JP4542336B2 - ベンゼン環上にアミノ基を有するβ−ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体 - Google Patents

ベンゼン環上にアミノ基を有するβ−ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体 Download PDF

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Description

本発明はL-グルタミン酸取り込み阻害に関し、さらに詳細にはL-グルタミン酸トランスポーターのグルタミン酸取り込み活性の抑制作用を有する下記式(1)で表される光学活性L-スレオ-β-ベンジルオキシアスパラギン酸のベンゼン環上にアミノ置換基を有する誘導体：
Figure 0004542336
[式中、Ｒは水素、アシル基部分が置換されてもよい直鎖または分岐低級脂肪族アシル基、環状脂肪族アシル基、芳香環上に置換基を有してもよい芳香族アシル基、アミノ酸類由来の基、ビオチン誘導体由来の基である]に関する。
本化合物の開発は、L-グルタミン酸トランスポーターのグルタミン酸取り込み阻害剤の開発への糸口を提供するものであり、てんかん、ハンチントン氏病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病などの神経障害、神経変異症等の治療への展開が期待できる。
L-グルタミン酸はほ乳動物の中枢神経系における興奮性神経刺激の伝達物質であり、シナプス間での素早い神経伝達を引き起こすだけではなく、高次で複雑な生理的過程である記憶や学習にも関与していることが知られている。シナプス間での興奮性の神経伝達は、プレシナプスからのグルタミン酸の放出に始まり、神経末端やグリア細胞に存在する高親和性のグルタミン酸トランスポーターによるシナプス間隙からの素早いグルタミン酸の取り込みにより終焉する。(Attwell, D. and Nicholls, D., TIPS 68-74, 1991)
いくつかの遺伝的な神経変性疾患においては、患者の脳の一部にナトリウム依存性グルタミン酸取り込み活性の低下が報告されている(Rothstein, J. D. et al., N. Eng. J. Med 326, 1464-1468, 1992)。このため、グルタミン酸トランスポーターの機能の発現と阻害がこれらの疾患との関連で注目されている。
研究初期段階では、グルタミン酸トランスポーターの研究は主に脳から調製したシナプトゾームや、腎や小腸から得た膜標本を用いて行われてきた。その後、1992年にナトリウム依存性高親和性グルタミン酸トランスポーターのcDNAがクローニングされてからは、分子生物学的にも研究がなされるようになってきた。(Pines, G. et al., Nature 360, 464-467, 1992; Storck, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10955-10959, 1992; Kanai, Y. et al., Nature 360, 467-471, 1992)。さらに1994年にはヒトのグルタミン酸トランスポーター遺伝子もクローニングされ、EAAT1-5のサブタイプに分類されている(Arriza, J. L. et al., J. Neurosci. 14, 5559-5569; Fairman, W. A. et al., nature, 375, 599-603, 1995; Arriza, J. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4155-4160, 1997)。
しかしながら、グルタミン酸トランスポーター蛋白は他の神経伝達物質トランスポーターとの相同性が低く、また脂溶性に基づく膜貫通部分の推測も困難であることから、３次元構造や基質認識部位の構造は未だ議論されているところである。(Grunewald, M. et al., Neuron 21, 623-632, 1998; , Seal, R. P. et al., Neuron 25, 695-706, 2000)
このような状況に鑑み、グルタミン酸トランスポーターとてんかん・ハンチントン氏病・筋萎縮性側索硬化症(ALS)・アルツハイマー病などの神経障害などの神経変性疾患との関連の究明のためには、種々のグルタミン酸トランスポーター阻害剤、とりわけブロッカーとして作用する阻害剤の開発が要望されている。
従来のシナプトゾームを用いるグルタミン酸取り込み阻害物質の検索から、現在までに、スレオ-β-ヒドロキシアスパラギン酸およびCCG-III [(2S,1'S, 2'R)-2-(カルボキシシクロプロピル)グリシン]、t-2,4-PDC（trans-ピロリジン-2,4-ジカルボン酸）等の化合物がグルタミン酸取り込み阻害物質として知られているが、これらは自らも基質としてトランスポーターに取り込まれることにより競合的にグルタミン酸の取り込みを抑制する阻害物質であった。
また、グルタミン酸取り込み阻害物質の一種であるカイニン酸およびジヒドロカイニン酸は、それ自身は取り込まれずにグルタミン酸の取り込みを阻害するブロッカーであることが、電気生理学的研究により示された。さらに、これらの化合物は５つのEAATサブタイプのうちのEAAT2(GLT-1タイプ)にのみ作用することも示された(Arriza, J. L. et al., J. Neurosci. 14, 5559-5569. 1994)。しかしながら、これらの化合物は、イオンチャンネル型グルタミン酸受容体に対して強い興奮作用を併せ持つ化合物であった。
本発明者らはβ位に置換基をもつβ-ヒドロキシアスパラギン酸誘導体が、EAAT1-5全てのサブタイプに対して、取り込み阻害作用を示すことを報告している(Lebrun, B. et al., J. Biol. Chem. 272, 20336-20339, 1997; Shimamoto, K. et al., Mol. Pharmacol. 53, 195-201, 1998; Shigeri, Y. et al., J. Neurochem. 79, 297-302, 2001)。中でもβ位の置換基が嵩高い化合物は、全てのサブタイプにおいてブロッカーとして働き、グルタミン酸の取り込みのみならず、ヘテロエクスチェンジによるグルタミン酸の漏出やナトリウムイオンの流入も阻害することを見いだしている(Chatton, J-Y. et al., Brain Res. 893, 46-52, 2001)。特にL-スレオ-β-ベンジルオキシアスパラギン酸（L-TBOA）は強いブロッカー作用を有し、しかもグルタミン酸受容体に対する親和性は既存の阻害剤より低いことから、グルタミン酸トランスポーター研究の標準物質となるに至っている。
β-ヒドロキシアスパラギン酸には４種の立体異性体が存在するが、その中でL-スレオ体が最も強い取り込み阻害作用を示す(Shimamoto, K. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 2407-2410, 2000)。従来のTBOAはDL体で用いられており、正確な構造活性相関を議論するためには、L-スレオ体の選択的な合成が要望されていた。
一方、グルタミン酸トランスポーターの３次元構造を解明し、基質輸送機構や基質結合部位を明らかにするためには、蛋白の精製が不可欠となる。アフィニティカラムクロマトグラフは蛋白精製に有効な手段である。既に抗体を用いた蛋白精製が試みられているが、抗体と蛋白の結合が強すぎるために、溶出の際に蛋白が本来の機能を失うという不都合があった。カラムリガンドにブロッカーを用いることができれば穏和な条件で溶出できることから、アフィニティカラムに結合できるような置換基を有するブロッカーが求められていた。
本発明者らはTBOAの強い親和性に着目し、TBOAのベンゼン環上に置換基を有する誘導体を合成し、その置換基をカラム担体に結合させることを考えた。L-スレオ-ヒドロキシアスパラギン酸誘導体を選択的に合成するべく、鋭意研究したところ、光学活性エポキシドを原料として目的のL-スレオ-ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体を得る合成経路を発明し、ベンゼン環上にアミノ基を有するβ-ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体が、アミノ基上に置換が起こっても取り込み阻害作用を保持していることを見いだした。
置換基としてアシル基を有する化合物は、TBOAと同程度もしくはそれ以上の阻害作用をもつグルタミン酸トランスポーター阻害剤として作用する。特にベンゾイル誘導体を有する化合物は著しく活性が上昇し、阻害剤とてTBOAよりも優れていることを見出した。一方、置換基としてアミノ酸を有するものは、その遊離のアミノ基と市販のカラム担体のカルボン酸もしくはハロゲン化アルキル基に簡単に結合させることができる。また、ビオチニル基を有するものは、市販のアビジンカラムと結合させることができる。従って、本化合物により、ブロッカー活性を保ったままカラム担体への固定が可能になることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明によれば、化学式(1)で示される、光学活性β-ベンジルオキシアスパラギン酸のベンゼン環上にアミノ基を有する誘導体およびその塩を、グルタミン酸トランスポーターブロッカーとして提供することができ、さらにアフィニティカラムのリガンドとして供することができる。
Figure 0004542336
[式中、Ｒは水素、アシル基部分が置換されてもよい直鎖または分岐低級脂肪族アシル基、環状脂肪族アシル基、芳香環上に置換基を有してもよい芳香族アシル基、アミノ酸類由来の基、ビオチン誘導体由来の基である。]。
より詳細には、式(1)において、Ｒは水素もしくは直鎖または分岐C1-C8低級脂肪族アシル基、C4-C8環状脂肪族アシル基、C5-C15芳香族アシル基、アミノ酸誘導体、ビオチン誘導体である。Ｒで示される直鎖または分岐低級脂肪族アシル基および環状脂肪族アシル基の例としては、例えばアセチル基、プロピオニル基、n-ブタノイル基、sec-ブタノイル基、n-ペンタノイル基、ピバロイル基、フェニルアセチル基、シクロヘキシルカルボニル基等が例示される。また、そのアシル基上に置換基があっても良く、その際の置換基の例には、ヒドロキシ基、チオール基、アミノ基およびカルボキシル基が含まれる。Ｒで示される芳香族アシル基としては、ベンゾイル基、ナフトイル基、ピリジルカルボニル基等が例示される。また芳香環上に置換基を有していても良い。芳香環上の置換基としては、直鎖または分岐C1-C7アルキル基、C4-C10アリール基、C1-C6アルコキシル基、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、C1-C7アシルアミノ基、カルボキシル基、ハロゲン、ハロゲン化C1-C6アルキル基、ビオチニル基、およびアルキル部分がC1-C6のビオチニルアルキル基等が例示される。Rで示されるアミノ酸としては、例えばグリシル基、アラニル基、β-アラニル基、システイニル基等が例示される。Ｒで示されるビオチン誘導体としては、ビオチニル基、またはビオチニル-β-アラニル基等が例示される。
本発明の化合物は通常の方法によって塩とすることができる。このような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等があるが、これらはいずれも本発明に含まれる。一方、通常の酸によっても塩とすることができる。このような塩としては、塩酸塩、硫酸塩等の無機酸の塩、酢酸塩、クエン酸、トリフルオロ酢酸塩等の有機酸の塩等があるが、これらも本発明に含まれる。
また、ベンゼン環上の置換基の位置はオルト、メタ、パラの３種が存在するが、いずれも本発明に含まれる。但し、化合物の構造活性相関の検討から、ベンゼン環上のアミノ基はメタ配置のものが強い活性を示すことが判明した。従って次に示す合成スキームでは、メタ配置の化合物についての導入例を示すが、置換様式の異なる試薬を用いることにより所望の置換基を導入することが可能である。
本発明の化合物は以下のようにして合成することができる。例えば、Rがβ-アラニル基、ビオチニル-β-アラニル基、プロピオニル-β-アラニル基の化合物は、次のスキームに従い合成することができる。


