JP4671503B2

JP4671503B2 - デンドリマーフラーレン誘導体、その調製方法、および神経保護剤としての使用

Info

Publication number: JP4671503B2
Application number: JP2000533153A
Authority: JP
Inventors: ヒルシュ，アンドレアス
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 1998-02-25
Filing date: 1999-01-23
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2019-01-23
Also published as: JP2002504525A; DK1056475T3; ATE238814T1; ES2200499T3; EP1056475A1; DE19807979A1; DE59905324D1; WO1999043358A1; EP1056475B1; DE19807979C2; US6506928B1

Description

【０００１】
本発明はデンドリマーフラーレン誘導体、すなわち１つまたはそれ以上のデンドロンで置換されているフラーレン誘導体に関する。フラーレンは式Ｃ_2(10+m)（ｍは自然数）の炭素化合物である。これらは、炭素原子の五員環を１２および六員環を所望の数（すなわちｍ、ｍは少なくとも２である）含む。
【０００２】
フラーレンのアーチ状外表面およびそれにより生じるπ電子の配列は、フリーラジカルに対する高い反応性をもたらす（参考文献１；明細書の最後に参考文献を列挙する）。このように、Ｃ₆₀バックミンスターフラーレンは非常に容易にラジカルを付加することが知られている。最高３４のメチルラジカルの吸収が記載されており、したがってこれを“ラジカルスポンジ”（radical sponge）と名付けることが提案されている（後記参考文献１）。
【０００３】
生体系内のヒドロキシルおよびヒドロペルオキシドラジカルは、多不飽和脂肪酸を好んで攻撃することが知られている。この攻撃は、脂肪酸構造の架橋および重合を引き起こす。したがってフリーラジカルは、生体膜、とくに神経細胞膜の傷害も引き起こす。この神経細胞膜は、その脂質中の不飽和脂肪酸の割合がとくに高いという特徴を有する。このような生体膜の脂質構造に変化が生じる結果、膜透過性の変化、膜輸送機能の変化、膜のバリアー機序（barrier mechanisms）の変化および膜の受容体活性の変化が起こることがあり、これにより神経細胞が死に至る可能性がある。同様に、グルタミン酸受容体の過刺激は酸素のフリーラジカルおよび酸化窒素のフリーラジカルを生成し（後記参考文献２〜６）、その結果神経細胞に傷害を与え、特殊な症候群を発生させる（後記参考文献７〜１０）。
【０００４】
ラジカル補足剤は有害なフリーラジカルを除去し、抗酸化剤として作用し、神経細胞の傷害および神経膜（neuromembranes）の機能損失（loss of function）を抑制する。したがって、優れたラジカル補足性を備えるフラーレンはとくに、おそらく神経保護剤として作用し、酸化的変化に対する生体膜の保護に用いることができると考えられる。しかしながら、Ｃ₆₀フラーレンを溶解する有機溶媒は非常に少なく（ベンゼンおよびトルエンなど）、したがってこれを生体膜に投与することもできない。しかし、Ｃ₆₀に好適な官能基を付加すると水溶性が向上し、その結果生体系内での抗酸化剤として用いることが可能になると考えられる。最初の肯定的な結果はポリヒドロキシル化Ｃ₆₀を用いて達成され（後記参考文献１１）、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方で神経保護活性を示した三置換合成マロン酸誘導体Ｃ₆₀［Ｃ（ＣＯＯＨ）₂］₃により、より良い結果が得られている（後記参考文献１２）。参考文献１２に記載されているＣ₃またはＤ₃対称を有する２つの異性体の調製は、マロン酸ジエチルを用いてＣ₆₀を３回シクロプロパン化し、加水分解し、続いてクロマトグラフィーによる精製を行うＨｉｒｓｃｈ法（後記参考文献１３）により実施された。その２つの被験化合物は、ＥＰＲ分光法により示すことができたように、フリーラジカルに対し強い親和性を示し、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）への暴露、α−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）への暴露または酸素／グルコースの停止により誘発される皮質ニューロンの細胞培養の興奮毒性細胞死を阻害した。Ｃ₃対称性誘導体はさらに、血清の停止またはＡ^β１−４２タンパクへの暴露により誘発される、アポトーシスによる神経細胞死を減少させた。すべての場合において、Ｃ₃位置異性体はＤ₃異性体より優れた効果を示した。これは、極性が大きいので、脂質膜透過性能が向上するためと考えることができる（後記参考文献１２）。
【０００５】
ポリヒドロキシ置換フラーレンに比べ、マロン酸誘導体はラジカル補足剤として高い活性を示した。これは、付加の度合いが小さく、この結果、向上した水溶性を同時に伴う比較的大きな反応性表面の供給が多くなるためであった。
【０００６】
さらに、ポリ（ベンジルエーテル）デンドロンと結合したフラーレンが、後記参考文献１７により知られている。しかしながら、これらのフラーレン誘導体は水に溶解しない。同様に、水に不溶のデンドリマーフラーレンが、後記参考文献１９に開示されている。
【０００７】
