのレーザ光を反射する。

ＵＶレーザ１ｄからのレーザ光の光路上には、ダイクロイックミラー４で合成された光との交点上にダイクロイックミラー５が配置されている。ダイクロイックミラー５は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、ダイクロイックミラー４で合成されたレーザ光を反射し、ＵＶレーザ１ｄからのレーザ光を透過し、同一光軸上のマルチ波長のレーザ光を出射する。

レーザユニットＬのダイクロイックミラー５からのマルチ波長のレーザ光の出射光路には、カップリングレンズ６を介してフォトニック結晶ファイバ（以下、「ＰＣＦ」と略称する。）７の入射端が配置されている。

カップリングレンズ６は、ダイクロイックミラー５から出射されたレーザ光をＰＣＦ７の入射端へ集光する。ＰＣＦ７は、多数のエアーホールを規則正しく配列した構造のクラッドを持つ。ＰＣＦ７の詳細は、後述する。また、ＰＣＦ７は、マルチ波長のシングルモード光を出力する。

ＰＣＦ７の出射端には、コリメートレンズ８が配置されている。コリメートレンズ８は、マルチ波長のシングルモード光を平行光束に変換する。

コリメートレンズ８からの平行光束は、走査ユニットＳＵに導かれる。

走査ユニットＳＵには、コリメートレンズ８からの平行光束の光路上に波長分割素子９が配置されている。波長分割素子９は、平行光束の光のうち、後述する試料２１を励起するために必要な励起波長を透過し、試料２１で励起されて蛍光を発した蛍光波長を反射する特性を有している。

波長分割素子９を透過したレーザ光（励起波長光）の光路には、ガルバノミラーユニット１０が配置されている。ガルバノミラーユニット１０は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のガルバノミラー１０ａ、１０ｂを有する。これらのガルバノミラー１０ａ、１０ｂによりレーザ光（励起波長光）が２次元方向に偏向される。

波長分割素子９の試料２１からの蛍光の反射光路には、共焦点観察手段を構成するコンフォーカルレンズ１１、共焦点ピンホール１２、ダイクロイックミラー１３および光電変換素子１４，１５が配置されている。光電変換素子１４，１５には、例えばフォトマルチプライアが用いられる。

走査ユニットＳＵには、リレーレンズ１６を介して顕微鏡ユニットＭが接続されている。

顕微鏡ユニットＭでは、ガルバノミラーユニット１０により偏向されたレーザ光（励起波長光）の光路に、ミラー１７が配置されている。ミラー１７の反射光路には、結像レンズ１８および対物レンズ１９が配置されている。

この場合において、リレーレンズ１６を介してミラー１７で反射し、さらに結像レンズ１８を通ったレーザ光（励起波長光）は、対物レンズ１９を透過して、ステージ２０に載置された試料２１に照射される。このとき、結像レンズ１８により対物レンズ１９を透過する光は、先のコリメートレンズ８の光束径で試料２１上に集光され、ガルバノミラー１０ａ、１０ｂの動きにより試料２１上の所定の範囲で走査される。

なお、試料２１上に集光されるレーザ光（励起波長光）は、用途に応じて、静止させてスポット的に照射させてもよいし、走査ユニットＳＵを瞬間的にスキップ作動させて複数の任意の位置にスポット的に照射させるようにしてもよい。

試料２１は、レーザ光（励起波長光）により、蛍光指示薬が励起され蛍光を発する。この蛍光は、先の光路とは逆方向に、対物レンズ１９から結像レンズ１８、ミラー１７、リレーレンズ１６、ガルバノミラー１０ａ、１０ｂを通って波長分割素子９に達し、波長分割素子９で反射してコンフォーカルレンズ１１で集光される。そして、この集光位置にあるピンホール１２で焦点面だけの蛍光が選択され、ダイクロイックミラー１３で蛍光波長を分割した光が光電変換素子１４，１５により受光され画像化される。

なお、近赤外波長以上のレーザ１ａとして、ＩＲパルスレーザを用いることができる。このようなＩＲパルスレーザを用いると、２光子吸収により蛍光画像を取得することができる。このときの２光子吸収現象は、結像位置でのみ発生するので、ピンホール１２は、理論的には不要にできる。