スキーム１
Figure 0004542336
本発明の合成法の特徴は、上記スキームにおいて、化合物（１）の光学活性出発原料を用いることである。この化合物を、NaOH等のアルカリ金属水酸化物で水酸基の保護基を除去した後、得られた遊離の水酸基とベンゾイルイソシアナートを反応させて、式（２）で表されるベンゾイルカルバメートを得る。そのときの反応条件は、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）溶液中にベンゾイルイソシアナート約1.2当量を室温で加えて約30分攪拌するものである。式（２）の化合物を、触媒量のヨウ化テトラブチルアンモニウム存在下、弱塩基性の条件で反応させて、式（３ａ）および式（３ｂ）で表されるＬ−スレオ体のシクロカルバメート混合物を製造する。そのときの反応条件は、アセトニトリル溶液中に、炭酸カリウム約2当量、ヨウ化テトラブチルアンモニウム約0.15当量を加え、室温で14時間から18時間攪拌するものである。
本発明の合成法により、選択的にＬ−スレオ体のシクロカルバメート混合物が製造中間体として得られる。従来の報告(Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 2407-2410, 2000)に記載された方法では、スレオ体をエリスロ体との混合からカラムで精製する必要があったが、本発明の方法では精製の必要性が大幅に軽減される。
またニトロベンジル化において、既知のラクトン中間体(Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 2407-2410, 2000)に代えて、化合物（６）を基質に用いることにより、エリスロ体への異性化が抑えられた。従来の基質では30％程度の異性化が見られたのに対し、本化合物を用いた場合には痕跡量のみであり、よりスレオ体選択的な製造法となっている。そのときの反応条件は、約-20℃に冷却した化合物（６）のDMF溶液に約1.5当量の水素化ナトリウムと約0.3当量のヨウ化テトラブチルアンモニウムを加え、次いで約1.5当量の臭化ニトロベンジル（好ましくは臭化3-ニトロベンジル）を加えて約-20℃で約30分、さらに約０℃で約30分攪拌するものである。本反応において、臭化3-ニトロベンジルに代えて臭化3-アミノベンジルの保護体を使った場合には、反応時間を延長したり温度を上昇させたりしても反応が完結しないことから、ニトロ基をアミノ等価体として用いることで収量が大幅に向上している。また、本反応で得られた化合物（７）は、そのニトロ基を還元することで容易にアミノ化合物とすることができる。これをさらに酸塩化物やカルボン酸と縮合剤による反応などでアシル化することにより、所定の置換基を有する化合物に変換することができる。従って化合物（７）は目的とするアミノ置換ベンジルオキシアスパラギン酸合成の中間体として有用である。
本発明の化合物が有するグルタミン酸トランスポーターの阻害活性を調べる方法はよく知られている。例えば、本発明の化合物は恒常的にMDCK (Madin-Darby Canine Kidney)細胞に発現させた、または一過性にCOS-1細胞に発現させた、ヒトEAAT2およびEAAT3において、14Cでラベルしたグルタミン酸の細胞への取り込みを阻害することが確認された。従って、本発明の化合物はグルタミン酸トランスポーターの機構解明に繋がり、構造活性相関、蛋白構造解析などの研究を通して、神経変性疾患治療に結びつく有用な化合物である。
アフィニティーカラムの調製
式（１）の化合物のあるものは、グルタミン酸トランスポーター蛋白の単離および／または精製のためのアフィニティーカラムのリガンドとして使用できる。アフィニティーカラムの調製のためには、公知の方法を用いることができる。（カップリング反応一般については、Amersham Pharmacia Biotechから出版されている、アフィニティークロマトグラフィーハンドブック：原理と方法、を参照；ビオチン誘導体の反応については、D. Savage, G. Matton, S. Desai, G. Nielander, S. Morgensen, E. Conklin, Avidin-Biotin Chemistry: A handbook, Pierce Chemical Company (Rockford, USA), 1992を参照)。
アフィニティーカラムによる蛋白の精製
目的蛋白を含有する可能性のある液体試料を、上記のとおり調製したカラムに導入できる。液流を停止させて所定時間、例えば約30分間カラムをインキュベートする。蛋白は溶出バッファー（例えば、0.1 M HCl, pH 2.2)で溶出する。必要なら、蛋白溶液を脱塩カラムにとおして塩を除去する。
式（１）の化合物のいくつかは、トランスポーター蛋白の同定のための放射性同位体標識リガンドとして有用である。アイソトープ標識リガンドを得るには、公知の合成方法により、式（１）中の基Ｒのヒドロキシベンゾイル中間体を用い、例えば、スキーム２に示したとおり、標識した沃化メチルとの反応で、目的の標識リガンドを得ることができる。放射性同位元素で標識された沃化メチルは、いくつかの市販品されており、例えば、重水素標識沃化メチル、トリチウム標識沃化メチル、炭素14標識または炭素11標識沃化メチルがある。


