KR102409738B1 - 슈퍼-해상도 이미징 - Google Patents

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Abstract

샘플의 슈퍼-해상도 이미징을 위한 장치에 있어서: 전방 관측 시야(30) 내에 있는 샘플(2)로부터 방사되는 광을 수집하는 대물 렌즈(4); 수집된 광으로 샘플의 슈퍼-해상도 이미징을 수행하는 처리 장치(20); (i) 상기 관측 시야 외부로부터 입력 광을 수신하고, (ii) 샘플 상에 여기 광을 지향시키기 위해 도파관 구성 요소 내의 전반사를 사용하도록 배열된 도파관 구성 요소(1); 및 전자 광-경로 제어 시스템(40)으로서, 입력 광이: 제1 시간에서, 도파관 구성 요소 내의 제1 광학 모드에 대응되는 제1 광 경로를 따르게 하고; 및 제2 시간에서, 도파관 구성 요소 내의 제2 광학 모드에 대응되는 제2 광 경로를 따르게 하는 전자 광-경로 제어 시스템을 포함하고, 제2 시간은 제1 시간과 상이하고, 제2 광학 모드는 제1 광학 모드와 상이하다.

Description

슈퍼-해상도 이미징
본 발명은 샘플들의 슈퍼-해상도 이미징(super-resolution imaging)을 수행하는 장치 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 배타적이지는 않지만, 샘플들의 직접 확률 광학 재구성 현미경(dSTORM) 이미징을 수행하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
광학 현미경들은 조직학, 세포 생물학 및 관련 분야에서 세포들과 같은 생물학적 샘플들을 관찰하는 데 사용된다. 그러나 광학 현미경의 분해 능(resolving power)은 광의 회절 한계(diffraction limit)로 인해 제한적이다. 이 제한은 가시 광 현미경의 해상도를 약 200 ~ 300 nm로 제한한다. 이러한 제한을 극복하기 위해, "나노스코피(nanoscopy)", "슈퍼-해상도 이미징(super-resolution imaging)" 또는 "슈퍼-해상도 현미경 검사(super-resolution microscopy)"라고 하는 여러 기술들이 당 업계에서 개발되었다.
이러한 슈퍼-해상도 이미징 기술들을 사용하면 약 20 ~ 50 nm의 해상도로 생물학적 샘플을 이미징할 수 있다. 이들은 생물학적 샘플에 부착되거나 그 안에 내장된 포토-스위치 가능한(photo-switchable) 형광단들(fluorophores) 또는 양자점 마커(quantum dot markers)로부터 방출된 광을 처리하는 데 기반을 둔다. 이러한 슈퍼-해상도 기술들의 공지된 예들은 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), dSTORM(direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), PALM(Photoactivated Localization Microscopy), SOFI(Super-Resolution Optical Fluctuation Imaging), 및 ESI(Entropy-Based Super-Resolution Imaging)을 포함한다.
도 1은 dSTORM 이미징과 같은 슈퍼-해상도 이미징을 위한 예시적인 종래 기술의 배열을 도시한다. 상기 구성은 제1 레이저 광원(140), 제2 광원(145), 제1 빔 스플리터(160), 제2 빔 스플리터(150), 해당 파장에서 약 250nm의 해상도를 갖는 대물 렌즈(110)(예를 들어, 고-NA60x 대물 렌즈), 샘플 및 CCD 또는 sCMOS 검출기(190)를 포함한다. 상기 배열은 또한 제1 레이저 광원(140)으로부터 제1 빔 스플리터(160)로 광을 지향시키고 제2 레이저 광원(145)으로부터 제1 빔 스플리터 (160)로 광을 지향시키는 수단을 포함한다. 제1 빔 스플리터(160)는 제1 및 제2 레이저 광원들(140, 145)으로부터 수신된 레이저 광을 결합하여 여기 빔(130)을 형성하고 여기 빔(130)을 제2 빔 스플리터(150)로 지향시킨다. 제2 빔 스플리터(150)는 여기 빔(130)을 대물 렌즈(110)로 지향시킨다.
샘플의 특정 관심 영역을 이미징하기 위해, 여기 빔은 그 영역 내의 형광단들을 여기 시키도록 샘플(170)의 관심 영역 상으로 지향된다. dSTORM을 수행할 때, 당업자에게 공지된 바와 같이, 두 개의 상이한 파장들이 사용될 수 있다. 샘플 영역 내의 형광단들이 광을 방출할 때, 광은 관심 영역의 이미지를 생성하기 위해 수집되고 처리된다. 이는, 여기 빔(130)이 관심 영역 상으로 지향될 수 있고, 관심 영역으로부터 나오는 광이 수집될 수 있도록, 샘플(170) 상의 관심 영역 상에 대물 렌즈(110)를 집중시켜(by focusing) 달성된다. 제2 빔 스플리터(150)는 여기 광 (170)으로부터 수집된 광(120)을 필터링하고, 수집된 광(120)을 CCD 검출기(190)로 지향시키는 기능을 한다. 물론, 추가적인 필터링이 수행될 수 있다. 컴퓨터(도시되지 않음)는 CCD 검출기(190)로부터 데이터를 수신하고, 대물 렌즈의 250nm 해상도보다 큰 정확도로 가우시안-피팅(Gaussian-fitting)(또는 다른 공지된 방법)에 의한 형광단들의 위치를 결정하기 위해 데이터를 처리한다.
현재 슈퍼-해상도 이미징에 일반적으로 사용되는 장치의 문제점은 고가이며, 부피가 크며, 설치 및 작동이 번거로울 수 있다는 것이다.
슈퍼-해상도 이미징 배열은 일반적으로 감쇠장(evanescent field)(전반사 형광성) 또는 고도로-경사지고 적층된 광학 시트(highly-inclined and laminated optical sheet, HILO)로 샘플을 조명하기 위해 높은 개구 수(numerical aperture, NA)를 갖는 대물 렌즈를 사용한다.
그러나, 높은 개구 수(NA)를 갖는 렌즈는 비싸다. 또한 샘플로부터의 형광이 수집될 수 있는 필드를 제한하는 제한된 관측 시야(Field-of-View, FOV)를 가지고 있다. 이 제한된 시야는, 예를 들어, 대형 세포 배양물들(large cell cultures) 및 집단들(colonies), 또는 조직들(tissues)과 같은, 전형적인 생물학적 샘플들의 크기보다 작은 약 50 ~ 250 마이크로미터(micrometres) 크기이다. 이것은 전체 생물 샘플의 완전한 서브-해상도 이미지를 얻기 위해 이미징 중에 현미경이 샘플에 대해 재배치되고 재정렬될 필요가 있음을 의미한다. 세포 배양물의 제2 부분이 관측 시야 밖에 있을 때 세포 배양물의 제1 부분과 세포 배양물의 제2 부분을 포함하는 움직임을 동시에 이미징하는 것이 불가능하기 때문에, 이는 살아있는 세포 배양물들을 이미징할 때 특히 문제가 된다. 또한, 전체 생물학적 샘플의 완전한 서브-해상도 이미지를 형성하기 위해 획득된 서브-해상도 이미지를 함께 스티칭(stitching)하는데 복잡한 이미지 처리가 요구된다.
본 발명의 목적은 이러한 단점들을 다양하게 해결하는 슈퍼-해상도 이미징을 수행하는 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
제1 양태로부터, 본 발명은 샘플의 슈퍼-해상도 이미징을 위한 장치를 제공하며, 상기 장치는:
전방 관측 시야를 갖는 대물 렌즈로서, 전방 관측 시야 내에 있는 샘플로부터 방사되는 광을 수집하도록 배열된, 대물 렌즈;
수집된 광으로 샘플의 슈퍼-해상도 이미징을 수행하도록 배열된 처리 장치; 및
대물 렌즈의 전방에 위치되고, (i) 관측 시야 외부로부터 입력 광을 수신하고, (ii) 샘플 상에 여기 광을 지향시키기 위해 도파관 구성 요소(waveguide component) 내의 전반사를 사용하도록 배열된 상기 도파관 구성 요소를 포함한다.
제2 양태로부터, 본 발명은 대물 렌즈의 전방 관측 시야 내에 적어도 부분적으로 위치된 샘플의 슈퍼-해상도 이미징을 수행하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은:
상기 관측 시야 외부로부터 상기 대물 렌즈의 전방에 위치된 도파관 구성 요소로 입력 광을 수신하는 단계;
여기 광을 샘플 상으로 지향시키기 위해 도파관 구성 요소 내의 전반사를 이용하는 단계;
대물 렌즈로 샘플로부터의 광을 수집하는 단계; 및
수집된 광으로 슈퍼-해상도 이미징을 수행하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명에 따르면, 광은 대물 렌즈에 의해 공급되는 대신 도파관 구성 요소(전반사를 통해 광을 유도 하는)에 의해 샘플에 공급되는 것을 당업자는 알 수 있다. 따라서, 대물 렌즈는 샘플에 여기 광을 공급하고 샘플로부터 방출된 광을 모으기 위해 동일한 대물 렌즈를 요구하기보다는, 샘플로부터의 광을 수집하기 위해 최적화될 수 있다.
슈퍼-해상도 이미징을 위해 샘플을 여기 시키기 위해 도파관을 사용하는 것은, 슈퍼-해상도 이미징에서 일반적으로 사용되었던 것보다 낮은 개구 수를 갖는 이미징 대물 렌즈의 사용을 가능하게 하며, 샘플의 더 넓은 관측 시야와 더 낮은 장비 비용을 초래하는 것을 포함하는, 많은 놀라운 이점을 제공하며, 또한 도파관 구성 요소가 빔 스플리터들과 같은 추가 구성 요소를 요구하지 않고 샘플에 직접 여기 광을 공급할 수 있기 때문에 기존의 슈퍼-해상도 설정과 관련된 배열 복잡성을 피할 수 있다.