この従来技術に対し、本発明の目的は、フラーレンまたはフラーレン誘導体の水溶性をさらに向上させると同時に、現在までに知られている場合のようにＣ₆₀の反応性表面を縮小または遮蔽することなく、その結果ラジカル補足性を低下させないことであった。
【０００８】
この目的は、本発明に従い、フラーレンが少なくとも１つのデンドロンに結合しているデンドリマーフラーレン誘導体であって、そのデンドロンまたは各デンドロンが、水溶性を付与するプロトン性基（protic group）を少なくとも１つ有するデンドリマーフラーレン誘導体により達成される。
【０００９】
好適なプロトン性基は当業者に知られている親水基であり、好ましくは−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＯ₃Ｈ、−ＰＯ₃Ｈ、ＮＲ₄ ⁺、−ＮＨＯＨまたは−ＳＯ₂ＮＨ₂である。ここで、４つのラジカルＲは互いに独立しており、各場合において同一または異なり、−Ｈ、アルキルまたはアリールであってよい。−ＯＨ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ₂がとくに好ましい。−ＣＯＨ基を用いることもできる。
【００１０】
本発明によるフラーレン誘導体の２５℃、ｐＨ７での水溶性は１ｍｇ／ｍｌを超え、好ましくは５ｍｇ／ｍｌを超え、とくに好ましくは１０ｇ／ｌを超え、よりいっそう好ましくは２０ｍｇ／ｍｌを超えていてもよい。２５℃、ｐＨ１０での水溶性は１０ｍｇ／ｍｌを超え、好ましくは５０ｍｇ／ｍｌを超え、とくに好ましくは１００ｇ／ｌを超え、よりいっそう好ましくは２００ｍｇ／ｍｌを超えていてもよい。
【００１１】
本発明の意味におけるデンドロンは、構造ユニットとして末端に分岐部位（branching）を有する、Ｃ₆₀コアユニットの付加物である。さらに、各場合において、他の末端に同様に枝分かれがある同一または他のサブユニットが、これに結合することができる。したがって、分岐度によって、もっとも近接する分岐部位の数と、末端の官能基（水溶性）の数も、結果的に２倍、３倍または何倍にもなる。デンドロンの結合の繰り返しにより形成される放射状に対称な各“殻”は、次の世代とよばれる。ラジカルに対しより反応性の高い表面を利用できるようにするためには、水溶性に必要なデンドロンをＣ₆₀コアからできるだけ離れた位置に維持し、Ｃ₆₀コアが“被覆”されるのを防止することが有効と思われる。このことは、第１世代のデンドロンをいわゆる“スペーサー”（spacer）（長さがＣ₁〜約Ｃ₁₀₀、好ましくはＣ₂〜Ｃ₁₀の炭素鎖）を介して結合することにより可能になり、この炭素鎖は第１世代の“セパレーター”（separator）として働く。
【００１２】
好適な分岐部位はとくに三価または多価の元素で、例えばＮ−、Ｃ−、Ｐ−、Ｓｉまたは多価分子セグメント（アリール、ヘテロアリールなど）などである。分岐度は好ましくは２〜３であり、世代数は１以上１０以下であってよい。
【００１３】
本発明に従った目的は、従属請求項により好ましく解決する。従属請求項に開示する個々の特徴または多くの特徴は、各場合において、それ自体でまたは組み合わせて、基本的な目的の解決方法を示すこともでき、個々の特徴を請求項のカテゴリー内で所望により組み合わせることもできる。
【００１４】
上記でさらに述べた例に比べ、フラーレンのモノ付加物（monoadducts）は、その水溶性が十分に高い場合、改良点と考えられる。フラーレンの付加の度合いが小さいほど、フリーな反応性表面（free reactive surface）は大きくなり、この表面がラジカル補足性をもたらすようである。しかし、このようなモノ付加物は、親水基の数が相応して減少するため、ポリ付加物に比べ水溶性が劣ると思われる。この矛盾点は、本発明に従ったフラーレンにより解決される。これは、このフラーレンは、さらに外側により高い世代の分岐部位があるので、水溶性もまた所望により高くなっているためである。
【００１５】
好ましい化合物を式１（スキーム１）に示す。これは、Ｃ₆₀−フラーレンのデンドリマー−分岐誘導体に関する。このタイプの一置換デンドリマーは有利であり、末端に好適な官能基を選択すると、付加の度合いに関係なく優れた水溶性を維持する。溶解性に寄与するデンドリマー最外殻の官能基の数はさらに、分岐度およびデンドロンの世代数（上項参照）により特定される。個々の分子エステルの分岐部位の元素は、とりわけ好ましくはγ−アミノトリスカルボン酸（式１に示すタイプ）、α−アミノジカルボン酸、α−ω−ジアミノカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、酒石酸誘導体、ポリフェノール、ペントースおよびヘキソース型の炭水化物成分、グリセロール誘導体ならびに一般的な多官能化合物であってよい。さらに、個々のデンドリマーの枝部位（branches）または個々の世代の連続的な結合は、酸アミド化合物、ペプチド化合物、エステル結合、アミノ酸およびヒドロキシ酸のさまざまな酸アミドまたはエステル結合の性質に従ったデプシペプチド様結合、グリセリド様結合およびポリエステルまたはポリエーテル、ポリフェニルエーテルならびにグリコシドに対応する。遮蔽による、フリーなフラーレン表面の有害作用が、第３世代のデンドリマー殻の場合にのみ予想される。しかしこの遮蔽は、小さなフリーラジカルを容易に透過させるため、必ずしも抗酸化活性を低下させなくてもよい。炭素原子数が２〜６の好適な長さのスペーサー鎖を選択することにより、さらにフラーレン表面の有用性を変化させるか、または確実にすることができる。個々の枝部位に脂肪酸の長鎖を用いるとさらに、二分子膜内の脂質の脂肪酸鎖に対する親和性をもたらすことができるので、神経膜のインターカレーションを改善し、ラジカル補足性を改良することができる。
【００１６】
【化１】