スキーム２
Figure 0004542336
(2S,3R)-ベンゾイルカルバミン酸 [3-(ベンジルオキシメチル)オキシラニル]メチルエステル (2)
市販の(2S,3R)-[3-(ベンジルオキシメチル)オキシラニル]メタノール p-ニトロ安息香酸エステル (5.0 g , 14.6 mmol)のTHF溶液 (20 mL)に1N 水酸化ナトリウム水溶液(17.5 mL, 17.5 mmol)を加えて、0℃で１時間撹拌した。反応溶液をエーテルで抽出し、有機層を水洗後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去して油状のアルコール体を得た。これをTHF(20 mL)に溶解し、室温にてベンゾイルイソシアナート (2.57g, 17.5 mmol)のTHF溶液を加えた。反応溶液を室温で３０分間撹拌し、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を終結させた。エーテルで抽出後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し得られたをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（エーテル / ヘキサン = 3 / 1）、標題化合物5.8 g (>100%)を得た。少量の不純物（ベンズアミド）を含むが、次の反応にはこれ以上の精製はせずに用いた。分析用サンプルとして一部を再結晶（エーテル/ヘキサン）にて精製した。
mp 79-81 °C; [α]D -22.9° (c 0.80, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ3.31 (m 2 H), 3.64 (dd, 1 H, J = 6.0, 11.5 Hz), 3.73 (dd, 1 H, J = 4.3, 11.5 Hz), 4.15 (dd, 1 H, J = 7.0, 12.0 Hz), 4.54 (dd, 1 H, J = 3.5, 12.0 Hz), 4.54 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.61 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.30 (m, 1 H), 7.35 (m, 4 H), 7.48 (ddd, 2H, J = 1.0, 7.5, 7.8 Hz), 7.59 (tt, 1 H, J = 1.0, 7.5 Hz), 7.83 (ddd, 2 H, J = 1.0, 1.0, 7.8 Hz), 8.33 (s, 1 H).

(4R,1'S)-4-(2-ベンジルオキシ-1-ベンゾイルオキシエチル)-オキサゾリジン-2-オン (3a)
(4R,5S)-4-ベンゾイルオキシメチル-5-ベンジルオキシメチル-オキサゾリジン-2-オン (3b)
ベンゾイルカルバメート(2) 5.8 gのアセトニトリル溶液（100 mL）に炭酸カリウム (4.04 g, 29.2 mmol)とヨウ化テトラブチルアンモニウム (800 mg, 2.2 mmol)を加えて、室温で１８時間撹拌した。反応溶液に飽和塩化アンモニウムを加えて反応を終結させた。エーテルで抽出後、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（エーテル / ヘキサン = 2 / 1）、標題化合物の混合物4.87 g (３段階 98%)を得た。
3a: mp 85-87 °C; [α]D +43.6° (c 0.55, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ3.68 (d, 2 H, J = 5.0 Hz), 4.11 (ddd, 1 H, J =, 4.5, 5.0, 5.5 Hz), 4.27 (dd, 1 H, J = 5.5, 11.5 Hz), 4.44 (dd, 1 H, J = 4.5, 11.5 Hz), 4.57 (dt, 1 H, J = 5.0, 5.0 Hz), 4.58 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 4.61 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 6.08 (br s, 1 H), 7.33 (m, 5 H), 7.43 (ddd, 2H, J = 1.0, 7.5, 7.8 Hz), 7.57 (tt, 1 H, J = 1.0, 7.5 Hz), 8.00 (ddd, 2 H, J = 1.0, 1.0, 7.8 Hz).
3b: mp 116-117 °C; [α]D -52.6°(c 0.86, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ3.75 (dd, 1 H, J = 4.5, 10.5 Hz), 3.83 (dd, 1 H, J = 3.8, 10.5 Hz), 4.24 (dd, 1 H, J = 4.8, 8.8 Hz), 4.29 (ddd, 1 H, J = 3.5, 4.8, 8.5 Hz), 4.49 (d, 1 H, J = 8.5 Hz), 4.51 (d, 1 H, J = 8.5 Hz), 4.54 (d, 1 H, J = 8.8 Hz), 5.16 (ddd, 1 H, J = 3.5, 3.8, 8.5 Hz), 5.98 (s, 1 H), 7.29 (m, 5 H), 7.44 (m, 2 H), 7.58 (tt, 1 H, J = 1.5, 7.5 Hz), 8.03 (m, 2 H).

(2R,3S)-4-ベンジルオキシ-2-N-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1,3-ブタンジオール (4)
シクロカルバメート(3) (4.05 g, 11.9 mmol)のエタノール溶液 (100 mL)に水酸化バリウム（８水塩）(11.3 g, 35.7 mmol)と水 (100 mL)を加え、縣濁液を80℃で１８時間撹拌した。氷冷後10%希硫酸でpHを３に調整した。沈殿物をセライト濾去後、濾液を濃縮し、ジ-t-ブチル-ジカルボナート (5.5 mL, 23.8 mmol)、1,4-ジオキサン (100 mL)を加え、1 N水酸化ナトリウムで溶液のpHを９に調整した。反応混合物を室温にて１８時間撹拌し、1 N塩酸で中和後、酢酸エチルで抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（エーテル / ヘキサン = 3 / 1）、標題化合物3.06g (２段階83%)を得た。
油状; [α]D +3.1° (c 0.87, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ1.37 (s, 9 H), 2.88 (br s, 1 H), 3.12 (s, 1 H), 3.46 (dd, 1 H, J = 7.5, 9.5 Hz), 3.53 (dd, 1 H, J = 4.5, 9.5 Hz), 3.66 (m, 1 H), 3.69 (m, 1 H), 3.79 (m, 1 H), 4.07 (s, 1 H), 4.50 (s, 2 H), 5.26 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.30 (m, 5 H)

(2R,3S)-4-ベンジルオキシ-2-N-tert-ブトキシカルボニルアミノ-1,3-ビス(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-ブタン (5)
ジオール(4) (2.0 g, 6.4 mmol)の 塩化メチレン溶液 (100 mL)にトリフルオロメタンスルホン酸 t-ブチルジメチルシリル (4.4 mL, 19 mmol)と2,6-ルチジン (3.0 mL)を氷冷下で加えて３０分撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を終結させ、エーテルで抽出し、有機層を1 N塩酸、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（エーテル / ヘキサン = 1 / 3）、標題化合物2.96 g (86%)とモノシリル体 295 mg (11%)を得た。
油状; [α]D -7.7° (c1.71, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ -0.01 (s, 3 H), 0.00 (s, 6 H), 0.02 (s, 3 H), 0.82 (s, 9 H), 0.83 (s, 9 H), 1.45 (s, 9 H), 3.39 (m, 3 H), 3.56 (dd, 1 H, J = 5.0, 10.0 Hz), 3.70 (m, 1 H), 4.12 (dt, 1 H, J = 1.5, 6.0 Hz), 4.44 (s, 2 H), 4.71 (d, 1 H, J = 9.0 Hz), 7.20 (m, 1 H), 7.28 (m, 4 H).