次に、ＰＣＦ（フォトニック結晶ファイバ）７について説明する。

図２は、ＰＣＦ７の断面図を示す図である。例えばＧｅからなるコア７ａの周囲にＳｉからなるクラッド７ｂが設けられている。また、コア７ａ周囲のクラッド７ｂには、多数のエアーホール７ｃが規則正しく配列されている。この場合、ＰＣＦ７は、コア７ａとクラッド７ｂともに同じ材質（例えばシリカ）で形成されたものでもよい。

ＰＣＦ７は、クラッド７ｂのエアーホール７ｃの配列、エアーホール７ｃの数、クラッド７ｂの面積全体の中でエアーホール７ｃが占める割合、コア７ａの径およびコア７ａの材質などにより特性が決定される。

また、ＰＣＦ７は、
格子間隔Λ：エアーホール７ｃの中心間隔、
エアーホール径ｄ：クラッド７ｂのエアーホール径、
コア径２ａ：中心欠陥の高屈折率部の最小径で第一層エアーホールと外接する円の径、
比エアーホール径ｄ／Λ：ｄとΛの比（この値は、クラヅドの実効的な屈折率と関係することから、構造の規格化パラメータとしてしばしば使われる）、
空隙率（AIR FILLING FRACTION）Ｆ：高屈折率触媒に対するエアーの割合、
規格化周波数Λ／λ：波長に対するエアーホール中心間隔の相対的な大きさ（導波特性の記述にはΛそのものより規格化周波数を用いる。）
とすると、これらの関係式は、

で表わされる。

ここでの屈折率導波型ＰＣＦは、導波原理が全反射である点は、通常のファイバと同じである。両者の特性の違いは、ＰＣＦ７では、クラッド７ｂの実効屈折率が光の波長により大きく変化する点である。クラッド７ｂの実効屈折率は、エアーホール７ｃの径やピッチと波長との大小関係により変化する。これによって、波長が短くてもシングルモード動作することや、コア７ａの面積をどんなに大きくてもシングルモード動作するという特性が生まれる(果てしないシングルモードＥＳＭ：ENDLESSLY-SINGLEMODE)。

もう1つの違いは、コア７ａとの屈折率差を通常の光ファイバよりもはるかに大きくできるという点である。クラッド７ｂの実効屈折率は、エアーホール７ｃの直径やピッチによって制御でき、エアーホール７ｃを大きくすることで空気の影響を高めれば実効屈折率は大きく下がる。すなわち、従来の光ファイバに比べて、屈折率差の変化の自由度が大変大きい。

コア７ａとクラッド７ｂの屈折率差は、光の導波構造（光の封じ込め構造）に関係し、光の導波構造は、光ファイバの導波路分散と相関を持つ。このことから、ＰＣＦ７では、導波路分散を広い範囲に亘って変えることが可能である。したがって、この導波路分散と材料分散（ファイバの素材自身が持つ分散）を組み合わせることによって、例えば、短波長でゼロ分散を持つ光ファイバや広い波長帯域に亘って分散がフラットな光ファイバを実現できる。

さらに、クラッド７ｂのエアーホール径をＸＹ方向で異ならせる構造異方性を持たせたり、コア径を非円とすることなどで大きな偏波保持性が生まれ、偏波保持ファイバを実現することもできる。

通常の光ファイバの導波モードの数は、次式のＶ値で与えら、Ｖ値が２．４以下の場合にシングルモード動作する。

通常のシングルモードファイバでは、ｎ_ｃ０とｎ_ｃ１が材料分散により波長とともに同等に変化する。そのため（３）式の√の中の値は、ほとんど波長に対して一定となる。その結果、Ｖ値は波長λに反比例して変化することになり、波長が短くなるとシングルモード条件であるＶ＜２．４が成り立たなくなる。