【００１７】
標的化合物の調製は、収束合成（convergent synthesis）、すなわち相応するデンドリマーの枝部位を別個に第１、第２、第３または第ｎ世代まで合成し、最後に好適な結合反応（例えばシクロプロパン化、ディールス−アルダー反応、［３＋２］付加環化など）によりＣ₆₀フラーレンと結合させることにより行われる。スキーム２に従った第１世代のデンドリマーフラーレンの合成（調製例８参照）では、Ｏ−ベンジルで保護したγ−ヒドロキシ酪酸２を、カルボキシで保護したγ−アミノトリスカルボン酸［ベヘラアミン（Behera amine）、ジ−ｔ−ブチル４−アミノ−４−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニルエチル）ヘプタンジオエート３（後記参考文献１４、１５、１８）］と、縮合剤および活性化剤（例えばジシクロヘキシルカルボジイミド［ＤＣＤ］、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール［１−ＯＨ−ＢＴ］、他のカルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシ化合物など）を用いた反応により縮合する。ここで得られる酸アミド［ジ−ｔ−ブチル４−（４−ベンジルオキシブチリルアミノ）−４−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニルエチル）ヘプタンジオエート４］は、水素化分解または特別な穏やかな加水分解により脱保護することができ、この過程でカルボキシル官能基の保護基に影響を与えることなく、遊離したヒドロキシ酸アミド［ジ−ｔ−ブチル４−（４−ヒドロキシブチリルアミノ）−４−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニルエチル）ヘプタンジオエート５］を得ることができる。二塩化マロニル（malonyl dichloride）およびピリジンまたは他の窒素塩基を用いた化合物５の後の反応により、第１世代のデンドロン６［カスケードポリマーの命名：６−カスケード：メタン［２］：（２−アザ−７−オキサ−３，８−ジオキソオクチリジン）：ｔｅｒｔ−ブチルプロパノエート］が生成する。これは、アミド様デンドロン結合ならびに、分岐ユニットとマロン酸エステル残基との間の長さＣ₄のスペーサー鎖を有する、マロン酸ジアルキルエステルである。相応する他のベンジルで保護したω−ヒドロキシカルボン酸２（例えば３−ヒドロキシプロピオン酸、５−ヒドロキシ吉草酸または６−ヒドロキシヘキサン酸など）を選択することにより、スペーサー鎖を所望のように短縮または延長することもできる。この後、われわれが記載した方法に従い（後記参考文献１６）、Ｃ₆₀をＣＢｒ₄およびＤＢＵ／塩化メチレンの存在下でシントン６を用いてシクロプロパン化することができる。得られるデンドリマーフラーレン［６−カスケード：メタノ−Ｃ₆₀−フラーレン［２］：（２−アザ−７−オキサ−３，８−ジオキソオクチリジン）：ｔｅｒｔ−ブチルプロパノエート７］のｔｅｒｔ−ブチル保護基は、好ましくはギ酸を用いて、加水分解により容易に除去することができ、その結果、神経保護剤として用いることができる水溶性ポリカルボキシ官能化（polycarboxyfunctionalized）デンドリマーフラーレン８が得られる。［６−カスケード：メタノ−Ｃ₆₀−フラーレン［２］：（２−アザ−７−オキサ−３，８−ジオキソオクチリジン）：プロパン酸］
【００１８】
【化２】