(2S,3R)-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-2-ヒドロキシ酪酸 メチルエステル (6)
シリル保護体(5) 2.96 g (5.48 mmol)をメタノール(100 mL)に溶かし、パラジウム黒 200 mgを加えて水素雰囲気下で３時間撹拌した。触媒を濾去し、溶媒を留去した後、残査を塩化メチレン100 mLに溶かした。ここに、あらかじめ塩化オキザリル (952 μL, 11 mmol)とDMSO (1.17 mL, 16.4 mmol)を-78℃の塩化メチレン中で混合しておいたものを-78℃にて加えて、反応混合物を-78℃で１０分、-50℃で１時間撹拌した。反応混合物にトリエチルアミン(3 mL, 22 mmol)を-50℃で加えた後、0℃まで昇温し５分撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を終結させ、エーテルで抽出し、有機層を1 N塩酸、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し得られた残査をアセトン50 mLに溶かして０℃でJones試薬を溶液が褐色になるまで加えた。2-プロパノールを加えて反応を終結させ、エーテルで抽出した。有機層にジアゾメタンを加えてメチルエステル化し、溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し、得られた残査をTHF 100 mLに溶かし、フッ化テトラn-ブチルアンモニウムのTHF溶液 (1 N, 11 mL)を加えた。酢酸エチルを加えて抽出し、有機層を5% クエン酸水溶液で洗った。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して得られたラクトンとジオールの混合物をメタノールに溶かして、触媒量の酸性樹脂(amberlyst 15E)を加えて１６時間撹拌した。触媒を濾去し、溶媒を留去して得られた残査をDMFに溶かし、塩化t-ブチルジメチルシリル (828 mg, 5.5 mmol)とイミダゾール (748 mg, 11 mmol)を加えて室温で３時間撹拌した。メタノールを加えて反応を終結させ、エーテルで抽出し、有機層を1 N塩酸、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（エーテル / ヘキサン = 1 / 3）、標題化合物1.25 g (7段階63%)を得た。
油状; [α]D+10.7° (c1.50, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ0.03 (s, 6 H), 0.90 (s, 9 H), 1.44 (s, 9 H), 3.27 (d, 1 H, J = 4.0 Hz), 3.64 (dd, 1 H, J = 7.5 Hz, 9.5 Hz), 3.73 (dd, 1 H, J = 5.0, 9.5 Hz), 3.79 (s, 3 H), 4.09 (m, 1 H), 4.46 (m, 1 H), 4.87 (d, 1 H, J = 9.0 Hz).

(2S,3R)-3-N-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-tert-ブチルジメチルシリルオキシ-2-(3-ニトロベンジル)オキシ酪酸 メチルエステル (7)
2-OH体(6) (700 mg, 1.93 mmol)のDMF溶液5mLに-20℃で水素化ナトリウム (116 mg, 2.90 mmol), ヨウ化テトラn-ブチルアンモニウム (213 mmol, 0.60 mmol)を加え、更に臭化 3-ニトロベンジル (625 mg, 2.90 mmol)を加えて、-20℃で３０分、０℃で３０分撹拌した。５％クエン酸水溶液を加えて反応を終結させ、エーテルで抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（エーテル / ヘキサン = 1 / 3）、標題化合物759 mg (79 %)を得た。
油状; [α]D -8.7° (c 1.94, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ0.03 (s, 3 H), 0.06 (s, 3 H), 0.86 (s, 9 H), 1.40 (s, 9 H), 3.57 (dd, 1 H, J = 9.5, 9.5 Hz), 3.69 (dd, 1 H, J = 5.0, 9.5 Hz), 3.77 (s, 3 H), 4.18 (m, 1 H), 4.39 (d, 1 H, J = 2.0 Hz), 4.50 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.86 (d, 1 H, J = 10.0 Hz), 4.88 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.53 (dd, 1 H, J = 8.0, 8.0 Hz), 7.71 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 8.16 (m, 1 H), 8.22 (s, 1 H).

(2S,3R)-2-[3-(3-N-ベンジルオキシカルボニルアミノプロピオニルアミノ)ベンジルオキシ]-3-N-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-tert-ブチルジメチルシリルオキシ酪酸 メチルエステル (8)
ニトロベンジル体(7) (759 mg, 1.52 mmol)のメタノール溶液 30 mLに触媒量のパラジウム-炭素(10%)を加えて、水素雰囲気下で３時間撹拌した。触媒を濾去し、濾液を減圧濃縮した。残査を塩化メチレン50 mLに溶かし、N-ベンジルオキシカルボニル-β-アラニン (439 mg, 2 mmol), 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (406 mg, 2 mmol)を加えて室温で３０分撹拌した。エーテルと水を加えて抽出し、有機層を5% クエン酸水溶液、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水で順次洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（エーテル / ヘキサン = 3 / 1）、標題化合物956 mg (２段階 94%)を得た。
油状, [α]D -5.3°(c1.68, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ0.03 (s, 3 H), 0.06 (s, 3 H), 0.89 (s, 9 H), 1.40 (s, 9 H), 2.58 (m, 2 H), 3.54 (m, 3 H), 3.64 (dd, 1 H, J = 5.0, 9.5 Hz), 3.74 (s, 3 H), 4.13 (m, 1 H), 4.32 (br s, 1 H), 4.36 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 4.69 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 4.98 (d, 1 H, J = 10.0 Hz), 5.08 (m, 2 H), 5.66 (br s, 1 H), 7.08 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.30 (m, 6 H), 7.48 (m, 2 H), 7.96 (s, 1 H).

(2S,3S)-3-[3-(3-N-ベンジルオキシカルボニルアミノプロピオニルアミノ)ベンジルオキシ]-2-N-tert-ブトキシカルボニル-アスパラギン酸 δ-メチルエステル (9)
化合物 8 (777 mg, 1.15 mmol)のメタノール溶液 10mLに触媒量のDL-カンファースルホン酸を加えて５時間撹拌した。エーテルと水を加えて抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し、得られた残査をアセトン5 mLに溶かして０℃でJones試薬を溶液の褐色が消えなくなるまで加えた。2-プロパノールを加えて反応を終結させ、エーテルで抽出した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で水層に抽出後、水層を2 N塩酸でpH2とし、酢酸エチルで再度有機層へ抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（メタノール / クロロホルム = 1 / 19）、標題化合物210 mg (２段階 32%)を得た。
油状; [α]D -52.5° (c0.46, CHCl3); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ1.40 (s, 9 H), 2.53 (m, 2 H), 3.48 (m, 2 H), 3.77 (s, 3 H), 4.29 (d, 1 H, J = 12.5 Hz), 4.45 (d, 1 H, J = 2.5 Hz), 4.81 (m, 2 H), 5.07 (s, 2 H), 5.48 (d, 1 H, J = 9.5 Hz), 5.83 (m, 1 H), 6.96 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.17-7.36 (m, 8 H), 8.44 (br s, 1 H).