바람직하게는 대물 렌즈의 관측 시야 외부에 위치되는 레이저와 같은 광원으로부터의 입력 광을 수신한다. 도파관 구성 요소는 공기를 통해 또는 도파관 구성 요소에 결합된 광섬유 케이블과 같은 다른 매체를 통해 입력 광을 수신할 수 있다. 입력 광의 파장은 예를 들어, 복수의 상이한 파장들 사이의 시간 다중화(temporal multiplexing)에 의해 시간에 따라 변할 수 있다. 입력 광은 대물 렌즈를 통과하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 여기 광은 대물 렌즈를 통과하지 않는 것이 바람직하다. 대물 렌즈는 바람직하게는 0.4보다 큰 개구 수를 가지며; 바람직하게는 1.49 미만이다.
대물 렌즈는 바람직하게는 도파관을 통한 광 경로의 방향과 비-평행인 광 축을 갖는다. 일부 실시 예들에서, 대물 렌즈의 광 축은 도파관을 통한 광 경로의 방향 또는 도파관의 평면 층에 실질적으로 수직이다.
임의의 적합한 슈퍼-해상도 이미징 기술이 수행될 수 있다. 슈퍼-해상도 이미징은 바람직하게는, 수집된 광의 적어도 하나의 파장에 대해, 이미징 해상도는 그 파장에서의 대물 렌즈의 해상도보다 더 미세하다. 물론, 대물 렌즈의 해상도는 렌즈의 회절 제한(diffraction limit)에 의해 제한될 것이다. 수집된 광은 바람직하게는 샘플에 의해 방출된 형광을 포함한다; 슈퍼-해상도 이미징은 바람직하게는 형광 현미경 검사이다. 슈퍼-해상도 이미징은 단일-분자 위치 인식 방법(single-molecule localization method) 또는 변동-광-필드 기반 슈퍼-해상도 기술(fluctuating-light-field-based super-resolution technique)을 포함할 수 있다. 슈퍼-해상도 이미징은 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy); dSTORM(direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy); PALM(Photoactivated Localization Microscopy); SOFI(Super-Resolution Optical Fluctuation Imaging); 및 ESI(Entropy-Based Super-Resolution Imaging)으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시 예들의 세트는 dSTORM을 사용한다.
도파관 구성 요소는 임의의 적합한 형태를 취할 수 있다. 일부 실시 예들에서, 이는 하나 이상의 평면 층들을 포함한다. 도파관 구성 요소는 슬래브 도파관 구조, 리브 도파관 구조, 스트립 도파관 구조 또는 다중-코어 여기 도파관 구조를 포함할 수 있다. 바람직한 실시 예들의 세트에서, 도파관은, 평면 기판일 수 있는, 기판 상에 단일 하나로 통제되어(monolithically) 집적된 도파관 구조를 포함한다. 기판은 실리콘일 수 있다. 기판은 바람직하게는, 160 내지 170 마이크로미터와 같은, 200 마이크로미터 미만의 최대 두께를 갖는다. 일부 실시 예들에서, 기판은 기판을 통해 샘플로부터 광이 수집될 수 있도록 투명할 수 있다.
도파관 구성 요소는 바람직하게는 출력 면으로부터 여기 광을 출력하도록 배열되고, 출력 면은 적어도 부분적으로 대물 렌즈의 관측 시야 내에 있다. 출력 면은 바람직하게는 평면이다. 그것은 도파관 구성 요소 내의 광에 의해 취해진 경로의 방향과 평행할 수도 있고(예를 들어, 여기 광을 감쇠장으로서 샘플에 지향시킬 때), 또는 도파관 구성 요소 내의 광에 의해 취해진 경로의 방향에 대해 기울어 질(바람직하게는 수직) 수도 있다(예를 들어, 빔 또는 시트로서 출력 면으로부터 샘플로 여기 광을 지향시킬 때).
상기 도파관 구성 요소는, 그 폭이, 적어도 하나의 치수에서, 샘플을 향한 방향으로 증가하는 광 경로를 따라 샘플을 향하여 입력 광을 유도하도록 배치될 수 있다. 이것은 감쇠장을 통해 간접적으로 또는 직접적으로 여기 광을 사용하여 샘플의 더 큰 영역을 조명하는 데 유용할 수 있다. 이 폭은 바람직하게는 단열적으로 증가하여, 도파관의 단일 모드 조건이 유지될 수 있다(특정 슈퍼-해상도 이미징 기술에 유용할 수 있는).
실시 예들의 한 세트에서, 도파관 구성 요소는 감쇠장으로 구성된 여기 광만을 샘플 상에 지향시키도록 배열된다. 샘플은 바람직하게는 도파관 구성 요소와 접촉한다. 상기 도파관 구성 요소는 제1 코어 영역 및 상기 제1 코어 영역과 접촉하는 제1 클래딩 영역을 포함할 수 있으며, 제1 코어 영역은 제1 클래딩 영역보다 더 높은 굴절률을 가지며 상기 도파관을 통해 제1 코어 광로를 획정하도록 배열되며, 제1 클래딩 영역은 샘플을 유지하기 위한 샘플 웰을 형성하도록 형상화된다.
샘플 웰은 하나 이상의 벽들, 특히 네 개의 평면의 측벽들을 포함할 수 있다. 샘플 웰은 예를 들어 BSA(bovine serum albumin), PEG(polyethylene glycol) 또는 PLL(poly-L-lysine) 분자를 포함하는 생체 적합성(bio-compatible) 층으로 코팅될 수 있다.
실시 예들의 다른 세트에서, 도파관 구성 요소는 도파관 구성 요소의 에지 면으로부터 여기 광을 출력하도록 배열된다. 샘플은 에지 면과 접촉하거나, 에지 면과 샘플 사이에 에어 갭 및/또는 셀 완충 용액(예를 들어, 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS))과 같은 매질이 있을 수 있다. 다시, 도파관 구성 요소는 샘플을 유지하기 위한 샘플 웰을 형성할 수 있다. 이 샘플 웰은 하나 이상의 측벽들을 포함할 수 있다. 이들 측벽들 중 적어도 하나는 적어도 하나의 도파 층을 포함할 수 있다. 에지 면은 샘플 웰의 하나의 측벽의 적어도 일부분을 형성할 수 있다. 따라서, 수신된 샘플은 횡 방향, 바람직하게는 대물 렌즈의 광학 축에 수직인 방향으로 조명될 수 있다. 에지면은 예를 들어 BSA(bovine serum albumin), PEG(polyethylene glycol) 또는 PLL(poly-L-lysine) 분자를 포함하는 생체 적합성 층으로 코팅될 수 있다.
이러한 배열들은 형광단들이 샘플의 표면 영역을 넘어 - 예를 들어 1 마이크로 미터보다 깊게 시료 내에서 여기 될 수 있게 한다.
이러한 배열들은 또한, 여기 전력이 비교적 낮은-전형적으로 총 입력 광 전력의 약 10 %보다 작은-공지된 감쇠장-기반 조명 기술들과 비교하여, 주어진 레이저 소스에 대해 비교적 높은 전력으로 형광단들이 효율적으로 여기될 수 있게 한다.
에지 면으로부터의 여기 광은 바람직하게는 광 시트로서 형상화된다. 광 시트는 바람직하게는 대물 렌즈의 전방 관측 시야의 주 방향을, 바람직하게는 수직으로, 가로 지르는, 평면에서 샘플과 교차한다. 광 시트를 생성함으로써 바람직하게는 샘플의 전체 단면이 조명될 수 있다. 또한, 광은 대물 렌즈의 광학 축에 평행 한 것보다 횡단 평면에서 발산하는 광으로서 또는 균일 발산을 갖는 빔으로서 형성될 수 있다.
에지 면으로부터 방사되는 광 빔 또는 광 시트의 두께는 500, 1000 또는 2000 nm 미만인 것이 바람직하다. 이를 용이하게 하기 위해, 도파 층은 투명한 물질의 광-투과성 박막으로서 증착될 수 있다. 이 박막은 1 mm 미만의 두께를 가질 수 있다.
에지 면은 샘플이 위치될 수 있는 표면 영역의 측방에 위치될 수 있다.
에지 면으로부터의 여기 광의 발산은 적어도 대물 렌즈의 광 축에 평행 한 평면에서 제어될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 이 평면에서, 발산은 바람직하게는 평면인 에지 면의 형상 및 단면으로 인해 자연 발산보다 더 작도록 제어된다. 이러한 제어는 에지 면 그 자체, 또는 에지 면에 근접한 도파 층의 영역에 의해 제공될 수 있다.
빔은 또한 바람직하게는 광축 상의 샘플 내의 초점(focal point) 또는 선형 초점(line focus) 쪽으로 수렴할 수 있다. 광 축의 방향에 평행한 평면에서의 수렴과 광 축을 가로 지르는 발산이 동시에 설립될 수 있다.
도파관 구성 요소는 여기 광을 집중시키도록 배열된 렌티큘러 렌즈(lenticular lens), 정적 격자(static grating) 또는 음향 격자(acoustic grating)를 포함할 수 있다. 이는 샘플의 어느 부분이 여기 되는지 더 잘 제어 할 수 있다. 동일한 이유로, 도파관 구성 요소는 여기 광을 집중시키기 위한 렌즈를 형성하기 위해 적어도 하나의 치수가 점점 가늘어지는 광 경로를 따라 샘플을 향하여 입력 광을 유도하도록 배열될 수 있다. 렌즈는 액시콘 렌즈 일 수 있다. 액시콘 렌즈는 중심 코어가 일정 거리 동안 얇고 비-회절인 의사-베셀 빔(pseudo-Bessel beam)을 생성하는 데 사용될 수 있다. 점점 가늘어 지는 것(tapering)은 회전 대칭일 수 있으며-예를 들어, 원뿔 모양의- 그러나 그것은 예를 들어, 리소그래피(lithography)를 사용하여 제조가 용이할 수 있기 때문에 바람직하게는 쐐기-형(wedge-shaped) 또는 피라미드형이다. 렌즈는 바람직하게는 출력 면에 위치한다.