【００１９】
第２世代のデンドリマーフラーレン１［１８−カスケード：メタノ−Ｃ₆₀−フラーレン［２］：（２−アザ−７−オキサ−３，８−ジオキソオクチリジン）：（２−アザ−３−オキソペンチリジン）：プロパン酸］（調製例１参照）を、スキーム２に示す第１世代の誘導体８の合成と類似の方法で調製した（スキーム３）。第１世代の場合と同様に、ｔｅｒｔ−ブチルで保護したγ−アミノトリスカルボン酸３を、ｔｅｒｔ−ブチルエステルが化合物３の合成前駆体となる（１５、１６）適切なニトロトリスカルボン酸９と１ＨＯ−ＢＴの存在下でＤＣＣを用いて反応させ、続いて水素を用いて第２世代のデンドロン１０［９−カスケード：アミノメタン［３］：（２−アザ−３−オキソペンチリジン）：ｔｅｒｔ−ブチルプロパノエート］に還元する。化合物８の調製と類似の反応により、スペーサー２との結合、相応するマロン酸ジエステルの生成およびシクロプロパン化が起こり、カルボキシルで保護したデンドリマーフラーレン誘導体が得られる。類似の方法で保護基を除去すると、第２世代のデンドリマーフラーレン１が得られる。後者は、すでに水（ｐＨ＞７）、ＭｅＯＨおよび他の極性溶媒中で非常に容易に溶解する。前記化合物の２５℃、ｐＨ７の水に対する溶解性を測定した結果、約３４ｍｇ／ｍｌであった。ｐＨ１０での溶解性は約２５０ｍｇ／ｍｌであった。
【００２０】
【化３】

【００２１】
アミノ誘導体１０とニトロトリスカルボン酸９との間での第３の縮合反応により、第３世代のデンドロン１１［２７−カスケード：アミノメタン［３］：（２−アザ−３−オキソペンチリジン）²：ｔｅｒｔ−ブチルプロパノエート］が得られる。これもまた、スペーサーを延長することにより、第３世代のシクロプロパン化試薬１２に転化することができる。前記条件下でフラーレンＣ₆₀に付加すると、Ｃ₆₀をコアユニットとする第３世代のデンドリマー１３が得られる。ｔｅｒｔ−ブチル基を脱保護すると、第３世代の水溶性デンドリマーフラーレン［５４−カスケード：メタノフラーレン［２］：（２−アザ−７−オキサ−３，８−ジオキソオクチリジン）：（２−アザ−３−オキソペンチリジン）²：プロパン酸１４］（スキーム４）が同様に得られる。これはおそらく特徴的なラジカル補足性を示し、膜保護性および神経保護性を有すると考えられる。
【００２２】
【化４】