(2S,3S)-3-[3-(3-アミノプロピオニルアミノ)ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (AA-TBOA)
化合物9 (190 mg, 0.33 mmol)のメタノール溶液1 mLに1 N水酸化ナトリウム水溶液1.5 mLを加えて氷零下で１時間、室温で16時間撹拌した。2 N塩酸1mLを加えた後酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去して得られた残査をメタノール(5 mL)に溶かして、触媒量の塩酸とパラジウム黒を加えて水素雰囲気下で３時間撹拌した。触媒を濾去し、濾液を濃縮して得られた残査を塩化メチレン2 mLに溶かして、トリフルオロ酢酸1 mLを加えて１５分撹拌した。溶媒を留去し、残査をDowex 50 x 100のカラムクロマトグラフィーに付し、水で洗浄後、1 Nアンモニア水で溶出した。凍結乾燥を繰り返し、標題化合物 (97 mg, 91%)を得た。
アモルファス；[α]D -25.0° (c 0.88, H2O); 1H NMR (D2O, 400 MHz); δ2.74 (t, 2 H, J = 6.5 Hz), 3.18 (t, 2 H, J = 6.5 Hz), 3.69 (s, 1 H), 4.24 (s, 1 H), 4.42 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.71 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.22 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.36 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.41 (dd, J = 7.0 Hz, 7.5 Hz), 7.50 (d, 1 H, J = 7.5 Hz).

(2S,3S)-3-[3-(3-N-ビオチニルアミノプロピオニルアミノ)ベンジルオキシ]-2-N-tert-ブトキシカルボニル-アスパラギン酸 δ-メチルエステル (10)
化合物 8 (107 mg, 0.20 mmol)のメタノール溶液 5 mLに触媒量のパラジウム-炭素(10%)を加え、水素雰囲気下で３時間撹拌した。触媒を濾去し、濾液を濃縮して得られた残査を塩化メチレン2 mLに溶かして、ビオチン ペンタフルオロフェニルエステル (91 mg, 0.22 mmol), トリエチルアミン (30 μL, 0.22 mmol)を加えて３０分室温で撹拌した。反応液をエーテルで希釈し、1 N塩酸、水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去して得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（メタノール / クロロホルム = 1 / 10）、標題化合物55 mg (２段階 46%)を得た。
油状；[α]D -26.8° (c 0.58, MeOH) 1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ1.40 (s, 9 H), 1.5-1.8 (m, 6 H), 2.26 (m, 2 H), 2.66 (m, 2 H), 2.77 (m, 3 H), 2.89 (dd, 1 H, J = 4.5, 13.0 Hz), 3.13 (m, 1 H), 3.46 (m, 1 H), 3.68 (m, 1 H), 3.75 (s, 3 H), 4.34 (m, 1 H), 4.42 (d, 1 H, J = 13.0 Hz), 4.44 (d, 1 H, J = 2.0 Hz), 4.51 (m, 1 H), 4.80 (dd, 1 H, J = 2.0, 9.5 Hz), 4.91 (d, 1 H, J = 13.0 Hz), 5.49 (d, 1 H, J = 9.5 Hz), 6.52 (m, 1 H), 6.61 (s, 1 H), 6.66 (s, 1 H), 6.86 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.02 (s, 1 H), 8.04 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 8.87 (s, 1 H).

(2S,3S)-3-[3-(3-N-ビオチニルアミノプロピオニルアミノ)ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (Bio-AA-TBOA)
化合物 10 (13 mg, 0.22 mmol)のメタノール溶液1mLに1 N 水酸化ナトリウム水溶液66 μLを加えて室温で１８時間撹拌した。反応液を2 N 塩酸でpH 1に調節し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して得られた残査をクロロホルム1mLに溶かし、トリフルオロ酢酸1 mLを加えて１５分撹拌した。溶媒を留去し、残査をDowex 50 x 100のカラムクロマトグラフィーに付し、水で洗浄後、1 Nアンモニア水で溶出した。凍結乾燥を繰り返し、標題化合物 7.9 mg (72%)を得た。
アモルファス；[α]D +6.1° (c 0.32, 50% DMSO-H2O); 1H NMR (D2O, 400 MHz); δ1.15 (m, 2 H), 1.32 (m, 1 H), 1.45 (m, 3 H), 2.53 (dd, 1 H, J = 4.0, 12.5 Hz), 2.54 (m, 2 H), 2.66 (dd, 1 H, J = 5.0, 12.5 Hz), 2.81 (m, 1 H), 3.44 (m, 2 H), 3.48 (d, 1 H, J = 4.5 Hz), 3.90 (dd, 1 H, J = 1.0, 2.0 Hz), 3.94 (dd, 1 H, J = 4.5, 8.0 Hz), 4.24 (m, 2 H), 4.37 (d, 1 H, J = 12 Hz), 4.60 (d, 1 H, J = 12 Hz), 7.09 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.22 (s, 1 H), 7.29 (dd, 1 H, J = 7.5, 7.5 Hz), 7.38 (d, 1 H, J = 7.5 Hz).

(2S,3R)-2-[3-(3-N-プロピオニルアミノプロピオニルアミノ)ベンジルオキシ]-3-N-tert-ブトキシカルボニルアミノ-4-tert-ブチルジメチルシリルオキシ酪酸 メチルエステル (11)
化合物8 (110 mg, 0.16 mmol)のメタノール溶液 10 mLに触媒量のパラジウム-炭素(10%)を加えて、水素雰囲気下で３時間撹拌した。触媒を濾去し、濾液を減圧濃縮した。残査を塩化メチレン10 mLに溶かし、氷零下でトリエチルアミン (45 μL, 0.32 mmol)、塩化プロピオニル (16 μL, 0.19 mmol)を加えて15分撹拌した。エーテルと水を加えて抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、、5% クエン酸水溶液、水で順次洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し（エーテル / ヘキサン = 3 / 1）、標記化合物 75 mg (２段階 79%)を得た。
油状； 1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ0.03 (s, 3 H), 0.05 (s, 3 H), 0.87 (s, 9 H), 1.12 (t, 3 H, J = 7.5 Hz), 1.40 (s, 9 H), 2.19 (q, 2 H, J = 7.5 Hz), 2.62 (t, 2 H, J = 5.5 Hz), 3.58 (m, 4 H), 3.75 (s, 3 H), 4.11 (m, 1 H), 4.32 (d, 1 H, J = 1.5 Hz), 4.38 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 4.73 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 4.98 (d, 1 H, J = 9.5 Hz), 6.44 (t, 1 H, J = 5.5 Hz), 7.09 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.28 (m, 1 H), 7.51 (m, 2 H), 8.38 (s, 1 H).