一方、ＰＣＦ７は、この式が次式で表される。

Λ：格子間隔、√ｎ_０：シリカの屈折率、ｎ_ｅｆｆ：クラッドの実効屈折率
この（４）式では、√の中のｎ_ｅｆｆの値が波長依存性があるためにＶｅｆｆ値は、通常の光ファイバと異なった波長依存性を示す。これは、波長が短くなるとコアとクラッドの実効屈折率の差が小さくなり、（４）式中のλと√の値が共に小さくなり、それぞれ相殺し合う。つまり、通常の光ファイバのようにλに反比例するのでなく、波長による変化が小さくなり、波長が短くなるにしたがい変化が鈍くなり、一定の値(最大値)に近づく。比エアーホール径ｄ／Λ：ｄとΛの比が小さい場合、Ｖｅｆｆ値の最大値は、より小さな値に収束する。Ｖｅｆｆ値はＰＣＦの場合、４．１以下でシングルモード動作することが示されており、この条件を満たすｄ／Λ値は、約０．４以下になる。

また、ＮＡは、次式で与えられる。

通常の光ファイバでは、コアとクラッドの屈折率差△ｎは、波長によりほとんど変化しないため、ＮＡも波長による変化はほとんどない。これに対し、ＰＣＦ７では、ｎ_ｅｆｆが短波長になるほど、ｎ_ｃ０に近づくため、顕著な波長依存性を示し、短波長になるほどＮＡは小さくなる。

よって、通常の光ファイバでは、短波長でシングルモードにするには、コア径を小さくする必要があるが、ＰＣＦ７では、短波長でシングルモードにするのに、コア径を小さくしなくても可能である。また、通常の光ファイバでは、ＮＡは、波長による変化がないままであるが、ＰＣＦ７では、（５）式から明らかなように、短波長になるほどＮＡを小さくすることが可能である。

このようなＰＣＦ７を用いることにより、共焦点顕微鏡として、例えば、４０５ｎｍ近辺のＶＩＯＬＥＴレーザ１ｃと４４０〜６３５ｎｍまでの可視域レーザを同時に使用することがあっても、１本のＰＣＦ７のみで走査ユニットＳＵ側に光伝搬することができる。勿論、３５０ｎｍ程度の紫外域から１２００ｎｍの近赤外波長以上であっても、１本のＰＣＦ７のみで対応することが可能である。

従って、このようにすれば、レーザユニットＬと走査ユニットＳＵとの間を接続するファイバとしてＰＣＦ７を用いることで、近赤外波長域からＵＶ波長域までの広い波長域の光を１本のＰＣＦ７のみで走査ユニットＳＵ側に光伝搬することができる。つまり、従来では、波長域が広がると、所定の波長域毎にファイバを分けて、走査ユニットに光伝搬させる必要があったが、これを最小１本のＰＣＦ７のみで光伝搬することができる。

このことは、レーザユニットＬを各波長域毎に、それぞれ用意する必要がなく、１つに纏めることができるので、レーザ光をコントロールするための制御系も構成が簡単になるばかりか、配線数を減らすことも可能であり、価格的に安価にできるとともに、配線数を減らせることで、信頼性の向上も図れる。

また、１本のＰＣＦ７で走査ユニットＳＵ側に光伝搬できることで、走査ユニットに光を導入した後も、所定の波長域毎にコリメートレンズなどの光学系を用意する必要がなくなり、波長域毎の光軸調整を必要としない。従来、各波長域毎の光学系の光軸調整は、物理的に行われるため、熱膨張などによって、光軸ずれ発生し易かったが、１本のＰＣＦ７のみで同軸上に光を導入し、光軸調整を省略できるので、光軸のずれがなくなり、光軸ずれによる試料上の走査位置が変わることがないため、取得される画像の信頼性が高い。

さらに、顕微鏡を納入後、新たに他の波長領域のレーザを追加した場合も、レーザユニットＬで光学調整をすればよく、ＰＣＦ７については、そのまま対応できるので、ユーザ先でのセットアップも容易である。また、ファイバが何らかの影響で壊れた場合も、従来であれば、ファイバのカップリング調整と走査ユニットに導入するための光学調整の他に、さらに走査ユニット内での光学調整も必要であるが、ＰＣＦ７であれば、交換の後、ＰＣＦ７のカップリング調整と走査ユニットに導入するための光学調整だけで済むためメンテナンス性が高い。

さらにまた、従来では、走査ユニット内で各波長領域毎のコリメートレンズより出射したレーザ光を対物レンズに導入するため、これらのレーザ光をダイクロイックミラーなどを用いた光線方向変換エレメントで合成するようにしていたが、これら光線方向変換エレメントを必要としないので、走査ユニットをコンパクトにすることができるとともに、光線方向変換エレメントでの光の損失も防止でき、効率のよい光伝搬を行なうことができる。