공지된 슈퍼-해상도 기술의 한계는 샘플의 하나의 작은 영역 만이 여기 되어 이미징될 수 있다는 것다. 본 발명의 실시 예에서의 도파관 구성 요소는:
제1 코어 영역 및 제1 코어 영역과 접촉하는 제1 클래딩 영역으로서, 제1 코어 영역은 제1 클래딩 영역보다 높은 굴절률을 갖고 도파관 구성 요소를 통해 제1-광 경로를 획정하도록 배열된, 상기 제1 코어 영역 및 제1 클래딩 영역; 및
제2 코어 영역 및 상기 제2 코어 영역과 접촉하는 제1 클래딩 영역으로서, 상기 제1 코어 영역은 상기 제2 클래딩 영역보다 높은 굴절률을 갖고 도파관 구성 요소를 통해 제2-광 경로를 획정하도록 배열된, 상기 제2 코어 영역 및 제2 클래딩 영역을 포함하며,
제1 코어 영역은 여기 광을 샘플의 제1 영역 상으로 지향 시키도록 배열되고, 제 2 코어 영역은 여기 광을 제1 영역과 상이한 샘플의 제2 영역 상으로 지향 시키도록 배열된다.
이러한 방식으로, 샘플은 각각의 영역들에서 선택적으로 형광단들을 자극함으로써 다중 영역들(예를 들어, 샘플을 통한 평행 슬라이스들)에서 이미징될 수 있다. 물론, 도파관 구성 요소는 샘플의 세 개, 네 개 또는 그 이상의 별개의 영역들로 광을 지향시킬 수 있도록 추가 코어 및 클래딩 영역들을 포함할 수 있다. 따라서, 처리 장치가 샘플의 3 차원(3D) 모델을 생성하는 것이 가능할 수 있다.
도파관 구성 요소는 샘플을 유지하기 위한 웰 또는 다른 유지 배열을 포함할 수 있다.
상기 장치는, 입력 광이 제 1 시간에서 도파관 구성 요소 내의 제1 광 경로를 따르게 하고, 제1 시간과 다른 제2 시간에서, 도파관 구성 요소 내의 제1 광 경로와 다른 제2 광 경로를 따르게 하도록 배열된 전자 광-경로 제어 시스템을 포함할 수 있다. 바람직하게는 입력 광은 제2 시간에서 제1 광 경로를 따르지 않는다. 바람직하게는, 입력 광은 제1 시간에서 제2 광 경로를 따르지 않는다. 다중-코어 실시 예에서, 이들 제1 및 제2 광 경로들은 각각 제1-코어 광 경로 및 제2-코어 광 경로에 대응될 수 있고; 대안적으로, 이들은 단일 코어 내에서 다른 경로일 수 있다. 제1 시간 및 제2 시간은 모두 단일-프레임 노광 기간, 즉 단일 프레임에 대한 노광 시간 내에 있을 수 있다(예를 들어, STORM 또는 dSTORM과 같은 단일-분자 위치 인식 기술을 사용할 때). 대안적으로, 제1 시간은 제1 프레임에 대한 노광 기간 내에 있을 수 있고, 제2 시간은 제1 프레임과 다른 제2 프레임에 대한 노광 기간 내에 있을 수 있다(예를 들어, ESI 또는 SOFI와 같은 변동-광-필드-기반 기술을 사용할 때). 이것은, 제1 및 제2 광 경로들이 도파관 구성 요소 내의 상이한 각각의 광학 모드들에 대응할 수 있기 때문에, 감쇠장으로 샘플을 여기 시키도록 배열된 실시 예에서 특히 유리한 것으로 밝혀졌다. 따라서 감쇠장의 패턴은 광학 모드들 사이에서 따라 달라진다. 하나의 단일-프레임 노광 기간 내에 다수의 이러한 패턴들을 생성함으로써, 하나의 모드를 전체적으로 사용하는 것과 비교하여, 단일-분자 위치 인식 기술을 사용할 때 노광 기간에 걸쳐 샘플의 보다 균일한 평균 여기가 달성될 수 있다. 샘플이 단일-프레임 노광 기간 동안 균일하게 여기되지 않으면 결과로 나오는 슈퍼-해상도 이미지에 중요한 세부 사항이 누락되거나 스트라이프 패턴들과 같은 인공물이 포함될 수 있다. 대안적으로, 상이한 각각의 프레임들의 노광 기간들에서 상이한 패턴들을 생성함으로써, 변동하는-광-필드-기반 슈퍼-해상도 기술을 사용하여 조명의 적절한 변동을 달성할 수 있다. 이 경우, 각 패턴(모드)은 주어진 단일-프레임 노광 기간 동안 바람직하게 일정하다.
처리 장치는 바람직하게는 약 1, 5, 10, 100, 1000 또는 10,000 밀리초의 지속 기간을 갖는 노광 기간에 걸쳐 수집된 광을 사용하여 하나의 프레임을 생성하도록 구성된다. 당업자에게 익숙한 바와 같이, 프레임은 처리 장치의 메모리에 저장될 수 있다(예를 들어, 어레이로서).
처리 장치는 바람직하게는 복수의 프레임들-예를 들어 100, 1000, 10,000 또는 그 이상-을 생성하고, 이들을 사용하여 하나 이상의 슈퍼-해상도 출력 이미지들 또는 애니메이션들을 생성하도록 구성된다(예를 들어, 위에서 언급된 바와 같은, 종래의 슈퍼-해상도 기술을 사용하여). 이러한 출력 이미지 또는 애니메이션은 메모리에 저장되거나 및/또는 컴퓨터 모니터와 같은 디스플레이 상에 표시될 수 있다. 프레임들은 모두 바람직하게는 동일한 노광 기간을 갖는다.
처리 장치는 마이크로 프로세서, 마이크로 컨트롤러, ASIC, FPGA, DSP, 메모리 및 소프트웨어 명령어를 포함하는 메모리 중 하나 이상과 같은 임의의 적절한 처리 수단을 포함할 수 있다. 그것은 데스크탑 PC와 같은 로컬 장치 또는 서버와 같은 원격 장치를 포함 할 수도 있고, 서버 클라우드를 포함하는 것과 같이 배포 될 수도 있다. 추가의 양태들로부터, 본 발명은, 예를 들어 광원을 제어하는 것 및/또는 광-주입 디바이스를 제어하는 것 및/또는 샘플로부터 수집된 광을 사용하여 슈퍼-해상도 이미지를 생성하는 것을 포함하는, 본원에 개시된 임의의 단계들을 수행하도록 처리 장치를 지시하기 위한 명령어들을 포함하는, 소프트웨어, 및 소프트웨어를 지는 유형 매체를 포함한다.
광-경로 제어 시스템은 단일 프레임에 대한 노광 기간 내에서 제1 및 제2 광 경로들(및 선택적으로 추가 광 경로들) 사이에서 입력 광을 여러 번-예를 들어 2, 10, 100 회 이상-순한 시키도록 배열될 수 있다. 이는, 예를 들어 dSTORM-온-칩 실험에서 특정 슈퍼-해상도 기술을 사용할 때 유용하고, 이는 단일 이미지 프레임 내에서 둘 이상의 모드가 여기되는 것을 가능하게 한다. 변동-광-필드-기반 슈퍼-해상도 기술들에 대해, 이미지 프레임 당 하나의 모드를 갖는 것이 바람직할 수도 있다.
장치는 입력 광을 광섬유 케이블, 렌즈 또는 거울과 같은 도파관 구성 요소에 주입 시키도록 배열된 광-주입 디바이스를 포함할 수 있다. 광-주입 디바이스는 처리 장치에 의해 제어될 수 있다. 광-경로 제어 시스템은 단일-프레임 노광 기간 동안, 또는 단일-프레임 노광 기간으로부터 다음 단일-프레임 노광 기간 동안 도파관 구성 요소에 대해 광학-주입 장치를 이동시켜, 입력 광이 도파관 구성 요소에 입사하는 위치 또는 각도를 변경시키도록(예를 들어, 도파관 구성 요소의 입구 면에서) 배열된 액추에이터를 포함할 수 있다. 렌즈 부분 또는 전체 대물 렌즈를 움직이면 제 시간에 상이한 평행 오프셋들, 상이한 입사각들 또는 다른 초점 위치들이 초래될 수 있다. 액추에이터는, 광-주입 디바이스에 결합될 수 있는, 진동 압전 스테이지(vibrating piezoelectric stage)와 같은 압전 액추에이터 또는 진동 모터를 포함 할 수 있다. 액추에이터는 광을 도파관 구성 요소에 결합시키는 역할을 하는 예를 들어 도파관의 상부, 하부 또는 측면에서, 입력 광의 전파 방향에 평행한 평면에서 연장될 수 있는 음향-광학 격자(acousto-optic grating)를 포함할 수 있다; 변조 신호의 주파수를 변경함으로써, 상이한 격자들 및 상이한 편향들이 생성될 수 있고, 따라서 입력 광 빔을 도파관 구성 요소의 입구 면과 관련하여 움직일 수 있다.
광-경로 제어 시스템은 단일-프레임 노광 기간 동안, 또는 단일-프레임 노광 기간으로부터 다음 단일-프레임 노광 기간 동안, 입력 광의 편광, 위상 또는 파장 중 하나 이상을 변경시키는 배열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 다양한 광 경로 길이를 제공하기 위해 상이한 위치에 상이한 두께를 갖는 회전 디스크 또는 이동 가능한 슬래브와 같은 회전 가능한 편광기 또는 위상 변경 장치를 포함할 수 있다. 광-경로 제어 시스템은 단일-프레임 노광 기간 동안 또는 하나의 단일-프레임 노광 기간으로부터 다음 단일-프레임 노광 기간 동안 도파관 구성 요소 내의 온도를 변화시켜 도파관 구성 요소 내의 굴절률을 변화 시키도록 배열된 온도-변화 소자를 포함할 수 있다.
또한, 본 출원인은, 단일-프레임 노광 기간들 내에 또는 사이에서 입력 광을 변화시킬 필요가 없는, 감쇠장으로부터의 다양한 여기 장을 달성하는 또 다른 방법을 고안하였다. 이는, 동시에 광을 도파관 구성 요소를 통해 제1 광 경로를 따르게 하고 도파관 구성 요소를 통해 제2 광 경로를 따르게 지향시켜, 제1 및 제2 광학 모드들이 간섭하도록 함으로써 달성될 수 있고, 여기서 제1 광 경로는 도파관 구성 요소의 제1 광학 모드에 대응되고 제2 광 경로는 도파관 구성 요소의 제2 광학 모드에 대응된다. 이러한 간섭으로 인해 이미징이 진행되는 동안 감쇠 여기 광의 강도가 변조된다. 이러한 조명은, SOFI 및 ESI와 같은, 변동-조명-기반의 슈퍼-해상도 분석에 매우 적합한 것으로 밝혀졌다.