(2S,3S)-3-[3-(3-N-プロピオニルアミノプロピオニルアミノ)ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (Pr-AA-TBOA)
化合物 11 (57 mg, 0.096 mmol)のメタノール溶液 10mLに触媒量のDL-カンファースルホン酸を加えて3時間撹拌した。エーテルと水を加えて抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し、得られた残査をアセトン5 mLに溶かして０℃でJones試薬を溶液の褐色が消えなくなるまで加えた。2-プロパノールを加えて反応を終結させ、エーテルで抽出した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で水層に抽出後、水層を2 N塩酸でpH2とし、酢酸エチルで再度有機層へ抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して得られた残査をメタノール1mLに溶かし、1 N 水酸化ナトリウム水溶液1 mLを加えて室温で１８時間撹拌した。反応液を2 N 塩酸でpH 1に調節し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して得られた残査をクロロホルム1mLに溶かし、トリフルオロ酢酸1 mLを加えて１５分撹拌した。溶媒を留去し、残査をDowex 50 x 100のカラムクロマトグラフィーに付し、水で洗浄後、1 Nアンモニア水で溶出した。凍結乾燥を繰り返し、標題化合物 14 mg (5 steps , 39%)を得た。
アモルファス；[α]D -17.3 ° (c 0.71, H2O); 1H NMR (D2O, 400 MHz); δ1.11 (t, 3 H, J = 7.5 Hz), 2.27 (q, 2 H, J = 7.5 Hz), 2.66 (t, 2 H, J = 6.5 Hz), 3.57 (t, 2 H, J = 6.5 Hz), 3.68 (s, 1 H), 4.24 (s, 1 H), 4.44 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.72 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.24 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.32 (s, 1 H), 7.43 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.51 (d, 1 H, J = 7.5 Hz).

β-アラニンを含まない化合物についてもScheme 3に従い、同様の方法でA-TBOA, Bio-A-TBOA, Pr-A-TBOA, Piv-A-TBOA, PhAcA-TBOA, cHexcA-TBOA, BzA-TBOA, o-MeO-BzA-TBOA, m-MeO-BzA-TBOA, p-MeO-BzA-TBOA, diMeO-BzA-TBOA, tBu-BzA-TBOA, Ph-BzA-TBOA, CN-BzA-TBOA, NO2-BzA-TBOA, F-BzA-TBOA, OCF3-BzA-TBOA, CF3-BzA-TBOA, OHex-BzA-TBOA, Hep-BzA-TBOA を合成した。


スキーム３
Figure 0004542336
(2S,3S)-3-(3-アミノベンジルオキシ)アスパラギン酸 (A-TBOA)
アモルファス；1H NMR (D2O, 400 MHz); δ3.86 (d, 1 H, J = 2.0 Hz), 4.19 (d, 1 H, J = 2.0 Hz), 4.26 (d, 1 H, J = 11.6 Hz), 4.52 (d, 1 H, J = 11.6 Hz), 6.70 (m, 3 H), 7.10 (t, 1 H, J = 7.6 Hz).

(2S,3S)-3-[3-(N-ビオチニルアミノ)ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (Bio-A-TBOA)
アモルファス；[α]D +31.1° (c 0.35, H2O); δ1.53 (m, 2 H), 1.68 (m, 1 H), 1.79 (m, 3 H), 2.49 (t, 2 H, J = 7.8 Hz), 2.82 (d, 1 H, J = 13.0 Hz), 3.04 (dd, 1 H, J = 5.0, 13.0 Hz), 3.40 (m, 1 H), 3.70 (s, 1 H), 4.26 (s, 1 H), 4.44 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.47 (dd, 1 H, J = 4.5, 8.0 Hz), 4.67 (dd, 1 H, J = 5.0, 7.5 Hz), 4.73 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.25 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.32 (s, 1 H), 7.44 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.53 (d, 1 H, J = 7.5 Hz).

(2S,3S)-3-[3-(N-プロピオニルアミノ)ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (Pr-A-TBOA)
アモルファス；1H NMR (D2O, 400 MHz); δ1.07 (t, 3 H, J = 7.5 Hz), 2.30 (q, 2 H, J = 7.5 Hz), 3.70 (s, 1 H), 4.14 (s, 1 H), 4.31 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.58 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.08 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.13 (s, 1 H), 7.28 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.34 (d, 1 H, J = 8.0 Hz).

(2S,3S)-3-[3-(N-ピバロイルアミノ)ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (Piv-A-TBOA)
アモルファス；[α]D -27.7° (c 0.31, H2O); 1H NMR (D2O, 400 MHz); δ1.20 (s, 9 H), 3.86 (dd, 1 H, J = 2.0, 2.5 Hz), 4.20 (dd, 1 H, J = 2.0, 2.5 Hz), 4.34 (d, 1 H, J = 12 Hz), 4.57 (d, 1 H, J = 12 Hz), 7.10 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.17 (s, 1 H), 7.25 (m, 2 H)

(2S,3S)-3-[3-(N-フェニルアセチルアミノ)ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (PhAcA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ:3.61 (s, 2 H), 3.89 (d, 1 H, J = 8.5 Hz), 4.16 (d, 1 H, J = 8.5 Hz), 4.43 (d, 1 H, J = 11.0 Hz), 4.76 (d, 1 H, J = 11.0 Hz), 7.14 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.20-7.35 (m, 6 H), 7.53 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.55 (s, 1 H).

(2S,3S)-3-[3-(N-シクロヘキシルカルボニルアミノ)ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (cHexcA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 1.10-1.42 (m, 6 H), 1.73 (m, 4 H), 2.29 (m, 1 H), 4.27 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.46 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.49 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.72 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.03 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.26 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.46 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.55 (s, 1 H).

(2S,3S)-3-[3-(N-ベンゾイルアミノ)ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (BzA-TBOA)
1H-NMR (CD3OD) δ: 4.46 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 4.59 (d, 1 H, J = 2.5 Hz), 4.72 (d, 1 H, J = 2.5 Hz), 4.82 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 7.14 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.34 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.50 (m, 2 H), 7.57 (m, 1 H), 7.63 (s, 1 H), 7.67 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.93 (m, 2 H).

(2S,3S)-3-[3-[N-(2-メトキシベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (o-MeO-０BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 3.86 (3 H, s), 4.06 (d, 1 H, J = 4.0 Hz), 4.42 (d, 1 H, J = 4.0 Hz), 4.48 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 4.72 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 7.05 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.19 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.14 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.31 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.49 (dt, 1 H, J = 1.5, 8.0 Hz), 7.59 (s, 1 H), 7.60 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.65 (dd, 1 H, J = 1.5, 7.5 Hz).

(2S,3S)-3-[3-[N-(3-メトキシベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (m-MeO-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 3.84 (s, 3 H), 4.15 (d, 1 H, J = 4.5 Hz), 4.39 (d, 1 H, J = 4.5 Hz), 4.50 (d, 1 H, J = 9.5 Hz), 4.80 (d, 1 H, J = 9.5 Hz), 7.16 (m, 2 H), 7.33 (t, 1 H, J = 6.5 Hz), 7.44 t, 1 H, J = 6.5 Hz), 7.47 (m, 1 H), 7.53 (d, 1 H, J = 6.5 Hz), 7.67 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.74 (s, 1 H).

(2S,3S)-3-[3-[N-(4-メトキシベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (p-MeO-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ:3.82 (s, 3 H), 3.95 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 4.23 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 4.48 (d, 1 H, J = 11.0 Hz), 4.80 (d, 1 H, J = 11.0 Hz), 7.04 (d, 2 H, J = 9.0 Hz), 7.18 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.30 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.66 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.72 (s, 1 H), 7.94 (d, 2 H, J = 9.0 Hz).