図３は、ＰＣＦ７の端面処理について説明する図である。図３において、ＰＣＦ７は、Ｇｅからなるコア７ａの周囲に、シリカからなるクラッド７ｂが設けられ、さらに、コア７ａ周囲のクラッド７ｂに、多数のエアーホール７ｃが配置されている。この場合において、カップリングレンズ６やコリメートレンズ８との光学的な接続をするために、ＰＣＦ７の両端にコネクタ（図示しない）が取り付けられる。コネクタを取り付ける際に、ＰＣＦ７の両端を研磨する必要がある。しかし、ＰＣＦ７は屈折率差を持たせるために微小な穴（エアーホール７ｃ）が開いており、端面処理のためクラッド７ｂ端面を研磨すると、エアーホール７ｃが埋まってしまい本来の性能を出せなくなってしまう。そこで、予めクラッド７ｂ端面において、１０〜５００μｍ程度の範囲だけエアーホール７ｃ部分を無くし、この部分で端面研磨できるようにする。この場合、カップリングレンズ６を介して入射されるレーザ光は、コア７ａ上の、該コア７ａ先端からエアーホール７ｃ先端までの間のエアーホール７ｃが存在しない部分で焦点を結ばせるようにすればよいが、望ましくは、コア７ａ上のエアーホール７ｃ先端に相当する位置がよい。

第１の実施の形態では、レーザユニットＬとして、近赤外波長以上のレーザ１ａ、可視域レーザ１ｂ、ＶＩＯＬＥＴレーザ１ｃ、ＵＶレーザ１ｄなどが設けられる例を述べたが、レーザが２個以上存在すれば、上述したと同様な効果を得られる。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

図４は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図であり、図１と同一部分には、同符号を付している。

図４において、共焦点顕微鏡は、顕微鏡ユニットＭ、走査ユニットＳＵの他、光源ユニットとしてＬＥＤ光源ユニットＬＥを備えている。

ＬＥＤ光源ユニットＬＥには、発光ダイオードとして、それぞれ発光色の異なる青色のＬＥＤ３１ａ、緑色のＬＥＤ３１ｂ、赤色のＬＥＤ３１ｃが設けられている。

ＬＥＤ３１ａ、３１ｂ、３１ｃから発せられる光は、図示しない合成手段で合成され、マルチ波長の光として、カップリングレンズ６を介してＰＣＦ７の入射端へ集光する。ＰＣＦ７は、マルチ波長のシングルモード光の光を出力する。

以下、第１の実施の形態で述べたと同様で、コリメートレンズ８で平行光束になって、波長分割素子９で、平行光束の光の内、試料２１を励起するために必要な励起波長が透過する。

波長分割素子９で励起波長光となった光は、ガルバノミラーユニット１０で、試料２１面上のＸＹ方向に偏向され、リレーレンズ１６を透過してミラー１７に入射する。ミラー１７で反射した光は、結像レンズ１８より対物レンズ１９を透過して試料２１上に集光され、ガルバノミラー１０ａ、１０ｂの動きにより試料２１上の所定の範囲で走査される。

第１の実施の形態と同様に、試料２１上に集光されるレーザ光（励起波長光）は、用途に応じて、静止させてスポット的に照射させてもよいし、走査ユニットＳＵを瞬間的にスキップ作動させて複数の任意の位置にスポット的に照射させるようにしてもよい。

試料２１上に照射されるレーザ光（励起波長光）により、蛍光指示薬が励起されると、蛍光が発する。この蛍光は、先の光路とは逆方向に、対物レンズ１９から結像レンズ１８、ミラー１７、リレーレンズ１６、ガルバノミラー１０ａ、１０ｂを通って波長分割素子９で反射してコンフォーカルレンズ１１で集光される。そして、この集光位置にあるピンホール１２で焦点面だけの蛍光が選択され、ダイクロイックミラー１３で蛍光波長を分割した光が光電変換素子１４，１５により受光され画像化される。