본원에 설명된 임의의 양태 또는 실시 예의 특징들은, 적절하다면, 본원에 기재된 임의의 다른 양태 또는 실시 예에 적용될 수 있다. 다른 실시 예들 또는 실시 예들의 세트가 참조될 때, 이들은 반드시 구별될 필요는 없지만 오버랩 될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 특정 바람직한 실시 예들은 첨부된 도면들을 참조하여 단지 예로서 설명될 것이며, 이하:
도 1은 형광 현미경 검사(fluorescence microscopy)를 수행하기 위한 종래 기술의 개략도이다;
도 2는 본 발명에 따른 형광 현미경 검사를 수행하기 위한 장치의 개략도이다;
도 3은 본 발명에 따른 도파관 구성 요소(waveguide component)의 단면도이다;
도 4는 도 3의 도파관 구성 요소의 평면도이다;
도 5a, 도 5b 및 도 5c는 본 발명에 따른 도파관 구성 요소들의 평면도이다;
도 6a, 도 6b 및 도 6c는 모두 본 발명에 따른 세 개의 대체 도파관 구조들의 단면 프로파일들이다;
도 7은 본 발명에 따른, 도파관의 말단에 있는, 다중-코어 도파관 구성 요소의 측면 프로파일이다; 그리고
도 8a 및 8b는 본 발명에 따른 두 개의 도파관 구성 요소들의 상이한 에지 면 배열들(facet arrangements)의 평면도이다.
도 2는 도파관 구성 요소(waveguide component)(1)를 향하는 전방(forward) 관측 시야(field of view)(30)를 갖는 'Plan N 20x/0.4 OlympusTM' 대물 렌즈'와 같은 대물 렌즈(objective lens)(4)를 포함하는 형광 현미경 검사(fluorescence microscopy)를 수행하기 위한 장치를 도시한다. 또한, 이는 도파관 구성 요소(1)의 입력 면(facet)에 광학적으로 결합된 광-주입 디바이스(light-injecting device)(40), 및 대물 렌즈(4)의 전방 관측 시야(30) 내의 도파관 구성 요소(1) 상에 위치된 샘플들(2)을 포함한다. 이 장치는 또한 전방 관측 시야(30) 내에서 대물 렌즈(4)에 의해 수집된 광을 수신하고 처리하도록 구성된 처리 장치(processing arrangement)(20)를 포함한다.
본 예제의 샘플은, 물론 다른 샘플도 사용될 수 있지만, 형광단들(fluorophores)이 내장된 유기 셀(organic cell)이다.
광-주입 디바이스(40)는 광을 도파관 구성 요소(1)에 주입하기 위한 대물 렌즈(10), 액추에이터(12) 및 세 개의 광원들(8)을 포함한다. 세 개의 광원들로부터의 3 개의 광선들은 각각 405 nm, 488 nm 및 647 nm의 파장을 갖는다. 대물 렌즈(10)는 세 개의 광선들을 수신하고 광선들을 집광하여 도파관 구성 요소(1)에 주입시킨다. 주입된 광은 도파관에 대한 입력 광을 형성한다. 하나 이상의 상이한 파장들을 갖는 입력 광은, 예를 들어 dSTORM을 사용하여, 샘플(2)의 단일-분자-국부 슈퍼-해상도(single-molecule-localisation super-resolution) 이미징을 가능하게 한다.
액추에이터(12)는 상이한 위치에서 광을 도파관 구성 요소(1)로 주입하기 위해 및/또는 상이한 각도로 도파관 구성 요소(1) 내로 광을 주입하기 위해 도파관 구성 요소(1)에 대해 대물 렌즈(10)를 움직일 수 있다. 광이 도파관 구성 요소(1) 내로 주입되는 위치 및/또는 각도를 변경함으로써, 광-주입 디바이스(40)와 도파관 구성 요소(1) 사이의 광학 결합(optical coupling)이 미세하게 조정될 수 있다. 또한, 그것은 주입된 광이 도파관 구성 요소를 따라 전파되는 광 경로를 변화시키기 위해, 이미징 프로세스 동안 상이한 위치 및/또는 각도로 도파관 구성 요소에 광이 주입되게 한다. 주입된 광이 도파관 구성 요소 내에서 전파되는 광 경로는 도파관 구성 요소(1)의 광학 모드에 의해 획정된(defined) 광 경로에 대응한다.
도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 도파관 구성 요소(1)는 기판(201) 상에 형성된 도파관 구조(waveguide structure)를 포함한다. 도파관 구조의 층들은 상부 클래딩 층(cladding layer)(204)과 하부 클래딩 층(202) 사이에 샌드위치된 광 유도 층(optical guiding layer)(203)(때때로 본 명세서에서는 코어 층(203)으로 지칭 됨)을 포함한다. 하부 클래딩 층(202)은 기판(201)과 코어 층(203)의 제1 면(208) 사이에 배치된다. 상부 클래딩 층(204)은 코어 층(203)의 제1 면 (208)에 대향하는 코어 층(203)의 제 2면(209) 상에 배치된다. 코어 층(203)은 클래드 층보다 높은 굴절률(refractive index)을 가지며, 도파관 구성 요소(1)에 주입된 광을 유도한다.
이 예에서, 도파관 구조는 슬래브(slab) 도파관(도 3 및 도 6a에 도시된 바와 같이)이지만, 아래에 설명된 바와 같이, 도파관 구성 요소는 대신에 리브(rib)(예를 들어, 도 6b에 도시된 바와 같이), 스트립(strip)(예를 들어, 도 6c에 도시된 바와 같이) 또는 다중-코어(multi-core) 여기(excitation)(예를 들어, 도 7에 도시된 바와 같이) 도파관 구조를 포함할 수 있다.
도 3, 도 4 및 도 6a의 슬래브 도파관 구조는 바람직하게는 실리콘 또는 투명 기판 상에 형성되며, 오산화 탄탈럼(Ta2O5) 또는 질화 규소(Si3N4)의 얇은 코어 층(203)(바람직하게는 500 nm 미만), 이산화 규소(SiO2)의 하부 클래딩 층(202), 및 이산화 규소(SiO2)의 상부 클래딩 층(204)을 포함한다. 상부 및 하부 클래딩은 대안적으로 바이오-이미징(bio-imaging)에 사용된 샘플 매질(sample medium)의 굴절률에 밀접하게 매칭된 굴절률을 갖는 재료로 이루어질 수 있다(즉, n = 1.38).
도파관 구성 요소(1)에 주입된 광은 도파관 구조(1)를 따라 전파되고, 주입된 광의 일부는 도파관 코어 영역 외부로 전파된다. 이 부분의 광은 감쇠장(evanescent field)로 알려져 있다. 감쇠장에서의 강도는 얇은 도파관을 만들고 코어와 클래딩 사이의 높은 굴절률 대비를 사용하여 증가시킬 수 있다. 따라서, 코어 용 고 굴절률 재료 및 클래딩 용 저 굴절률 재료를 갖는 것이 바람직하다(이상적으로 샘플의 매질과 매칭된). 또한, 코어 및 클래딩 재료는 낮은 흡수 손실 및 낮은 자동-형광성(auto-fluorescence)을 가져야 한다.
도파관 구성 요소(1)는 샘플(206)을 유지하도록 만들어진 도크(dock)도 포함하여, 그것이 도파관 구조에서 전파되는 감쇠장과 오버랩 된다. 감쇠장과의 오버랩은 주입된 광의 적어도 일부가 도크 내에 포함된 샘플(206) 상으로 지향되게 하는 것을 보장한다. 샘플(206) 상으로 지향된 광은 본 명세서에서 여기 광(excitation light)으로 지칭된다. 여기 광이 샘플(206) 상으로 지향되는 도파관 구조의 면은 본 명세서에서는 출력 면(output face)으로 지칭된다.
슬래브 도파관 구조에서, 도크는 감쇠장과 오버랩되는 샘플 웰(sample well)(207)을 획정하는 상부 클래딩 층(204)에 갭(gap)을 포함한다. 샘플 웰(207)은 도파관 구성 요소(1)의 길이 및 폭을 따라 적어도 부분적으로 연장된다.
처리 장치(20)는 샘플로부터의 광을 검출하기 위한, CCD 또는 sCMOS 카메라와 같은, 형광 검출 장치(fluorescence detection device)(5)와, 형광 검출 장치(5)를 제어하고 검출된 광을 처리하여 공지된 슈퍼-해상도 이미징 기술을 사용하여 샘플(206)의 슈퍼-해상도 이미지를 생성하기 위한 전자 제어 유닛(electronic control unit)(6)을 포함한다.
예를 들어, 10 밀리초(milliseconds) 동안 지속되는, 슈퍼-해상도 단일-프레임 노광 기간(super-resolution single-frame exposure period)의 시작 시, 액추에이터(12)는 광-주입 디바이스(40)를 제1 광-주입 위치에 위치시킨다. 제1 광-주입 위치에서, 광-주입 디바이스는 슬래브 도파관 구조 내의 제1 광 경로(또는 광 경로들의 제1 세트)를 따르도록 제1 입력 광을 도파관 구성 요소(1)에 주입한다. 제1 광 경로 또는 경로들을 따르는 주입된 광의 적어도 일부분은 코어 영역(203) 외부의 제1 감쇠장으로서 전파되어 샘플 웰(207) 내로 지향된다. 샘플 웰(207) 내로 지향된 제1 감쇠 광은 제1 여기 패턴을 형성한다. 제1 여기 패턴은 대략 1 밀리초 동안 샘플 웰(207) 내의 샘플(206)을 조명한다.
슈퍼-해상도 단일-프레임 노광 기간의 시작으로부터 1 밀리초 후에, 액추에이터(12)는 광-주입 디바이스(40)를 제2 광-주입 위치에 위치시킨다. 제2 광-주입 위치에서, 광-주입 디바이스는 슬래브 도파관 구조 내의 제2 광 경로(또는 광 경로들의 제2 세트)를 따르도록 제2 입력 광을 도파관 구성 요소(1)에 주입한다. 제2 광 경로 또는 경로들을 따르는 주입된 광의 적어도 일부분은 코어 영역(203) 외부의 제2 감쇠장으로서 전파되어 샘플 웰(207) 내로 지향된다. 샘플 웰(207) 내로 지향된 제2 감쇠장은 제2 여기 패턴을 형성한다. 제2 여기 패턴은 대략 1 밀리초 동안 샘플 웰(207) 내의 샘플(206)을 조명한다.