(2S,3S)-3-[3-[N-(3,4-ジメトキシベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (diMeO-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 3.79 (s, 6 H), 4.14 (d, 1 H, J = 4.5 Hz), 4.41 (d, 1 H, J = 4.5 Hz), 4.48 (d, 1 H, J = 9.5 Hz), 4.71 (d, 1 H, J = 9.5 Hz), 7.04 (d, 1 H, J = 8.5 Hz), 7.10 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.31 (t, 1 H, J = 6.5 Hz), 7.46 (d, 1 H, J = 2.0 Hz), 7.55 (dd, 1 H, J = 2.5, 8.5 Hz), 7.58 (d, 2 H, J = 8.5 Hz).

(2S,3S)-3-[3-[N-(4-tert-ブチルベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (tBu-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 1.33 (s, 9 H), 4.05 (s, 1 H), 7.08 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.32 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.48 (s, 2 H), 7.50 (d, 2 H, J = 7.5 Hz), 7.74 (d, 2 H, J = 7.5 Hz).

(2S,3S)-3-[3-[N-(4-フェニルベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (Ph-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 3.92 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.38 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.48 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.71 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.13 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.33 (t, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.39 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.48 (t, 2 H, J = 7.5 Hz), 7.64 (m, 2 H), 7.50 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 7.78 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 7.98 (d, 2H, J = 8.0 Hz)

(2S,3S)-3-[3-[N-(4-シアノベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (CN-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 4.30 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.52 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.54 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.79 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.16 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.37 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.64 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.71 (s, 1 H), 7.98 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 8.07 (d, 2 H, J = 8.5 Hz).

(2S,3S)-3-[3-[N-(4-ニトロベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (NO2-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 4.28 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.50 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.52 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 4.76 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 7.14 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.36 (t, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.62 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.69 (s, 1 H), 8.10 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 8..32 (d, 2 H, J = 8.5 Hz).

(2S,3S)-3-[3-[N-(4-フルオロベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (F-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 4.30 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.52 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.53 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 4.77 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 7.12 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.33 (m, 3 H), 7.63 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.70 (s, 1 H), 7.99 (m, 2 H).

(2S,3S)-3-[3-[N-(4-トリフルオロメトキシベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (OCF3-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 4.25 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.48 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.50 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.65 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.14 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.32 (t, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.46 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 7.59 (s, 1 H), 7.61 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.99 (d, 2 H, J = 8.5 Hz).

(2S,3S)-3-[3-[N-(4-トリフルオロメチルベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (CF3-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 4.28 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.51 (d, 1 H, J = 3.5 Hz), 4.53 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.77 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.14 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.36 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.63 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.70 (s, 1 H), 7.87 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 8.08 (d, 2 H, J = 8.5 Hz).

(2S,3S)-3-[3-[N-(4-n-ヘキシルオキシベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (OHex-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 0.81 (t, 3 H, J = 7.0 Hz), 1.24 (m, 6 H), 1.35 (m, 2 H), 3.92 (d, 1 H, J = 4.0 Hz), 3.99 (t, 2 H, J = 6.5 Hz), 4.38 (d, 1 H, J = 4.0 Hz), 4.46 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 4.68 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 6.98 (d, 2 H, J = 9.0 Hz), 7.09 (d, 1 H, d, J = 7.5 Hz), 7.30 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.57 (s, 1 H), 7.58 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.84 (d, 2 H, J = 9.0 Hz).

(2S,3S)-3-[3-[N-(4-n-へプチルベンゾイル)アミノ]ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (Hep-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 0.83 (t, 3 H, J = 6.5 Hz), 1.24 (m, 8 H), 1.56 (m, 2 H), 2.62 (t, 2 H, J = 7.5 Hz), 3.81 (d, 1 H, J = 6.5 Hz), 4.28 (d, 1 H, J = 6.5 Hz), 4.48 (d, 1 H, J = 11.0 Hz), 4.75 (d, 1 H, J = 11.0 Hz), 7.17 (d, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.30 (m, 3 H), 7.68 (m, 2 H), 7.85 (d, 2 H, J = 7.5 Hz).

(2S,3S)-3-[3-(N-(4-(5-アミノペンチルオキシ)ベンゾイル)アミノ)ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (A-PenO-BzA-TBOA)
1H-NMR (D2O) δ: 1.36 (tt, 2 H, J = 7.5 Hz), 1.58 (tt, 2 H, J = 7.5 Hz), 1.66 (tt, 2 H, J = 7.5 Hz), 2.86 (t, 2 H, J = 7.5 Hz), 3.94 (t, 2 H, J = 6.0 Hz), 4.30 (s, 1 H), 4.44 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.52 (s, 1 H), 4.68 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 6.89 (d, 2 H, J = 7.5 Hz), 7.08 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.31 (m, 3 H), 7.66 (d, 2 H, J = 7.5 Hz).

(2S,3S)-3-[3-(N-(4-(5-ビオチニルアミノペンチルオキシ)ベンゾイル)アミノ)ベンジルオキシ] アスパラギン酸 (BioA-PenO-BzA-TBOA)
1H-NMR (DMSO-d6, D2O) δ: 1.20-1.65 (m, 12 H), 1.71 (m, 2 H), 2.04 (t, 2 H J = 7.0 Hz), 2.56 (d, 1 H, J = 13.0 Hz), 2.78 (dd, 1 H, J = 4.5, 13.0 Hz), 3.05 (m, 3 H), 4.01 (t, 2 H, J = 5.5 Hz), 4.13 (m, 1 H), 4.32 (m, 2 H), 4.48 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 4.71 (d, 1 H, J = 11.5 Hz), 7.01 (d, 2 H, J = 8.0 Hz), 7.13 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 7.30 (t, 1 H, J = 7.5 Hz), 7.64 (m, 2 H), 7.89 (d, 2 H, J = 8.0 Hz).

同様の手法でpara-置換体 (p-Pr-A-TBOA)も合成した。
(2S,3S)-3-[4-(N-プロピオニルアミノ)ベンジルオキシ]アスパラギン酸 (p-Pr-A-TBOA)
アモルファス；1H NMR (50% D2O/DMSO-d6, 400 MHz); δ1.03 (t, 3 H, J = 7.5 Hz), 2.27 (q, 2 H, J = 7.5 Hz), 4.20 (s, 1 H), 4.43 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.60 (s, 1 H), 4.66 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 7.22 (d, 2 H, J = 7.0 Hz), 7.39 (m, 2 H).
活性評価
公知の方法(Shimamoto, K. et al., Mol. Pharmacol. 53, 195-201, 1998; Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 2407-2410, 2000)に従い、恒常的にMDCK (Madin-Darby Canine Kidney) 細胞に発現させた、または一過性にCOS-1細胞に発現させた、ヒトEAAT2およびEAAT3において[14C]グルタミン酸の取り込み阻害作用を測定した。グルタミン酸取り込み活性は、1 μMのL-[14C]グルタミン酸と所定の濃度の試料を加えて１２分間インキュベートした後細胞を溶解して、取り込まれた放射活性を液体シンチレーターにより測定した。取り込み量は化合物が無い（緩衝液のみ）場合を100%とし、ナトリウムフリー溶液での取り込みの場合を0%とした％で表示し、IC50値を求め表１に示した。