このようにすれば、光源ユニットとして、発光色の異なるＬＥＤ３１ａ、３１ｂ、３１ｃを有するＬＥＤ光源ユニットＬＥを用い、走査ユニットＳＵとの間をＰＣＦ７で接続するようにしたので、レーザを使わないポイントスキャン方式の走査型共焦点顕微鏡を実現できる。

ＬＥＤ光源ユニットＬＥからのＬＥＤ光をＰＣＦ７に導入するが、ＰＣＦ７は、従来のシングルモードファイバに比べてコア径を大きくすることが可能（例えば数十μｍ程度）なので、カップリング効率をよくすることができ、共焦点顕微鏡で必要なシングルモードの光を確実に得ることができる。

ＬＥＤ光源ユニットＬＥのＬＥＤ３１ａ、３１ｂ、３１ｃを光源として使用して共焦点顕微鏡を構成できるので、価格的にも安価にできる。また、ＬＥＤ３１ａ、３１ｂ、３１ｃは、レーザに比べて消費電力が小さく、省エネルギー化が可能である。さらに、ＬＥＤ３１ａ、３１ｂ、３１ｃは、非常に小さいため、コンパクトな光源を実現できる。このため、図４では、ＬＥＤ光源ユニットＬＥは、走査ユニットＳＵと分けて構成されていたが、走査ユニットＳＵ内に組み込むことも可能になり、一体化によるさらなるコンパクト化が実現できる。

ＬＥＤ光源ユニットＬＥのＬＥＤ３１ａ、３１ｂ、３１ｃは、電圧のオンオフのみで点灯、消灯が可能であり、また、輝度を変化させるために、電流を可変したり、パルス状にＯＮ／ＯＦＦすることなどの変調により、輝度を変えることも可能で、これによって調光も簡単にできる。このことは、従来においては、調光制御するために特別の機構が必要であったが、電気制御回路だけで実現できるので、コンパクトになるとともに、安価にできる。

ＬＥＤ３１ａ、３１ｂ、３１ｃは、レーザに比べて、寿命が長く、システムの維持コストが安いという効果もある。

ＬＥＤは、レーザに比べて、いろいろな波長のものも実用化されており、試料２１の励起波長に対して、波長選択自由度が高いというメリットもある。

ＬＥＤは、レーザと比べると波長幅が広い。よって、ＢＡフィルタやＡＯＴＦなどの波長選択素子と組み合わせて、必要な波長幅に変換して使用することで、波長の選択性を向上させることができる。

一方、図４では、ＬＥＤ光源ユニットＬＥには、ＬＥＤ３１ａ、３１ｂ、３１ｃのみを設けたが、レーザ光源を組み合わせることで、強い光が必要な場合は、レーザを利用し、弱い光でも構わない場合は、ＬＥＤを利用するという利便性の向上も可能である。

（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。

従来のファイバを用いる場合は、カップリングレンズおよびコリメートレンズの波長補正を行わない。これは、これまでのファイバでは、ＮＡが波長依存性をほとんど持たないからである。

しかし、第１の実施の形態に用いられるＰＣＦ７は、ＮＡが波長依存性を持っている。このためカップリングレンズ６とコリメートレンズ８は、波長依存性を考慮した設計が必要である。つまり、これらカップリングレンズ６とコリメートレンズ８は、ＰＣＦ７のコア７ａに対してカップリング作用又はコリメート作用が波長依存しないものにする必要がある。このため、短波長域についてＮＡが小さく、長波長域についてはＮＡが大きくなるように特性を補正するレンズ構成とする必要がある。ちなみに、コリメートレンズ８は、図５に示すように、ＰＣＦ７のＮＡがほぼ一定の場合、異なる波長λ１、λ２、λ３によって光の広がりが異なる。ここでの波長は、λ１＜λ２＜λ３である。

そこで、第３の実施の形態では、カップリングレンズ６およびコリメートレンズ８として、波長によってＮＡが変化するようなレンズ（例えば、所定量の色収差を持たせたレンズ）を用いる。このようにすれば、カップリングレンズ６によるカップリング効率とコリメートレンズ８によるコリメート光の平行度を最適化することが可能になる。つまり、カップリングレンズ６については、カップリング効率を改善できるので、ＰＣＦ７へ入射する光の損失を少なくすることが可能となり、光の強度が強い光源を使う必要がなく省エネルギー化が図ることができる。また、コリメートレンズについても、光の平行度を保ったまま、光束径をほぼ一定にすることができるので、対物レンズ１９に入射する光の損失を最小限にして試料２１に導くことができ、励起効率を良くすることが可能である。