슈퍼-해상도 단일-프레임 노광 기간의 시작으로부터 2 밀리초 후에, 액추에이터(12)는 광-주입 디바이스(40)를 제3 광-주입 위치에 위치시킨다. 제3 광-주입 위치에서, 광-주입 디바이스는 슬래브 도파관 구조 내의 제3 광 경로(또는 광 경로들의 제3 세트)를 따르도록 제3 입력 광을 도파관 구성 요소(1)에 주입한다. 제3 광 경로 또는 경로들을 따르는 주입된 광의 적어도 일부분은 코어 영역(203) 외부의 제3 감쇠장으로서 전파되어 샘플 웰(207) 내로 지향된다. 샘플 웰(207) 내로 지향된 제3 감쇠장은 제3 여기 패턴을 형성한다. 제3 여기 패턴은 대략 1 밀리초 동안 샘플 웰(207) 내의 샘플(206)을 조명한다.
그 후, 액추에이터(12)는 광-주입 디바이스(40)를 제1 광-주입 위치로 되돌려 놓고 10 밀리초 노광 기간이 종료될 때까지 프로세스 사이클을 반복한다.
샘플(206)을 조명하는 제1, 제2 및 제3 여기 패턴들은 샘플의 형광단들(fluorophores)을 자극하여 형광을 내고(fluoresce) 광을 방출한다. 대물 렌즈(4)는 전체 단일-프레임 노광 기간 동안 형광단들로부터 방출된 광을 수집한다. 대물 렌즈(4)에 의해 단일-프레임 노광 기간 동안 수집된 광은 형광 검출 장치(5)로 지향된다. 형광 검출 장치(5)는 수신된 광을 전기 신호로서 검출하고 전기 신호를 전자 제어 유닛(6)으로 전송한다. 전자 제어 유닛(6)은 샘플의 제1 이미지를 생성하기 위해 dSTORM 단일-분자 위치 측정 방법(single-molecule localization method)을 사용하여 전기 신호를 처리한다.
전자 제어 유닛(6)은 마이크로 프로세서, 마이크로 컨트롤러, ASIC, FPGA, DSP, 메모리 및 소프트웨어 명령어들을 포함하는 메모리 중 하나 이상과 같은 임의의 적절한 처리 수단들을 포함할 수 있다; 그것은 데스크톱 PC와 같은 단일 장치를 포함하거나 원격 서버 또는 서버 클라우드들과 같이 분배될 수 있다.
샘플의 제1 이미지는 dSTORM 슈퍼-해상도 이미징 기술의 제1 프레임에 대응된다. 제1 프레임이 생성된 후, 장치는 샘플의 10,000 또는 그 이상의 프레임들을 생성한다. 다음 프레임들 각각에서, 샘플은 다시 다음-단일 프레임 노광 기간 동안 차례로 세 개의 여기 패턴들의 사이클로 차례로 조명된다.
전자 제어 유닛(6)은 제1 프레임 및 후속 프레임들 각각을 메모리에 기록한다. 모든 프레임들이 캡쳐(capture)된 후, 전자 제어 유닛(6)은 공지된 dSTORM 슈퍼-해상도 이미징 기술을 사용하여 모든 프레임들에 기초하여 샘플의 최종 슈퍼-해상도 이미지를 생성한다.
본 발명자들은 단일-프레임 노광 기간 동안 샘플(206)에 대한 여기 광의 중첩 및 방향을 변화시키는 것이 단일-프레임 노광 기간 동안 여기 광의 더 양호한 균일성을 제공한다는 것을 발견했다. 특히, 그들은, 정적인 광 경로와 비교하여, 변화하는 광 경로들이 샘플과 오버랩되는 여기 광의 강도를 평균화한다는 것을 발견했다. 여기 광의 보다 나은 균일성은 더 나은 해상도, 더 작은 인공물(artefacts), 더 선명한 대조, 및 더 나은 강도 색영역(gamut)을 갖는 보다 나은 품질의 슈퍼-해상도 이미지를 초래한다. 어떤 경우에는, 조명 패턴이 너무 균일하지 않기 때문에(예를 들어, 시각화되는 구조와 유사한 스케일로 스트라이프들을 갖는), 이 기능이 없으면 도파관-기반 슈퍼-해상도 이미징이 전혀 불가능할 수도 있다.
이 예에서, 샘플 웰(207)과 오버랩되는 코어 층(203)의 제2 면(209)은 광이 샘플 상으로 지향되는 출력 면을 형성한다는 것을 알 수 있을 것이다.
제1, 제2 및 제3 광 경로들(또는 경로들의 세트들)은 도파관 구조의 상이한 광학 모드들에 의해 획정된 상이한 경로들에 대응할 수 있다. 예를 들어, 제1 광 경로는 슬래브 도파관 구조의 기본 모드에 대응할 수 있고 제2 광 경로는 슬래브 도파관 구조의 제1 차 모드에 대응할 수 있다. 다른 예로서, 광 경로들의 제1 세트는 슬래브 도파관 구조의 모드들(예를 들어, 기본 모드 및 제1-차 모드)의 제1 세트에 대응할 수 있고 광 경로들의 제2 세트는 슬래브 도파관 구조의 모드들(예를 들어, 제1-차 모드 및 제2-차 모드)의 제2 세트에 대응할 수 있다.
도 2는 따라서, 예를 들어 dSTORM과 같은, 형광 현미경 검사를 수행하기 위한 설정을 도시한다. 도파관 구성 요소(1)는 대물 렌즈(4)의 관측 시야 내에 위치된 샘플(2)을 지지한다. 도파관 구성 요소(1)는 광이 주입되는 도파관 구조를 형성한다. 주입된 광은 도파관 구조를 따라 전반사에 의해 유도되고, 주입된 광의 적어도 일부는 감쇠 광 필드로서 전파된다. 도파관은 주입된 광의 적어도 일부를 샘플(2) 상에 지향시킨다.
선택적으로, 도파관 구성 요소(1)에 대한 대물 렌즈(10)의 움직임을 제어하는 액추에이터(12)는 전자 제어기에 의해 제어된다. 예를 들어, 액추에이터는 ThorlabsTM의 피에조(piezo) 제어기 BPC303에 의해 제어되는 피에조 스테이지(piezo stage) 일 수 있다.
대안적으로, 도파관 구성 요소(1)에 광을 주입하기 위해 대물 렌즈(10)를 사용하는 대신에, 광-주입 디바이스(40)는 광 섬유(optical fibre)(11)로 도파관 구성 요소(1)에 광을 주입할 수 있다. 예를 들어, 광-주입 디바이스(40)는 각각의 광원으로부터의 광선들을 수신하도록 배열된 광 섬유 결합기(optical fibre coupler)(10) 및 광 섬유 결합기(10)와 도파관 구성 요소(1) 사이에 광학적으로 결합된 광 섬유(11)를 포함할 수 있다. 광 섬유 결합기는 광 섬유(11)를 따라 상이한 광선들을 다중화(multiplexing)하고 도파관 구성 요소(1)에 집광한다. 선택적으로, 본 실시 예에서, 광-주입 디바이스(40)는 광 섬유(11)와 관련되어 액추에이터(12)를 포함할 수 있으며, 대물 렌즈(10)와 관련되어 액추에이터의 배열과 마찬가지로, 액추에이터(12)는 도파관 구성 요소(1)에 대한 광 섬유(11)의 위치 및/또는 각도를 움직일 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 도파관 구성 요소(1)는 액추에이터(13)에 연결되어 도파관 구성 요소(1)에 대한 광-주입 디바이스(40)의 위치를 조정할 수 있다. 따라서, 이 액추에이터는 본 개시의 실시 예들에 따라 단일-프레임 노광 기간 동안 도파관 구조 내의 제1 및/또는 제2 광 경로들을 따르도록 도파관 구성 요소(1)에 입력 광을 주입하는데 사용될 수 있다. 액추에이터(13)는, 예를 들어, 진동하는 피에조 스테이지일 수 있다.
선택적으로, 광-주입 디바이스(40)는 임의의 수의 광원들(8) 또는 단일-파장 또는 조정 가능한 파장 광원과 같은 단일 광원(8)을 포함할 수 있다. 각각의 광원은, 예를 들어, 가시 스펙트럼(400 ~ 800 nm) 또는 근적외선(near-IR)(800 ~ 1500 nm) 내의, 형광단들의 여기에 적합한 광을 방출할 수 있다. 또한, 각각의 광원은 고체 상태 레이저, 섬유 레이저 또는 다이오드 레이저와 같은 레이저 광원일 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 각각의 광원들(8)은 LED 광원 또는 슈퍼-해상도 현미경 검사에 적합한 임의의 다른 광원일 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 입력 광은 단일 파장 또는 다중 파장들을 가질 수 있다. 예를 들어, 입력 광은 647 nm 광 및 488 nm 광을 포함할 수 있다(형광 이미징에 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 파장들).
대안적으로, 광-주입 디바이스는 제1, 제2 및 제3 광 경로들(또는 광 경로들의 세트들)를 따라 가도록 제1, 제2 및 제3 입력 광을 동시에 도파관 구성 요소(1)에 주입할 수 있다. 본 실시 예에서, 제1, 제2 및 제3 광 경로들은 도파관 구성 요소(1)의 도파관 구조의 제1, 제2 및 제3 광학 모드에 의해 획정된 광 경로들에 대응한다. 제1, 제2 및 제3 광학 모드들 각각은 서로 상이하다. 도파관 구성 요소(1)를 통해 제1, 제2 및 제3 광학 모드들을 동시에 전파하면, 제1, 제2 및 제3 광학 모드들이 서로 간섭(interfere) 한다. 당해 분야에서, 상이한 전파 모드들의 간섭은 모드 비팅(mode beating)으로 알려져 있다. 제1, 제2 및 제3 모드들을 비팅하는 것은 도파관 구성 요소(1)로부터 샘플 상으로 지향된 여기 광을 변조(modulating)한다. 본 발명자들은 이러한 방식으로 여기 광을 변조하는 것이, 여기 광을 시간적으로 변화시키기에 적합한 슈퍼-해상도 이미징 기술에 기초하여 샘플을 이미징 할 수 있게 한다는 것을 발견했다.