【００２３】
調製例：
物質の数字はスキーム２に基づき、インデックスａは第２世代の適切な化合物を示す。
９−カスケード：［Ｎ−（４−ベンジルオキシブチリル）アミノメタン］［３］：（２−アザ−３−オキソペンチリジン）：ｔｅｒｔ−ブチルプロパノエート４ａ
４．５８ｇのアミノカルボン酸エステル１０［９−カスケード：アミノメタン［３］：（２−アザ−３−オキソペンチリジン）：ｔｅｒｔ−ブチルプロパノエート１０］、６１８ｍｇの４−ベンジルオキシ酪酸２、６５６ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド［ＤＣＣ］および４３０ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール［１−ＨＯ−ＢＴ］を５０ｍｌのＤＭＦに溶解し、この溶液を室温で２４時間撹拌する。減圧下で溶媒を除去した後、残渣を酢酸エチルで抽出し、冷却した１０％塩酸、水、１０％ＮａＨＣＯ₃溶液および濃ＮａＣｌ溶液で洗浄する。ＭｇＳＯ₄上で乾燥した後、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、ヘキサン／酢酸エチル１：１）により精製する。３．０７ｇの白色粉末（６０％）４ａが得られる。
９−カスケード：［Ｎ−（４−ヒドロキシブチリル）アミノメタン］［３］：（２−アザ−３−オキソペンチリジン）：ｔｅｒｔ−ブチルプロパノエート５ａ
２．９７ｇの化合物４ａを１００ｍｌのエタノールに溶解し、この溶液を１００ｍｇのパラジウム／炭素（１０％）で処理する。反応混合物を室温、常圧で水素化し、触媒を濾過により除去した後、減圧下で濃縮すると、２．６６ｇ（９５％）の白色粉末５ａが得られる。
１８−カスケード：メタン［２］：（２−アザ−７−オキサ−３，８−ジオキソオクチリジン）：（２−アザ−３−オキソペンチリジン）：ｔｅｒｔ−ブチルプロパノエート６ａ
１．６ｇの化合物５ａおよび８３ｍｇの無水ピリジンを、保護ガスとしての窒素雰囲気下で５０ｍｌの塩化メチレンに溶解し、撹拌し、０℃に冷却する。７３ｍｇの二塩化マロニルを徐々に加え、この混合物を０℃でさらに２時間および室温で１２時間撹拌する。その後、これを５０ｍｌの塩化メチレンで処理し、水で洗浄する。ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、シクロヘキサン／酢酸エチル）により精製した後、４２５ｍｇ（２６％）の生成物６ａが得られる。
１８−カスケード：メタノ−Ｃ ₆₀ −フラーレン［２］：（２−アザ−７−オキサ−３，８−ジオキソオクチリジン）：（２−アザ−３−オキソペンチリジン）：ｔｅｒｔ−ブチルプロパノエート７ａ
４２５ｍｇの化合物６ａ、９８ｍｇのＣ₆₀、４５ｍｇのＣＢｒ₄および２３ｍｇのＤＢＵを、窒素雰囲気下で１００ｍｌの無水トルエンに溶解する。この混合物を室温で２２時間撹拌した後、溶媒を減圧下で分離し、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製する。このとき、最初に未反応Ｃ₆₀をトルエンを用いて溶出し、その後生成物の混合物をトルエン／酢酸エチル（１：１）を用いて溶出する。これをＨＰＬＣを用いてさらに精製する。１１０ｍｇ（２１％）の褐色粉末７ａが得られる。
１８−カスケード：メタノ−Ｃ ₆₀ −フラーレン［２］：（２−アザ−７−オキサ−３，８−ジオキソオクチリジン）：（２−アザ−３−オキソペンチリジン）：プロパン酸１
１００ｍｇの化合物７ａを１５ｍｌのギ酸に溶解し、室温で撹拌する。反応は２０時間後に完了する。ギ酸をオイルポンプ減圧（oil-pump vacuum）により除去した後、７０ｍｇ（９５％）の赤褐色粉末１が得られる。
【００２４】
化合物１の分光データ：
【００２５】
【化５】

【００２６】
参考文献：
【００２７】
【化６】

【００２８】
【化７】

Claims

下記の化学式；

からなる化合物である、デンドリマーフラーレン誘導体。
２５℃、ｐＨ７における水溶性が１ｍｇ／ｍｌを超える、請求項１に記載のフラーレン誘導体。
第１段階でデンドロンを調製することと、第２段階でこれを付加物を介してフラーレンに結合することを含む、請求項１に記載の化合物の調製方法。
デンドロンを収束合成により調製する、請求項３に記載の方法。
請求項１に記載の化合物を含む治療を目的とする薬品。
請求項１に記載の化合物を含む神経保護剤としての薬品。
治療を施す有機体にフリーラジカルが有害作用を及ぼす疾病の治療用医薬品を製造するための、請求項１に記載のフラーレン誘導体の使用。