（第３の実施の形態の変形例）
また、対物レンズ１９で形成されるビームスポット径は、光の波長λと開口数ＮＡに依存する。波長λが短いほど、ビームスポット径は小さくなる。そこで、光の波長λによるスポット径の変動を開口数ＮＡ（すなわち、対物レンズへの入射ビーム径）の調節によって相殺するように、ＰＣＦ７以降のコリメートレンズ８を含む光学系の波長特性を光学的にコンペンセート（補償）する。これによって、対物レンズ１９からの光のスポット径は、波長λに関わらず等しく揃えることができる。従って、分解能に対する波長の影響をなくすことができる。

（第４の実施の形態）
次に、本発明の第４の実施の形態を説明する。

ところで、ＰＣＦ７は、規則正しいエアーホールが開いているが、これでは、共焦点顕微鏡で必要とする偏波特性を持たせた光伝播が得られないことがある。

そこで、第４の実施の形態のＰＣＦ７には、図６（ａ）及び図６（ｂ）に示すようにコア７ａ周囲のクラッド７ｂに形成されるエアーホール７ｃの配置を鉛直Ｖ方向と水平Ｈ方向で異ならしたものが用いられる。

このようなＰＣＦ７によれば、偏波特性を持った波長の光を、偏波特性を維持したままシングルモード伝播することが可能となる。

なお、エアーホール７ｃの鉛直Ｖ方向と水平Ｈ方向の配置は、例えば、図７（ａ）に示すように六角形状、図７（ｂ）に示す長方形状、図７（ｃ）に示す楕円状など各種のものが考えられる。

従って、このようにすれば、ＰＣＦ７により偏波特性を維持した波長の光伝播が可能になるので、共焦点顕微鏡では、ＤＩＣ観察が、簡単に可能である。仮に、ＰＣＦ７で偏波特性を維持できなければ、別途波長板などが必要となるが、ＰＣＦ７で偏波特性を維持した光伝播を可能とすることで、波長板が不要になる。このことは、波長板での光の損失を無くすことができるので、さらに明るく効率の良いシステムの構築が可能である。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

なお、以上述べた実施の形態には、以下の発明も含まれる。

（１）前記フォトニック結晶ファイバは、入射端側にカップリングレンズ、出射端側にコリメートレンズがそれぞれ配置されること。

（２）前記フォトニック結晶ファイバは、少なくとも２つの光源に対して１本設けられること。

本発明の実施の形態によれば、例えば、近赤外波長域からＵＶ波長域までの広い波長域の光を１本のＰＣＦのみで光走査手段側にシングルモードで光伝搬することができるので、光走査手段側に光を導入した後も、波長域毎に光学系を用意する必要がなくなり、波長域毎の光軸調整を必要としない。これにより、光軸のずれがなくなり、光軸ずれによる試料上の走査位置が変わることがない。さらに、顕微鏡を納入後、新たに他の波長領域のレーザを追加した場合も、光源ユニットで光学調整をすればよく、ＰＣＦについては、ＰＣＦ自身の交換や増設を必要とせずに、そのまま対応できるので、ユーザ先でのセットアップも容易である。なお、上記の実施の形態では、ＰＣＦで近赤外波長域からＵＶ波長域までの波長域の光を光走査手段側にシングルモードで光伝搬する例を説明したが、赤外波長域からＵＶ波長域までの波長域の光を光伝搬しても良い。

また、本発明の実施の形態によれば、コア径を太くした（例えば数十μｍ程度）ＰＣＦを用いることで発光ダイオードのように比較的大きな点光源を使用できる。また、光源ユニットとして、発光色の異なる発光ダイオードを用いることで、ポイントスキャン方式の共焦点顕微鏡を実現できる。