선택적으로, 모드 비팅은 여기 광을 변조하기 위해 도파관 구조에서 전파되는 임의의 수의 광학 모드들로 수행될 수 있다. 예를 들어, 모드 비팅은 동시에 도파관 구조 내에서 전파되는 제1 및 제2 광학 모드들만으로 수행될 수 있다.
선택적으로, 서브-해상도 이미징(sub-resolution imaging)은 형광단들 대신에 양자 점들(quantum dots)을 포함하는 샘플 상에서 수행될 수 있다. 본 실시 예에서, 샘플 상으로 지향된 여기 광은 슈퍼-해상도 이미징을 위해 광을 방출하도록 양자 점들을 시뮬레이션 한다.
선택적으로, 처리 장치(20)는 또한 대물 렌즈(4)에 의해 수집된 광을 필터링하기 위해 대역 필터와 같은 하나 이상의 필터들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 필터는 여기 광에 대응하는 광을 차단하고 형광단들에 의해 방출된 광에 대응되는 광을 통과시키도록 구성될 수 있다.
도 6a, 도 6b 및 도 6c는 세 개의 상이한 가능한 도파 구조들(waveguiding structures)의 층들의 단면을 도시한다.
도 6a는 도 3 및 도 4를 참조하여 전술한 슬래브 도파관 구조(200)의 층들의 단면을 도시하지만, 샘플 웰(206)로부터 떨어진 영역에 있다.
도 6b는 리브 도파관 구조(300)를 획정하기 위해 도파관 구조의 상부 클래딩 층(204) 내로 에칭된 리지(ridge)를 가짐으로써 측면의 광 유도가 제공되는 선택적 변형을 도시한다. 리브 도파관 구조(300)에서, 리지는 상부 클래딩 층(204)을 통해 부분적으로 에칭되지만 코어 층(203)을 통해 에칭되지 않는다. 리브 도파관 구조(300)의 측면의 광 유도는 코어 층(203) 외부로 향하는 감쇠장의 강도를 증가시킨다. 따라서, 슬래브 도파관 구조(200)와 비교하여, 리브 도파관 구조(300)에 획정된 샘플 웰(207)과 오버랩되는 감쇠장의 강도가 증가되어, 샘플(206)과 상호 작용하는 여기 광의 강도를 증가시킨다. 여기 광의 강도를 증가 시키면 더 강한 형광성이 생성된다.
도 6c는 스트립 도파관 구조(400)를 획정하기 위해 도파관 구조의 코어 층(203)을 통해 추가로 에칭된 리지를 구비함으로써 샘플(206) 상으로 지향된 감쇠장의 강도의 추가 향상이 제공되는 다른 변형을 도시한다. 스트립 도파관 구조(400)의 측면의 광 유도는 코어 층(203) 외부로 지향된 감쇠장의 강도를 증가시킨다. 따라서, 슬래브 도파관 구조(200) 및 리브 도파관 구조(300)와 비교하여, 스트립 도파관 구조(300)에 획정된 샘플 웰(207)과 오버랩되는 감쇠장의 강도가 증가되어, 샘플(206)과 상호 작용하는 여기 광의 강도를 증가시킨다. 여기 광의 강도를 증가 시키면 더 강한 형광성이 생성된다.
일반적으로, 리브 도파관은 감소된 측벽 거칠기(sidewall roughness)로 인하여 전파 손실을 감소시킨다. 리브 도파관들은 단일 모드 조건을 위해 도파관 파라미터들(예를 들어, 두께 및 폭과 같은)을 확장한다. 그러나, 빛은 스트립 도파관 내부에 더 단단히 국한되어(confined), 더 가파른 굴곡(bend)과 회전(turn)을 허용하고, 도파관 구조의 풋프린트(footprint)를 줄인다. 또한, 두 도파관들 내부의 유사한 유도 전원에 대해 스트립 도파관은 리브 도파관보다 감쇠장의 더 높은 강도를 갖는다. 또한, 두 도파관들이 모두 단일 모드로 만들어지지 않으면, 주어진 도파관 파라미터에 대해 일반적으로 스트립 도파관은 리브 도파관보다 더 많은 모드들을 지원할 것이다. 이미징 조건들에 따라 슬라브, 리브 또는 스트립 도파관 지오메트리들(geometries)이 사용될 수 있다. 감쇠장에서 보다 높은 전력이 요구되는 경우 리브 도파관을 사용하는 것이 바람직하다(바이오-이미징에 대해 사용되는 가시 파장에 대해 전파 손실이 현저히 증가하므로); 그러나 스트립 도파관은 더 많은 모드들을 지원할 수 있기 때문에, 스트립 도파관은 변동-광-필드-기반 이미징 기술들에 대해 선호된다. 그러나, 슬래브, 리브 또는 스트립 도파관 구조들은 모든 슈퍼-해상도 이미징 기술들에 사용될 수 있다.
슬래브 도파관 구조(200), 리브 도파관 구조(300) 및 스트립 도파관 구조(400)의 폭은 바람직하게는 1 미크론(micron) 내지 100 미크론의 범위이다.
선택적으로, 리브 또는 스트립 도파관 구조는 그 길이를 따라 넓어 져서 상부 클래딩 층(204)에 획정된 샘플 웰(207)의 폭을 증가시킬 수 있다. 도파관 구조의 폭을 증가 시키면 도파관 구조를 따라 전파되는 광학 광 필드의 폭이 넓어지고, 샘플(206)을 유지하기 위한 더 큰 샘플 웰(207)을 허용한다. 보다 넓은 여기 광 필드와 결합된 더 큰 샘플 웰(207)은 유리하게도 서브-해상도 이미징을 위해 보다 큰 샘플 영역이 이미징될 수 있게 한다.
도 5a, 도 5b, 도 5c는 샘플 웰(207)이 리브 도파관 구조(300)의 상부 클래딩 층(204)에 형성되는 세 개의 대안적인 배열들의 각각의 평면도를 예시한다. 도 5a 및 도 5b에서, 리브 도파관 구조(300)의 폭은 단열적으로(adiabatically) 증가되어 더 큰 샘플 영역(207)을 획정하고 도파관 구조를 따라 전파되는 광학 광(optical light) 필드의 폭을 넓힌다. 본 발명자들은 단열적으로 도파관 구조의 폭을 증가시키는 것이 단열 영역(450) 이전의 영역에서 전파되는 광학 광의 광학 모드 프로파일을 유지할 수 있다는 것을 발견했다. 예를 들어, 단열 구조(450)는 단열 구조에 이르는 도파관 구조에서 전파되는 광학 광의 기본 모드 프로파일을 유지한다.
선택적으로, 도 5b의 영역(460)에 도시된 바와 같이, 리브 또는 스트립 도파관 구조의 폭은 샘플 웰(207) 영역 이후에 점점 가늘어질 수 있다.
슬래브 도파관 구조를 포함하는 도파관 구성 요소(1)는 표준 반도체 제조 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 슬래브 도파관 구조는: 먼저 SiO2(202)의 하부 층을 실리콘 기판 상에 스퍼터링(sputtering)하는 단계; SiO2(202)의 하부 층 상에 Ta2O5의 코어 층(203)을 스퍼터링하는 단계; 그리고 이어서 SiO2(204)의 상부 층을 코어 층(203) 상에 스퍼터링하는 단계에 의해 제조될 수 있다. 샘플 층(207)은 포토리소그래피 및 습식-에칭을 사용하여 상부 층(204)에 갭을 획정함으로써 형성될 수 있다.
리브 도파관 구조를 포함하는 도파관 구성 요소(1)는 상부 클래딩 층(204)을 이온-빔 밀링(ion-beam milling)하여 리지를 획정함으로써 제조될 수 있다. 상부 클래딩 층(204)은 바람직하게는 코어 층(203) 위에서 200nm의 깊이로 에칭된다. 이온-빔 밀링은 유리하게 도파관의 측벽 거칠기를 감소시키고 따라서 도파관 구조 내의 광 전파 손실을 감소시킨다.
선택적으로, 도파관 구조 및 샘플 웰(207)은 도파관 구성 요소(1)의 기판(201) 상에 하나로 통제되어(monolithically) 집적될 수 있다.
선택적으로, 도파관 구성 요소(1)는 복수의 도파관 구조들을 포함할 수 있다. 각각의 도파관 구조는 입력 광을 수신하고 샘플 웰(207) 내로 여기 광을 향하게 할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 도파관 구조는 복수의 도파관 구조들을 포함할 수 있고, 각각의 도파관 구조는 입력 광을 수신하고 여기 광을 복수의 도파관 구조들 중 하나 이상으로 향하게 할 수 있다.
샘플(206)을 샘플 웰(207)에 위치시키기 전에, 도파관 구성 요소(1)를 5%(v/v) HellmanexTM(Sigma AldrichTM으로부터)에서 70℃에서 10분간 침지시킴으로써 도파관 요소(1)를 세정할 수 있다. 이어서, HellmanexTM(Sigma AldrichTM으로부터)는, 이를 먼저 탈 이온수(deionized water)에 침지시키고, 두 번째로 이소프로판올(isopropanol)에 침지시키고, 세 번째로 탈 이온수에 침전시킴으로써, 제거될 수 있다.
샘플 웰(207)은 도 3에 도시된 바와 같이 도파관 코어 층(203) 상에 배치된 바이오 층(bio layer)(205)을 포함할 수 있다. 바이오 층은 전도성 코어 층(203)에 대한 샘플 내의 형광단들의 비-특이적 결합(non-specific binding)을 방지하고, BSA 또는 PEG를 포함할 수 있다. 또한, 바이오 층(205)은 샘플 웰(207) 내에서 직접적으로 샘플의 구축(cultivation)을 용이하게 한다. 바이오 층(205)이 바람직하지만 필수는 아니다. 또한, 바이오 층의 두께는 감쇠장이 여전히 샘플 웰(207) 내의 샘플과 오버랩이 보장되도록 선택되며, 전형적으로 20 nm 미만이다.