Figure 0004542336
上記の結果は、本発明の化合物のヒトEAAT2およびEAAT3による[14C]グルタミン酸の取り込みに対する阻害効果は、TBOAの阻害効果に比べて少なくとも同等であるか、化合物によっては顕著に大きかった。さらに、表1の化合物のいくつかの阻害作用は、EAAT3よりもEAAT2に対して選択的であることに注目される。
アフィニティーカラムリガンドの調製調製
調製例 1.
CNBr-活性化セファロース (Sepharose) 4B (Amersham Biosciences) の所定量をグラスフィルター上に秤取する。1 mM HClを用いて洗浄と膨潤を繰り返えす。本発明の化合物(リガンド)をカップリング用バッファー(例えば、0.5 M NaClを含む0.1 M NaHCO3, pH 8.3)に溶解する。このリガンド溶液をゲル分散液と室温で2時間または4 ℃で一夜混合する。次に、ゲルをブロッキング剤、例えば1M エタノールアミンまたは0.2 Mグリシン, pH 8.0中に導入する。このゲルをカップリング用バッファーおよび酢酸バッファー(0.5 M NaCl, 0.1 M AcOH, pH 4)にてこの順序で洗浄して、過剰のリガンドをおよびブロッキング剤を除去する。ゲルは4-8℃で保存する。
調製例 ２
所定量のECH セファロース(Sepharose) 4B (Amersham Biosciences)を、グラスフィルター上に秤取し、0.5 M NaClで洗浄する。本発明の化合物（リガンド）を水に溶解し、このpHを4.5に調節する。カルボジイミドの水溶液を調製し、そのpHを4.5に調節する。膨潤したゲル、リガンド溶液およびカルボジイミド溶液を混合して、室温で一夜反応させる。過剰のリガンド、尿素誘導体および残存リガンドを洗浄して除去する。ゲルは4-8℃で保存する。
調製例３
固定化したアビジンまたはストレプトアビジンのスラリーを、カラムに注入する。充填したカラムは、５倍量の結合バッファー（例えば、PBS)で洗浄して平衡化させる。本発明のビオチン化化合物をカラムに導入し、カラムを30分間静置する。カラムを10倍量の結合バッファーで洗浄する。

Claims (18)

  1. 下記式（1）：
    Figure 0004542336
    （式中、Ｒは水素、アシル基部分が置換されてもよい直鎖または分岐低級脂肪族アシル基、環状脂肪族アシル基、芳香環上に置換基を有してもよい芳香族アシル基、アミノ酸類由来の基、ビオチン誘導体由来の基を示す。）で表される、ベンゼン環上に置換基を有するL-スレオ-β-ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体またはその塩。
  2. Ｒが水酸基またはチオール基で置換されてもよい直鎖または分岐低級脂肪族アシル基、環状脂肪族アシル基、芳香環上に置換基を有してもよい芳香族アシル基、または水酸基もしくはチオール基を含むアミノ酸類由来の基である、請求項１の化合物。
  3. Ｒがアセチル基、プロピオニル基、n-ブタノイル基、sec-ブタノイル基、n-ペンタノイル基、ピバロイル基、フェニルアセチル基、シクロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、置換ベンゾイル基、ナフトイル基、またはピリジルカルボニル基である、請求項１の化合物。
  4. Ｒがグリシル基、アラニル基、β-アラニル基、またはシステイニル基である、請求項１の化合物。
  5. Ｒがビオチニル基、またはビオチニル-β-アラニル基である、請求項１の化合物。
  6. Ｒが置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、シアノ基、ニトロ基およびハロゲン原子からなる群から選択される一または二以上の置換基で置換されたベンゾイル基である、請求項３の化合物。
  7. ベンゾイル基上の置換基が同位元素を含む、請求項６の化合物。
  8. 式（３ａ）および／または式（３ｂ）：
    Figure 0004542336
    (式中、Ｂｚｌはベンジル基を示し、Ｂｚはベンゾイル基を示す)のシクロカルバメート混合物を水酸化バリウムで処理し、生じた沈殿を除去した後、濾液をジ-t-ブチル-ジカルボネートと反応させて、式（４）：
    Figure 0004542336
    の化合物とし、次いで該化合物の水酸基をt-ブチルジメチルシリル基で保護して式(5) ：
    Figure 0004542336
    の化合物とし、さらに該化合物のベンジルオキシ基を選択的にメチルエステル化することからなる、式(6) ：
    Figure 0004542336
    （式中、ＢＯＣはt-ブトキシカルボニル基を示し、ＴＢＳはt-ブチルジメチルシリル基を示す)の化合物の製造方法。
  9. 請求項８で定義した式（６）の化合物を、水素化ナトリウムおよびヨウ化テトラ-n-ブチルアンモニウムの存在下で、臭化ニトロベンジルと立体特異性を変化させることなく反応させることからなる、式（７）：
    Figure 0004542336
    （式中、Ｂｏｃはt-ブトキシカルボニル基を示し、ＴＢＳはt-ブチルジメチルシリル基を示す)で表される、Ｌ−スレオ−ニトロベンジル化（２Ｓ，３Ｒ）化合物の製造方法。
  10. 式（７）で表されるＬ−スレオ−ニトロベンジル化（２Ｓ，３Ｒ）化合物の収率が少なくとも７０％である、請求項９の方法。
  11. 式（７）の化合物のベンゼン環上のＮＯ2基をＮＨＲ基(基中、ＲはＺ基を示すか、またはＲは請求項１ないし５のいずれかにおいて定義した意味を示す）に変換して請求項１ないし５のいずれか1項の化合物を製造し、存在するなら保護基を全て除去する工程をさらに含む、請求項９または１０の方法。
  12. 式（７）：
    Figure 0004542336
    （式中、Ｂｏｃはt-ブトキシカルボニル基を示し、ＴＢＳはt-ブチルジメチルシリル基を示す)で表される化合物。
  13. 式（６）：
    Figure 0004542336
    （式中、Ｂｏｃはt-ブトキシカルボニル基を示し、ＴＢＳはt-ブチルジメチルシリル基を示す)で表される化合物。
  14. −ＮＨＲ基と反応性の官能基を有する固体担体、および式(1)のベンゼン環上の−ＮＨＲ基と前記担体の反応性基との反応によって前記固定担体に結合した請求項1で定義した式(1)のＬ−スレオ−β−ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体からなる、L-グルタミン酸トランスポーター蛋白に特異的に結合することができるアフィニティーカラム用リガンド。
  15. ＲがＨであり、そしてＬ−スレオ−β−ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体が、Ｌ−スレオ−β−ベンジルオキシアスパラギン酸のベンゼン環上の−ＮＨ2と固体担体上のカルボキシもしくはハロアルキル基との反応によって、固体担体に結合した、請求項１４のリガンド。
  16. Ｒがビオチニル基であり、そしてＬ−スレオ−β−ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体が、ビオチニル基と固体担体上のアビジン残基との反応により固体担体に結合している、請求項１４のリガンド。
  17. 請求項１４ないし１６のいずれかで定義したアフィニティーリガンドを用意し；
    Ｌ−グルタミン酸トランスポーター蛋白を含む可能性がある水溶液中の生物学的サンプルを、上記アフィニティーリガンドと接触させ；
    上記アフィニティーリガンドを洗浄し；そして
    上記アフィニティーリガンドからＬ−グルタミン酸トランスポーター蛋白を溶出する；
    工程からなる、生物学的試料中のＬ−グルタミン酸トランスポーター蛋白を精製または同定する方法。
  18. 哺乳類（ヒトを除く。）に、請求項１ないし７のいずれかに定義した式（１）の化合物またはその塩の有効量および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を投与することからなる、哺乳類（ヒトを除く。）のＬ−グルタミン酸トランスポーター関連の神経変性疾患の治療方法。
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