さらに、本発明の実施の形態によれば、対物レンズからの光のスポット径を揃えることができ、波長分解能の影響をなくすことができる。

さらに、本発明の実施の形態によれば、ＰＣＦにより偏波特性を維持した波長の光伝播が可能になる。

本発明の第１の実施の形態に係る共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。第１の実施の形態で使用されるＰＣＦの概略構成を示す図。第１の実施の形態で使用されるＰＣＦの端面処理を説明するための図。本発明の第２の実施の形態に係る共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。本発明の第３の実施の形態に用いられるコリメートレンズの特性を説明するための図。本発明の第４の実施の形態に用いられるＰＣＦの概略構成を示す図。第４の実施の形態の変形例の概略構成を示す図。

符号の説明

Ｍ…顕微鏡ユニット
ＳＵ…走査ユニット
Ｌ…レーザユニット
１ａ…近赤外波長以上のレーザ、１ｂ…可視域レーザ、１ｃ…ＶＩＯＬＥＴレーザ、１ｄ…ＵＶレーザ
２…反射ミラー、３、４、５…ダイクロイックミラー
６…カップリングレンズ、７…ＰＣＦ
７ａ…コア、７ｂ…クラッド、７ｃ…エアーホール
８…コリメートレンズ、９…波長分割素子
１０…ガルバノミラーユニット、１０ａ．１０ｂ…ガルバノミラー
１１…コンフォーカルレンズ、１２…共焦点ピンホール
１３…ダイクロイックミラー、１４．１５…光電変換素子
１６…リレーレンズ、１７…ミラー、１８…結像レンズ
１９…対物レンズ、２０…ステージ、２１…試料
３１ａ．３１ｂ、３１ｄ…ＬＥＤ

Claims

波長の異なる光を発生する少なくとも２つの光源を有する光源ユニットと、
前記光源ユニットからの光を試料上に集光させる対物レンズと、
前記光源ユニットからの光を前記試料上で２次元走査する光走査手段と、
前記光源ユニットと前記光走査手段との間に配置され、前記光源ユニットから導入される光を前記走査手段側に伝搬する一つのフォトニック結晶ファイバと、
前記フォトニック結晶ファイバから出射した光をコリメートして前記光走査手段へ導くコリメート手段と、
前記光走査手段による２次元走査により前記試料上から発生する蛍光を共焦点観察する蛍光観察手段と、
前記光源ユニットからの光を用いてＤＩＣ観察を行うＤＩＣ観察手段とを具備し、
前記光源ユニットにより発生する光は、波長４０５ｎｍ付近の光と波長６３５ｎｍ付近の光を含み、かつ偏光特性を有する光であり、
前記フォトニック結晶ファイバは、コアの周囲に設けられるクラッドに配置された複数のエアーホールを有するとともに、このエアーホールの配置が鉛直方向と水平方向で異なることにより偏波特性を維持した光伝播を可能にしたことを特徴とする共焦点顕微鏡。
請求項１に記載の共焦点顕微鏡において、前記フォトニック結晶ファイバの端面から所定の距離まで、前記複数のエアーホールが形成されていないことを特徴とする共焦点顕微鏡。
請求項２に記載の共焦点顕微鏡において、前記所定の距離は、５０から５００μｍであることを特徴とする共焦点顕微鏡。
請求項１または２に記載の共焦点顕微鏡において、前記複数のエアーホールは、第１の径を有するエアーホールと、第１の径と異なる第２の径を有するエアーホールとを有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
請求項１に記載の共焦点顕微鏡において、前記光源ユニットの少なくとも２つの光源のうち、少なくとも１つが発光ダイオードであることを特徴とする共焦点顕微鏡。
請求項１に記載の共焦点顕微鏡において、前記光源ユニットの少なくとも２つの光源は、発光ダイオードであることを特徴とする共焦点顕微鏡。
請求項１に記載の共焦点顕微鏡において、
前記光源ユニットは可視域の光と、バイオレット、紫外域、近赤外または赤外の少なくとも１つの帯域の光とを発生し、
前記フォトニクス結晶ファイバは、前記光源ユニットが発生した光を１本のフォトニクス結晶ファイバのみで前記光走査ユニットに伝送することを特徴とする共焦点顕微鏡。
請求項１または２に記載の共焦点顕微鏡において、前記コリメート手段はコリメートレンズを備え、
前記コリメートレンズを所定量の色収差をもたせたレンズ構成とすることにより、波長によらずコリメートされた光の平行度を保ったまま光束径をほぼ一定にすることを特徴とする共焦点顕微鏡。