선택적으로, 샘플들은 예를 들어 유리 커버 슬립(glass coverslips)에 세포 부착을 위해 사용되는 공지된 프로토콜과 같은 표준 프로토콜에 따라 도파관 구성 요소(1)의 샘플 웰(207)에서 직접적으로 준비될 수 있다.
스트립 도파관 구조(400)의 리지(410)의 측벽은 샘플(206)을 유지하기 위한 도크(207)를 획정할 수 있다. 즉, 리지의 측벽은 샘플 웰(207)을 획정할 수 있다. 이 예에서, 샘플(206) 상에 지향되고 샘플 웰(207)과 오버랩되는 것은 리지의 측면에서 코어 층(203) 외부에서 전파되는 감쇠장이다. 리지의 측벽 옆에 샘플 웰을 배치하는 것은 또한 본 개시에 따라 샘플과 상호 작용하는 증가된 강도의 감쇠장으로부터 이익을 얻는다. 즉, 도파관 구조의 측벽은 샘플을 지지할 수 있고, 샘플을 수용하기 위한 샘플 웰(207)을 형성할 수 있다. 도파관 구성 요소는 샘플을 유지하기 위한 다른 구조를 포함할 수 있다.
대안적인 배열에서, 도파관 구조의 단부 면은 샘플(206)을 유지하기 위한 도크(207)를 획정한다. 즉, 도파관 구조의 단부 면은 샘플 웰(207)을 획정할 수 있다. 본 실시 예에서, 도파관 구성 요소(1)를 따라 유도되어 도파관 구성 요소(1)의 단부 면을 빠져 나가는 입력 광은 샘플(206) 상으로 지향된다. 샘플 웰(207)은 도파관 구조를 기판 층까지 또는 기판 층을 통해 종단(terminating)시킴으로써 형성될 수 있다. 전형적으로, 도파관 구조는 도파관 구조를 에칭 또는 쪼갬(cleaving)으로써 종단될 수 있다.
도 7은 단부 면 조명 배열의 예를 도시한다. 도파관 구성 요소(1)는 기판(201) 상에 형성된 다중 코어 도파관 구조 및 도파관 구조의 단부 면(250)에 의해 획정된 샘플 웰(207)을 포함한다. 도파관 구조의 단부 면(250)은 샘플 웰(207)의 벽을 획정하고 샘플(206)이 지지될 수 있는 지지체를 제공한다.
멀티코어 도파관 구조의 층들은 제1 광 유도 층(203a) 및 제2 광 유도 층(203b) (또는 제1 코어 층(203a) 및 제2 코어 층(203b))을 포함한다. 제1 코어 층(203a)은 상부 클래딩 층(204)과 하부 클래딩 층(202) 사이에 샌드위치 된다. 하부 클래딩 층(204)은 기판(201)과 제1 코어 층(203a) 사이에 배열된다. 제2 코어 층(203b)은 상부 클래딩 층(upper cladding layer)(204)과 최상부 클래딩 층(top cladding layer)(214) 사이에 샌드위치 된다. 제1 코어 층(203a)은 상부 클래딩 층(204) 및 하부 클래딩 층(202)보다 높은 굴절률을 갖는다. 제2 코어 층(203b)은 상부 클래딩 층(204) 및 최상부 클래딩 층(214)보다 높은 굴절률을 갖는다.
샘플 웰 및 단부 면은 기판 층(201)까지 다중코어 도파관 구조에서 에칭된 갭에 의해 형성되어 입력 광이 각각의 코어들로부터 도파관 구조 밖으로 그리고 자유 공간으로, 또는 샘플 내로 유도될 수 있다.
슈퍼-해상도 이미징 동안의 제1 시간에서, 액추에이터(12)는 광-주입 디바이스(40)를 제1 광-주입 위치에 위치시킨다. 제1 광-주입 위치에서, 광-주입 디바이스는 입력 광을 도파관 구성 요소(1)에 주입하여 입력 광을 멀티코어 도파관 구조의 제1 코어(203a)를 통해 유도한다. 제1 코어 층(203a)은 샘플 웰(207)의 제1 높이에서 그리고 제1 영역을 통해 주입된 광을 도파관 구조 외부로 지향시킨다.
슈퍼-해상도 이미징 동안의 상기 제1 시간에 후속하는 제2 시간에서, 액추에이터(12)는 광-주입 디바이스(40)를 제2 광-주입 위치에 위치시킨다. 제1 광-주입 위치에서, 광-주입 디바이스는 입력 광을 도파관 구성 요소(1)에 주입하여 입력 광을 멀티코어 도파관 구조의 제2 코어(203b)를 통해 유도한다. 제 2 코어 층(203b)은 샘플 웰(207)의 제2 높이에서 그리고 제2 영역을 통해 주입된 광을 도파관 구조 외부로 지향시킨다. 제2 높이는 제1 코어 영역(203a)에 대한 제2 코어 층(203b)의 위치에 의해 획정된다. 샘플 웰(207)을 통과하는 제1 영역(510)은 여기 광이 지향되지 않는 분리 영역에 의해 제2 영역 (520)으로부터 분리된다.
도파관 구조 외부로 지향된 광은 샘플의 형광단들을 시뮬레이팅하여 형광을 내고 광을 방출한다. 실질적으로 샘플의 제1 영역(510)의 형광단들 만이 제1 코어 층(203a)으로부터 방사되는(emanating) 여기 광에 의해 시뮬레이팅 된다. 유사하게, 샘플의 제2 영역(520)의 형광단들 만이 제2 코어 층(203b)으로부터 방사되는 여기 광에 의해 시뮬레이팅 된다. 샘플(206)에서 여기된 체적(volume)은 본질적으로 도파관 구조의 에지 면(250)으로부터 방사되는 여기 광의 체적으로 국한된다.
방출된 광은 도 2를 참조하여 기술된 바와 같이 슈퍼-해상도 이미징을 제공하도록 수집 및 처리된다. 샘플 웰의 상이한 영역들을 통해 여기 광을 지향시킴으로써, 멀티코어 구조는 유리하게 샘플 웰(207) 내의 샘플(206)의 상이한 영역들이 여기 광으로 자극될 수 있게 한다. 특히, 멀티코어 도파관은 샘플 내의 다른 높이들에 위치된 형광단들을 시뮬레이팅하고, 이 방식으로, 샘플의 상이한 깊이들로부터 광이 방출되는 것을 가능하게 한다. 샘플의 상이한 깊이들에서 방출된 광을 수집하면 상이한 샘플 깊이들에서 슈퍼-해상도 이미징이 가능하다. (여기에서, 높이들, 깊이들, 폭들 등의 참조는, 문맥이 이것을 요구하지 않는 한, 장치가 특정한 배향으로 동작하는 것을 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.)
요약하면, 본 실시 예에서, 단부 면(250) 자체는 샘플 웰(207)의 측벽의 일부이고 샘플(206)에 의해 접촉된다. 예를 들어, 광은 적합한 결합 기술, 예를 들어 단부 면(250)에 대향하는 입사 면 상에 결합될 광을 집중시키는 대물 렌즈를 사용하여 도 6의 좌측으로부터 각각의 도파 층에 결합된다.
샘플(206) 상으로 지향된 여기 광이 도파관 구조의 에지 면(25)으로부터 방사되는 배열에서, 도파관 구조의 상부 클래딩 층(204)은 공기일 수 있다. 즉, 도파관 구조의 층들은 기판(201) 상에 배열된 하부 클래딩 영역(202) 및 하부 클래딩 영역(202) 상에 배열된 코어 영역(203)을 포함할 수 있다.
비록 도 7에 도시되지는 않았지만, 샘플 웰 내의 샘플(206)은, 단부 면(250)과 접촉하는 것 보다는, 도파관 구조의 단부 면(250)과 접촉하지 않게 배열될 수 있다. 이러한 배열에서, 여기 광은 자유 공간에서 단부 면(250)으로부터 샘플(206)로 전파된다.
선택적으로, 이 배열의 샘플 웰(207)은 기판(201)의 상부의 웰의 바닥에 증착된 바이오 층(205)을 포함할 수 있다. 바이오-층(205)은 기판 층(201)에 대한 샘플 내의 형광단들의 비-특이적 결합을 방지하고 BSA, PEG 또는 PLL을 포함할 수 있다. 또한, 바이오-층은 샘플 웰(207) 내에서 직접적으로 샘플의 구축을 용이하게 한다. 바이오 층(205)이 바람직하지만 필수는 아니다.
선택적으로, 도파관 구조의 에지 면(edge facet)(250)은 평면이다.
도파관 구조의 에지 면(250)으로부터 방사되는 여기 광은 약간 발산될 수 있다. 여기 광의 발산(divergence)은 에지 면(250)에서의 도파관 구조의 폭에 의존한다. 도파관 구조의 단부 면으로부터 외부로 지향된 여기 광의 발산을 감소시키기 위해, 도파관 구조의 폭은 그 길이를 따라 가늘어져서 여기 광을 집중시키기 위한 렌즈를 형성할 수 있다.
도 8a는 폭이 그 길이를 따라 가늘어져 가늘어진 단부 면(650)을 형성하는 스트립 도파관 구조(400)를 도시한다. 선택적으로, 도파관의 높이는 또한 2 차원으로 가늘어진 단부 면을 획정하기 위해 그 길이를 따라 가늘어질 수 있다. 본 발명자들은 도파관 영역의 단부 면(650)을 가늘어지게 하여 적어도 하나의 치수의 액시콘 렌즈(axicon lens)를 획정하는 것이 특히 도파관 구조 외부로 샘플(206) 상으로 향하는 광의 발산을 감소 시키는데 유리하다는 것을 발견하였다(즉, 여기 광). 가늘어진 팁(tip)(650)으로서 도파관 구조의 단부 영역을 형성하는 것은 빔 형성을 위한 액시콘 렌즈를 생성한다. 액시콘 렌즈는 도파관 구조를 통한 입력 광의 전파 방향을 따라 라인 포커스(line focus)를 제공한다.
도파관 구조의 폭은 적절한 마스크에 따라 렌즈를 형성하기 위해 도파관의 단부 면을 형상화하기 위한 이온 빔 밀링 또는 다른 적절한 에칭 기술을 사용하여 점점 가늘어질 수 있다. 선택적으로, 도파관 구조의 폭은 렌즈를 형성하기 위해 도파관의 단부 면을 형상화하기 위한 재-성장 및 선택-성장 또는 임의의 다른 적절한 에피택셜 기술(epitaxial technique)을 사용하여 점점 가늘어질 수 있다. 도파관 구조의 높이는 또한 적절한 에칭 프로세스를 사용하여 점점 가늘어질 수 있다(예를 들어, 포인트로).
부가적으로 또는 대안적으로, 도파관 구조의 단부 면에서 지향된 여기 광의 발산을 감소시키기 위해 도파관 구조의 단부 면에서 집광을 위해 격자(grating)(660)가 제공될 수 있다.
도 8b는 스트립 도파관 구조의 단부 면에 배열된 격자(660)를 도시한다. 본 실시 예에서, 격자(660)는 여기 광을 오버랩하고, 여기 광의 발산을 감소시키고 여기 광을 샘플(206) 상에 집중 시키도록 여기 광을 안쪽으로 반사시킨다. 격자(660)는 표준 에칭 기술을 사용하여 도파관 구조의 하나 이상의 층으로 및/또는 기판으로 에칭될 수 있다.
도파관 구조의 단부 영역은 기판 층(201)에 수직이고 대물 렌즈(4)의 광학 축(3)과 평행 한 평면에서 도파관 구조로부터 방사되는 여기 광을 편향시키기 위해 정적인 또는 프로그램 가능한 음향 격자(acoustic grating)(660)를 획정할 수 있다. 결과적으로, 도파관 구조로부터 방사되는 여기 광의 빔의 높이는 프로그램 가능한 음향 격자(660)를 조정함으로써 제어될 수 있다.
당업자는 본 발명이 그의 몇몇의 특정 실시 예들을 설명함으로써 예시되었지만, 이들 실시 예들에 제한되지 않음을 이해할 것이다. 첨부된 청구항의 범위 내에서 많은 변형 및 수정이 가능하다.
본원에 포함된 선행 기술에 대한 모든 참조는 그러한 기술이 세계 어느 나라에서나 일반적인 지식의 일부를 구성한다는 인정을 의미하지는 않는다. 용어 "포함한다(comprise)," 및 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시적인 언어 또는 필요한 의미로 인해 문맥이 다른 것을 요구하는 경우를 제외하고 포괄적 또는 개방적 의미로 사용된다(즉, 추가 특징들의 존재 또는 추가를 배제하지 않도록).

Claims (48)

  1. 샘플의 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미징(super-resolution fluorescence-microscopy imaging)을 위한 장치에 있어서,
    전방 관측 시야(forward field of view)를 갖는 대물 렌즈(objective lens)로서, 상기 전방 관측 시야 내에 있는 상기 샘플로부터 방사되는(emanating) 광을 수집하도록 배열된, 상기 대물 렌즈;
    상기 수집된 광으로 상기 샘플의 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미징을 수행하도록 배열된 처리 장치(processing arrangement);
    상기 대물 렌즈의 전방에 위치되고, (i) 상기 전방 관측 시야 외부로부터 입력 광(input light)을 수신하고, (ii) 상기 샘플 상에 여기 광(excitation light)을 지향시키기 위해 도파관 구성 요소(waveguide component) 내의 전반사를 사용하도록 배열된 상기 도파관 구성 요소; 및
    전자 광-경로 제어 시스템(electronic optical-path control system)으로서,
    제1 여기 패턴으로 상기 샘플을 조명하도록, 제1 파장의 입력 광이, 제1 시간에서, 상기 도파관 구성 요소 내의 제1 광학 모드(optical mode)에 대응되는 제1 광 경로(optical path)를 따르게 하고;
    상기 제1 여기 패턴과 상이한 제2 여기 패턴으로 상기 샘플을 조명하도록, 상기 제1 파장의 입력 광이, 제2 시간에서, 상기 도파관 구성 요소 내의 제2 광학 모드에 대응되는 제2 광 경로를 따르게 하도록 배열된, 상기 전자 광-경로 제어 시스템을 포함하고,
    상기 제2 시간은 상기 제1 시간과 상이하고, 상기 제2 광학 모드는 상기 제1 광학 모드와 상이한,
    장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 시간 및 상기 제2 시간은 상기 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미징의 제1 프레임에 대한 노광 기간(exposure period) 내에 있으며, 이에 의해 상기 장치는 상기 제1 프레임 동안 상기 제1 여기 패턴에 의해서만 제공되는 것보다 균일한 상기 샘플의 평균 여기를 제공하도록 구성되는
    장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 시간은 상기 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미징의 제1 프레임에 대한 노광 기간 내에 있고, 상기 제2 시간은, 상기 제1 프레임과 다른, 상기 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미징의 제2 프레임에 대한 노광 기간 내에 있는,
    장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도파관 구성 요소로 입력 광을 주입하도록 배열된 광 주입 장치(light injecting device)를 더 포함하고, 상기 전자 광-경로 제어 시스템은 상기 제1 시간과 상기 제2 시간 사이에 상기 입력 광이 상기 도파관 구성 요소로 들어가는 위치 또는 각도를 변화시키도록 상기 도파관 구성 요소에 대해 상기 광 주입 장치를 움직이도록 배열된 액추에이터(actuator)를 포함하는,
    장치.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전자 광-경로 제어 시스템은 상기 제1 시간에서 제1 값 및 상기 제2 시간에서, 상기 제1 값과 다른, 제2 값을 갖도록 상기 입력 광의 편광(polarisation) 또는 위상(phase)을 변화시키는 장치를 포함하는,
    장치.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미징은 단일-분자 위치 측정 방법(single-molecule localization method)을 포함하는,
    장치.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미징은 변동-광-필드-기반 슈퍼-해상도 방법(fluctuating-light-field-based super-resolution method)을 포함하는,
    장치.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도파관 구성 요소는 리브(rib) 또는 스트립(strip) 도파관 구조를 포함하는
    장치.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도파관 구성 요소는 제1 코어 영역 및 상기 제1 코어 영역과 접촉하는 제1 클래딩 영역(cladding region)을 포함하고, 상기 제1 코어 영역은 상기 제1 클래딩 영역보다 높은 굴절률을 갖고, 하나 이상의 광 경로들을 따라 상기 도파관 구성 요소를 통해 광을 유도하도록 배열되며, 상기 제1 클래딩 영역은 상기 샘플을 유지하기 위한 샘플 웰(sample well)을 획정하도록 형상화되는,
    장치.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도파관 구성 요소는 기판 상에 하나로 통제되어(monolithically) 집적된 도파관 구조를 포함하는,
    장치.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도파관 구성 요소는 제1 코어 영역을 포함하고, 상기 제1 및 제2 광 경로는 상기 제1 코어 영역 내의 상이한 경로인
    장치.
  12. 대물 렌즈의 전방 관측 시야 내에 적어도 부분적으로 위치된 샘플의 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미징을 수행하는 방법에 있어서,
    상기 전방 관측 시야 외부로부터 상기 대물 렌즈의 전방에 위치된 도파관 구성 요소로 입력 광을 수신하는 단계;
    제1 여기 패턴으로 상기 샘플을 조명하도록, 제1 파장의 입력 광을, 제1 시간에서, 상기 도파관 구성 요소 내의 제1 광학 모드에 대응되는 제1 광 경로를 따르도록 지향시키는 단계;
    상기 제1 여기 패턴과 상이한 제2 여기 패턴으로 상기 샘플을 조명하도록, 상기 제1 파장의 입력 광을, 제2 시간에서, 상기 도파관 구성 요소 내의 제2 광학 모드에 대응되는 제2 광 경로를 따르도록 지향시키는 단계로서, 상기 제2 시간은 상기 제1 시간과 상이하며 상기 제2 광학 모드는 상기 제1 광학 모드와 상이한, 상기 제2 시간에서 상기 입력 광을 지향시키는 단계;
    상기 샘플 상에 여기 광을 지향시키기 위해 상기 도파관 구성 요소 내의 전반사를 이용하는 단계;
    상기 대물 렌즈로 상기 샘플로부터 형광을 수집하는 단계; 및
    상기 수집된 형광으로 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미지를 생성하는 단계를 포함하는,
    방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제1 시간 및 상기 제2 시간은 상기 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미지의 제1 프레임에 대한 노광 기간 내에 있으며, 이에 의해 상기 제1 및 제2 여기 패턴은 상기 제1 프레임 동안 상기 제1 여기 패턴에 의해서만 제공되는 것보다 균일한 상기 샘플의 평균 여기를 제공하는
    방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 제1 시간은 상기 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미지의 제1 프레임에 대한 노광 기간 내에 있고, 상기 제2 시간은 상기 제1 프레임과는 상이한 상기 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미지의 제2 프레임에 대한 노광 기간 내에 있는,
    방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    단일-분자 위치 인식 방법을 사용하여 상기 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미지를 생성하는 단계를 포함하는,
    방법.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    변동-광-필드-기반 슈퍼-해상도 방법을 사용하여 상기 슈퍼-해상도 형광 현미경 검사 이미지를 생성하는 단계를 포함하는,
    방법.
  17. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도파관 구성 요소의 리브 또는 스트립 도파관 구조를 따라 상기 제1 파장의 입력 광을 지향시키는 단계를 포함하는,
    방법.
  18. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도파관 구성 요소로부터 여기 광을 상기 샘플 상으로 지향시키는 단계는 감쇠장으로 구성된 여기 광만을 상기 샘플 상으로 지향시키는 단계를 포함하는,
    방법.
  19. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도파관 구성 요소에 획정된 샘플 웰 내에 상기 샘플을 유지하는 단계를 더 포함하는,
    방법.
  20. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도파관 구성 요소로부터 여기 광을 상기 샘플 상으로 지향시키는 단계는 상기 도파관 구성 요소의 에지 면으로부터 여기 광을 상기 샘플 상으로 지향시키는 단계를 포함하는,
    방법.
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